C型利钠肽在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用

c型利钠肽在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及c型利钠肽在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。


背景技术：

2.c型利钠肽(c-type natriuretic peptide，cnp)是利钠肽家族成员之一1，cnp为包含 22个氨基酸的肽段，由利钠肽前体蛋白c(natriuretic peptide precursor c,nppc)剪切而来2。细胞中nppc基因被转录翻译成含126个氨基酸的cnp-126，随后被信号肽酶和弗林蛋白酶(furin)剪切形成含53个氨基酸的肽段cnp-53，并被分泌到细胞外2。在细胞外，cnp-53再次被剪切形成cnp-222(如图1所示)。在组织液和血浆中同时存在cnp-53和cnp-22，且两者的作用是等效的2。cnp降解速度很快，在血浆中的半衰期只有2.6分钟1。细胞外，cnp被脑啡肽酶(neprilysin)剪切其氨基端疏水残基而失活，sacubitril作为脑啡肽酶抑制剂能够显著升高血浆中cnp水平3。cnp-22 首次在猪脑的提取物中被发现4，随后研究显示cnp在中枢神经系统和软骨中含量丰富外5，在内皮细胞中持续高表达
6,7
。cnp在血管稳态调控中的作用逐渐被关注。
3.动脉粥样硬化是一种动脉壁纤维脂肪样病变，随着病程的进展，将导致脑卒中、冠心病以及下肢动脉疾病致残等的发生8。目前治疗动脉粥样硬化主要以血浆胆固醇治疗为主。在降脂治疗的药物中，他汀类药物通过竞争性抑制肝细胞羟甲基戊二酰辅酶a还原酶活性从而抑制胆固醇在肝脏的合成。如果无法达标，联合应用抑制胆固醇吸收的依折麦布进一步降低低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, ldl-c)水平9。在上述联合治疗仍无法将ldl-c控制在目标值一下时，考虑加用 pcsk9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)抑制剂。然而，临床实践中，ldl-c 控制比例仍然十分有限。此外，他汀类药物常见的不良反应包括肌病和肝脏不良反应，其他还有胃肠反应、皮肤潮红、头痛等。他汀相关性肌病临床表现包括肌痛、肌炎和横纹肌溶解。肝功能受损的表现为血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,alt) 及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,ast)水平升高。因此，他汀类药物禁用于活动性肝病或原因不明的转氨酶持续升高，并且用药期间应定期监测肝功能，如果 alt或ast持续升高超过正常值上限3倍以上，建议减低用药剂量或停止用药。因此，寻找不依赖血脂水平治疗动脉粥样硬化相关疾病的有效手段至关重要。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是如何预防和/或治疗动脉粥样硬化，如何制备预防和 /或治疗动脉粥样硬化药物。
5.为了解决以上技术问题，本发明的第一个目的是提供c型利钠肽(cnp)在制备制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。
6.上述应用中，所述c型利钠肽可为氨基酸序列如序列表序列1所示的多肽。
7.上述应用中，所述动脉粥样硬化可为动脉内膜有脂质等血液成分的沉积、平滑肌细胞增生和胶原纤维增多，形成粥糜样含脂坏死病灶和血管壁硬化的病症。
8.所述药物的活性成分含有c型利钠肽。
9.所述药物可只为c型利钠肽，也可还含有载体或赋形剂。
10.这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料 (如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中具体的是水溶性载体材料。使用这些材料可以制成多种剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将单位给药剂型制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将单位给药剂型制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将单位给药剂型制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、ph调节剂等。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔；粘膜给药。
