针对淋球菌感染的免疫原性蛋白

1.本发明涉及一种用于预防和治疗淋病奈瑟菌或淋球菌相关疾病和病症的免疫原性肽。


背景技术：

2.淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)的多重耐药菌株的持续出现是对淋病的性传播感染(1,2)的管理的重大挑战，世界卫生组织(3)、疾病控制中心(4)和澳大利亚国家抗微生物耐药性(amr)战略(5)已将淋病奈瑟菌作为需要立即采取行动的紧急公共卫生威胁列为优先事项。据估计，全世界每年有超过1.06亿例淋病病例(6)，并且感染率正在上升(例如，在过去五年中，美国的病例增加了67％(7)，澳大利亚增加了80％(8))。淋病奈瑟菌感染的结局因感染部位和性别而异(在9,10中进行了综述)，包括无症状和局部症状感染，但如果未被诊断和/或治疗，淋病可导致严重的后遗症，诸如盆腔炎性疾病、妊娠和新生儿并发症以及不育。淋病奈瑟菌感染也会增加感染和传播hiv的风险。
3.由于其高患病率，它可能引起的严重后遗症，以及治疗淋病奈瑟菌的多重耐药菌株的难度越来越大，因此迫切需要开发预防感染的疫苗。然而，开发淋球菌疫苗存在着各种挑战，包括淋病奈瑟菌表面结构的高水平相位和抗原变异，以及感染后没有保护性免疫的事实，这意味着没有确定的保护相关性来引导临床前疫苗研究(在9,11中综述)。


技术实现要素：

4.令人惊讶的是，本发明人发现，施用来自淋病奈瑟菌的奈瑟菌肝素结合抗原(nhba)蛋白的c末端片段可以引发比全长蛋白具有更高的杀菌和调理吞噬杀伤水平的抗体的产生，在具有相对较低的nhba表达的淋球菌菌株中尤其如此。
5.因此，在广义上，本发明涉及nhba蛋白诸如在seq id no:1中列出的蛋白质或其具有免疫原性的并且可以引发针对淋病奈瑟菌或淋球菌的免疫应答的片段、变体或衍生物。在优选的形式中，nhba蛋白是包含seq id no:2中列出的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物的c末端片段。
6.本发明的第一方面提供了淋病奈瑟菌的分离的奈瑟菌肝素结合抗原(nhba)蛋白的免疫原性片段。
7.适当地，分离的nhba蛋白包含seq id no:1中列出的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物。
8.在特定的实施方案中，免疫原性片段包含分离的nhba蛋白诸如seq id no:2或其片段、变体或衍生物的c末端片段。
9.适当地，seq id no:2的变体或衍生物包含其残基3、5、6、9、20、50、57、60、61、69、71、75、76、83、88、89、91、92、93、113、135、150、152、153、167、173、177、180和181的一个或多个氨基酸取代。更具体地说，seq id no:2的一个或多个氨基酸取代可以选自由a3v、i5m、p6l、p9s、g20e、p50s、r57s、g60a、e61k、a69v、t71a、n75s、g76r、m83t、p88s、y89c、s91t、
g92r、g93s、s113g、t135n、g150d、a152v、g153d、a167t、g173s、g177d、d180e、r181q及其任何组合组成的组。
10.在一些实施方案中，免疫原性片段包含分离的nhba蛋白的一个或多个肝素结合残基和/或一个或多个活性位点残基。在其他实施方案中，免疫原性片段不包含分离的nhba蛋白的肝素结合残基和/或活性位点残基。
11.在第二方面，本发明在于包含根据第一方面的一种或多种免疫原性片段的分离的蛋白质。
12.在第三方面，本发明涉及一种分离的核酸，其包含编码第一方面的免疫原性片段或第二方面的分离的蛋白质的核苷酸序列，或其包含与其互补的核苷酸序列。
13.在第四方面，本发明提供了包含第三方面的分离的核酸的基因构建体。
14.在第五方面，本发明在于包含第四方面的基因构建体的宿主细胞。
15.在第六方面，本发明涉及产生第一方面的分离的免疫原性片段或第二方面的分离的蛋白质的方法，所述方法包括：(i)培养第五方面的宿主细胞；以及(ii)从步骤(i)中培养的所述宿主细胞分离所述免疫原性片段或蛋白质。
16.在第七方面，本发明提供了一种抗体或抗体片段，其结合第一方面的免疫原性片段或第二方面的分离的蛋白质或者针对所述免疫原性片段或分离的蛋白质产生。
17.在第八方面，本发明在于一种组合物，其包含第一方面的一种或多种免疫原性片段、第二方面的分离的蛋白质、第三方面的分离的核酸、第四方面的基因构建体、第五方面的宿主细胞和/或第七方面的抗体或抗体片段，任选地连同药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
18.适当地，本组合物是免疫原性组合物，诸如疫苗。
19.在第九方面，本发明提供了一种引发针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答的方法，所述方法包括给受试者施用：第一方面的一种或多种免疫原性片段；第二方面的分离的蛋白质；第三方面的分离的核酸；第四方面的基因构建体；第五方面的宿主细胞；第七方面的抗体或抗体片段；和/或第八方面的组合物；从而引发免疫应答的步骤。
20.在第十方面，本发明涉及诱导针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌的免疫的方法，所述方法包括给受试者施用：第一方面的一种或多种免疫原性片段；第二方面的分离的蛋白质；第三方面的分离的核酸；第四方面的基因构建体；第五方面的宿主细胞；第七方面的抗体或抗体片段；和/或第八方面的组合物；从而诱导针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌的免疫的步骤。
21.在第十一方面，本发明在于治疗或预防受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染的方法，所述方法包括给受试者施用：第一方面的一种或多种免疫原性片段；第二方面的分离的蛋白质；第三方面的分离的核酸；第四方面的基因构建体；第五方面的宿主细胞；第七方面的抗体或抗体片段；和/或第八方面的组合物；从而预防或治疗受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染的步骤。
22.在第十二方面，本发明提供了至少部分地抑制或防止淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌与受试者中的细胞结合的方法，所述方法包括给受试者施用：第一方面的一种或多种免疫原性片段；第二方面的分离的蛋白质；第三方面的分离的核酸；第四方面的基因构
建体；第五方面的宿主细胞；第七方面的抗体或抗体片段；和/或第八方面的组合物；从而抑制或防止淋病奈瑟菌细菌与受试者的细胞结合的步骤。
23.在第十三方面，本发明在于至少部分地抑制或降低受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的血清抗性的方法，所述方法包括给受试者施用：第一方面的一种或多种免疫原性片段；第二方面的分离的蛋白质；第三方面的分离的核酸；第四方面的基因构建体；第五方面的宿主细胞；第七方面的抗体或抗体片段；和/或第八方面的组合物；从而抑制或降低受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染血清抗性的步骤。
24.在第十四方面，本发明提供了检测从受试者获得的生物样品中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的方法，所述方法包括使所述生物样品与第八方面的抗体或抗体片段接触从而检测所述生物样品中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的步骤。
25.在第十五方面，本发明涉及第一方面的一种或多种免疫原性片段、第二方面的分离的蛋白质、第三方面的分离的核酸、第四方面的基因构建体、第五方面的宿主细胞、第七方面的抗体或抗体片段和/或第八方面的组合物在制造用于以下的药物中的用途：引发针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答；诱导针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫；治疗或预防受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟球菌细菌感染；至少部分地抑制或防止淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌与受试者中的细胞结合；和/或用于至少部分地抑制或降低受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染的血清抗性。
26.在第十六方面，本发明在于第一方面的一种或多种免疫原性片段、第二方面的分离的蛋白质、第三方面的分离的核酸、第四方面的基因构建体、第五方面的宿主细胞、第七方面的抗体或抗体片段和/或第八方面的组合物，其用于或当使用时用于：引发针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫应答；诱导针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的免疫；治疗或预防受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟球菌细菌感染；至少部分地抑制或防止淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌与受试者中的细胞结合；和/或至少部分地抑制或降低受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染的血清抗性。
27.优选地，上述方面的受试者是人。
28.如本文所用，不定冠词’一个/一种(a)'和'一个/一种(an)'在这里用于指代或包含单数或复数要素或特征，不应被视为表示或定义“一个(one)”或“单一(single)”要素或特征。
29.除非上下文另有要求，否则术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”或类似术语意在表示非排他的包含，使得所叙述的要素或特征的清单不只是包括那些声明或列出的要素，而是可以包括未列出或声明的其他要素或特征。
30.关于在诸如免疫原性片段之类的氨基酸序列的上下文中的“基本上由组成”，表示所叙述的氨基酸序列连同在n-或c-末端的另外一个、两个或三个氨基酸。
附图说明
31.图1.淋球菌nhba的概述。(a)来自淋病奈瑟菌菌株1291的nhba蛋白的示意图，显示了信号肽区(空心框)和富精氨酸区(arg；灰色框)。还显示了在该研究中使用的重组蛋白、成熟的nhba(nhba；缺乏预测的信号肽)和nhba的c端片段(nhba-c)。(b)淋病奈瑟菌的14个
主要nhba变体的氨基酸序列的比对，其中在所有变体之间相同的氨基酸被显示为深灰色垂直线，在大多数变体之间保守的氨基酸被显示为浅灰色，错配或空位被显示为白色。nhba肽的数目显示在左侧，并且在pubmlst中含有这个变体的分离物的％显示在右侧。(c)14个主要nhba变体的邻接系统发育树。在本研究中使用的菌株中存在的四个nhba变体加下划线。(d)在本研究中使用的菌株中存在的四个nhba变体的氨基酸比对。通过点指示与共有序列(显示在底线上)的匹配。富精氨酸区由虚线指示，nhba-c片段由线指示。
32.图2.在一组淋球菌菌株中的nhba表达。在(a)淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba::kan突变体(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株中的nhba表达的蛋白质印迹分析，以及(b)sba和opa测定法中使用的淋球菌菌株。在印迹下方指示所使用的血清。
33.图3.通过淋病奈瑟菌上的片段沉积测量的抗体结合和补体活化。在存在(a)多克隆抗血清或(b)从用nhba-弗氏或nhba-c-弗氏免疫的小鼠纯化的igg的情况下，在淋病奈瑟菌1291的表面上的抗体结合和抗体介导的c3片段沉积的流式细胞术。这些值代表抗体与淋病奈瑟菌细胞的结合和c3片段沉积的几何平均荧光。包括仅二级抗体(-ve)、免疫前小鼠血清(pi)和仅补体(c)对照。
34.图4.nhba抗血清对淋病奈瑟菌的功能阻断活性。(a)nhba-肝素与α-nhba抗体的相互作用的阻断。在不存在血清(0；白色)或存在免疫前(pi；浅灰色)、α-nhba(中灰色)或α-nhba-c(深灰色)血清的情况下进行nhba-肝素相互作用的表面等离子体共振(spr)分析。数据代表一式三份样品的平均nhba-肝素结合( /-1标准差)，其为在不存在抗体情况下(无抗体对照(白色)设定为100％)结合的百分比。(b-c)淋病奈瑟菌与上皮细胞粘附的阻断。在所有测试浓度下α-nhba和α-nhba-c血清处理的淋球菌相对于未处理对照(0；白色)与(b)宫颈和(c)尿道上皮细胞具有显著降低的粘附性(p《0.05，使用双尾学生t检验计算)。免疫前血清(pi，浅灰色)，不影响细菌粘附(p》0.05)。结果显示为来自一式三份血清处理的样品相对于无抗体对照的粘附细菌的平均百分比(设定为100％的无抗体对照的结果对于宫颈细胞和尿道细胞分别为4.33
±
0.31x103和1.37
±
0.061x103个粘附cfu)。误差条表示
±
1个标准差。用一式三份样品进行两次实验，并显示代表性结果。
35.图5.淋病奈瑟菌中的nhba表达。淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba::kan突变体(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株的全细胞裂解物的(a)考马斯染色的sds-page和(b)蛋白质印迹分析，用印迹下方指示的α-nhba抗体进行探测。图2a中所示的蛋白质印迹的区域是加框的。一组淋病奈瑟菌菌株的全细胞裂解物的(c)考马斯染色的sds-page和(d)蛋白质印迹分析。图2b中所示的蛋白质印迹的区域是加框的。
36.图6.nhba-肝素相互作用的表面等离子体共振(spr)分析。在存在免疫前血清(肝素和pi)、无血清(肝素)或α-nhba-弗氏免疫后血清(肝素和α-nhba)的情况下重组nhba与肝素结合的spr分析的代表性传感图。反应单位是由于传感器芯片上随时间的质量变化而产生的任意单位。时间以秒表示。
37.图7.nhba序列特征和表达。(a)显示了淋病奈瑟菌(ng)菌株1291nhba和脑膜炎奈瑟菌(nm)菌株mc58 nhba蛋白的示意图，其中脂盒基序(灰色框)和甘氨酸片段(黑色框)显示在n末端，并且富精氨酸区(白色框)显示在nhba的中心区域。每种蛋白质的氨基酸(aa)长度显示在右侧。(b)在macvector中使用clustalw将ng和nm nhba蛋白比对，并且将相同的氨基酸显示为深灰色垂直线，错配显示为浅灰色线，空位显示为白色。显示了ng和nm nhba蛋
白(加框)中富精氨酸区的氨基酸序列及其侧翼序列，其中相同的氨基酸呈灰色阴影，错配显示为白色。显示了富arg区上游的脑膜炎球菌nalp的切割位点，以及人乳铁蛋白(hlf)、激肽释放酶(hkl)和c3转化酶。(c)使用多克隆抗nhba抗体进行的在37℃生长的淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba敲除(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株的全细胞裂解物的蛋白质印迹。还显示了在32℃与37℃下生长的wt中nhba表达的上调。ngag_01228的周质蛋白显示为上样对照。(d)在32℃和37℃下生长的淋病奈瑟菌wt、δnhba和δnhba_c菌株的全细胞的流式细胞术，其中使用多克隆抗nhba抗体证实nhba在细胞表面上的表达。阴性(-ve)对照是wt，其中仅使用二级抗体。这些值代表几何平均荧光。
38.图8.淋球菌nhba涉及细胞聚集。(a)在gc肉汤中的淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba敲除(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株的生长和沉降曲线，其中在600nm的光密度下测量吸光度。(b)每ml的在胰蛋白酶消化之前和之后的od
600 1培养物的淋病奈瑟菌集落形成单位(cfu)。在胰蛋白酶处理之后，wt和δnhba_c菌株的可数cfu分别增加了2.6和2.4倍(p＝8.1x10-5
和5.1x10-4
)，而δnhba cfu未受影响(p＝0.31)。对于a和b；相对于wt，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。(c)重组nhba
ng
与全细胞淋病奈瑟菌(ng)结合的流式细胞术分析(黑色-仅ng；白色-ng 标记的nhba
ng
)。(d)显示nhba
ng
与淋病奈瑟菌的结合的全细胞elisa滴定曲线(黑线)。仅抗体的对照曲线(虚线)指示在全细胞淋病奈瑟菌和his标签抗体之间不存在非特异性相互作用。
39.图9.淋球菌nhba涉及微菌落形成。菌株在玻璃面(上图)或在载玻片上的人尿道上皮细胞单层(下图)上生长5小时的淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba敲除(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株的扫描电子显微镜检查。对于wt和δnhba_c菌株可见聚集体和微菌落，而δnhba菌株则被视为单菌落或双球菌。以5,000的放大倍数采集图像，每个框底部的比例尺代表5μm。
