一种功能化固相微萃取探针及其在河鲀鱼毒素活体检测中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种功能化固相微萃取探针及其在河鲀鱼毒素活体检测中的应用。


背景技术：

2.我国河鲀鱼食用历史悠久，是河鲀鱼的产销大国，拥有丰富的河鲀鱼资源。然而，河鲀鱼在生长过程中容易受到环境中各类污染物的侵袭从而在体内积聚河鲀鱼毒素，对河鲀鱼的食用安全产生严重威胁。而且，河鲀鱼毒素有较高的稳定性，一般的烹饪方法很难将其破坏，且中毒后尚无针对性的解毒剂或抗毒素。因此，用科学有效的方法检测河鲀鱼中的河鲀鱼毒素，从而避免河鲀鱼毒素中毒事件的发生非常重要。现有的河鲀鱼毒素检测方法包括小鼠生物法、免疫检测法、仪器分析法等，仍存在一些不足之处。例如，中国发明专利申请(公布号：cn201410603308.5)公开“免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法”，利用免疫亲和柱的独特选择识别性和液相色谱-串联质谱的高灵敏性和精确性，测定海洋生物中的河鲀鱼毒素，但不足之处在于：在前处理过程中需要使用溶剂提取河鲀鱼毒素，并用免疫亲和柱进行净化，步骤繁琐且免疫亲和柱也需要经过十天以上才能制备完成，比较耗时，而且检测过程对样品具有致死性。中国发明专利申请(公布号：cn201410251894.1)公开“一种河豚毒素检测试剂盒”，利用免疫增强乳胶比浊法快速简便地检测河鲀鱼毒素，实现大批量检测，但不足之处在于：需要将样品解刨均质后测定，破坏了河鲀鱼较高的经济价值，并且与河鲀鱼毒素单克隆抗体相结合的纳米乳胶颗粒制备过程也较繁琐。因此，寻找一种河鲀鱼毒素快速简便的活体检测方法很有必要。
3.固相微萃取(spme)技术是一种相对新型的无溶剂萃取方法，集采集、分离和富集于一体，是一种方便快捷与绿色环保的样品前处理技术。spme对整个样品体系的影响较小，可以用于检测或分析活体动物中的目标组分。例如，中国发明专利申请(公布号：cn112547030a) 公开“一种超交联聚合物纳米颗粒固相微萃取生物相容性探针及其在活体分析中的应用”，含有超交联聚合物纳米颗粒和聚去甲肾上腺素生物相容涂层的石英纤维作为固相微萃取探针用于植物活体中农药残留分析，同样探针的制备过程比较繁琐。基于spme技术在活体检测中的优势，急需构建一种河鲀鱼毒素的活体检测方法探究河鲀鱼毒素在鱼体内的残留水平，且现有技术中尚未有基于固相微萃取技术活体检测河鲀鱼毒素的相关报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中检测河鲀鱼毒素存在准备时间长、检测成本高和样品致死性方面的不足，本发明主要目的在于提供一种功能化固相微萃取探针，灵敏度高且成本低。
5.本发明另一目的在于提供上述功能化固相微萃取探针的制备方法，通过浸渍法制备得到。
6.本发明再一目的在于提供上述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼毒素活体检测中的应用，准备时间短、灵敏度高且检测成本低，有效避免检测河鲀鱼毒素导致的样品致死性问题。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供一种功能化固相微萃取探针，其通过氧化石墨烯-聚丙烯腈溶液涂覆于活化不锈钢针上并由去甲肾上腺素溶液在其表面自发聚合形成pne涂层得到，其中：
9.所述go-pan溶液由氧化石墨烯(go)溶于聚丙烯腈(pan)胶中制成，制备方法包括：将质量比为1:7
