一种全人源单克隆抗体组合及其应用的制作方法

一种全人源单克隆抗体组合及其应用
1.优先权信息
2.本技术请求2021年5月14日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202110529265.0的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。
技术领域
3.本发明属于抗体工程领域，具体涉及一种针对冠状病毒的单抗组合及其应用，特别是涉及一种预防或治疗sars-cov-2突变株感染的抗体组合。


背景技术：

4.冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征(sars)等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，需根据患者临床情况进行治疗。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》公布，在重型、危重型病人治疗的其他治疗措施中，可采用恢复期血浆治疗。2月8日，首期在江夏区第一人民医院开展了3名危重患者的新冠特免血浆治疗，目前连同后续医院治疗的危重病人超过了10人。经临床反映，患者接受治疗12至24小时后，实验室检测主要炎症指标明显下降，淋巴细胞比例上升，血氧饱和度、病毒载量等重点指标全面向好，临床体征和症状明显好转。3月4日国家卫生健康委办公厅、中央军委后勤保障部卫生局联合发布《新冠肺炎康复者恢复期血浆临床治疗方案(试行第二版)》。围绕康复者血浆中和病毒的治疗目的，细化了临床使用的适应证、禁忌症和不宜使用的情况。康复者血浆主要用于病情进展较快、重症、危重症新冠肺炎患者。原则上病程不超过3周；新冠病毒核酸检测阳性或临床专家判定患者存在病毒血症，在病情急性进展期应当尽早使用。
5.尽管康复患者血浆疗法在临床上取得了一定的成效，然而由于抗原患者血浆来源有限、纯化抗体安全隐患高、特异性抗体效价不稳定。效价高、性能稳定、安全性好的单克隆抗体对于控制新冠状病毒疫情具有良好的应用前景。目前现有文献已经公开或教导了针对新冠病毒rbd制备保护性中和单抗的报道。利用新冠病毒刺突蛋白rbd产生抗新冠病毒的保护性中和抗体(如：biorxiv，“sars-cov-2and sars-cov spike-rbd structure and receptor binding comparison and potential implications on neutralizing antibody and vaccine development”，20200220)。sars刺突蛋白rbd和新冠病毒刺突蛋白rbd存在交叉中和表位肽，抗sars的单克隆抗体cr3022能够结合新冠病毒刺突蛋白rbd(emerging microbes&infections,9(1):382-385,20200217)。采用同源建模的方法明确了新冠病毒病毒ctd1/人ace2复合物的蛋白-蛋白相互作用界面的热点和关键残基，筛选靶向ctd1区域与ace2结合表面的候选抑制剂，阻断病毒与人体ace2蛋白的识别与结合。
6.目前针对新冠病毒s蛋白已经开发了多种单克隆抗体药物，由上海君实生物医药科技股份有限公司、中国科学院微生物研究所等单位共同开发的重组全人源抗新冠病毒单
克隆抗体注射液(简称“js016”)，获得国家药监局批准进入ⅰ期临床试验。济民可信集团近日宣布，其自主研发的新冠病毒特异性中和抗体注射液(项目代号：jmb2002)日前已获得fda批准，将在美国开展临床试验。临床前研究显示，jmb2002能够精准占据病毒s蛋白的s1亚基上受体结合域(rbd)与ace2结合界面的关键表位。
7.尽管抗sars-cov-2中和性抗体药物的研究取得了很大的进展，但sars-cov-2的变异速度快，《病毒学报》2月8日发布的一项新的研究显示，新型冠状病毒自2019年底流行至今，已演变出800余个不同亚型或分支。sars-cov-2的不断变异导致中和性抗体的预防和治疗效果具有不稳定性，特别是sars-cov-2s蛋白关键位点的突变，容易导致目前针对s蛋白的中和性抗体对sars-cov-2的中和活性降低甚至丧失。