40.图10.淋球菌nhba与几种具有高亲和力的聚糖结合。nhba
ng
与(a)糖基氨基聚糖(gag)和(b)非gag聚糖结合的表面等离子体共振(spr)分析。显示了每种聚糖的名称、结构和硫酸化模式(s)，以及nhba
ng
与每种聚糖结合的解离常数(kd)。*还显示了nhba
nm
相互作用的kd[14]，使得能够比较。nhba
nm
对β-glc6p具有更高的亲和力(k
d 0.056 /-0.025μm)。nb
–
无浓度依赖性结合。
[0041]
图11.淋球菌重组nhba与上皮细胞结合。(a)在nhba
ng
与宫颈上皮细胞(tcx)结合的40倍放大下获得的共聚焦荧光图像。细胞的(i)扩展焦点和(ii)xyz横截面。(iii)仅抗体处理的细胞(无重组nhba)和(iv)用nhba
ng
和二级抗体处理的细胞的对照图像。白色箭头指示定位在细胞表面上的蛋白质。(b)重组nhba
ng
与人宫颈(tcx)和尿道(tuec)上皮细胞结合的流式细胞术分析。
[0042]
图12.淋球菌nhba有助于在人血清中存活和粘附于人上皮细胞。(a)淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba敲除(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株在10％(v/v)正常人血清中60分钟之后的存活率。数据代表作为接种物的百分比的一式三份样品的平均存活百分比，其显示为相对于wt(对于野生型的结果，设定为100％，为5.5x104个菌落形成单位(cfu))。在不存在肝素或存在肝素的血清中的wt的存活率之间没有显著差异。(b)淋病奈瑟菌以及淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba
ng
敲除(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株对人宫颈(tcx)和人尿道(tuec)上皮细胞的粘附。(c)淋病奈瑟菌1291野生型(wt)与未处理(无处理)或用重组
nhba
ng
(1-100μg/ml)或pna作为阴性对照(100μg/ml)预处理的tcx细胞的粘附。数据代表作为接种物的百分比的一式三份样品的平均粘附或侵入百分比，其显示为相对于wt(对于wt的结果，设定为100％，其为(b)1.1x105(tcx)和1.7x105(tuec)，(c)6.5x104粘附cfu)。误差条代表 /-1个标准差。相对于未处理的wt，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，使用双尾学生t检验。在至少三种情况下进行实验，并显示了具有代表性结果。
[0043]
图13.淋球菌nhba的保守性。显示了淋病奈瑟菌(ng)的八种最常见nhba变体的比对，其中共有序列在顶部。还包括来自菌株mc58的脑膜炎奈瑟菌(nm)nhba序列(nhba-3)。
[0044]
图14.在淋病奈瑟菌中的nhba表达。
[0045]
(a)淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba::kan突变体(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株的全细胞裂解物的考马斯染色的sds-page和蛋白质印迹分析，其中用α-nhba和α-ngag01228抗体进行探测。图1c中所示的蛋白质印迹的区域是加框的。(b)淋病奈瑟菌1291wt、nhba和nhba_c菌株的菌毛蛋白制剂的考马斯染色的sds-page和蛋白质印迹分析，其中用α-c311菌毛蛋白抗体进行探测。(c)淋病奈瑟菌1291wt、nhba和nhba_c菌株的肌氨酰外膜蛋白(omp)制剂的考马斯染色的sds-page，其中显示主要的omp，包括不透明(opa)蛋白和孔蛋白(por)蛋白。(d)淋病奈瑟菌1291wt、δnhba和δnhba_c菌株的脂低聚糖(los)制剂的银染色的sds-page凝胶。(e)在32℃和37℃下生长的淋病奈瑟菌1291野生型(wt)的全细胞裂解物的考马斯染色的sds-page和蛋白质印迹分析，其中用α-nhba进行探测。图1c中所示的蛋白质印迹的区域是加框的。
[0046]
(f)在具有α-nhba的情况下在32℃和37℃下生长的淋病奈瑟菌wt、δnhba和δnhba_c菌株的全细胞的流式细胞术。阴性(-ve)对照是wt，其中仅使用二级抗体。这些值代表几何平均荧光。
[0047]
图15.淋球菌nhba涉及细胞聚集。(a)未用胰蛋白酶处理('
‑’
；上图)或用胰蛋白酶处理(' ’；下图)的淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba::kan突变体(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株的革兰氏染色。(b)未用胰蛋白酶处理的(-)和用胰蛋白酶处理的( )全细胞淋病奈瑟菌1291wt的蛋白质印迹分析，其中用α-nhba和针对周质蛋白ngag_01228的抗体进行探测。
[0048]
图16.淋病奈瑟菌的聚糖结合。热图显示全细胞淋病奈瑟菌菌株1291与阵列上聚糖的结合(黑条)(来自三个独立实验的结果的平均值)。将聚糖基于它们各自的末端糖加以聚类。指示了每个类别中结合的聚糖的数量和百分比。聚糖结合的完整数据集显示在表4中。
[0049]
图17.淋病奈瑟菌1291的nhba蛋白的全长(上图)(seq id no:1)和c末端片段(下图)(seq id no:2)的氨基酸序列。
[0050]
图18.对于41个淋病奈瑟菌nhba变体的具有seq id no:2的c末端免疫原性片段的共有序列的氨基酸序列变异。
[0051]
图19.nhba的免疫原性。来自每只小鼠的免疫后血清的elisa滴度，所述小鼠经过用针对纯化的重组nhba的nhba-c-弗氏或nhba-c-白矾免疫。将五只小鼠中每只的滴度用符号显示，并且将几何平均滴度(gmt)用条形指示。
[0052]
图20.抗nhba抗体的血清杀菌活性(a，c)和(b)调理吞噬活性。(a，c)抗nhba血清的血清杀菌活性(sba)。显示了淋病奈瑟菌菌株1291在正常人血清作为补体来源和热灭活小
鼠血清的2倍稀释液的存在下的存活率。血清是：(a)抗nhba-c血清加佐剂(弗氏或白矾)，与无血清(0)和免疫前(pi)对照血清相比。还显示了“无补体”对照(nc)(仅用1/100稀释度的小鼠血清孵育的细菌)；或(c)从nhba-c-白矾血清纯化的抗nhba抗体。(b)抗nhba血清的调理吞噬活性(opa)。淋病奈瑟菌菌株1291在存在人多形核白细胞(pmn)、正常人血清和小鼠血清的情况下的存活率，如上文(a)所示。显示了“无补体”对照(nc)(仅用1/400稀释度的小鼠血清孵育的细菌)以及“仅pmn”对照(pmn)(用pmn但未用小鼠血清并且未用补体孵育的细菌)。对于a
–
c，数据代表相对于未处理的野生型菌株(0)获得的结果的一式三份样品的平均存活率(未处理的野生型，设定为100％，分别代表对于a
–
c的2.5x 103、1.6x 103和3.5x 103个菌落形成单位)。误差条代表
±
1个标准差。使用双尾学生t检验来比较相对于无血清(0)未处理的野生型的存活率；*，p《0.05**，p≤0.01，***，p≤0.001。还(c)使用单因素方差分析(方差分析；p《0.0001)和dunnett多重比较检验进行了统计分析(未处理的野生型对照组(0)相对于6.25或12.5，p》0.9；0相对于25、50或100μg/ml，p≤0.0001)。
[0053]
图21.淋病奈瑟菌在人血清中的存活率。显示了淋病奈瑟菌1291野生型(wt)和nhba敲除(δnhba)菌株在0-10％(vol/vol)人血清中30分钟之后的存活率。测试的人血清是用淋病奈瑟菌预先吸收以去除与淋病奈瑟菌交叉反应的任何抗体的正常人血清。将这种耗竭的血清用作血清杀菌活性(sba)和调理吞噬杀伤(opa)测定法中的补体源。数据代表相对于用未处理的菌株(0)获得的结果的一式三份样品的平均存活率(未处理的wt，设定为100％，代表2.8
×
103个菌落形成单位(cfu)；未处理的δnhba，设定为100％，代表2.5
×
103cfu)。进行了三次实验，并显示了具有代表性结果。使用双尾学生t-检验来比较相对于未处理对照的存活率，***，p≤0.001。相对于未处理(0)对照，wt在测试的血清中的存活率％没有显著差异。
[0054]
图22.抗nhba血清的血清杀菌活性(sba)。显示了淋病奈瑟菌菌株1291在正常人血清作为补体来源和热灭活小鼠血清的2倍稀释液的存在下的存活率。血清是抗nhba-c血清加白矾或抗nhba-c血清加白矾，其抗nhba抗体已耗竭。数据代表相对于未处理的野生型菌株(0)获得的结果的一式三份样品的平均存活率(未处理的野生型，设定为100％，代表3.3x103个菌落形成单位)。误差条代表
±
1个标准差。使用双尾学生t-检验来比较相对于显示为白色(0)的未处理野生型的存活率；*，p《0.05，***，p≤0.001。
[0055]
序列简述
[0056]
[0057]
具体实施方式
[0058]
本发明至少部分地基于发现来自淋病奈瑟菌的nhba的c末端片段显示出显著改进的针对淋球菌的免疫原性。用nhba蛋白片段进行免疫可以引发杀菌、调理吞噬的抗体，并且可以抑制淋球菌对粘膜上皮细胞的粘附。
[0059]
本发明的一个广泛的方面涉及淋病奈瑟菌的分离的奈瑟菌肝素结合抗原(nhba)蛋白的免疫原性片段，诸如包含seq id no:1中列出的氨基酸序列或其片段、变体或衍生物的免疫原性片段。
[0060]
淋病奈瑟菌(也称为淋病双球菌或淋球菌)是一类变形菌，可引起性传播泌尿生殖感染淋病，以及其他淋球菌相关疾病、病症和疾患，包括口咽淋病、直肠淋病、播散性淋球菌血症、淋球菌性化脓性关节炎和新生儿淋球菌性眼炎。如本文通常使用的，“淋病奈瑟菌”包括由本领域技术人员可鉴定的淋病奈瑟菌的所有菌株和血清型，并包括本文中描述的那些。淋病奈瑟菌还包括不同菌株的基因变体。人们可以通过本领域已知的许多方法确定目标生物是否为淋病奈瑟菌，所述方法包括对16s核糖体rna(rrna)基因的测序，如在chakravorty等人(2007)中针对淋病奈瑟菌所述，将其通过引用并入本文。
[0061]
脑膜炎奈瑟菌的奈瑟菌肝素结合抗原(nhba，以前称为gna2132)是4cmenb的组分，其以nhba-gna1030融合蛋白的形式存在(14)。脑膜炎球菌nhba(nhba
nm
)是一种表面暴露的脂蛋白，由三个区域组成-一个n末端区域(高达残基200-250)，预计其本质上是无序和未折叠的(15)；一个富精氨酸的中央区域，其与包括肝素、硫酸肝素和硫酸软骨素在内的聚糖结合(16-18)；以及一个c末端区域，其折叠为反平行β桶(15,19,20)。nhba
nm
相对良好地保守，尽管在不同的脑膜炎球菌菌株之间在n末端区域含有若干插入/缺失(15)。nhba
nm
诱导针对各种脑膜炎奈瑟菌菌株的血清杀菌抗体(17,21,22)，并且这些抗体也是调理吞噬的(23,24)，并且能够阻断脑膜炎奈瑟菌对上皮细胞的粘附(18)。nhba(nhba
ng
)的淋球菌同源物在淋病奈瑟菌菌株之间高度保守(》93％的同一性)，并且与4cmenb中的nhba-2肽变体共享67％的同一性(13,25)。本发明人最近表明，nhba
ng
是表面暴露的，并且被来自4cmenb疫苗接种者的抗体识别(13)。在seq id no:1中列出淋病奈瑟菌的nhba蛋白的一个实例。
[0062]
为了本发明的目的，关于“分离”，意指已从其自然状态中移出或以其他方式受到人工操作的材料。分离的材料可以基本上或实质上从通常在其自然状态中伴随其的组分游
离出来，或者可以将它操作为使其与通常在其自然状态中伴随其的组分一起处于人工状态。分离的材料可以是天然的、化学合成的或重组的形式。
[0063]
关于“蛋白质”，意指氨基酸聚合物。所述氨基酸可以是天然或非天然氨基酸，如本领域公知的d-或l-氨基酸。
[0064]
术语“蛋白质”包括并涵盖“肽”，典型地用于描述具有不超过五十(50)个氨基酸的蛋白质和“多肽”，典型地用于描述具有超过五十(50)个氨基酸的蛋白质。
[0065]“片段”是蛋白质的区段、结构域、部分或区域，其构成所述蛋白质的少于100％的氨基酸序列。
[0066]
一般而言，片段可包含具有至多10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、400个或425个氨基酸的氨基酸序列，诸如在seq id no:1中列出的全长nhba蛋白。
[0067]
在特定的实施方案中，分离的nhba蛋白的免疫原性片段包含分离的nhba蛋白的10个至250个氨基酸或由所述氨基酸组成，更优选15个至190个氨基酸，甚至更优选至多20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180个或185个氨基酸，诸如在seq id no:1或seq id no:2中列出。
[0068]
在某些实施方案中，所述免疫原性片段包含分离的nhba蛋白的c末端片段。如本文所用，如应用于nhba蛋白的术语“c末端片段”，通常可包含位于或包含nhba蛋白的c末端结构域中的至少约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205个或210个连续或连接的氨基酸。
[0069]
在一个具体实施方案中，免疫原性片段包含seq id no:2中列出的氨基酸序列、由所述氨基酸序列组成、基本上由所述氨基酸序列组成或被包含所述氨基酸序列内，其基本上包含nhba的细胞外或细胞外暴露的结构域。
[0070]
在另一个实施方案中，所述免疫原性片段包含分离的nhba蛋白的一个或多个聚糖或肝素结合残基和/或一个或多个活性位点残基。
[0071]
因而，免疫原性片段可包含对应于seq id no:2并构成seq id no:1的片段的nhba蛋白的细胞外或细胞外暴露的结构域的部分或全部，或者免疫原性片段可包括包含聚糖结合残基和/或其活性位点残基之一的这个细胞外或细胞外暴露的结构域序列的片段。
[0072]
在本发明的上下文中，如本文所用的术语“免疫原性的”指示当将蛋白质施用给动物时所述蛋白质产生或引发免疫应答(诸如对淋病奈瑟菌或其分子成分的免疫应答)的能力或潜力。设想免疫应答可以是b淋巴细胞或t淋巴细胞介导的，或者是它们的组合。有利的是，关于“免疫原性的”，意指能够引发b淋巴细胞应答，尽管不限于此。“免疫原性的”也可以表示能够引发中和抗体反应。
[0073]
关于“引发免疫应答”，意指产生或刺激免疫系统的一种或多种元素的产生或活动，所述免疫系统包括细胞免疫系统、抗体和/或天然免疫系统。适当地，免疫系统的一种或多种元素包括b淋巴细胞、抗体和中性粒细胞。在一个实施方案中，免疫应答是粘膜免疫应答。
[0074]
如本文所用，蛋白质“变体”与参考氨基酸序列共享可定义的核苷酸或氨基酸序列
关系。例如，参考氨基酸序列可以是氨基酸序列seq id no:1或seq id no:2。所述“变体”蛋白可以具有被缺失或被取代不同氨基酸的参考氨基酸序列的一个或多个氨基酸。本领域充分了解的是，在不改变免疫原性片段和/或蛋白质的活性的情况下，一些氨基酸可以被取代或缺失(保守取代)。因此，可以将seq id no:1或seq id no:2的一个或多个其他残基保守地修饰(例如通过氨基酸置换或缺失)，使得所述变体基本上保留seq id no:1或seq id no:2的免疫原性。优选地，蛋白质变体与参考氨基酸序列诸如seq id no:1或seq id no:2共享至少70％或75％，优选至少80％或85％或更多，或更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
[0075]
还设想了“野生型”或“未修饰”的nhba蛋白片段序列诸如seq id no:1或seq id no:2的序列的修饰，可以显著改善或增强免疫原性片段的免疫原性。举例来说，可以将免疫原性片段修饰为基本上匹配或对应于特定淋病奈瑟菌菌株的nhba蛋白序列，从而提高所述免疫原性片段对所述菌株的免疫原性，所述菌株诸如本文所述的那些。因此，术语“变体”还包括本文公开的分离的蛋白质或其片段，其由天然存在的(例如，等位基因)变体产生或包含所述变体的氨基酸序列；同源物(例如，来自淋病奈瑟菌以外的物种，诸如脑膜炎奈瑟菌)；和合成变体，诸如使用诱变技术在体外产生的变体。通常，修饰包括nhba蛋白片段的一个或多个氨基酸的取代。
[0076]
变体可以保留相应野生型蛋白质的生物活性(例如等位基因或菌株变体、旁系同源物和直向同源物，诸如在图18中描述的那些)或相比于相应野生型蛋白质可能缺乏或具有显著降低的生物活性。
[0077]