–
8的pan固体和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)混合，充分搅拌使pan分散均匀并适当溶解形成粘稠的悬浊液，在80
–
100℃加热50
–
70min，使pan完全溶解于dmf形成黄色澄清透明的pan胶，冷却至室温；取go粉末加入dmf中超声分散均匀，两者质量体积比为15
–
25mg：200
–
300μl，得到的go溶液加入到上述pan胶，搅拌均匀；
10.所述活化不锈钢针由直径0.4
–
0.6mm的医用不锈钢针剪成2
–
3cm长的小段，依次在浓盐酸中超声预处理8
–
12min、取出和去离子水润洗的表面活化处理得到。
11.第二方面，本发明提供上述功能化固相微萃取探针的制备方法，通过浸渍法制备得到，包括：所述活化不锈钢针一端垂直浸入所述go-pan溶液，缓慢取出，在80
–
100℃加热2
–
4 min，至dmf充分挥发使涂层固定，重复数次上述浸入和加热步骤，使涂层均匀包裹在所述活化不锈钢针上，浸入所述ne溶液中在其表面自发聚合24h，取出，去离子水冲洗即得；所述ne溶液的浓度为0.2mg/ml，通过ne溶解在10mm ph 8.5的tri缓冲液和甲醇的混合溶液(1:1，v/v)中不断搅拌使其溶解而成。
12.优选地，所述功能化固相微萃取探针的表面涂层厚度为50
–
70μm。
13.第三方面，本发明提供上述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼毒素活体检测中的应用。
14.优选地，所述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼肌肉中对河鲀鱼毒素的检出限为32ng/g，定量限为150ng/g，线性范围为50
–
1000ng/g。
15.优选地，所述功能化固相微萃取探针进行河鲀鱼毒素活体检测的方法，包括以下步骤：
16.(1)用丁香酚将活体河鲀鱼进行麻醉；
17.(2)用医用注射器针在鱼鳍附近的背部肌肉侧面扎一个1.5cm深度的小孔；
18.(3)将医用注射器针从小孔中拔出，所述功能化固相微萃取探针插入小孔中进行活体萃取；
19.(4)将上述河鲀鱼从水中捞出，再次麻醉后取出所述功能化固相微萃取探针；
20.(5)先用去离子水冲洗所述功能化固相微萃取探针，再用脱附溶剂对萃取到的河鲀鱼毒素进行脱附；
21.(6)步骤(5)中的脱附液进行lc-ms/ms分析，获得鱼体内的河鲀鱼毒素含量。
22.优选地，步骤(1)和(4)中，麻醉河鲀鱼的方法为：将5ml丁香酚液体加入5l自来水中，配制成0.1％丁香酚(体积分数)水溶液，从水中将河鲀鱼捞起浸入到上述溶液中，数秒后其身体失去平衡后立即将鱼捞出，完成麻醉。
23.优选地，步骤(3)中，所述活体萃取的时间为30
–
70min。
24.优选地，步骤(5)中，所述脱附溶剂选自甲醇、50％甲醇、乙腈和50％乙腈，脱附时间为20
–
40min。
25.优选地，步骤(6)中，所述lc-ms/ms分析的条件为：使用日本岛津公司的超高效液相色谱
–
三重四极杆质谱联用仪(nexera lc30ad&sciex selexion triple quad 5500 system)，质谱离子源为电喷雾离子源(esi)，分离使用美国安捷伦科技有限公司的hilic色谱柱(2.1
×
100mm，1.7μm)，流动相a为含0.1％甲酸的水溶液，流动相b为0.1％的乙腈，流速为0.4ml/min，柱温为40℃；