11.本发明的第二个目的是提供c型利钠肽在制备抑制动脉粥样硬化斑块形成产品中的应用。上述应用中，所述c型利钠肽可为氨基酸序列如序列表序列1所示的多肽。
12.本发明的第三个目的是提供c型利钠肽在制备减少动脉脂质沉积产品中的应用。上述应用中，所述c型利钠肽可为氨基酸序列如序列表序列1所示的多肽。
13.本发明的第四个目的是提供c型利钠肽在制备促进动脉胶原沉积产品中的应用。上述应用中，所述c型利钠肽可为氨基酸序列如序列表序列1所示的多肽。
14.本发明的第五个目的是提供c型利钠肽在制备抑制动脉粥样硬化斑块中坏死核产品中的应用。上述应用中，所述c型利钠肽可为氨基酸序列如序列表序列1所示的多肽。
15.本发明的第六个目的是提供c型利钠肽在制备减少动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞浸润产品中的应用。上述应用中，所述c型利钠肽可为氨基酸序列如序列表序列1所示的多肽。
16.本发明的第七个目的是提供c型利钠肽在制备促进动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞沉积产品中的应用。上述应用中，所述c型利钠肽可为氨基酸序列如序列表序列1 所示的多肽。
17.本发明还提供c型利钠肽在制备如下任一模型中的应用：
18.x1、脂质沉积降低动脉模型；
19.x2、胶原沉积增加动脉模型；
20.x3、动脉粥样硬化斑块中坏死核抑制动脉模型；
21.x4、动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞浸润降低动脉模型；
22.x5、动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞沉积增加动脉模型；
23.x6、动脉粥样硬化斑块中平滑肌细胞沉积增加动脉模型；
24.x7、il-1β表达下降巨噬细胞模型；
25.x8、hif-1α表达下降巨噬细胞模型。
26.上述应用中，所述c型利钠肽可为氨基酸序列如序列表序列1所示的多肽。
27.本发明通过对给予生理盐水或c型利钠肽治疗、西方饮食喂养8周后的apo e-/-小鼠检测，结果表明c型利钠肽降低动脉粥样硬化斑块形成，减少动脉粥样硬化斑块中坏死核的形成，减少动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞浸润并促进平滑肌细胞沉积，cnp 不影响血浆中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇以及高密度脂蛋白胆固醇含量。本发明通过对小鼠原代腹腔巨噬细胞以c型利钠肽预处理后，给予lps处理后检测炎症因子il-1β及其转录因子hif-1α蛋白水平表达，结果表明巨噬细胞中c型利钠肽下调il-1β及hif-1α表达。发现了c型利钠肽可作为动脉粥样硬化的防治候选药物。本发明对动脉粥样硬化的治疗具有应用价值。
附图说明
28.图1为cnp蛋白的合成、释放与降解示意图。
29.图2为apo e-/-小鼠给予生理盐水或cnp治疗，西方饮食喂养8周后的主动脉树染色结果图。其中，图2的a图为主动脉树染色图，主动脉内膜深色区域为动脉粥样硬化斑块；图2的b图为统计病变斑块面积占主动脉血管总面积的百分比的柱状图，结果以均值
±
标准误表示，组间比较采用t检验，每组小鼠数n＝8，*代表显著性分析结果为p《0.05。
30.图3为apo e-/-小鼠给予生理盐水或cnp治疗，西方饮食喂养8周后的小鼠主动脉流出道冰冻切片h&e染色、油红o染色、天狼星红染色以及马松三色染色结果图。其中，图3的a图为小鼠主动脉流出道冰冻切片h&e染色、油红o染色、天狼星红染色以及马松三色染色染色图，比例尺400μm；图3的b图为分别统计病变斑块面积占主动脉流出道横截面积的百分比、油红o染色面积占病变斑块面积的百分比以及天狼星红染色面积占病变斑块面积的百分比的柱状图，结果以均值
±
标准误表示，组间比较采用t检验，每组小鼠数n＝8，*代表显
著性分析结果为p《0.05。
31.图4为apo e-/-小鼠给予生理盐水或cnp治疗，西方饮食喂养8周后的小鼠主动脉流出道冰冻切片h&e染色结果图。其中，图4的a图为小鼠主动脉流出道冰冻切片h&e染色图，比例尺100μm；图4的b图为统计坏死核面积占病变斑块面积的百分比的柱状图，结果以均值
±
标准误表示，组间比较采用t检验，每组小鼠数n＝8， *代表显著性分析结果为p《0.05。
32.图5为apo e-/-小鼠给予生理盐水或cnp治疗，西方饮食喂养8周后的小鼠主动脉流出道冰冻切片免疫荧光染色结果图。其中，图5的a图为小鼠主动脉流出道冰冻切片免疫荧光染色图，cd68标记巨噬细胞，α-sma标记平滑肌细胞，dapi标记细胞核，比例尺200μm；图5的b图为分别统计cd68阳性面积占病变斑块面积的百分比和α-sma阳性面积占病变斑块面积的百分比的柱状图，结果以均值
±