适当地，免疫原性片段包含seq id no:2的残基3、5、6、9、20、50、57、60、61、69、71、75、76、83、88、89、91、92、93、113、135、150、152、153、167、173、177、180和181或如图18所示的一个或多个氨基酸取代。在特定的实施方案中，一个或多个氨基酸取代选自下列各项组成的组：seq id no:2的残基3处的缬氨酸(v)氨基酸(a3v)；残基5处的甲硫氨酸(m)氨基酸(i5m)；残基6处的亮氨酸(l)氨基酸(p6l)；残基9处的丝氨酸(s)氨基酸(p9s)；残基20处的谷氨酸(e)氨基酸(g20e)；残基50处的丝氨酸(s)氨基酸(p50s)；残基57处的丝氨酸(s)氨基酸(r57s)；残基60处的丙氨酸(a)氨基酸(g60a)；残基61处的赖氨酸(k)氨基酸(e61k)；残基69处的缬氨酸(v)氨基酸(a69v)；残基71处的丙氨酸(a)氨基酸(t71a)；残基75处的丝氨酸(s)氨基酸(n75s)；残基76处的精氨酸(r)氨基酸(g76r)；残基83处的苏氨酸(t)氨基酸(m83t)；残基88处的丝氨酸(s)氨基酸(p88s)；残基89处的半胱氨酸(c)氨基酸(y89c)；残基91处的苏氨酸(t)氨基酸(s91t)；残基92处的精氨酸(r)氨基酸(g92r)；残基93处的丝氨酸(s)氨基酸(g93s)；残基113处的甘氨酸(g)氨基酸(s113g)；残基135处的天冬酰胺(n)氨基酸(t135n)；残基150处的天冬氨酸(d)氨基酸(g150d)；残基152处的缬氨酸(v)氨基酸(a152v)；残基153处的天冬氨酸(d)氨基酸(g153d)；残基167处的苏氨酸(t)氨基酸(a167t)；残基173处的丝氨酸(s)氨基酸(g173s)；残基177处的天冬氨酸(d)氨基酸(g177d)；残基180处的谷氨酸(e)氨基酸(d180e)；残基181处的谷氨酰胺(q)氨基酸(r181q)；其任何组合。
[0078]
在一个特定实施方案中，变体蛋白或肽可包含一个或多个残基，诸如在其n和/或c末端的赖氨酸残基。所述多个赖氨酸残基(例如，聚赖氨酸)可以是赖氨酸残基的线性序列，或者可以是赖氨酸残基的支链序列。这些另外的赖氨酸残基可促进肽溶解度的增加。
[0079]
本文通常用于描述对应的蛋白质和核酸之间的序列关系的术语包括“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。由于对应的核酸/蛋白质可能各自包含(1)仅由核酸/蛋白质共享的完整核酸/蛋白质序列的一个或多个部分，以及(2)在核酸/蛋白质之间发散的一个或多个部分，因此序列比较通常通过比较在“比较窗口”上的序列来鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指通常由6、9或12个连续残基组成的概念区段，将其与参考序列进行比较。为了对应序列的最佳比对，比较窗口可以包含与参考序列相比约20％或更少的添加或缺失(即空位)。通过计算机化的算法实现(intelligenetics的geneworks程序；在wisconsin genetics软件包7.0版中的gap、bestfit、fasta和tfasta，genetics computer group，575science drive madison，wi，usa，通过引用并入本文)或通过检查和通过选择的各种方法中的任何一种生成的最佳比对(即在比较窗口上产生最高同源性百分比)，可以进行用于比对比较窗口的序列的最佳比对。也可以参考blast系列程序，例如由altschul等人，1997，nucl.acids res.25 3389所公开的，将其通过引用并入本文。序列分析的详细讨论可以在ausubel等人编辑的current protocols in molecular biology的19.3单元中找到(john wiley&sons inc ny，1995-1999)。
[0080]
术语“序列同一性”在其最广泛的意义上在本文中使用，以包括精确核苷酸或氨基酸匹配的数量，同时考虑到使用标准算法的适当比对，同时考虑到序列在比较窗口上相同的程度。因而，通过以下方式计算“序列同一性百分比”：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定在其上相同的核酸碱基(例如，a、t、c、g、u)存在于两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目，将所述匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数(即，窗口大小)，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比。例如，“序列同一性”可以理解为表示通过dnasis计算机程序(windows版本2.5；可以获自hitachi software engineering co.，ltd.，south san francisco，california，usa)计算的“匹配百分比”。
[0081]
本发明还提供了本文公开的免疫原性片段的衍生物。适当地，免疫原性片段包含seq id no:2中列出的氨基酸序列。
[0082]
如本文所用，“衍生物”是已经被改变的分子，诸如蛋白质、或其片段或变体，所述改变方式为本领域所理解的，例如，通过与其他化学部分缀合或络合，通过翻译后修饰(例如磷酸化、乙酰化等)、糖基化修饰(例如添加、去除或改变糖基化)、脂质化和/或包含另外的氨基酸序列。一种特定的衍生物是通过将免疫原性片段与白喉毒素(dt)缀合而获得。这可以通过添加c末端半胱氨酸残基而得以促进。
[0083]
另外的氨基酸序列可包括产生融合蛋白的融合伴侣氨基酸序列。举例来说，融合伴侣氨基酸序列可有助于检测和/或纯化分离的融合蛋白。非限制性实例包括金属结合(例如多组氨酸)融合伴侣、麦芽糖结合蛋白(mbp)、蛋白a、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、荧光蛋白序列(例如gfp)、表位标签，诸如myc、flag和血凝素标签。
[0084]
其他另外的氨基酸序列可以是载体蛋白的氨基酸序列，所述载体蛋白诸如白喉类毒素(dt)或其片段，或crm蛋白片段，诸如在国际公开wo2017/070735中所述。在特定的实施方案中，本文所述的免疫原性片段或分离的蛋白质与载体蛋白缀合、偶联或以其他方式连接。
[0085]
本发明所设想的其他衍生物包括但不限于对侧链的修饰，在肽或蛋白质合成过程
中掺入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用交联剂和其他方法，所述方法对本发明的免疫原性蛋白、片段和变体施加构象约束。
[0086]
在这方面，技术人员参考coligan等人编辑的current protocols in protein science第15章(john wiley&sons ny 1995-2008)关于与蛋白质的化学修饰有关的更广泛的方法。
[0087]
在相关方面，本发明提供了一种分离的蛋白质，其包含淋病奈瑟菌的nhba的一种或多种免疫原性片段。适当地，分离的蛋白质不是淋病奈瑟菌的全长或野生型nhba。
[0088]
在一个特定的实施方案中，本发明设想了分离的蛋白质，其包含本文所述的多个免疫原性片段，诸如呈“多胞形”蛋白质的形式。例如，所述免疫原性片段可以单独存在或作为重复序列存在，其还包括串联重复片段。在所述分离的蛋白质中存在的一种或多种免疫原性片段之间还可以包括异源氨基酸序列(例如，“间隔物”氨基酸)。
[0089]
在一个另外的实施方案中，本方面的发明提供了一种分离的蛋白质或肽，其由以下组成：(i)本文所述的免疫原性片段或其区段、结构域、部分或区域(例如，其表位或抗原决定簇)，并且包括其片段、变体或衍生物；和(ii)任选地一个或多个另外的氨基酸序列。在这方面，另外的氨基酸序列优选是异源氨基酸序列，其可以在前述蛋白质的叙述的氨基酸序列的n-和/或c-末端，尽管对其没有限制。
[0090]
可以通过本领域已知的任何手段产生本文所述的免疫原性片段和/或分离的蛋白质，包括其片段、变体和衍生物，所述手段包括但不限于化学合成、重组dna技术和产生肽片段的蛋白水解切割。
[0091]
化学合成包括固相和溶液相合成。这样的方法是本领域公知的，尽管参考了化学合成技术的实例，所述实例如提供在nicholson编辑的synthetic vaccines第9章(blackwell scientific publications)以及coligan等人编辑的current protocols in protein science第15章(john wiley&sons，inc.ny usa 1995-2008)中。在这方面，还参考了国际公开wo 99/02550和国际公开wo 97/45444。
[0092]
可以由本领域技术人员方便地制备重组蛋白，其中使用标准方案，例如在sambrook等人的molecular cloning.a laboratory manual(cold spring harbor press，1989)，尤其是第16和17节；ausubel等人编辑的current protocols in molecular biology(john wiley&sons，inc.ny usa 1995-2008)，尤其是第10和16章；以及coligan等人编辑的current protocols in protein science(john wiley&sons，inc.ny usa 1995-2008)，尤其是第1、5和6章中所述。通常，重组蛋白的制备包括编码蛋白质的核酸在适合的宿主细胞中的表达。
[0093]
在另一方面，本发明设想了分离的核酸，其编码核酸序列或与所述核酸序列互补，所述核酸序列编码本文公开的免疫原性片段和分离的蛋白质或者包含与其互补的核苷酸序列。
[0094]
可以容易地根据nhba的完整基因组核酸序列推导出编码本发明的分离的免疫原性蛋白、分离的免疫原性片段、变体、衍生物和多胞形的核苷酸序列。
[0095]
这个方面还包括所述分离的核酸的片段、变体和衍生物。
[0096]
如本文所用的术语“核酸”表示单链或双链dna和rna。dna包括基因组dna和cdna。rna包括mrna、rna、rnai、sirna、crna和自催化rna。核酸也可以是dna-rna杂交体。核酸包含
核苷酸序列，所述核苷酸序列通常包括包含a、g、c、t或u碱基的核苷酸。然而，核苷酸序列可以包括其他碱基，诸如肌苷、甲基胞嘧啶、甲基肌苷、甲基腺苷和/或硫尿苷，尽管对其没有限制。
[0097]
因此，在特定的实施方案中，分离的核酸是cdna。
[0098]“多核苷酸”是具有八十(80)个或更多个连续核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”具有少于八十(80)个连续核苷酸。
[0099]“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，例如，其被适当地标记，目的是检测rna或dna印迹中的互补序列。
[0100]“引物”通常是单链寡核苷酸，优选具有15-50个连续核苷酸，其能够退火到互补的核酸“模板”，并通过dna聚合酶诸如taq聚合酶、rna依赖性dna聚合酶或测序酶
tm
的作用以模板依赖性方式延伸。
[0101]
在一个实施方案中，本发明提供了编码本发明的分离的免疫原性片段或蛋白质的分离的核酸的变体。
[0102]
在一个实施方案中，核酸变体编码本发明的分离的蛋白质或免疫原性片段的变体。
[0103]
适当地，核酸变体与本发明的分离的核酸共享至少35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％、66％、67％、68％、69％，优选至少70％、71％、72％、73％、74％或75％，更优选至少80％、81％、82％、83％、84％或85％，甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％的核苷酸序列同一性。
[0104]
本发明还设想了诸如通过利用密码子序列冗余进行修饰的核酸。在更具体的实例中，可以修饰密码子使用，以便优化核酸在特定生物或细胞类型中的表达。
[0105]
本发明进一步提供了修饰的嘌呤(例如，肌苷、甲基肌苷和甲基腺苷)和修饰的嘧啶(例如，硫尿苷和甲基胞嘧啶)在本发明的分离的核酸中的用途。
[0106]
本领域技术人员将很好地理解，可以使用标准方案方便地制备本发明的分离的核酸，所述标准方案诸如描述于current protocols in molecular biology的第2章和第3章中的那些(ausubel等人编辑，john wiley&sons ny，1995-2008)。
[0107]
在又另一个实施方案中，互补核酸在高严格条件下与本发明的核酸杂交。
[0108]
本文使用“杂交(hybridise)和杂交(hybridisation)”来表示至少部分互补的核苷酸序列的配对，以产生dna-dna、rna-rna或dna-rna杂交体。通过碱基配对产生包含互补核苷酸序列的杂交序列。
[0109]
本文中使用的“严格性”是指温度和离子强度条件，以及在杂交过程中是否存在某些有机溶剂和/或洗涤剂。严格性越高，则在杂交核苷酸序列之间需要的互补水平就越高。
[0110]“严格条件”表示仅仅具有高频率互补碱基的核酸才会杂交的条件。
[0111]
严格条件是本领域公知的，诸如在上文ausubel等人的第2.9章和第2.10章中所述，将它们通过引用并入本文。熟练的收件人还将认识到可以操纵各种因素来优化杂交的特异性。最终洗涤的严格性的优化可用于确保高度的杂交。
[0112]
可以通过印迹技术来鉴定互补核苷酸序列，所述技术包括由此将核苷酸固定在基质(优选合成膜，诸如硝酸纤维素)上的步骤、杂交步骤和检测步骤，通常使用标记的探针或其他互补核酸。dna印迹用于鉴定互补的dna序列；rna印迹用于鉴定互补的rna序列。可以使
用斑点印迹和狭线印迹来鉴定互补的dna/dna、dna/rna或rna/rna多核苷酸序列。这样的技术是本领域技术人员公知的，并且在上文ausubel等人的第2.9.1页至第2.9.20页中已有描述。根据这样的方法，dna印迹涉及通过凝胶电泳根据大小分离dna分子，将大小分离的dna转移至合成膜，并使膜结合的dna与互补的核苷酸序列杂交。当在cdna或基因组dna文库中鉴定互补核酸时，诸如通过噬斑或菌落杂交过程，使用替代的印迹步骤。这个程序的其他典型实例描述于sambrook等人的molecular cloning.a laboratory manual(cold spring harbor press，1989)第8-12章中。
[0113]
用于检测与固定核酸杂交的标记核酸的方法是本领域从业者公知的。这样的方法包括放射自显影术、化学发光、荧光和比色检测。
[0114]
也可以使用核酸序列扩增技术分离、检测核酸和/或使其经受重组dna技术。
[0115]
适合的核酸扩增技术涵盖热法和等温法，是熟练的收件人公知的，并且包括聚合酶链反应(pcr)；链置换扩增(sda)；滚环复制(rcr)；基于核酸序列的扩增(nasba)、q-β复制酶扩增、重组酶聚合酶扩增(rpa)和解旋酶依赖性扩增，尽管对其没有限制。
[0116]
如本文所用，“扩增产物”是指通过核酸扩增生成的核酸产物。
[0117]
核酸扩增技术可以包括特定的定量和半定量技术，诸如qpcr、实时pcr和竞争性pcr，如本领域公知的。
[0118]
在另一方面，本发明提供了一种基因构建体，其包含：(i)本文所述的分离的核酸；或(ii)包含与其互补的核苷酸序列的分离的核酸。
[0119]
适当地，所述基因构建体是质粒、噬菌体、粘粒、酵母或细菌人工染色体的形式，或包含本领域公知的遗传成分。基因构建体可能适合于在细菌或其他宿主细胞中的分离的核酸的维持和增殖，以便通过重组dna技术进行操纵和/或本发明的核酸或编码蛋白表达。
[0120]
出于宿主细胞表达的目的，基因构建体是表达构建体。适当地，表达构建体包含与表达载体中的一个或多个另外的序列可操作连接的本发明的核酸。“表达载体”可以是诸如质粒之类的自主复制的染色体外载体，或整合到宿主基因组中的载体。
[0121]
关于“可操作连接”，意指所述另外的核苷酸序列相对于本发明的核酸而被定位，以便优选地启动、调节或以其他方式控制转录。
[0122]
调节性核苷酸序列通常将适用于用于表达的宿主细胞。对于各种宿主细胞，许多类型的适当的表达载体和适合的调控序列是本领域已知的。
[0123]
通常，所述一个或多个调节性核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。
[0124]
本发明设想了本领域已知的组成型或诱导型启动子。
[0125]
表达构建体还可包括编码融合伴侣(通常由表达载体提供)的另外的核苷酸序列，使得本发明的重组过敏蛋白表达为融合蛋白，如上文所述。
[0126]
在特定的实施方案中，所述基因构建体适合于施用给受试者，诸如人类。在优选的形式中，基因构建体适合于受试者(诸如人类)的dna疫苗接种。
[0127]
适当地，dna疫苗接种是通过一个或多个质粒dna表达构建体进行的。质粒通常包含病毒启动子(诸如sv40、rsv或cmv启动子)。可以包括内含子a，以提高mrna稳定性，从而增加蛋白质表达。质粒可以还包括多克隆位点、强的多腺苷酸化/转录终止信号，诸如牛生长
激素或兔β-球蛋白多腺苷酸化序列。质粒可还包含梅森-辉瑞(mason-pfizer)猴病毒顺式作用转录元件(mpv-cte)，同时具有或没有hiv rev增加的包膜表达。可以改善表达的另外的修饰包括增强子序列，合成内含子、腺病毒三联前导(tpl)序列的插入和/或对多腺苷酸化和/或转录终止序列的修饰。dna疫苗质粒的非限制性实例是pvac，可以从invivogen在商业上可获得。
[0128]
描述dna疫苗学的有用的参考文献是dna vaccines，methods and protocols第二版(methods in molecular medicine series的第127卷，humana press，2006)。
[0129]
在一个另外的方面，本发明提供了用本文所述的核酸分子或遗传构建体转化的宿主细胞。
[0130]