26.梯度洗脱程序如下：起始为5％的流动相a，95％的流动相b，保持0.5min后，在2.5min 内流动相a升至60％，随后在1min内升至95％，再保持2min不变，然后在0.1min内降回至5％，维持1.9min不变，每个样品的分析时间为8min；
27.质谱条件如下：采用esi正离子模式，气帘气为35psi，离子化电压为5500v，去溶剂温度为500℃，雾化气为55psi，辅助加热气为55psi，采用多重反应监测(mrm)对样品进行分析。
28.优选地，步骤(6)中，采用外标法对脱附液中河鲀鱼毒素浓度进行定量的方法为：将河鲀鱼毒素溶于少量的1％乙酸水溶液(v/v)中，用甲醇定容，分别配制出浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的河鲀鱼毒素标准梯度溶液，使用lc-ms/ms分析河鲀鱼毒素标准梯度溶液，以浓度为x轴，峰面积为y轴，绘制河鲀鱼毒素的标准曲线，对脱附液的河鲀鱼毒素浓度进行定量。
29.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
30.(1)本发明的功能化固相微萃取探针可以检测出活体河鲀鱼中的河鲀鱼毒素含量，其检出限可以满足河鲀鱼安全食用的需要，制备方法简便，灵敏度高且成本低。
31.(2)本发明中功能化固相微萃取探针用于检测活体河鲀鱼中的河鲀鱼毒，不需要杀死河鲀鱼，检测用时较短，可在1小时内完成萃取和检测过程，灵敏度高且检测成本低，有效避免检测河鲀鱼毒素导致的样品致死性问题，保护河鲀鱼较高的经济价值，也更加符合动物实验的伦理。
附图说明
32.图1是实施例中go-pan@pne探针照片。
33.图2是实施例中go-pan@pne探针的扫描电镜照片。
34.图3是实施例中lc-ms/ms分析河鲀鱼毒素标准品得到的标准曲线。
35.图4是实施例中go-pan@pne探针萃取河鲀鱼毒素加标鱼肉后得到的lc-ms/ms色谱图。
36.图5是空白pan探针、go-pan探针以及go-pan@pne探针分别萃取河鲀鱼毒素1μg/g 加标鱼肉与1μg/ml水溶液的结果。
37.图6是实施例中go-pan@pne探针萃取河鲀鱼毒素加标鱼肉的萃取时间优化。
38.图7是实施例中go-pan@pne探针萃取河鲀鱼毒素加标鱼肉的脱附溶剂优化。
39.图8是实施例中go-pan@pne探针萃取河鲀鱼毒素加标鱼肉的脱附时间优化。
40.图9是实施例中go-pan@pne探针萃取河鲀鱼毒素加标鱼肉的线性范围。
41.图10是实施例中go-pan@pne探针进行河鲀鱼中河鲀鱼毒素的活体检测照片。
具体实施方式
42.下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于以下范围。实施例中所用试剂未进行注明者，均为市售常规产品，可购买获得。
43.以下实施例中基于固相微萃取(spme技术的河鲀鱼毒素活体检测方法，步骤如下：
44.(1)制备go-pan溶液：将质量比为1:7
–
1:8的pan固体和dmf混合，充分搅拌使pan 分散均匀并适当溶解，形成粘稠的悬浊液。在烘箱中80
–
100℃加热50
–
70min，使pan完全溶解于dmf，从而制成黄色澄清透明的pan胶，将其冷却至室温。另取15
–
25mg go粉末加入200
–
300μl的dmf中，超声1h使其分散均匀。将分散均匀的go溶液加入上述pan 胶，搅拌均匀，制备出go-pan溶液。
45.(2)通过浸渍法制备go-pan@pne探针：将直径0.4
–