标准误表示，组间比较采用t检验，每组小鼠数n＝8，*代表显著性分析结果为p《0.05。
33.图6为apo e-/-小鼠给予生理盐水或cnp治疗，西方饮食喂养8周后的小鼠血细胞成分、血生化以及血脂等指标的柱状图。其中，图6的a图为小鼠血浆中甘油三酯含量柱状图，图6的b图为小鼠血浆中的总胆固醇含量柱状图，图6的c图为小鼠血浆中的低密度脂蛋白胆固醇含量柱状图，图6的d图为小鼠血浆中的高密度脂蛋白胆固醇含量柱状图。结果以均值
±
标准误表示，组间比较采用t检验，每组小鼠数n＝8，*代表显著性分析结果为p《0.05。
34.图7为给予生理盐水或cnp预处理后给予lps处理，小鼠原代腹腔巨噬细胞 western blot检测hif1-α和il-1β蛋白表达结果图。其中，图7的a图为生理盐水或cnp预处理后给予lps处理后不同时间的hif1-α和il-1β蛋白western blot电泳照片，图7的b图为生理盐水或cnp预处理后给予lps处理后不同时间的hif1
‑ꢀ
α和il-1β蛋白表达含量柱状图，图7的c图为生理盐水或不同浓度cnp预处理后给予lps处理后hif1-α和il-1β蛋白western blot电泳照片，图7的d图为生理盐水或不同浓度cnp预处理后给予lps处理后hif1-α和il-1β蛋白表达含量柱状图。结果以均值
±
标准误表示，组间比较采用bonferroni校正的双因素方差分析，独立实验数n＝5，*代表显著性分析结果为p《0.05。
具体实施方式
35.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
36.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
37.下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
38.下述实施例中各材料和试剂的购买来源：
39.下述实施例中雄性载脂蛋白e缺失(apolipoprotein e-/-,apo e-/-)小鼠(货号 14012a)为北京华阜康生物科技股份有限公司产品，12-14周龄，每只体重32.63
±ꢀ
2.22g。
40.下述实施例中c型利钠肽(c-type natriuretic peptide，cnp)是包含22个氨基酸的肽段，其氨基酸序列为glskgcfglkldrigsmsglgc(如序列表序列1所示)，为r&d systems公司产品，货号为3520。
41.pbs为sigma-aldrich公司产品，货号为806552。
42.lps为sigma-aldrich公司产品，货号为l3012。
43.抗体cd68为santa cruz biotechnology公司产品，货号为sc-20060。
44.抗体α-sma为abcam公司产品，货号为ab5694。
45.抗体hif-1α为novus biologicals公司产品，货号为nb100-105。
46.抗体il-1β为r&d systems公司产品，货号为af-401-na。
47.抗体β-actin为proteintech公司产品，货号为hrp-60008。
48.实施例1
49.一、西方饮食喂养试验
50.所用小鼠为12-14周雄性载脂蛋白e缺失(apolipoprotein e-/-,apo e-/-)小鼠，12-14 周龄，每只体重32
±
2.22g，随机分为两组，分别为cnp处理组和生理盐水对照组，每组8只，具体处理如下：
51.cnp处理组：西方饮食喂养8周，自由饮食，同时皮下植埋渗透性微泵缓释持续灌注cnp溶液，cnp用生理盐水配制及稀释，以200μg/kg/day剂量持续灌注8 周。
52.生理盐水对照组：西方饮食喂养8周，自由饮食，同时皮下植埋渗透性微泵缓释持续灌注生理盐水，持续灌注8周。
53.所述西方饮食成分含40kcal脂肪，1.25％胆固醇和0.5％胆酸。
54.8周后取小鼠进行如下测定：
55.对主动脉树进行enface油红染色，观察动脉粥样硬化斑块发生情况，统计病变斑块面积占主动脉血管总面积的百分比，每组8只小鼠，结果见图2：主动脉树染色显示cnp降低动脉粥样硬化斑块形成。
56.对主动脉流出道切片进行伊红-苏木素(hematoxylin and eosin stain,h&e)、油红o、天狼星红以及马松三色染色，观察主动脉流出道部位的斑块发生、脂质沉积、胶原沉积以及坏死核形成情况，分别统计病变斑块面积占主动脉流出道横截面积的百分比、油红o染色面积占病变斑块面积的百分比以及天狼星红染色面积占病变斑块面积的百分比，结果见图3：主动脉流出道切片染色显示cnp可以降低动脉粥样硬化斑块形成，减少脂质沉积并促进胶原沉积。h&e染色统计坏死核面积占病变斑块面积的百分比，结果见图4：主动脉流出道切片染色显示cnp可以减少动脉粥样硬化斑块中富含脂质的坏死核(lrnc)的形成。