用于表达的适合宿主细胞可以是原核或真核的。例如，适合的宿主细胞可以包括但不限于哺乳动物细胞(例如hela、hek293t、jurkat细胞)、酵母细胞(例如酿酒酵母)、利用或不利用杆状病毒表达系统的昆虫细胞(例如sf9、粉纹夜蛾)、植物细胞(例如莱茵衣藻、三角褐指藻)或细菌细胞，诸如大肠杆菌。将基因构建体引入宿主细胞(无论是原核细胞还是真核细胞)是本领域公知的，例如描述于ausubel等人编辑的current protocols in molecular biology(john wiley&sons，inc.1995-2009)中，尤其是第9和第16章。
[0131]
在又另一个方面，本发明提供了产生本文所述的分离的免疫原性片段或分离的蛋白质的方法，所述方法包括：(i)培养上文所述的先前转化的宿主细胞；和(ii)从步骤(i)中培养的所述宿主细胞分离所述片段或蛋白质。
[0132]
可以由本领域技术人员方便地制备重组蛋白，其中使用标准方案，例如在sambrook等人的molecular cloning.a laboratory manual(cold spring harbor press，1989)，尤其是第16和17节；current protocols in molecular biology，ausubel等人编辑(john wiley&sons，inc.1995-2009)，尤其是第10和第16章；以及current protocols in protein science，coligan等人编辑(john wiley&sons，inc.1995-2009)，尤其是第1、第5和第6章。
[0133]
在一个另外的方面，本发明提供了一种抗体或抗体片段，其结合本文所述的的免疫原性片段或分离的蛋白质或是针对所述免疫原性片段或分离的蛋白质产生。
[0134]
适当地，所述抗体或抗体片段特异性地结合所述分离的免疫原性片段和/或蛋白质。
[0135]
在一些实施方案中，抗体可以降低、消除、抑制或压制淋病奈瑟菌的nhba与诸如gag、肝素、硫酸乙酰肝素和软骨素的一种或多种聚糖和/或底物分子的结合。在其他实施方案中，抗体可以降低、消除、抑制或压制淋病奈瑟菌在受试者中结合或粘附到细胞(诸如上皮细胞)上的能力。在进一步的实施方案中，抗体可以降低、消除、抑制或压制淋病奈瑟菌在受试者中诱导血清抗性的能力。在某些实施方案中，抗体诱导或介导淋病奈瑟菌细胞的补体依赖性裂解和/或调理吞噬杀伤。
[0136]
适当地，抗体或抗体片段特异性地结合包含seq id no:2中列出的氨基酸序列或其变体、片段或衍生物的分离的免疫原性肽。在一些实施方案中，抗体或抗体片段以比针对全长nhba蛋白产生的抗体显著更高的亲和力与在seq id no:2中包含的最小表位序列结合。在这种情况下，关于“显著更高的亲和力”，表示比在特定浓度的nhba蛋白至少高2、3、4、5、6、7、8、9倍或10倍的亲和力。
[0137]
抗体和抗体片段可以是多克隆的或单克隆的、天然的或重组的。抗体片段包括fc、fab或f(ab)2片段和/或可以包含单链fv抗体(scfv)。例如，根据分别在美国专利第5,091,513号、欧洲专利第239,400号或或winter&milstein，1991，nature 349:293的论文中描述的方法，可以制备这样的scfv。抗体还可以包括多价重组抗体片段，诸如双抗体、三抗体和/或四抗体，包括多个scfv，以及二聚化激活的半抗体(例如wo/2007/062466)。举例来说，可以按照在holliger等人的1993proc natl acad sci usa 90 6444中；或在kipriyanov的2009methods mol biol 562 177中描述的方法制备这样的抗体。适用于抗体生产、纯化和用途的公知的方案可以发现于例如coligan等人的current protocols in immunology的第2章(john wiley&sons ny，1991-1994)和harlow，e.&lane，d.antibodies:a laboratory manual，cold spring harbour，cold spring harbour laboratory，1988。
[0138]
产生多克隆抗体的方法是本领域技术人员公知的。例如，可以使用的示例性方案描述于例如上文的coligan等人的current protocols in immunology中和上文的harlow&lane，1988中。举例来说，可以针对纯化或重组的nhba蛋白或其免疫原性片段(例如，seq id no:2)在生产物种(诸如马)中产生多克隆抗体，然后随后在给药前纯化。
[0139]
可以使用标准方法或通过更近的对它的修改产生单克隆抗体，所述标准方法例如最初描述于&milstein，1975，nature 256，495的文章中，所述修改例如描述于上文的coligan等人的current protocols in immunology中，其中使来源于生产物种的脾脏或其他产生抗体的细胞永生化，所述生产物种已经接种了本发明的一种或多种分离的蛋白质、其片段、变体或衍生物。在某些实施方案中，单克隆抗体或其片段可以呈重组形式。如果单克隆抗体最初是由非人哺乳动物的脾细胞产生的，这对于“人源化”单克隆抗体或片段可能特别有利。
[0140]
本发明的抗体和抗体片段可能特别适合于本文所述的分离的免疫原性片段和/或蛋白质的亲和色谱纯化。例如，可以参考在上文的coligan等人的current protocols in immunology的第9.5章中描述的亲和色谱程序。
[0141]
在一些实施方案中，可以将抗体或抗体片段施用于哺乳动物以提供对淋球菌感染的“被动”免疫。
[0142]
在另一个实施方案中，结合本文所述的nhba的分离的免疫原性片段和/或蛋白质或者针对所述分离的免疫原性片段和/或蛋白质产生的抗体或抗体片段可用于检测细胞表面表达的nhba。
[0143]
本发明的某些进一步的方面和实施方案针对动物和更特别是人类中的淋球菌相关疾病、病症或疾患提供了预防、治疗和/或免疫的组合物和/或方法。
[0144]
在一个这样的方面，本发明在于用于预防或治疗淋球菌相关疾病、病症或疾患的组合物，所述组合物可以包含(i)一种或多种本文所述的免疫原性片段和/或蛋白质；(ii)本文所述的一种或多种分离的蛋白质；(iii)本文所述的一种或多种分离的核酸；(iv)本文所述的一种或多种基因构建体；和/或(v)一种或多种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段与如本文所述的那些免疫原性片段或分离的蛋白质结合或者针对所述免疫原性片段或分离的蛋白质产生，任选地连同药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
[0145]
关于“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”，意指可以安全地用于全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。根据特定的给药途径，可以使用本领域公知的各种
载体。这些载体可以选自包括下列物质的组：糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐诸如无机酸盐(包括氢氯化物、溴化物和硫酸盐)、有机酸诸如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐以及无热原水。
[0146]
描述药物上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用参考文献是remington’s pharmaceutical sciences(mack publishing co.n.j.usa，1991)，将其通过引用并入本文。
[0147]
在一个实施方案中，本发明的药物组合物是免疫原性组合物。更具体地说，免疫原性组合物适当地是疫苗。
[0148]
本文通常使用的术语“免疫”、“接种疫苗”和“疫苗”是指引发针对淋病奈瑟菌的保护性免疫应答，由此至少部分预防淋病奈瑟菌的后续感染或将其降低至最低限度的方法和/或组合物。
[0149]
因此，可以递送这样的组合物，目的是在向受试者给药后产生至少部分免疫，并且优选为保护性免疫，或用于产生针对淋病奈瑟菌细菌的免疫应答，优选保护性免疫应答，尽管对其没有限制。
[0150]
关于“保护性免疫”，意指这样的免疫水平，由此对一种或多种抗原的反应性足以导致所述抗原的快速结合和/或消除，因而至少部分地改善或预防随后在动物(诸如人类受试者)中的淋病奈瑟菌细菌感染。
[0151]
关于“保护性免疫应答”，意指足以预防或减轻在动物(诸如人类受试者)中的当前和/或未来淋病奈瑟菌细菌感染的严重程度、症状、方面或特征的免疫应答水平。
[0152]
在另一个具体实施方案中，免疫原性组合物包含本文公开的一种或多种用于受试者的被动免疫的抗体。
[0153]
适合的疫苗可以呈蛋白质疫苗的形式，特别是包含淋病奈瑟菌的nhba蛋白的一种或多种免疫原性片段，或其片段、变体或衍生物，如本文所述。
[0154]
通过前述可以理解，本发明的免疫原性组合物和/或疫苗可包括“免疫学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”。
[0155]
有用的载体在本领域是公知的，并且包括例如：甲状腺球蛋白；白蛋白，诸如人血清白蛋白；来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌的毒素、类毒素或毒素的任何突变体交叉反应物质(crm)；聚氨基酸，诸如聚(赖氨酸:谷氨酸)；流感；轮状病毒vp6、细小病毒vp1和vp2；乙型肝炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重组疫苗等。可替代地，可以使用载体蛋白或其他免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可以使用细菌毒素、类毒素或crm的t细胞表位。在这方面，可以参考美国专利第5,785,973号，将其通过引用并入本文。
[0156]“免疫学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”在其范围内包括水、碳酸氢盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水或盐水和/或本领域公知的佐剂。如本领域将理解的，“佐剂”表示由一种或多种物质组成的组合物，其增强疫苗组合物的免疫原性和有效性。
[0157]
优选地，为了引发免疫应答的目的，某些免疫剂可以与本文所述的免疫原性片段或分离的蛋白质组合使用或缀合。术语“免疫剂”在其范围内包括本领域公知的载体、递送剂、免疫刺激剂和/或佐剂。如本领域所理解的，免疫刺激剂和佐剂是指或包括一种或多种
增强组合物的免疫原性和/或有效性的物质。
[0158]
适合的佐剂或免疫刺激剂的非限制性实例包括角鲨烷和角鲨烯(或植物或动物来源的其他油类)；嵌段共聚物；洗涤剂，诸如源的其他油类)；嵌段共聚物；洗涤剂，诸如a，矿物油诸如drakeol或marcol，植物油诸如花生油；棒状杆菌来源的佐剂诸如短小棒状杆菌；丙酸杆菌来源的佐剂，诸如痤疮丙酸杆菌；牛分枝杆菌(卡介苗或bcg)；百日咳博德特菌抗原；破伤风类毒素；白喉类毒素；表面活性物质诸如十六胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、双十八烷基二甲基溴化铵、n,n-二十八烷基-n
′
,n
′
双(2-羟乙基丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和普卢兰尼克多元醇；多胺诸如吡喃、硫酸葡聚糖、聚ic卡波普；肽，诸如胞壁酰二肽及其衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬肽；油乳液；和矿物凝胶诸如磷酸铝、氢氧化铝或白矾；白细胞介素诸如白细胞介素2和白细胞介素12；单核因子诸如白细胞介素1；肿瘤坏死因子；干扰素诸如γ干扰素；诸如皂苷-氢氧化铝或quil-a氢氧化铝的组合；脂质体；和佐剂；分枝杆菌细胞壁提取物；合成糖肽诸如胞壁酰二肽或其他衍生物；阿夫立定；脂质a衍生物；硫酸葡聚糖；单独的deae-葡聚糖或连同磷酸铝一起；羧基聚亚甲基诸如卡波普的ema；丙烯酸共聚物乳液诸如neocryl a640(例如美国专利第5,047,238号)；油包水乳化剂，诸如montanide isa 720；脊髓灰质炎病毒、牛痘或动物痘病毒蛋白；或其混合物。
[0159]
关于亚单位疫苗，这种疫苗的实例可以用iscom配制，诸如在国际公开wo97/45444中所述。
[0160]
油包水制剂形式的疫苗的实例包括montanide isa 720，诸如在国际公开wo97/45444中所述。
[0161]
设想了用于生产疫苗组合物的任何适合的程序。例如，示例性程序包括描述于new generation vaccines(1997年，levine等人，marcel dekker，inc.new york，basel，hong kong)中的那些程序，将其通过引用并入本文。
[0162]
可替代地，疫苗可以呈核酸疫苗的形式，特别是dna疫苗。描述dna疫苗学的有用的参考文献是dna vaccines，methods and protocols第二版(methods in molecular medicine series的第127卷，humana press，2006)，将其通过引用并入本文。
[0163]
在一些实施方案中，本发明的分离的免疫原性蛋白和/或片段可以用作纯化形式的疫苗，其与免疫原性载体蛋白融合，或通过活疫苗递送系统表达，所述活疫苗递送系统包括减毒病毒、病毒样颗粒或减毒活细菌。
[0164]
在其他实施方案中，本发明的组合物和疫苗可以以减毒或灭活的细菌的形式施用于人类，所述细菌可以被诱导表达本发明的一种或多种分离的免疫原性蛋白或免疫原性片段。减毒细菌的非限制性实例包括沙门菌属物种，例如肠道沙门菌鼠伤寒变种或伤寒沙门菌。可替代地，可以减毒形式使用其他肠道病原体，诸如志贺菌属物种或大肠杆菌。通过灭活在芳香族氨基酸生物合成途径(alderton等人，avian diseases 35 435)中的基因，通过在芳香族氨基酸生物合成途径中的两个基因中(诸如在美国专利第5,770,214号中描述)或在其他基因诸如htra中(诸如在美国专利第5,980,907号中描述)或在编码外膜蛋白诸如ompr的基因中(诸如在美国专利第5,851,519号中所述)引入突变，已经构建了减毒的沙门菌菌株。
[0165]
在一个实施方案中，抗原组合物包含外膜囊泡(omv)。omv天然存在于革兰氏阴性
细菌中，是由蛋白质、脂质(主要是lps)和周质内容物组成的非复制球形纳米颗粒。适当地，omv可以从任何细菌物种的天然分泌或洗涤剂提取的外膜制备，所述细菌物种例如培养的奈瑟菌属物种的菌株(例如，淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌)或大肠杆菌。可以通过本领域已知的任何方法获得omv(参见例如，gerritzen等人.2017，biotech adv.35:565-574；semchenko等人.2017，infect immun 85(2)e00898-16)。在特定的实施方案中，可以用omv配制本公开的免疫原性片段和/或分离的蛋白质，用于表面暴露、非表面暴露、附着在omv上或不附着(即，简单混合)。免疫原性片段和/或分离的蛋白质和omv可以由革兰氏阴性细菌同时产生，使得omv与免疫原性片段和/或分离的蛋白质一起产生，所述免疫原性片段和/或分离的蛋白质加载到omv的表面上或腔内。可替代地，免疫原性片段和/或分离的蛋白质可以在omv产生之后附着到omv上，诸如通过使用与omv中的融合蛋白结合的抗原上的亲和力标签的共价附着(参见例如，alves等人，2015，acs appl.mater.interfaces，7(44):24963-24972)。更进一步地，免疫原性片段和/或分离的蛋白质可以在omv产生之后加载至omv内腔，或者在omv产生之后简单地与omv混合。具有本公开的免疫原性片段和/或分离的蛋白质的用作佐剂的示例性omv包括由任何革兰氏阴性细菌产生的omv，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌。进一步设想的是，可以将omv从其来源的细菌物种进行基因修饰，以便在从其来源的所述omv内单独地或与其他淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌抗原组合地表达nhba蛋白或上调其表达。
[0166]
所述蛋白质、肽、片段或融合蛋白的表达含有转运或免疫原性功能，并且可导致免疫原性蛋白、肽或片段在细胞质、细胞壁中产生，暴露在细胞表面上或以分泌形式产生。
[0167]
另一方面，本发明涉及一种引发针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌的免疫应答的方法，所述方法包括给受试者施用：一种或多种本文所述的免疫原性片段；本文所述的分离的蛋白质；本文所述的分离的核酸；本文所述的基因构建体；本文所述的宿主细胞；本文所述的抗体或抗体片段；和/或前述方面的组合物；从而引发免疫应答的步骤。
[0168]
适当地，所述方法在所述受试者中引发或增强免疫应答，以预防或预防性地或治疗性地治疗在所述受试者中的淋球菌相关疾病、病症或疾患。
[0169]
在相关方面，本发明提供了诱导针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌的免疫的方法，所述方法包括给受试者施用：本文所述的一种或多种免疫原性片段；本文所述的分离的蛋白质；本文所述的分离的核酸；本文所述的基因构建体；本文所述的宿主细胞；本文所述的抗体或抗体片段；和/或本文所述的组合物；从而诱导针对受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌的免疫的步骤。