0.6mm医用不锈钢针剪成2
–
3cm 长的小段，并将其在浓盐酸中超声预处理8
–
12min后取出，用去离子水润洗，以医用不锈钢针表面活化。将处理过的医用不锈钢针的一端约1cm的长度垂直浸入步骤(1)中制备的溶液，之后缓慢取出，并在80
–
100℃加热2
–
4min令dmf充分挥发，使涂层固定。重复数次该浸入和加热步骤，以使涂层尽量均匀包裹在医用不锈钢针上，并使最终的涂层厚度约为50
–
70μm。将ne溶解在tri冲液(10mm，ph＝8.5)和甲醇的混合溶液(1:1，v/v)中(浓度0.2mg/ml)。将制备完成的探针浸入ne溶液中24h，使ne在探针表面自发聚合。时间到后，取出探针，用去离子水反复润洗，即得到go-pan@pne探针。
46.(3)使用go-pan@pne探针进行河鲀鱼毒素的活体检测：从水中将河鲀鱼捞起，将其浸入0.1％丁香酚(体积分数)的水溶液中麻醉，直至其身体失去平衡。将鱼捞出，使用医用注射器针在鱼鳍附近的背部肌肉侧面扎一个约1.5cm深度的小孔。将注射器从小孔中拔出，然后将自制探针插入小孔中。在取样过程中，将暗纹东方鲀放回清水中萃取30
–
70min。萃取后，将鱼再次从水中捞出，将其麻醉后将探针取出。用纯水冲洗探针2
–
4s后，使用脱附溶剂进行脱附。
47.(4)仪器分析：步骤(3)中获得的脱附液通过lc-ms/ms检测，采用外标法确定河鲀鱼体内的河鲀鱼毒素含量水平。
48.一些实施方式中，步骤(3)中，使用自制探针进行河鲀鱼毒素活体检测的具体方法参数为：自制探针对河鲀鱼毒素的萃取时间为30
–
70min，脱附溶剂可选择甲醇、50％甲醇、乙腈和50％乙腈，脱附时间为20
–
40min。
49.一些实施方式中，步骤(4)中，液相色谱串联质谱的检测方法为：使用日本岛津公司的超高效液相色谱
–
三重四极杆质谱联用仪(nexera lc30ad&sciex selexion triple quad 5500 system)进行分析，质谱离子源为电喷雾离子源(esi)，分离使用美国安捷伦科技有限公司的hilic色谱柱(2.1
×
100mm，1.7μm)。流动相a为含0.1％甲酸的水溶液，流动相b为0.1％的乙腈，流速0.4ml/min，柱温40℃。梯度洗脱程序如下：起始为5％的流动相a，95％的流动相b，保持0.5min后，在2.5min内流动相a升至60％，随后在1min内升至95％，再保持 2min不变，然后在0.1min内降回至5％，维持1.9min不变。每个样品的分析时间为8min。质谱条件如下：esi正离子模式，气帘气35psi，离子化电压5500v，去溶剂温度500℃，雾化气55psi，辅助加热气55psi，采用多重反应监测(mrm)对样品进行分析。
50.一些实施方式中，步骤(4)中，采用外标法对脱附液中的河鲀鱼毒素进行定量的具体方法为：将河鲀鱼毒素溶于少量的1％乙酸水溶液(v/v)中，再使用甲醇定容，分别配制出
浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的河鲀鱼毒素标准梯度溶液，使用权利要求3所述的仪器分析方法分析河鲀鱼毒素标准梯度溶液，以浓度为x轴，峰面积为y轴，绘制出河鲀鱼毒素标准曲线，对脱附液的河鲀鱼毒素浓度进行定量。
51.以下通过具体实施例对本发明的技术方案进一步解释说明。
52.实施例1
53.制备用于固相微萃取的go-pan@pne探针，其由go-pan溶液涂覆在活化不锈钢针上形成，并在表面添加自聚合的pne涂层，可直接用于河鲀鱼体内河鲀鱼毒素的活体检测测量河鲀鱼体内河鲀鱼毒素的含量水平，制备流程如图1所示，步骤为：
