一种功能化固相微萃取探针及其在河鲀鱼毒素活体检测中的应用的制作方法

技术特征：
1.一种功能化固相微萃取探针，其特征在于，其通过氧化石墨烯-聚丙烯腈溶液涂覆于活化不锈钢针上并由去甲肾上腺素溶液在其表面自发聚合形成pne涂层得到，其中：所述氧化石墨烯-聚丙烯腈溶液由氧化石墨烯溶于聚丙烯腈胶中制成，制备方法包括：将质量比为1:7
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8的聚丙烯腈固体和n,n-二甲基甲酰胺混合，充分搅拌使聚丙烯腈分散均匀并适当溶解形成粘稠的悬浊液，在80
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100℃加热50
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70min使聚丙烯腈完全溶解形成黄色澄清透明的聚丙烯腈胶，冷却至室温；取氧化石墨烯粉末加入到n,n-二甲基甲酰胺中超声分散均匀，两者质量体积比为15
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25mg：200
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300μl，得到的氧化石墨烯溶液加入到上述聚丙烯腈胶，搅拌均匀；所述活化不锈钢针通过直径0.4
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0.6mm的医用不锈钢针剪成2
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3cm长的小段，依次在浓盐酸中超声预处理8
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12min、取出和去离子水润洗的表面活化处理得到。2.根据权利要求1所述的功能化固相微萃取探针，其特征在于，包括：所述活化不锈钢针一端垂直浸入所述氧化石墨烯-聚丙烯腈溶液，缓慢取出，在80
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100℃加热2
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4min，至n,n-二甲基甲酰胺充分挥发使涂层固定，重复数次上述浸入和加热步骤，使涂层均匀包裹在所述活化不锈钢针上，浸入浓度为0.2mg/ml的去甲肾上腺素溶液中自发聚合24h，取出，用去离子水冲洗即得；其中，所述去甲肾上腺素溶液通过去甲肾上腺素溶解在10mm ph 8.5的tri缓冲液和甲醇的混合溶液(1:1，v/v)中不断搅拌使其溶解而成。3.根据权利要求2所述的功能化固相微萃取探针，其特征在于，所述功能化固相微萃取探针的表面涂层厚度为50
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70μm。4.权利要求1至3任一项所述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼毒素活体检测中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述功能化固相微萃取探针在河鲀鱼肌肉中对河鲀鱼毒素的检出限为32ng/g，定量限为150ng/g，线性范围为50
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1000ng/g。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过所述功能化固相微萃取探针进行河鲀鱼毒素活体检测的方法，包括以下步骤：(1)用丁香酚将活体河鲀鱼进行麻醉；(2)用医用注射器针在鱼鳍附近的背部肌肉侧面扎一个1.5cm深度的小孔；(3)将医用注射器针从小孔中拔出，所述功能化固相微萃取探针插入小孔中进行活体萃取；(4)将上述河鲀鱼从水中捞出，再次麻醉后取出所述功能化固相微萃取探针；(5)先用去离子水冲洗所述功能化固相微萃取探针，再用脱附溶剂对萃取到的河鲀鱼毒素进行脱附；(6)步骤(5)中的脱附液进行lc-ms/ms分析，获得鱼体内的河鲀鱼毒素含量。优选地，步骤(1)和(4)中麻醉河鲀鱼的方法为：将5ml丁香酚液体加入5l自来水中，配制成0.1％丁香酚(体积分数)水溶液，从水中将河鲀鱼捞起浸入到上述溶液中，数秒后其身体失去平衡后立即将鱼捞出，完成麻醉。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述活体萃取的时间为30
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70min。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脱附溶剂选自甲醇、50％甲醇、乙腈和50％乙腈，脱附时间为20
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40min。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述lc-ms/ms分析的条件为：使用超高效液相色谱
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三重四极杆质谱联用仪，质谱离子源为电喷雾离子源，分离使用美国安捷伦科技
有限公司的hilic色谱柱，流动相a为含0.1％甲酸的水溶液，流动相b为0.1％的乙腈，流速为0.4ml/min，柱温为40℃；梯度洗脱程序如下：起始为5％的流动相a，95％的流动相b，保持0.5min后，在2.5min内流动相a升至60％，随后在1min内升至95％，再保持2min不变，然后在0.1min内降回至5％，维持1.9min不变，每个样品的分析时间为8min；质谱条件如下：采用电喷雾离子源正离子模式，气帘气为35psi，离子化电压为5500v，去溶剂温度为500℃，雾化气为55psi，辅助加热气为55psi，多重反应监测进行样品分析。10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(6)中，采用外标法对脱附液中河鲀鱼毒素浓度进行定量的方法为：将河鲀鱼毒素溶于少量的1％乙酸水溶液(v/v)中，用甲醇定容分别配制出浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的河鲀鱼毒素标准梯度溶液，用lc-ms/ms分析河鲀鱼毒素的标准梯度溶液，以浓度为x轴，峰面积为y轴，绘制河鲀鱼毒素的标准曲线，对脱附液的河鲀鱼毒素浓度进行定量。

技术总结
本发明公开了一种功能化固相微萃取探针及其在河鲀鱼毒素活体检测中的应用，该探针由氧化石墨烯-聚丙烯腈溶液涂覆于活化不锈钢针上并在表面自发聚合PNE涂层得到，活化不锈钢针一端垂直浸入氧化石墨烯-聚丙烯腈溶液，缓慢取出，加热使涂层固定，重复浸入和加热步骤使涂层均匀包裹在活化不锈钢针上，浸入去甲肾上腺素溶液中在其表面自发聚合形成涂层。本发明的功能化固相微萃取探针可以检测出活体河鲀鱼中的河鲀鱼毒素含量，检出限满足河鲀鱼安全食用需要，检测不需要杀死河鲀鱼，可在1小时内完成萃取和检测过程，灵敏度高且检测成本低，同时有效避免检测河鲀鱼毒素导致的样品致死性问题。死性问题。死性问题。


技术研发人员：刘源 孟恒立 姜水 胡云
受保护的技术使用者：扬州市食品药品检验检测中心
技术研发日：2022.07.11
技术公布日：2022/11/15