[0170]
适当地，针对淋病奈瑟菌细菌的免疫应答或免疫可预防动物感染淋球菌相关疾病、病症或疾患。另外，本领域技术人员将理解，对于跨不同奈瑟菌物种的nhba蛋白，由于在蛋白质序列特别是c末端序列中观察到的同源性，所述方法还可用于对动物进行免疫，以对抗其他奈瑟菌物种，诸如脑膜炎奈瑟菌。
[0171]
在一个另外的方面，本发明在于治疗或预防受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染的方法，所述方法包括给受试者施用：本文所述的一种或多种免疫原性片段；本文所述的分离的蛋白质；本文所述的分离的核酸；本文所述的基因构建体；本文所述的宿主细胞；本文所述的抗体或抗体片段；和/或本文所述的组合物；从而预防或治疗受试
者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染的步骤。
[0172]
与前两个方面类似，所述方法也可用于治疗动物的另外的奈瑟菌物种，包括但不限于脑膜炎奈瑟菌。
[0173]
如本文所用，“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)是指在淋球菌或脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患已开始发展后改善其体征或症状的治疗干预。关于淋球菌或脑膜炎球菌相关的疾病、病症或疾患，术语“改善”是指治疗的任何可观察到的有益效果。治疗不一定绝对有益于受试者。可以使用本领域普通技术人员已知的任何方法或标准来确定有益效果。
[0174]
如本文所用，“预防(preventing)”(或“预防(prevent)”或“预防(prevention)”)是指在淋球菌或脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患的症状、方面或特征发作之前启动的行动过程(诸如施用包含治疗有效量的本发明的一种或多种免疫原性蛋白和/或其片段、变体或衍生物的组合物)，从而预防或减轻所述症状、方面或特征。应当理解的是，这样的预防不一定绝对地有益于受试者。“预防性”治疗是对没有表现出淋球菌或脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患的体征或仅表现出早期体征的受试者施用的治疗，目的是降低发生淋球菌或脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患的症状、方面或特征的风险。
[0175]
术语“治疗有效量”描述了一定量的指定的剂，诸如本文所述的分离的免疫原性片段、分离的蛋白质和抗体或抗体片段，其足以在用该剂治疗的受试者中达到预期效果。例如，这可以是包含本文所述的分离的免疫原性片段、分离的蛋白质和/或抗体或抗体片段的组合物的量，其对于减轻、缓解和/或预防包括淋球菌或脑膜炎球菌感染在内的淋球菌或脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患是必需的。在一些实施方案中，“治疗有效量”足以减轻或消除淋球菌或脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患的症状。在其他实施方案中，“治疗有效量”是足以达到期望的生物效应的量，例如，足以在受试者中引发保护性免疫应答从而抑制或预防淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的量。
[0176]
理想的是，剂的治疗有效量是足以诱导期望的结果而在受试者中没有引起实质性细胞毒性作用的量。用于减轻、缓解和/或预防淋球菌或脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患(诸如淋球菌感染或脑膜炎球菌感染)的剂的有效量将取决于被治疗的受试者、任何相关疾病、病症和/或疾患的类型和严重程度(例如，淋球菌或脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患的类型和/或淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌菌株)、以及治疗组合物的给药方式。
[0177]
在本发明的上下文中，关于“淋球菌相关疾病、病症或疾患”，意指任何淋球菌或淋病奈瑟菌感染，包括由这样的淋病奈瑟菌感染而引起的任何临床病理学，诸如上文所述的那些。
[0178]
另外，关于“脑膜炎球菌相关疾病、病症或疾患”，意指任何脑膜炎球菌或脑膜炎奈瑟菌感染，包括由脑膜炎奈瑟菌感染引起的任何临床病理学，诸如脑膜炎、皮疹、败血病、发热、恶心、呕吐和腹泻。
[0179]
在又另一方面，本发明提供了至少部分地抑制或防止淋病奈瑟球菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌结合或粘附至受试者中的细胞的方法，所述方法包括给受试者施用：本文所述的一种或多种免疫原性片段；本文所述的分离的蛋白质；本文所述的分离的核酸；本文所述的基因构建体；本文所述的宿主细胞；本文所述的抗体或抗体片段；和/或本文所述的组合物；从而抑制或防止淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌与受试者的细胞结合的步骤。
[0180]
应当理解的是，细菌粘附至宿主细胞是成功定殖宿主粘膜表面的初始步骤和先决条件。在特定的实施方案中，所述细胞是上皮细胞，诸如阴道上皮细胞、宫颈上皮细胞、子宫内膜上皮细胞、咽上皮细胞和尿道上皮细胞。
[0181]
在又另一个方面，本发明涉及至少部分抑制或降低受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染的血清抗性的方法，所述方法包括给受试者施用：本文所述的一种或多种免疫原性片段；本文所述的分离的蛋白质；本文所述的分离的核酸；本文所述的基因构建体；本文所述的宿主细胞；本文所述的抗体或抗体片段；和/或本文所述的组合物；从而抑制或降低受试者中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细菌感染的血清抗性的步骤。
[0182]
淋病奈瑟菌是全世界人类性传播疾病的常见原因。一小部分淋球菌感染可能导致严重的危及生命的并发症，通常称为播散性淋球菌感染(dgi)。毒力以及对正常人血清的补体依赖性杀菌作用的抗性(即，血清抗性)似乎与种革兰氏阴性双球菌密切相关。
[0183]
适当地，本发明的上述方法是在诸如哺乳动物的动物上进行的。在一个实施方案中，哺乳动物是人。
[0184]
应当理解的是，在上述五个方面的方法中用于施用的组合物可以包含，但不一定限于，本发明的一种或多种免疫原性片段和/或分离的蛋白质和/或者针对本文所述的免疫原性片段和/或分离的蛋白质产生的本发明的一种或多种抗体或抗体片段。因此，在某些实施方案中，这样的组合物可包含一种或多种抗体或一种或多种抗体片段，所述抗体或抗体片段可以结合诸如在seq id no:2中列出的nhba蛋白(例如，seq id no:1)的c末端片段或针对它们而产生。
[0185]
关于“施用”或“给药”，意指通过特定的选择途径将本文公开的组合物引入到受试者中。
[0186]
可以采用任何安全的给药途径为患者提供本发明的组合物。例如，可以采用口服、直肠、肠胃外、舌下、口腔、静脉内、关节内、肌内、真皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内、阴道内和透皮给药。
[0187]
剂型包括片剂、分散体、混悬液、注射剂、溶液、糖浆剂、糖锭剂、胶囊、鼻喷雾剂、栓剂、气雾剂、透皮贴剂等。这些剂型还可以包括专门为此目的设计的注射或植入控制释放装置或修改为以这种方式另外起作用的其他形式的植入物。治疗剂的控制释放可以通过包被它的方式而实现，例如，用包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸在内的疏水性聚合物以及某些纤维素衍生物诸如羟丙基甲基纤维素。另外，可以通过使用其他聚合物基质、脂质体和/或微球来实现控制释放。
[0188]
适合于口服或肠胃外给药的本发明组合物可以呈现为各自含有预定量的本发明的一种或多种治疗剂的离散单位，诸如胶囊、扁囊剂、功能性食品/饲料或片剂，呈现为粉末或颗粒或为在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液、水包油乳液或油包水液体乳液。可以通过任何药学方法制备这样的组合物，但所有方法都包括使一种或多种如上所述的剂与构成一种或多种必要成分的载体结合的步骤。一般而言，通过使本发明的剂与液体载体或微细固体载体或两者均匀并紧密地混合，随后在需要时使产物成型为期望的表现形式来制备所述组合物。
[0189]
可以将以上组合物以与剂量制剂相容的方式并且以这样的药学上有效的量施用。在本发明的上下文中，施用至患者的剂量应该足以随着适当的时期推移在患者中实现有益
的反应。有待施用的剂的量可以取决于被治疗的受试者，包括其年龄、性别、体重和一般健康状况，这些因素将取决于从业者的判断。
[0190]
在上述方法和组合物的特定实施方案中，免疫原性片段或分离的蛋白质可以与另外的免疫原性片段或蛋白质联合施用，后者来源于nhba蛋白或本领域已知的另外的淋病奈瑟菌或脑膜炎奈瑟菌的蛋白质，诸如表面表达的metq蛋白(semchenko等人，2017)、msrab、ania和在bexsero疫苗(gsk疫苗)中存在的这四种抗原成分(即因子h结合蛋白(fhbp)、奈瑟菌粘附素a(nada)、奈瑟菌肝素结合抗原(nhba)和来自新西兰流行菌株(menzb，其提供pora)的外膜囊泡)中的一种或多种。在这方面，可以包括本文所述的免疫原性片段或分离的蛋白质，作为针对淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的多抗原疫苗的成分。在一些实施方案中，nhba的免疫原性片段或分离的蛋白质以及其他免疫原性片段或蛋白质可以被提供为单一的嵌合肽。在这个实施方案中，本文所述的免疫原性片段或分离的蛋白质可以是其他免疫原性片段或蛋白质的n末端或c末端。
[0191]
在最后一个方面，本发明提供了检测从动物获得的生物样品中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的方法，所述方法包括使所述生物样品与本文所述的抗体或抗体片段接触从而检测所述生物样品中的淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌的步骤。适当地，检测了在生物样品中的一个或多个淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌细胞的细胞外表面上的nhba蛋白。
[0192]
在某些实施方案中，所述生物样品可以是病理学样品，其包含从动物获得的一种或多种流体、细胞、组织、器官或器官样品。非限制性实例包括血液、血浆、血清、淋巴细胞、尿液、粪便、羊水、宫颈样品、脑脊液、组织活检、骨髓、支气管肺泡灌洗液、痰液和皮肤。
[0193]
适当地，检测淋病奈瑟菌和/或脑膜炎奈瑟菌包括在抗体或抗体片段与nhba蛋白之间形成可检测复合物的步骤。可以通过本领域已知的任何技术、测定法或手段检测这样形成的复合物，包括免疫印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、免疫沉淀、elisa、流式细胞术、磁珠分离和基于生物传感器的检测系统诸如表面等离子体共振，尽管对其没有限制。
[0194]
为了便于检测，可以直接标记抗体，也可以使用标记的二级抗体。另外，可以直接标记小分子。
[0195]
标记物可以选自包括下列物质的组：色原体、催化剂、生物素、地高辛配基、酶、荧光团、化学发光分子、放射性同位素、药物、磁珠和/或直接视觉标记物。
[0196]
在直接视觉标记物的情况下，可以使用由胶体金属或非金属颗粒、染料颗粒、酶或底物、有机聚合物、胶乳颗粒、脂质体或其他含有信号产生物质的囊泡等制成的标记物。
[0197]
所述荧光团可以是例如异硫氰酸荧光素(fitc)、alexa染料、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritl)、别藻蓝蛋白(apc)、德克萨斯红、cy5、cy3或r-藻红蛋白(rpe)等，它们是本领域公知的。
[0198]
所述酶可以是辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(ap)、β-半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶，尽管对其没有限制。
[0199]
在一些实施方案中，可以在诸如由商业病理学实验室或在医院执行的“高通量”诊断测试或程序中执行检测方法。
[0200]
进一步理解的是，在表征动物中的淋球菌相关疾病、病症或疾患的疾病进展和/或严重程度方面，这样的淋病奈瑟菌的检测方法可能具有潜在的实用性。另外，这样的方法可
用于选择动物进行抗nhba治疗，诸如通过所谓的“伴随诊断”。
[0201]
如本文通常使用的，术语“患者”、“个体”和“受试者”在本文公开的治疗或组合物的任何哺乳动物接受者的背景下使用。因此，本文公开的方法和组合物可具有医疗和/或兽医应用。在优选的形式中，哺乳动物是人。本文所述的方法的一个或多个步骤可以在体外进行。
[0202]
为了使本发明能够被充分理解并产生实践效果，参考以下非限制性实施例。
[0203]
实施例
[0204]
实施例1
[0205]
简介
[0206]
最近几项进展支持开发淋球菌疫苗的可行性。最近一项观察性研究表明，针对密切相关的细菌脑膜炎奈瑟菌的疫苗，即脑膜炎球菌b外膜囊泡(omv)疫苗menzb，针对淋病奈瑟菌感染的有效性为31％[12]。一种较新的四组分脑膜炎球菌b疫苗4cmenb(以bexsero销售)含有menzb omv组分和三种重组蛋白抗原，已被证明其可诱导针对淋病奈瑟菌蛋白(包括nhba)的交叉反应性抗体[13]。
[0207]
在本实施例中，我们对淋病奈瑟菌中的nhba的序列变异和表达进行了详细分析，并研究了针对nhba
ng
产生的抗体的水平、类型和功能活性，以评价全长蛋白和蛋白质的c末端片段作为淋球菌疫苗候选物的潜力。
[0208]
结果
[0209]
nhba在淋病奈瑟菌中高度保守
[0210]
我们之前已经证明nhba在淋病奈瑟菌中是保守的[13]，在这里我们进一步检查了nhba在可用的淋球菌分离株和基因组序列中的序列变异。使用来自淋病奈瑟菌菌株1291的1281个核苷酸的nhba基因(编码427个氨基酸的nhba(图1a))，针对genbank中可用的淋球菌基因组进行blastn搜索，揭示了nhba存在于所有594个基因组中，其中核酸同一性为94.1％-100％。针对pubmlst数据库的相似blastn搜索揭示，在4,424个分离株中存在nhba基因，其中同一性为85.1％-100％。在该blast搜索中，与nhba不匹配的1,228个分离株也缺少注释的16s和porb基因，表明对于这些分离株可获得不完整序列。这证实了nhba在1960-2020年间从》60个不同的国家收集的一组在时间和地理上多样化的淋球菌菌株中广泛分布和高度保守。
[0211]
截至2020年4月6日，在pubmlst数据库中具有注释的nhba蛋白的3,546个淋病奈瑟菌分离株中，有42个独特的nhba_肽变体。这些变体共享97.5％-100％的氨基酸同一性。有两个主要的nhba变体存在于70.3％的pubmlst分离株中：nhba-542(存在于39.7％的菌株中，包括淋病奈瑟菌1291)和nhba-475(存在于30.4％的菌株中，包括淋病奈瑟菌who p和who x)。总体而言，14个主要nhba变体中的一个存在于97.8％的分离株中，而其余28个nhba肽变体很少见，存在于1-10个分离株中(表5)。这14个最常见的变体的比对表明，n末端和c末端具有最高水平的保守性，其中在富精氨酸区上游存在可变的中心区域(图1b，将变体按丰度递减的顺序排列)。这些nhba变体的系统发育相关性如图1c中所示，并且在随后的测定法中使用了代表nhba多样性的一组菌株。鉴于c末端的序列保守性(图1b)，已经表征了脑膜炎球菌nhba c末端区域的结构[15，19，20]，并且c末端区域更有可能暴露于和可接触到疫苗诱导的抗体，我们将随后的研究重点放在重组全长nhba和c末端nhba片段(nhba-c)上(图
1a)。
[0212]
重组全长nhba和c末端nhba片段具有免疫原性并且诱导识别来自一系列淋球菌菌株的nhba变体的抗体
[0213]
为了检查淋球菌nhba的免疫原性，通过elisa和蛋白质印迹评估来自用重组全长nhba加弗氏佐剂或nhba-c片段加弗氏或氢氧化铝(白矾)免疫的小鼠的血清。使用全细胞elisa，我们表明nhba和nhba-c小鼠血清都可以检测到淋病奈瑟菌野生型(wt)和nhba互补(δnhba_c)菌株的表面上的天然nhba，其中nhba突变株(δnhba)的滴度显著降低(表1)。通过针对淋病奈瑟菌野生型全细胞裂解物和突变体的蛋白质印迹分析nhba抗血清，证实了抗血清特异性地识别nhba(图2a)。通过蛋白质印迹分析，证实了在一组淋病奈瑟菌菌株中的nhba的表达和nhba抗血清的交叉反应性(图2b)。nhba表达因菌株而异，在随后的测定法中使用高、中和低nhba表达子。
[0214]