54.(1)对医用不锈钢针表面进行活化，制备go-pan溶液、ne溶液；
55.(2)将活化不锈钢针一端约1cm的长度垂直浸入上述go-pan溶液，之后缓慢取出，完成浸渍；
56.(3)将浸渍完成的探针放入烘箱中，在90℃下加热3min直至dmf挥发，使涂层固定；
57.(4)将步骤(2)和(3)中的浸渍-加热步骤重复数次，以使涂层尽量均匀包裹在医用不锈钢针上，并使最终的涂层厚度约为50μm；
58.(5)将步骤(4)中将制备的探针浸入ne溶液中，使ne在探针表面自发聚合；
59.(6)24h后取出探针，用去离子水冲洗探针，即得go-pan@pne固相微萃取探针，如图1照片所示。
60.实施例2
61.制备用于固相微萃取的go-pan@pne探针，具体步骤为：
62.(1)对医用不锈钢针表面进行活化，制备go-pan溶液和ne溶液；
63.(2)将活化不锈钢针一端约1cm的长度垂直浸入上述go-pan溶液，之后缓慢取出，完成浸渍；
64.(3)将浸渍完成的探针放入烘箱在90℃下加热3min直至dmf挥发，使涂层固定；
65.(4)将步骤(2)和(3)中的浸渍-加热步骤重复数次，以使涂层尽量均匀包裹在医用不锈钢针上，并使最终的涂层厚度约为50μm；
66.(5)将(步骤(4)中将制备的探针浸入ne溶液中，使ne在探针表面自发聚合；
67.(6)24h后取出探针，用去离子水冲洗探针，即得go-pan@pne固相微萃取探针。
68.使用sem对实施例2go-pan@pne固相微萃取探针的表面形态进行表征。将探针剪成合适大小，用导电胶将其粘贴在样品台上，使用nova nano-sem 450型场发射扫描电子显微镜(fesem，美国fei公司)来观察探针的表面形态，扫描电镜照片如图2所示。在较低的放大倍率下，探针涂层表面整体呈现较为光滑和均匀的形态，没有较大的凸起、凹陷和凝结块，这样均匀的分布有利于提高探针的重现性。而在较高的放大倍率下，可观察到探针表面逐渐变得粗糙，出现了较多的折叠和多孔的结构，这是因为溶液中的dmf蒸发后，剩余的 pan与go固定在探针表面形成凹凸不平的结构，这样的结构有利于增大接触面积，提高探针的负载能力，从而提升萃取性能。
69.实施例3
70.制备用于固相微萃取的go-pan@pne探针，具体步骤为：
71.(1)对医用不锈钢针表面进行活化，制备go-pan溶液和ne溶液；
72.(2)将活化不锈钢针一端约1cm的长度垂直浸入上述go-pan溶液，之后缓慢取出，
完成浸渍；
73.(3)将浸渍完成的探针放入烘箱在90℃下加热3min直至dmf挥发，使涂层固定；
74.(4)将步骤(2)和(3)中的浸渍-加热步骤重复数次，以使涂层尽量均匀包裹在医用不锈钢针上，并使最终的涂层厚度约为50μm；
75.(5)将步骤(4)中将制备的探针浸入ne溶液中，使ne在探针表面自发聚合；
76.(6)24h后取出探针，用去离子水冲洗探针，即得go-pan@pne固相微萃取探针。
77.使用go-pan@pne探针对加标河鲀鱼肉进行萃取，萃取的具体步骤为：将数尾购买得到的暗纹东方鲀致死解剖，取背部肌肉绞碎成肉糜，称取5g至10ml玻璃样品瓶中，加入对应浓度的河鲀鱼毒素水溶液5ml，制备成河鲀鱼毒素加标鱼肉样品。探针垂直插入装有加标鱼肉样品的10ml玻璃样品瓶中，保证涂层完全浸没于鱼肉中。萃取结束后，用超纯水冲洗探针3s，之后用kimwipe纸巾擦干，将萃取后的探针浸入250μl的甲醇，对探针上萃取到的河鲀鱼毒素进行脱附，脱附液进行lc-ms/ms分析。