57.对主动脉流出道切片进行免疫荧光染色，检测α-sma以及cd68的表达，用以反映巨噬细胞浸润情况以及评价斑块稳定性，结果见图5：主动脉流出道切片染色显示cnp减少动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞浸润并促进平滑肌细胞沉积。
58.取全血和血浆，分析血细胞成分、血生化以及血脂等指标，结果见图6：cnp不影响血浆中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇以及高密度脂蛋白胆固醇含量。
59.二、小鼠原代腹腔巨噬细胞
60.对小鼠原代腹腔巨噬细胞进行如下试验：
61.1)不同预处理，脂多糖处理后不同时间hif1-α和il-1β蛋白的表达量
62.进行cnp预处理，以pbs预处理作为对照(各处理均在37℃条件下培养)：
63.cnp(100nm)：将cnp溶解于pbs中，得到cnp浓度为100μm的溶液，将此溶液以1:1000比例加入dmem培养液中，培养小鼠的原代腹腔巨噬细胞，培养30min。
64.pbs(磷酸缓冲盐溶液)：将pbs以1:1000比例加入dmem培养液中，培养小鼠的原代
腹腔巨噬细胞，培养30min。
65.每种预处理方式设置5个独立实验的重复，上述预处理完成后以100ng/ml的lps (脂多糖)处理0hr、6hr、12hr，脂多糖处理后在0hr、6hr、12hr分别利用western-blot 测定hif1-α蛋白表达水平和il-1β蛋白表达水平，并利用image j软件对western-blot 的检测结果进行定量，内参为β-action，结果见图7的a图和图7的b图。
66.其中，小鼠原代腹腔巨噬细胞的制备与鉴定如下：
67.c57bl/6小鼠(约6-8周龄的健康雄性)，将1.0ml 3％的thioglycollate培养液通过腹腔注射给予小鼠，持续正常饮食喂养3d，以便刺激腹腔巨噬细胞产生。通过颈椎脱臼法将小鼠处死，并将其浸泡入75％的酒精溶液中3min进行充分的消毒。随后，将小鼠置于超净台中，并固定在手术台上，充分暴露腹腔。用经高压灭菌后的器械在无菌条件下沿小鼠腹部正中线剪开皮肤，充分的暴露出腹膜，注意避免伤及腹膜壁。用20ml注射器抽取预冷好的pbs缓冲液，向腹膜腔注pbs 3ml，并轻柔小鼠腹部片刻，用吸管吸取回收pbs并收集到50ml无菌离心管中，反复冲洗腹膜腔并回收灌洗液数次，直至灌洗液呈清亮透明状。将收集到50ml离心管中的灌洗液以 1500r/min的速度离心5min，可见细胞聚集在离心管底面，弃掉上清液；加入含有 10％fbs的dmem培养液重悬细胞。将细胞悬液接种于6孔培养板中，放于37℃、 5％二氧化碳饱培养箱中培养。经2h的差异贴壁培养后，弃去培养液，用pbs充分洗涤2次，贴壁细胞即为巨噬细胞。
68.2)不同cnp预处理浓度，脂多糖处理后hif1-α和il-1β蛋白的表达量
69.进行不同浓度cnp预处理，以pbs预处理作为对照(各处理均在37℃条件下培养)：
70.cnp(0nm)：将pbs以1:1000比例加入dmem培养液中，培养小鼠的原代腹腔巨噬细胞，培养30min。
71.cnp(0.1nm)：将cnp溶解于pbs中，得到cnp浓度为0.1μm的溶液，将此溶液以1:1000比例加入dmem培养液中，培养小鼠的原代腹腔巨噬细胞，培养30min。
72.cnp(1nm)：将cnp溶解于pbs中，得到cnp浓度为1μm的溶液，将此溶液以1:1000比例加入dmem培养液中，培养小鼠的原代腹腔巨噬细胞，培养30min。
73.cnp(10nm)：将cnp溶解于pbs中，得到cnp浓度为10μm的溶液，将此溶液以1:1000比例加入dmem培养液中，培养小鼠的原代腹腔巨噬细胞，培养30min。
74.cnp(100nm)：将cnp溶解于pbs中，得到cnp浓度为100μm的溶液，将此溶液以1:1000比例加入dmem培养液中，培养小鼠的原代腹腔巨噬细胞，培养30min。
75.每种预处理方式设置5个独立实验的重复，上述预处理完成后以100ng/ml的lps (脂多糖)处理20hr，脂多糖处理后20hr分别测定hif1-α蛋白表达水平和il-1β蛋白表达水平，内参为β-action，结果见图7的c图和图7的d图。
76.以上预处理后，给予lps处理后，western blot检测炎症因子il-1β及其转录因子hif-1α蛋白水平表达的结果表明：巨噬细胞中cnp下调炎症因子il-1β及其转录因子hif-1α表达。
77.目前旨在减缓动脉粥样硬化进展的药物干预措施几乎只关注于降低血浆胆固醇水平。然而，许多临床和实验数据支持炎症在动脉粥样硬化形成中起着至关重要的作用
10-12
。炎症的下游生物标志物，如高敏c反应蛋白和白细胞介素-6，与心血管事件的风险增加相关，而不依赖于胆固醇水平
13，14
。他汀类药物可以降低胆固醇水平的同时，也进一步降
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