用重组nhba进行的elisa指示了在用nhba免疫的小鼠中存在显性igg1同种型反应(表1)。然而，在不同制剂之间的同种型和亚型的比率不同，其中nhba-弗氏具有相比于nhba-c-弗氏(igg1》igm＝igg2b》igg2a》igg3)和nhba-c-白矾(igg1》igm》igg2b》igg2a》igg3)的较高的igg3水平，以及较低的igg2a和igg2b(igg1》igm》igg3》igg2b》igg2a)水平。总体而言，elisa和蛋白质印迹结果证实，淋球菌nhba具有免疫原性，并且抗nhba抗血清能够识别在表达不同的nhba变体的几种淋病奈瑟菌菌株的表面上的nhba。
[0215]
nhba抗体促进c3片段沉积
[0216]
为了研究nhba抗血清是否促进补体级联的活化，使用流式细胞术研究了淋病奈瑟菌表面上的c3片段沉积。测试了nhba-弗氏和nhba-c-弗氏的小鼠血清，以及从这些血清纯化的nhba特异性igg，所有这些都结合淋病奈瑟菌菌株1291，正如通过相对于免疫前血清或对照处理的细菌的平均荧光强度增加得以证明(图3a-b，上图)。与人补体加上全血清或纯化的igg一起孵育的细菌相对于仅补体对照显著增加了c3片段沉积(nhba分别增加了7.1倍和5.2倍；nhba-c分别增加了4.8倍和4.7倍；图3a-b，下图)。
[0217]
nhba抗体具有杀菌和调理吞噬活性
[0218]
分别使用血清杀菌活性(sba)和调理吞噬杀伤(opa)测定法测试了nhba和nhba-c抗体介导淋病奈瑟菌的补体依赖性裂解和调理吞噬杀伤的能力。测试了含有不同的nhba变体并且具有可变的nhba表达水平的五种淋球菌菌株。对于sba测定法，将淋病奈瑟菌与nhba或nhba-c小鼠血清一起孵育，然后添加活性的人补体来源并测量细菌存活率。nhba-弗氏和nhba-c-弗氏血清均以浓度依赖性方式引发血清杀菌活性，其中sba滴度的范围为100至1600(与免疫前血清滴度《50相比)(图20a；表2)。对于opa测定法，用nhba或nhba-c抗体调理并在人补体存在下孵育的淋病奈瑟菌以剂量依赖性方式杀伤人pmn，其中opa滴度的范围为100至6,400(与免疫前血清滴度《50相比)(图20b；表2)。针对用经常用于人类疫苗的佐剂白矾配制的nhba(nhba-c-alum)而产生的血清也诱导了淋病奈瑟菌的sba和opa杀伤，其中滴度与nhba-c-弗氏血清所看到的滴度相似(图20a、b；表2)。来自用nhba-c-白矾免疫的小鼠的纯化的nhba免疫球蛋白介导了浓度依赖性sba杀伤(图20c)。此外，在nhba-c-白矾血清中未见杀伤，所述血清的抗nhba抗体已经耗竭(图22)，证实了针对nhba的免疫应答的特异性。
[0219]
nhba抗体减少了nhba与肝素的结合以及淋球菌对宿主细胞的粘附
[0220]
为了研究nhba和nhba-c抗血清是否可以抑制nhba的功能作用，我们用重组nhba及
其预测的底物肝素在存在和不存在nhba抗血清的情况下进行了基于表面等离子体共振(spr)的竞争性结合实验。在不存在抗血清的情况下，淋球菌nhba结合肝素。免疫前血清对肝素与nhba相互作用的能力没有影响，但来自用全长nhba免疫的小鼠的血清使肝素结合降低了85.7％(p＝0.0001)(图4a；图6)。然而，nhba-c血清未能显著抑制肝素和nhba之间的相互作用(结合减少11％；p＝0.1)(图4a；图6)。
[0221]
淋球菌nhba是暴露在表面的[13]，并且很可能具有与脑膜炎球菌nhba相似的粘附素功能[18]。因此，我们研究了nhba和nhba-c抗血清是否可以减少淋球菌对人细胞的粘附。用具有与抗血清一起预孵育的淋病奈瑟菌的转化的宫颈(tcx)和尿道(tuec)上皮细胞，进行了体外感染测定法。相对于无抗体对照，nhba和nhba-c血清，而不是免疫前血清，能够以浓度依赖性方式降低对tcx和tuec两者的粘附。例如，1:20稀释的nhba血清使tcx和tuec细胞中的淋球菌粘附分别降低19倍和6倍。类似地，1:20稀释的cnhba抗血清使tcx和tuec细胞中的细菌粘附分别降低8倍和5倍(图4b-c)。
[0222]
讨论
[0223]
鉴于抗微生物药物耐药性淋病奈瑟菌的威胁，越来越需要鉴定和表征潜在的疫苗候选物，以帮助开发淋球菌疫苗。在这里，我们表征了淋球菌nhba，并表明它在地理和时间上多样化的淋病奈瑟菌菌株中广泛分布和保守，并且针对全长nhba或nhba的c末端片段而产生的抗体介导了杀菌和调理吞噬杀伤。这些抗体还可以降低淋病奈瑟菌对人上皮细胞的粘附，并抑制nhba的聚糖结合活性。目前尚无已知的淋病奈瑟菌保护相关性(在[9]中综述)，然而nhba通过两种常规免疫杀伤机制引发能够杀伤淋病奈瑟菌以及介导感染中重要阶段的功能阻断的抗体的能力，支持其用于淋球菌疫苗的潜力。
[0224]
淋球菌nhba是高度保守的，在迄今为止研究的淋病奈瑟菌菌株中具有≥97.5％的氨基酸同一性，并且大多数菌株表达有限数量的nhba变体之一(例如，70.3％表达两个主要变体之一，91.3％表达七个变体之一)。我们还表明，nhba表达在菌株之间是可变的，即使在表达相同的nhba变体的菌株之间也是如此(例如，who x和who p)。然而，我们表明，针对nhba变体542(来自淋病奈瑟菌菌株1291)而产生的抗血清具有交叉反应性，能够杀伤表达同源和异源nhba变体的菌株以及具有高、中和低nhba表达的菌株。淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌菌株含有不同的主要nhba变体[13]，但我们的发现与脑膜炎奈瑟菌nhba的发现一致，其中针对nhba-2(在4cmenb中发现)的抗体的免疫反应性见于99.5％的美国流行的菌株(442个菌株)中，不论其nhba变体如何[26]。
[0225]
当用弗氏或氢氧化铝作为佐剂时，nhba和nhba-c片段在小鼠中具有免疫原性。总体而言，在所有情况下均引发igg1显性抗体反应，尽管针对不同的抗原和佐剂组合观察到其他同种型和亚型的不同模式。此外，尽管nhba-c相比于全长nhba产生的总igg滴度更低，但它针对研究组中的大多数菌株引发相似或更高的sba和opa滴度。已知免疫球蛋白同种型和亚型在激活补体和介导杀菌和调理吞噬活性的能力方面不同，尽管这种能力在抗原靶点之间不同。例如，靶向脑膜炎奈瑟菌pora抗原的小鼠抗体具有igg3》》igg2b》igg2a》》igg1的血清杀菌活性和igg3》igg2b＝igg2a》》igg1的调理吞噬胞活性的分层[27]。同样，与氢氧化铝相比，当用弗氏时，针对淋病奈瑟菌抗原msra/b的小鼠抗体具有较高的igg2a、igg2b和igg3滴度，msra/b-弗氏抗血清(而不是msra/b-白矾抗血清)介导了淋病奈瑟菌的sba和opa杀伤[28]。我们的数据表明，igg2a和igg2b在抗nhba sba和opa介导的淋病奈瑟菌杀伤中起
主导作用，因为与nhba-弗氏相比，nhba-c-弗氏引发了更高总水平的这些抗体。此外，nhba-c-白矾引发了igg2b》igg2a》igg3，并介导了针对所有五个测试的淋球菌菌株的sba和opa。这与未引发igg2a、igg2b或igg3的msra/b-白矾不同，抗msra/b-白矾未介导淋病奈瑟菌的杀伤[28]。抗体水平和功能的这种差异可以是抗原特异的，或者可能与不同研究中使用的不同免疫剂量和方案有关(nhba在第0天、第21天、第28天和第42天25μg，msra/b在第0天、第21天和第28天5μg)。
[0226]
总体而言，我们描述了nhba的几个关键特征，这些特征支持其在淋球菌疫苗中用作抗原，并强调了使用nhba的c末端片段作为优化抗原的潜力，其可以单独使用，或以具有另一种抗原的融合蛋白的形式使用。
[0227]
方法
[0228]
细菌菌株和生长条件
[0229]
在本研究中使用了淋病奈瑟菌菌株1291、fa1090、who g、who p和who x。淋病奈瑟菌在含有1％(v/v)isovitalex(becton dickinson)的gc琼脂(oxoid)上在37℃或32℃同时具有5％co2的条件下生长。在测定法中使用的大多数淋球菌群体是有菌毛的并且表达不透明蛋白，正如通过使用相差显微镜检查对菌落进行目视检查确定的。
[0230]
序列分析
[0231]
将序列与macvector比对，并计算氨基酸同一性和相似性的百分比(blosum90，阈值0)。用macvector构建nhba变体的邻接系统发育树(最佳树，未校正(“p”))。截至2019年9月19日，使用基本局部比对搜索工具程序(blast)，利用针对在genbank中的594个淋球菌基因组的来自淋病奈瑟菌1291(genbank登录eeh61857.1；基因组位点标签ngag_00725)的nhba，以及在奈瑟菌多位点序列分型网站(pubmlst；https://pubmlst.org/neisseria/)中的5652个淋病奈瑟菌分离株，确定了在淋球菌菌株之间的nhba和编码的nhba蛋白的存在和保守性。使用先前建立的nhba(由neis2109编码)的pubmlst命名法，其中每个唯一肽序列被分配唯一标识号(例如，nhba_肽2[nhba-2]在4cmenb中，并且nhba_肽542[nhba-542]在淋病奈瑟菌菌株1291中)。
[0232]
淋病奈瑟菌nhba突变株的构建
[0233]
使用5'-atgtttaaacgcagtgtgattgc-3'(seq id no:3)和5'-tcaatcccgatcttttttgccggc-3'(seq id no:4)引物扩增淋病奈瑟菌1291nhba基因并克隆到pgem-t easy载体(promega)中。将卡那霉素抗性基因(puc4kan；amersham biosciences)插入到bamhi限制性位点中，其中用5'-ggatccccggccgagattccgctgattcc-3'(seq id no:5)和5'-ggatccgcgacctcctcgaccgtgcagaac-3'(seq id no:6)引物，使用反向pcr将所述位点引入到nhba开放阅读框的中间(用于将卡那霉素抗性基因亚克隆到nhba基因中而引入的bamhi限制酶位点以小写显示)。将nhba::kan构建体用ncoi线性化并转化到淋病奈瑟菌1291中，生成1291nhba::kan菌株(δnhba)。通过使用互补质粒pcts32将完整的nhba基因(使用5'-ggcatatggcggaaacaata-3'(seq id no:7)和5'-tcaatcccgatcttttttgccggc-3'引物(seq id no:8)扩增)引入到δnhba菌株中而生成互补菌株(δnhba_c)[29]。通过pcr和蛋白质印迹证实了nhba基因的成功缺失和随后的互补。
[0234]
重组蛋白表达
[0235]
先前描述了没有预测信号肽的全长重组nhba的克隆和表达[13]。为了表达nhba
(nhba-c)的c片段，用含有使用引物5'-attactcgagtcgcttccggccgagattcc-3'(seq id no:9)和5'-tgaaggatcccggcatcaacatcaatc-3’(在对应的引物中，xhoi和bamhi位点以小写显示)(seq id no:10)从淋病奈瑟菌1291扩增的cnhba的pet19b质粒转化大肠杆菌bl21(de3)。通过向od
600 0.4的培养物加入1mm iptg并在20℃孵育24小时来诱导表达。如前所述，使用talon亲和树脂(clontech)纯化蛋白质[13]。
[0236]
多克隆抗体的生成
[0237]
在第0天、第21天、第28天和第42天，将具有五只3周龄的雌性balb/c小鼠(animal resources center，wa，australia)的组用25μg的重组蛋白连同弗氏佐剂(merck)或氢氧化铝进行皮下免疫(alhydrogel；invivogen)。第56天收集终末出血，经由离心收集血清。在免疫接种前从每只小鼠收集免疫前血清。根据澳大利亚科学目的动物护理和使用守则(the australian code for the care and use of animals for scientific purposes)的建议进行这项研究，并得到格里菲斯大学动物伦理委员会(griffith university animal ethics committee，aec)的批准。
[0238]
使用重组nhba的亲和色谱法从小鼠血清纯化多克隆nhba抗体。使用制造商的说明将nhba与n-羟基琥珀酰亚胺基-4快速流动(merck)偶联，并与用pbs稀释1/2的小鼠血清一起孵育。用0.1m甘氨酸缓冲液(ph 3.0)洗脱结合抗体。使用amicon-ultra离心旋转装置(merck)将洗脱的样品缓冲交换到pbs中。用bca(thermo)确定抗体浓度。
[0239]
酶联免疫吸附测定(elisa)
[0240]
使用96孔maxisorp(nunc)板以一式三份进行elisa，所述板用在100μl包被缓冲液(0.5m碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，ph 9.6)中的100ng纯化的重组蛋白在室温下包被1小时，如前所述[13，30，31]。elisa滴度是最高血清稀释度，其中在450nm处的吸光度大于平均阴性(除了一级抗体外的所有试剂) 3个标准差。
[0241]
血清杀菌活性(sba)和调理吞噬杀伤(opa)测定法
[0242]
如前所述进行sba和opa测定法[30，31]。简言之，将淋病奈瑟菌的大约1x103个菌落形成单位(cfu)在37℃下在热灭活(56℃，60min)的抗nhba或免疫前小鼠血清的连续稀释液中孵育15min。通过加入补体源(用淋病奈瑟菌预吸收的10％(v/v)正常人血清[30])(图21)启动sba测定法，然后在37℃、5％co2下孵育30min。通过加入补体源和约1x105个多形核白细胞(pmn)启动opa测定法，然后在37℃、5％co2下孵育90min。将每个孔的内容物的连续稀释液在gc琼脂上进行平板接种并生长过夜。滴度是在测定法中诱导了超过50％杀伤的最高抗体稀释度。使用单因素方差分析(anova)和双尾学生t检验进行统计分析。每个实验进行三次，其中每个实验中一式三份样品。
[0243]
流式细胞术分析
[0244]
如前所述，使用流式细胞术测量与淋病奈瑟菌和c3片段沉积的抗体结合[28]。简言之，将淋病奈瑟菌1291(约1x10
7 cfu)用1:100稀释的热灭活小鼠血清或在hbss

(汉克平衡盐溶液，含有0.15mm cacl2和0.5mm mgcl2以及1％bsa(w/v))中的70μg/ml的纯化的nhba抗体一起预孵育。将抗体处理的细菌洗涤并与1:200稀释的alexa fluor 488缀合的抗小鼠igg(thermo)一起或与用淋病奈瑟菌预吸收的5％正常人血清一起在37℃下孵育15min，之后通过用1:200稀释的fitc缀合的抗人c3c抗体(biorad)孵育细菌来检测c3片段。使用cyan adp流式细胞仪(beckman coulter)获取数据，并使用flowjo进行分析。
[0245]
表面等离子体共振(spr)
[0246]
使用pall pioneer fe进行spr竞争测定法。如前所述[30]，在onestep测定构建器中，使用nextstep注射进行竞争测定法。将免疫前和免疫后nhba小鼠血清用作第一次注射(a)，肝素作为第二次注射(b)。将肝素(最大onestep浓度为50μm)与nhba的结合与具有血清或没有血清的情况并且与1:200稀释的免疫前或免疫后血清进行比较。使用pioneer软件包收集数据，并使用qdat分析软件进行分析。基于没有血清的肝素注射(注射a＝缓冲液；b＝肝素)相对于在血清存在下(注射a＝免疫前/免疫后血清；b＝肝素)减去血清(注射a＝免疫前/免疫后血清；b＝缓冲液)的肝素结合的相对rmax，计算出阻断百分比。
[0247]
上皮细胞粘附测定法
[0248]
如前所述[31]进行淋球菌粘附测定法，其中有以下修改。简言之，用大约1x10
5 cfu感染tcx和tuec细胞单层(在37℃下10min)，其中将细菌最初用连续稀释的热灭活小鼠血清在室温下预孵育30min。感染后，用温热的hbss洗涤细胞单层三次，以除去非粘附细菌和接种在gc琼脂平板上的孔内容物。将结果计算为来自三个重复孔的平均cfu，并表示为相对于无抗体对照的粘附细菌的百分比。用anova和双尾学生t检验进行统计分析。每个实验进行三次。
[0249]
表1.淋球菌nhba和nhba-c的免疫原性。
[0250][0251]
^全细胞淋病奈瑟菌1291野生型(wt)、nhba::kan突变体(δnhba)和互补(δnhba_c)菌株。
[0252]
表2.nhba和nhba-c小鼠血清针对五种淋球菌菌株的血清杀菌和调理吞噬滴度。
[0253][0254]
*通过用全细胞裂解物的蛋白质印迹的目视检查确定的nhba表达水平(参见图2b)。sba，血清杀菌活性滴度；opa，调理吞噬滴度(诱导超过50％杀伤的最低抗体稀释度的倒数)。在sba和opa测定中，针对淋病奈瑟菌菌株的免疫前血清滴度为《50。
[0255]
参考文献
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[0283]
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[0284]
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[0286]
31.semchenko,e.a.,day,c.j.&seib,k.l.metq of neisseria gonorrhoeae is a surface-expressed antigen that elicits bactericidal and functional blocking antibodies.infect immun 85(2017).