78.lc-ms/ms仪器分析条件为：使用日本岛津公司的超高效液相色谱
–
三重四极杆质谱联用仪(nexera lc30ad&sciex selexion triple quad 5500system)进行分析。质谱离子源为电喷雾离子源(esi)。分离使用美国安捷伦科技有限公司的hilic色谱柱(2.1
×
100mm，1.7μm)。流动相a为含0.1％甲酸的水溶液，流动相b为0.1％的乙腈，流速0.4ml/min，柱温40℃。梯度洗脱程序如下：起始为5％的流动相a，95％的流动相b，保持0.5min后，在2.5min内流动相a升至60％，随后在1min内升至95％，再保持2min不变，然后在0.1min内降回至 5％，维持1.9min不变。每个样品的分析时间为8min。质谱条件如下：esi正离子模式，气帘气35psi，离子化电压5500v，去溶剂温度500℃，雾化气55psi，辅助加热气55psi，采用 mrm对样品进行分析。
79.图3是使用实施例3中的lc-ms/ms方法分析河鲀鱼毒素标准品得到的标准曲线，标曲线性良好，说明lc-ms/ms方法可以用于河鲀鱼毒素的定量分析。图4是使用实施例3中 go-pan@pne探针加标河鲀鱼肉进行萃取得到的lc-ms/ms色谱图，说明探针可以从河鲀鱼肉中萃取到河鲀鱼毒素。
80.实施例4
81.制备用于固相微萃取的go-pan@pne探针，具体步骤为：
82.(1)对医用不锈钢针表面进行活化，制备go-pan溶液和ne溶液；
83.(2)将活化不锈钢针一端约1cm的长度垂直浸入上述go-pan溶液，之后缓慢取出，完成浸渍；
84.(3)将浸渍完成的探针放入烘箱在90℃下加热3min直至dmf挥发，使涂层固定；
85.(4)将步骤(2)和(3)中的浸渍-加热步骤重复数次，以使涂层尽量均匀包裹在医用不锈钢针上，并使最终的涂层厚度约为50μm；
86.(5)将步骤(4)中将制备的探针浸入ne溶液中，使ne在探针表面自发聚合；
87.(6)24h后取出探针，用去离子水冲洗探针，即得go-pan@pne固相微萃取探针。
88.图5是使用空白pan探针、go-pan探针以及go-pan@pne探针分别萃取河鲀鱼毒素 1μg/g加标鱼肉与1μg/ml水溶液的结果，相比较于空白的pan探针，添加了go的探针对河鲀鱼毒素的萃取量大幅度提升，说明go对河鲀鱼毒素有吸附作用。当探针未包裹pne 时，在加标鱼肉中的萃取量相比于在水溶液中的萃取量更低，说明pne赋予了探针良好的抗生物腐蚀
能力，提升探针在鱼肉中的萃取性能。
89.实施例5
90.制备用于固相微萃取的go-pan@pne探针，具体步骤为：
91.(1)对医用不锈钢针表面进行活化，制备go-pan溶液和ne溶液；
92.(2)将活化不锈钢针一端约1cm的长度垂直浸入上述go-pan溶液，之后缓慢取出，完成浸渍；
93.(3)将浸渍完成的探针放入烘箱在90℃下加热3min直至dmf挥发，使涂层固定；
94.(4)将步骤(2)和(3)中的浸渍-加热步骤重复数次，以使涂层尽量均匀包裹在医用不锈钢针上，并使最终的涂层厚度约为50μm；
95.(5)将步骤(4)中将制备的探针浸入ne溶液中，使ne在探针表面自发聚合；
96.(6)24h后取出探针，用去离子水冲洗探针，即得go-pan@pne固相微萃取探针。
97.使用go-pan@pne探针，在加标浓度为1μg/g的加标河鲀鱼肉中，分别以5
–
60min(5、 10、15、20、30、45、60min)的时间范围进行萃取，选择最优萃取时间，结果如图6所示，在30min以后萃取量增长缓慢，选择30min为最优萃取时间。