[0287]
实施例2
[0288]
淋球菌奈瑟菌肝素结合抗原(nhba)涉及微菌落形成并且有助于血清抗性和粘附于上皮细胞
[0289]
奈瑟菌肝素结合抗原(nhba)存在于被许可用于预防由脑膜炎奈瑟菌引起的侵袭性疾病的四组分脑膜炎球菌血清型b疫苗(4cmenb，商品名bexsero)中[9]，其与淋病奈瑟菌密切相关。nhba的淋球菌同源物在淋病奈瑟菌菌株中暴露在表面且高度保守(》93％的同一性)，与4cmenb中存在的脑膜炎球菌nhba变体2(nhba-2)共享67％的同一性[10]，并且被来自接种4cmenb疫苗的人的人血清识别[11]。
[0290]
脑膜炎球菌nhba在菌株mc58(表达nhba-3)中得到了最广泛的研究，其命名的基础为其经由富精氨酸区(arg-区)结合糖胺聚糖(gag)肝素的能力，nhba与肝素的结合增加了脑膜炎球菌的血清抗性[12]并且与硫酸乙酰肝素的相互作用介导了与上皮细胞的结合[13]。nhba结合其他几种聚糖，其中发现与硫酸软骨素的亲和力最高[14]。脑膜炎球菌nhba是几种蛋白酶的靶标，所述蛋白酶包括人乳铁蛋白[12]、激肽释放酶[15]和c3-转化酶[16]，以及脑膜炎球菌nalp[12]。nalp在富精氨酸区之后切割nhba，并且已经推测的是，表达nalp的脑膜炎奈瑟菌的高毒力菌株释放增加血管通透性的nhba片段[17]。nhba-2在较低温度(32℃与37℃)[18]下也具有增加的表达，并在生物膜形成中起作用[19]。淋球菌nhba尚未被表征，但淋病奈瑟菌不表达nalp[20]，并且其nhba具有截短的arg区[10]，表明它可以在淋病奈瑟菌中发挥相比于在脑膜炎奈瑟菌中的不同的作用。在本实施例中，我们检查了nhba在淋病奈瑟菌中的功能，以便描述其在发病机制中的作用并支持其作为淋球菌治疗靶点或疫苗候选物的潜在用途。
[0291]
方法
[0292]
序列分析
[0293]
用在macvector中的clustal比对nhba序列(淋病奈瑟菌1291登录eeh61857.1；脑膜炎奈瑟菌mc58 aaf42586.1)。使用针对nhba的pubmlst命名法，其中每个唯一肽序列被分配一个标识号(例如，nhba_肽542[nhba-542]在淋病奈瑟菌1291中)。
[0294]
淋病奈瑟菌的生长和表型表征
[0295]
淋病奈瑟菌1291在含有1％(v/v)isovitalex(becton dickinson)的gc琼脂(oxoid)或gc肉汤上在32或37℃同时具有5％co2的条件下培养。分别将卡那霉素(50μg/ml)和大观霉素(100μg/ml)用于敲除和互补菌株。大多数淋球菌群体是有菌毛的并且表达不透明蛋白，正如通过相差显微镜检查确定的。在gc肉汤中进行生长速率和凝集实验，每小时一次地测量在600nm处的光密度(od
600
)[21，22]。sds-page和蛋白质印迹分析也显示在这些菌株中下列物质的分子量和丰度相似：菌毛蛋白(与δnhba和δnhba_c相比，wt中的菌毛蛋白略少；图14b)、包括por和opa在内的主要外膜蛋白(图14c)和脂低聚糖(los)(图14d)。在有指示的地方，淋病奈瑟菌在0.25％胰蛋白酶中经历5min的胰蛋白酶消化，用于聚集分析。
[0296]
淋病奈瑟菌nhba突变株和重组nhba的构建
[0297]
从淋病奈瑟菌菌株1291扩增nhba基因(ngag_00725)(引物5'-atgtttaaacgcagtgtgattgc-3'(seq id no:3)；5'-tcaatcccgatcttttttgccggc-3'(seq id no:4))并克隆到pgem-t easy(promega)中。将卡那霉素抗性基因(puc4kan；amersham biosciences)插入到bamhi位点中，使用反向pcr(引物5'-ggatccccggccgagattccgctgattcc-3'(seq id no:5)；5'-ggatccgcgacctcctcgaccgtgcagaac-3'(seq id no:6)将所述位点引入到nhba的中间；bamhi位点加下划线)。将nhba::kan构建体线性化并转化到淋病奈瑟菌1291中，生成nhba::kan(δnhba)。使用互补质粒pcts32，通过将完整的nhba基因引入(引物5'-ggcatatggcggaaacaata-3'(seq id no:7)；5'-tcaatcccgatcttttttgccggc-3'(seq id no:8))到δnhba中，生成互补菌株(δnhba_c)[23]。通过pcr和蛋白质印迹证实了nhba基因的缺失和随后的互补。
[0298]
将淋病奈瑟菌1291nhba基因克隆到大肠杆菌bl21中的pet19b中，并如前所述表达和纯化全长成熟nhba(无信号序列)重组蛋白[11]。
[0299]
多克隆抗nhba的生成
[0300]
在第0天、第21天、第28天和第42天，将具有五只3周龄的雌性balb/c小鼠(animal resources center，western australia)的组用25μg的重组nhba连同弗氏佐剂(merck)进行皮下免疫。第56天收集终末出血，经由离心收集血清。本研究得到格里菲斯大学动物伦理委员会(griffith university animal ethics committee)的批准。
[0301]
蛋白质印迹、elisa和流式细胞术
[0302]
如前所述，使用小鼠抗nhba进行来自淋病奈瑟菌全细胞裂解物(使用4-12％bis-tris sds-page(thermo)解析)的nhba表达的蛋白质印迹分析[24]。使用兔抗ngag_01228来检测如前所述的周质蛋白[24]。
[0303]
根据标准方案，通过使用hrp缀合的his标签抗体(thermo)在室温下孵育30分钟之后，测量带有his标签的重组nhba与全细胞淋病奈瑟菌结合的elisa分析[11，25]。
[0304]
通过流式细胞术测量在淋病奈瑟菌表面上的nhba表达(如前所述[24，26])，其中细菌(约108cfu)与抗nhba(1:200，30分钟)一起孵育，用pbs洗涤三次，与alexa fluor 488缀合的抗小鼠igg一起孵育(1:200，1小时；thermo)，洗涤，然后固定在甲醛中(2.5％，15分钟)。在37℃下孵育20分钟之后，测量fitc标记的淋球菌nhba(100μg/ml)与淋病奈瑟菌(约107cfu)或人tcx和tuec细胞(约5x105个细胞)的结合。使用cyan adp流式细胞仪(beckman coulter)分析所有样品。使用flowjo执行数据分析。
[0305]
显微镜检查
[0306]
使用荧光显微镜检查来测量淋球菌nhba(100μg/ml)与tcx细胞(在玻璃盖玻片上培养至完全汇合)在37℃下孵育20分钟的相互作用。将细胞洗涤三次以除去未结合的蛋白质并固定在甲醛中(2.5％，15分钟)。使用抗nhba(1:1000)[11]和alexa fluor 488缀合的抗小鼠igg(1:200；thermo)检测nhba
ng
。将细胞用alexa fluor 568鬼笔环肽(thermo)和dapi核复染。使用prolong gold antifade mountant(thermo)将玻璃盖玻片封固在显微镜载玻片上，在nikon a1r共聚焦显微镜上捕获图像并使用nis元件(nikon)分析数据。
[0307]
使用与淋病奈瑟菌的约1x106cfu在37℃下孵育5小时的tuec细胞研究淋球菌微菌落形成。用三次(hbss)洗涤细胞单层以除去非粘附细菌，在2％戊二醛和5％甲醛溶液中固定30分钟，并按照先前所述进行扫描电子显微镜检查[27]，并使用jcm-5000 neoscope
tm
(jeol)捕获图像。
[0308]
聚糖结合分析
[0309]
如前所述，用重组nhba(1μg)和糖组学研究所聚糖阵列(institute for glycomics glycan array，v3.0)进行聚糖阵列实验[14，28]。在三个独立的重复中，将阳性结合分配给平均荧光》比调整后的背景(幻灯片背景的平均值 3个标准差)高出1倍的斑点(学生t检验p《0.001)。
[0310]
使用biacore t200仪器进行表面等离子体共振(spr)，其中重组nhba
ng
(100μg/ml)通过在s系列cm5传感器芯片(ge healthcare)上的胺偶联固定在流动池2-4上，如前所述[14，25]。流动池1用作参考池，并且仅用乙醇胺固定。使用单周期动力学来计算与聚糖在100μm至1nm之间的浓度下以1:5稀释序列运行的相互作用的亲和力(kd)。使用biacore t200软件2.0.2分析结果。
[0311]
正常人血清(nhs)存活测定法
[0312]
如前所述，测试淋病奈瑟菌对血清介导的杀伤的抗性[24]，在37℃下在10％(v/v)中约104cfu孵育60分钟，然后接种到gc琼脂平板上。在有指示的情况下，将细菌与6μm肝素预孵育30分钟。细菌存活率计算为相对于无处理对照的cfu百分比(来自三个重复孔的平均值)。
[0313]
粘附测定法
[0314]
如前所述，用具有约105cfu的e6/e7转化原代人宫颈(tcx)和尿道上皮(tuec)细胞进行淋球菌粘附测定法1小时[26]。在用重组淋球菌nhba(1-100μg/ml)或花生凝集素凝集素(pna 100μg/ml；不结合tcx细胞的阴性对照[26])预处理的细胞中，类似地进行粘附阻断测定法，然后用淋病奈瑟菌感染10分钟。结果报告为相对于野生型的粘附细菌百分比(来自三个重复孔的平均值)和被计算为相对于无处理对照的粘附细菌百分比的粘附阻断。在三个不同的场合以一式三份进行粘附和血清存活测定法，并用anova和学生t检验进行统计分析。
[0315]
结果
[0316]
淋球菌nhba的序列特征及表达
[0317]
由淋病奈瑟菌菌株表达的主要nhba变体是nhba-542，存在于pubmlst数据库中》40％的淋球菌分离株中，包括菌株1291[11]。nhba-542(本文中称为nhba
ng
)具有426个氨基酸长，并且含有与来自脑膜炎奈瑟菌菌株mc58(本文中称为nhba
nm
)的充分表征的nhba-3中
描述的序列特征相似的序列特征，包括n末端的脂盒基序和聚甘氨酸片段以及在所述蛋白质的中心区域中的富精氨酸区(图7a)。然而，由于插入/缺失，在nhba
ng
和nhba
nm
之间存在一些差异(图7b)。与nhba-3相比，淋球菌nhba基因的n末端一半具有63个氨基酸缺失，这在主要淋球菌变体中是一致的(图13)。与nhba
nm
相比，nhba
ng
的arg区被截短。这个区域在nm菌株之间[12]和在主要ng nhba变体之间是高度保守的(图13；显示的变体存在于3068个分离株中的94％中[11])。
[0318]
为了促进淋球菌nhba的表征，在大肠杆菌中生成了重组的带有his标签的蛋白(nhba-542)，并在小鼠中产生了多克隆抗nhba抗体。另外，通过将卡那霉素抗性盒插入到淋病奈瑟菌菌株1291(δnhba)中的nhba基因的开放阅读框中而生成nhba的等基因突变体，并且通过将nhba基因的单个拷贝重新引入到反式基因组(δnhba_c)中来补充这个突变体。全细胞裂解物的蛋白质印迹分析证实了nhba在野生型菌株中的表达，其中通过抗nhba血清检测到58-80kda之间的单个条带。互补菌株表达的nhba水平与野生型相似，而在突变株中未检测到nhba表达(图7c；图13)。还通过流式细胞术检测在全细胞淋病奈瑟菌wt和δnhba_c菌株的表面上的nhba(图7c)。淋病奈瑟菌菌株在32℃和37℃下生长到对数中期，揭示了淋球菌nhba的表达受到温度调节，其中在较低温度下观察到更高的表达(图7b和c，图14)。
[0319]
淋球菌nhba涉及细胞聚集和微菌落形成
[0320]
为了研究nhba
ng
在体外生长中的作用，用gc肉汤和琼脂培养淋病奈瑟菌菌株1291野生型、δnhba和δnhba_c菌株。所有菌株在光密度方面均具有相等的生长速率和最大生长水平，然而与wt和δnhba_c菌株相比，δnhba突变株具有显著降低的沉降速率(图8a)。此外，当将光密度均衡样品(od
600
＝1)接种到gc琼脂平板上时，与wt或δnhba_c菌株相比，δnhba菌株的活cfu数量大约高出三倍(图8b)。用胰蛋白酶处理这些样品导致对于所有三个菌株均衡的cfu计数(wt和δnhba_c可计数cfu分别增加2.6倍和2.4倍，而δnhba cfu未受影响)(图8b)，表明所述表型是由于细胞聚集而不是细胞分离缺陷所致。对三种染色加/减胰蛋白酶处理的革兰氏染色分析证实了在未处理的wt和δnhba_c菌株中细胞聚集体的存在(图15a)。此外，蛋白质印迹分析表明，胰蛋白酶处理消化了来自细菌表面的nhba，但没有改变周质对照蛋白(图15b)。根据这一发现，调整了后续实验中使用的δnhba样品的体积以平衡cfu数。淋球菌菌毛蛋白和不透明蛋白先前已与细菌聚集体的形成有关，相差显微镜检查证实wt、δnhba和δnhba_c菌株在菌毛生成和不透明方面共享相同的菌落形态。
[0321]
为了确定nhba
ng
是否直接与淋球菌表面相互作用以促进聚集，我们使用了用重组nhba
ng
的流式细胞术和elisa。流式细胞术分析显示fitc标记的重组nhba
ng
与全细胞淋病奈瑟菌结合(图8c)。使用全细胞elisa证实这一点，其中重组nhba
ng
以浓度依赖性方式结合淋病奈瑟菌(图8d)。
[0322]
为了进一步研究nhba在细菌-细菌相互作用和淋球菌聚集体形成中的作用，我们检查了δnhba形成微菌落的能力。与wt或δnhba_c菌株不同，δnhba菌株在生长5小时后不能在玻璃盖玻片或人尿道上皮单层的表面形成微菌落(图9)。还进行了生物膜测定法，以研究nhba
ng
的自关联属性是否在淋球菌生物膜的建立中起作用。然而，在24-26小时的静态条件下，对于wt、δnhba和δnhba_c菌株观察到在生物膜形成方面没有差异(未显示数据)。
[0323]
nhba
ng
以高亲和力与几种聚糖结合
[0324]
使用聚糖阵列分析确定淋球菌nhba的聚糖结合谱，这些阵列显示368种代表在人
细胞上发现的聚糖的结构(包括具有相似结构但在链长、化学连接或间隔大小上不同的异构体和/或聚糖)。nhba
ng
与阵列上的39个聚糖结构结合(图16；表4)，包括gag肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素。nhba
ng
还结合含有乳糖-n-二糖和n-乙酰基乳糖胺核心结构(即，lnnt)的多种结构，包括它们的唾液化和岩藻糖基化变体(即，slex)，以及有限的一组n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺、葡萄糖基和甘露糖基聚糖。
[0325]
为了表征重组nhba
ng
与聚糖相互作用的动力学，使用结合在阵列上的选定gag(图10a)和非gag聚糖(图10b)进行spr分析。在所有测试的nhba
ng-聚糖相互作用中，计算的最高亲和力是与肝素(kd4.4 nm)的亲和力，其次是硫酸软骨素(k
d 73nm)。gag结构是高度异质的，由具有各种硫酸化模式的重复多糖组成。为了确定nhba
ng
是否优先结合具有特定硫酸化构型的聚糖，我们用三种类型的硫酸软骨素(a、b和c)进行了实验。nhba
ng
仅结合硫酸软骨素c(硫酸软骨素6-硫酸盐)，并且对于硫酸软骨素a(硫酸软骨素4-硫酸盐)或硫酸软骨素b(硫酸皮肤素)未观察到浓度依赖性结合。我们还表明nhba
ng
结合硫酸乙酰肝素，但亲和力较低(k
d 2.79μm)。在非gag聚糖方面，nhba
ng
结合α2-6唾液酸化五糖-lstc(k
d 0.24μm)(亲和力高于其异构体lstb(k
d 2.26μm))和lnnt的非唾液化变体(k
d 4.89μm)。此外，nhba
ng
对lewis x(k
d 0.68μm)的亲和力比对唾液酸基lewis x(k
d 3.65μm)的亲和力高5倍。对于透明质酸(一种非硫酸化gag)或h-二糖未观察到浓度依赖性结合，它们未被聚糖阵列上的nhba
ng
结合并用作阴性对照。
[0326]
淋球菌nhba与上皮细胞结合
[0327]
nhba
nm
经由与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的相互作用通过其arg区与上皮细胞结合[13]。为了研究nhba
ng
是否也与上皮细胞相互作用，用重组nhba
ng
和宫颈和尿道上皮细胞进行了共聚焦显微镜检查和流式细胞术分析。对于共聚焦显微镜检查，将重组nhba
ng
(rnhba
ng
)与人宫颈上皮(tcx)细胞一起孵育，并使用小鼠抗nhba一级抗体和alexa flour 488二级抗体进行检测。观察到nhba
ng
与tcx细胞的结合(白色箭头，图11a(i))，其中蛋白质信号定位在细胞表面(白色箭头，图11a(ii))。未观察到一级抗体(图11a(iii))或二级抗体(图11a iv)与tcx细胞的非特异性结合。流式细胞术分析进一步证实，nhba
ng
结合宫颈和尿道上皮细胞(图11b)。
[0328]
nhba有助于淋球菌血清存活率和对上皮细胞的粘附
[0329]
为了研究nhba
ng
对聚糖、淋球菌细胞和人上皮细胞相互作用的功能作用，我们进行了血清存活和上皮细胞粘附测定法。在10％的正常人血清(wt菌株的亚致死性血清浓度)中，用wt、δnhba和δnhba_c菌株进行的血清存活测定法表明，相对于wt和δnhba_c菌株，δnhba菌株具有降低大约5倍的存活率(图12a)。在暴露于人血清之前用肝素预处理淋球菌将δnhba突变株的存活率提高到与wt和δnhba_c菌株相当的水平。淋病奈瑟菌表达几种与肝素相互作用的蛋白质(例如opa[29])，可导致δnhba菌株中血清抗性的恢复。
[0330]
为了研究nhba
ng
在淋病奈瑟菌感染中的作用，我们用人宫颈和尿道上皮细胞以及wt、δnhba和δnhba_c菌株进行了体外感染测定法。对于上皮细胞的感染测定法，相对于wt，δnhba突变体具有分别11倍和12倍降低的对tcx细胞和tuec细胞的粘附性(图12b)。我们还对用重组nhba
ng
或阴性对照蛋白pna预处理的细胞进行了粘附测定法。淋球菌对nhba
ng
处理的细胞的粘附以浓度依赖性方式降低(即，2.5倍和1.7倍分别对应于100μg/ml和10μg/ml nhba
ng
)，而用100μg/ml pna处理细胞(不结合这些细胞的阴性对照)对细菌粘附没有影
响(图12c)。
[0331]
讨论
[0332]
由于感染率上升和抗微生物药物耐药性增加，性传播感染淋病是一个日益严重的公共卫生问题。淋病奈瑟菌主要定殖在粘膜表面，淋球菌的传播、定殖和发病机制是复杂的多因素过程[综述于30]。需要增加对淋球菌感染所有阶段的了解，以帮助开发新的治疗和预防策略。在这项研究中，我们根据其与聚糖、淋病奈瑟菌和人上皮细胞的相互作用来表征淋球菌nhba，并强调其涉及微菌落形成、对人血清的抗性以及对上皮细胞的粘附。
[0333]
nhba是经由反向疫苗学首先在脑膜炎奈瑟菌中鉴定的，其为脑膜炎球菌血清型b疫苗4cmenb开发的一部分[31，32]，此后对其功能作用进行了详细表征[12-16]。尽管在淋球菌和脑膜炎球菌nhba蛋白之间的序列同一性水平相对较高(约67％的同一性[11])，但在nhba序列与两种致病性奈瑟菌属物种遇到的条件之间有些差异，促使人们对淋病奈瑟菌中的nhba进行详细分析。nhba在淋病奈瑟菌中比在脑膜炎奈瑟菌中更保守[11]，在这里我们证实在淋病奈瑟菌中n末端的63个氨基酸缺失和截短的arg区在所有主要淋球菌nhba变体中是保守的。正因为如此，这里提供的数据很可能代表了nhba在大多数淋病奈瑟菌菌株中的作用。
[0334]
在我们的聚糖阵列分析中，重组nhba
ng
与包括几种gag诸如肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素在内的39种聚糖结合。我们之前表明，nhba
nm
与28种聚糖相互作用[14]，我们的spr分析证实nhba
ng
和nhba
nm
结合至少4种共同的聚糖(肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、glc-6p)，然而这些蛋白质之间的关键区别在于，nhba
ng
相比于nhba
nm
，其对肝素具有更高的结合亲和力，而对硫酸软骨素和葡萄糖6-磷酸具有更低的亲和力。这很可能是由于arg区的差异所致，已知其涉及nhba
nm
与gag结合[12，13]。此外，ng nhba
ng
而不是nhba
nm
与lewis x和唾液酸基lewis x抗原、乳糖n-新四糖(lnnt)及其在聚糖阵列上的唾液化变体相互作用，通常可以在宿主细胞的表面上发现它们。通过nalp进行nhba
nm
的脑膜炎球菌切割释放被称为c2的c末端片段[12]，所述片段含有富arg区并增加血管通透性[17]。另外，人蛋白酶乳铁蛋白和激肽释放酶切割arg区下游的nhba
nm
[12，15]，并且血清c3转化酶可以切割释放的nhba c2片段，从而去除arg区并消除蛋白质对细胞的毒性作用[16]。因为淋病奈瑟菌没有nalp基因[20]，所以nhba
ng
不会在arg区的上游被切割。未用人乳铁蛋白切割nhba
ng
(数据未显示)，并且还没有研究通过激肽释放酶和c3转化酶进行的切割。然而，由于不存在有nalp，即使nhba
ng
被这些人类酶切割，功能性arg区仍将附着在淋球菌表面，在那里它可以介导其与聚糖结合相关的作用。
[0335]
淋球菌δnhba突变株相对于wt和δnhba_c菌株显示出几种表型，包括在人血清中存活率降低、聚集和微菌落形成减少以及对宫颈和尿道上皮细胞的粘附降低。虽然淋病奈瑟菌很少引起播散性疾病，但其抵抗血清杀伤的能力已被广泛研究，并发现由包括孔蛋白[30-32]、los[33]和opa[28]在内的因素介导，并且在粘膜感染期间是相关的，因为血清和补体因子存在于生殖道和其他粘膜表面[34-36]。nhba
nm
也涉及血清存活，在血清测定前添加肝素导致血清敏感的未封装的亲本脑膜炎球菌菌株的存活率增加，但δnhba突变株则不然[12]。肝素与几种补体因子相互作用[37]，并且通过nhba
nm
的肝素介导的补体调节蛋白的募集被推荐为血清抗性的作用机制[12]。我们提出了nhba
ng
的相似作用机制，涉及相对于δnhba突变体的在wt菌株表面的补体调节蛋白的更高水平的募集。即使nhba
ng
相比于nhba
nm
对肝素具有更高的亲和力，但还有另外的淋球菌肝素结合蛋白诸如opa[28]在血清抗性中起作用，这将解释wt在测试的血清条件下相对较高的存活水平，以及在将肝素添加到测定法之后淋球菌δnhba突变体的抗性的恢复。
[0336]
淋球菌粘附于粘膜上皮是建立感染的关键第一步，在初始粘附之后，淋病奈瑟菌定殖取决于在上皮细胞表面上稳健的细菌聚集体和微菌落的形成[在30中综述]。初始粘附和微菌落形成两者都由包括iv型菌毛蛋白、不透明(opa)蛋白和脂低聚糖(los)在内的淋球菌因子介导[23，42-44]。然而，即使不存在菌毛蛋白或opa，淋病奈瑟菌也形成聚集体，表明存在促进gc聚集的未知宿主因子[45]。我们表明nhba
ng
在建立淋球菌感染中起关键作用，因为相对于野生型，δnhba突变体显示出对宫颈和尿道上皮细胞的粘附性降低，以及聚集和微菌落形成减少。此外，重组nhba
ng
直接与上皮细胞和淋球菌细胞两者相互作用，并且nhba
ng
能够以浓度依赖性的方式阻断对上皮细胞的粘附。这很可能是由于nhba与上皮细胞上的宿主聚糖相互作用的结果，所述聚糖介导nhba
nm
与hec-1b和cho-k1细胞的相互作用[13]。淋球菌nhba在32℃与37℃时上调，与脑膜炎奈瑟菌中的nhba调控一致[18]，在这些微生物在咽部粘附期间，这可能特别相关，因为这个生态位的温度较低。
[0337]
nhba
ng
介导细菌间相互作用，并且nhba
ng
在微菌落形成中的作用可能通过其与lnnt(作为los一部分在淋球菌细胞表面上存在)的相互作用而得到促进[46]。淋球菌微菌落与宿主微绒毛相互作用，并且导致宿主细胞骨架的重排和皮质斑块形成[47-51]。微菌落也与增加淋球菌对抗生素的耐药性有关[45]，暴露于精浆后细菌聚集体的形成得以增强，影响细菌传播[52]。脑膜炎奈瑟菌聚集体的形成对于抵抗细胞表面上的剪力也是重要的[53]，这对于淋病奈瑟菌来说可能也是重要的。然而，令人感兴趣地注意到，迄今为止尚未报道脑膜炎球菌nhba涉及聚集[13，54，55]。
[0338]
总之，我们强调了nhba在淋球菌感染和发病机制的几个阶段中的作用。正因为如此，靶向nhba自身和nhba-宿主相互作用可能是有用的治疗和疫苗方法。
[0339]
在整个说明书中，其目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或特定的特征集合。因此，本领域技术人员理解的是，根据即时公开，可以在不脱离本发明范围的情况下，在举例说明的具体实施方案中进行各种修改和改变。
[0340]
本文提及的所有计算机程序、算法、专利和科学文献以及蛋白质和核酸序列或登录号均通过引用并入本文。
[0341]
表3：用于生成nhba突变株和互补菌株的引物和载体*
[0342][0343]
*从淋病奈瑟菌菌株1291扩增nhba基因(ngag_00725)(引物nhba1和nhba2)并克隆到pgem-t easy(promega)中。将卡那霉素抗性基因(puc4kan；amersham biosciences)插入到bamhi位点中，使用反向pcr(引物nhba3和nhb4)引入到nhba中间。将nhba::kan构建体线性化并转化到淋病奈瑟菌1291中，生成nhba::kan(δnhba)。通过使用互补质粒pcts32[23]将完整的nhba基因(引物nhba5和nhba6)引入到δnhba中，生成互补菌株(δnhba_c)。分别将卡那霉素(50μg/ml)和大观霉素(100μg/ml)用于敲除和互补菌株。通过pcr和蛋白质印迹证实了nhba基因的缺失和随后的互补。
[0344]
表4：来自淋病奈瑟菌1291的重组nhba的聚糖阵列结果的热图。
[0345]
黑色方块表示在三次独立实验中与对应的聚糖的结合(白色方块表示无结合)。这些值代表来自三次独立实验(学生t检验p《0.001)的背景上方斑点的平均荧光强度(根据阵列上的空斑点的平均背景 3个标准差计算)。
[0346]
[0347]
[0348]
[0349]
[0350]
[0351]
[0352]
[0353]
[0354][0355]
表5：在pubmlst数据库中具有注释的nhba蛋白的淋病奈瑟菌分离株中的nhba肽变体的分布。
[0356]
[0357][0358][0359]
参考文献
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