98.使用go-pan@pne探针，在加标浓度为1μg/g的加标河鲀鱼肉中进行萃取，分别以甲醇、乙腈、50％甲醇(v:v)、50％乙腈(v:v)、超纯水为脱附溶剂进行脱附，选择最脱附溶剂，结果如图7所示，以甲醇为脱附溶剂的萃取量最大，选择甲醇为脱附溶剂。
99.使用go-pan@pne探针，在加标浓度为1μg/g的加标河鲀鱼肉中进行萃取，分别以 10
–
60min(10、15、20、30、45、60min)的时间范围进行脱附，选择最优脱附时间，结果如图8所示，在15min以后萃取量增长缓慢，选择15min为最优萃取时间。
100.实施例6
101.制备用于固相微萃取的go-pan@pne探针，具体步骤为：
102.(1)对医用不锈钢针表面进行活化，制备go-pan溶液和ne溶液；
103.(2)将活化不锈钢针一端约1cm的长度垂直浸入上述go-pan溶液，之后缓慢取出，完成浸渍；
104.(3)将浸渍完成的探针放入烘箱在90℃下加热3min直至dmf挥发，使涂层固定；
105.(4)将步骤(2)和(3)中的浸渍-加热步骤重复数次，以使涂层尽量均匀包裹在医用不锈钢针上，并使最终的涂层厚度约为50μm；
106.(5)将步骤(4)中将制备的探针浸入ne溶液中，使ne在探针表面自发聚合；
107.(6)24h后取出探针，用去离子水冲洗探针，即得到的go-pan@pne固相微萃取探针。
108.使用go-pan@pne探针以及实施例5中确定的最佳萃取条件测定探针在河鲀鱼毒素加标鱼肉中的线性范围，并确定检出限与定量限，其中河鲀鱼毒素加标鱼肉浓度时设置为5， 10，50，100，250，500，750，1000ng/ml共8个浓度梯度，根据萃取结果选择线性良好的浓度范围，并依此计算出检出限与定量限，检出限与定量限的信噪比分别选取为3和10，线性范围如图9所示，计算出线性范围为50
–
1000ng/g，检测限为32ng/g，定量限为150ng/g。
109.实施例7
110.制备用于固相微萃取的go-pan@pne探针，具体步骤为：
111.(1)对医用不锈钢针表面进行活化，制备go-pan溶液和ne溶液；
112.(2)将活化不锈钢针一端约1cm的长度垂直浸入上述go-pan溶液，之后缓慢取出，
完成浸渍；
113.(3)将浸渍完成的探针放入烘箱在90℃下加热3min直至dmf挥发，使涂层固定；
114.(4)将步骤(2)和(3)中的浸渍-加热步骤重复数次，以使涂层尽量均匀包裹在医用不锈钢针上，并使最终的涂层厚度约为50μm；
115.(5)将步骤(4)中将制备的探针浸入ne溶液中，使ne在探针表面自发聚合；
116.(6)24h后取出探针，用去离子水冲洗探针，即得go-pan@pne固相微萃取探针。
117.使用go-pan@pne探针进行河鲀鱼体内河鲀鱼毒素的活体检测，如图10所示，检测步骤为：
118.(1)用丁香酚将活体河鲀鱼进行麻醉；
119.(2)用医用注射器针在鱼鳍附近的背部肌肉侧面扎一个约1.5cm深度的小孔；
120.(3)将注射器从小孔中拔出，然后将探针插入小孔中进行萃取；
121.(4)将鱼再次从水中捞出，再次将其麻醉后将探针取出；
122.(5)用去离子水冲洗探针，用脱附溶剂对萃取到的河鲀鱼毒素进行脱附；
123.(6)将脱附液进行lc-ms/ms分析，获得河鲀鱼体内的河鲀鱼毒素含量。
124.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。