技术实现要素：

8.为解决上述问题，本发明利用，结合通过国家生物信息中心-2019新型冠状病毒信息库数据(https://bigd.big.ac.cn/ncov)跟踪调研了位于新冠病毒s蛋白的受体结合区(s1rbd)的全球流行突变株的情况。进一步，对前期研究获得的靶向sars-cov-2s蛋白s1rbd、具有良好中和活性的三株抗单克隆抗体mw05、mw06和mw07对上述流行突变株中部分流行株的s1rbd突变体蛋白进行分析，证实mw06和mw07与mw05联用时可以对抗mw05在部分突变株上的活性下降。
9.重点结合mw05与s1rbd相互作用的关键氨基酸残基信息，构建多个流行突变株的s1rbd重组蛋白，并通过结合和阻断活性实验证实mw05、mw06和mw07三个抗体在针对这些突变体蛋白上的结合和阻断活性具有互补性，即联用mw06或mw07分别对mw05活性降低的突变株具有明显的“纠正”作用。上述结果提示无论是与mw05表位完全无竞争作用的mw06，还是与mw05表位存在重叠，但相互作用关键氨基酸存在差异的mw07，两两联用都能不同程度上对抗新冠病毒在s1rbd上的突变，从而达到鸡尾酒疗法对抗流行突变的疗效。
10.具体而言，本发明提供一种针对sars-cov-2变异株进行预防和治疗的抗体组合，所述抗体组合包括选自mw05、mw06、mw07中的一种、两种或三种抗体，所述变异株为临床分离的sars-cov-2变异株。mw05、mw06、mw07三者在sars-cov-2刺突蛋白(s蛋白)上具有不同的抗原表位，在不同新冠s1rbd突变体上的结合和阻断活性具有互补性，且三株抗体对sars-cov-2变异株b.1.1.7、b.1.351的中和活性存在差异。与对sars-cov-2野生株相比，三种抗体对sars-cov-2变异株的中和活性出现了不同程度的下降甚至丧失。通过将多种抗体组合联用，可显著恢复针对sars-cov-2变异株的中和活性。
11.第一方面，本发明提供一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的药物，其包括选自单克隆抗体mw05、单克隆抗体mw06和单克隆抗体mw07中的一种、两种或三种抗体；
12.其中，
13.所述mw05的轻链可变区具有seq id no:7所示的lcdr1、seq id no:8所示的lcdr2和seq id no:9所示的lcdr3，且所述mw05的重链可变区具有seq id no:10所示的hcdr1、seq id no:11所示的hcdr2和seq id no:12所示的hcdr3；
14.所述mw06的轻链可变区具有seq id no:13所示的lcdr1、seq id no:14所示的lcdr2和seq id no:15所示的lcdr3，且所述mw06的重链可变区具有seq id no:16所示的hcdr1、seq id no:17所示的hcdr2和seq id no:18所示的hcdr3；
15.所述mw07的轻链可变区具有seq id no:19所示的lcdr1、seq id no:20所示的lcdr2和seq id no:21所示的lcdr3，且所述mw07的重链可变区具有seq id no:22所示的hcdr1、seq id no:23所示的hcdr2和seq id no:24所示的hcdr3。
16.第二方面，本发明提供一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的药物，其包括选自单克隆抗体mw05、单克隆抗体mw06和单克隆抗体mw07中的一种、两种或三种抗体；
17.其中，
18.所述mw05具有seq id no:1所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:2所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3；
19.所述mw06具有seq id no:3所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:4所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3；
20.所述mw07具有seq id no:5所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:6所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3。
21.进一步，根据本发明的实施例，所述的药物，至少包括单克隆抗体mw06。进一步，根据本发明的实施例，所述的药物还包括所述单克隆抗体mw05。
22.进一步，据本发明的实施例，所述的药物至少包括所述单克隆抗体mw05。进一步，据本发明的实施例，所述的药物还包括所述单克隆抗体mw06和/或所述单克隆抗体mw07。
23.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个位点的突变：
24.446g、501n、455l、417k、475a、505y、493q、453y、486f、446g、501n、417k、456f、477s、439n、520a、344a、382v、367v、330p、479p、483v、494s、518l、444k、477s、341v、384p、354n、478t、408r、459s、483v、476g、484e、385t、348a、506q、334n、370n、373s、403r、411a、481n、508y、414q，
25.其中，所述突变包括缺失、取代、插入。
26.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个突变：
27.446g》v、501n》y、455l》f、417k》n、475a》v、505y》c、493q》l、453y》f、486f》l、446g》s、501n》t、417k》r、456f》l、477s》n/i/t、439n》k、520a》s、344a》t/s、382v》l、367v》f/l、330p》s/a、479p》s、483v》a、494s》p/a、518l》i、444k》n、477s》r、341v》i、384p》l、354n》k、478t》k/i/r、408r》k/i/t、459s》y/f、483v》i/f、476g》s000、484e》k/q、385t》n/i、348a》t/s、506q》k/*、334n》k、370n》s、373s》l、403r》k、411a》s、481n》d、508y》h、414q》k/*/x。
28.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变位点如下：
29.k444、v445、g446、y449、n450、l452、y453、l455、f456、t470、v483、e484、g485、f486、c488、f490、q493、s494、n501、k417 n501 e484、d614。
30.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变如下：
31.k444n、k444r、v445f、g446v、y449f、n450k、l452r、l452m、y453f、l455f、f456l、t470n、v483a、v483i/f、e484d、e484k/q、g485s/r、f486l、c488r、f490s、f490l/v、q493l、s494l、s494p、n501y、k417t n501y e484k、d614g。
32.第三方面，本发明提供一种阻断sars-cov-2变异株与宿主细胞受体结合的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使宿主细胞接触前述的预防或治疗sars-cov-2变异株感染的药物。其中，该预防或治疗sars-cov-2变异株感染的药物具有前述预防或治疗sars-cov-2变异株感染的药物的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。
33.第四方面，本发明提供一种阻断sars-cov-2变异株与宿主细胞受体结合的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使宿主细胞接触包括选自单克隆抗体mw05、mw06、mw07中的一种、两种或三种抗体；
34.其中，
35.所述mw05具有seq id no:1所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:2所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3；
36.所述mw06具有seq id no:3所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:4所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3；
37.所述mw07具有seq id no:5所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:6所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3。
38.进一步，根据本发明的实施例，使sars-cov-2变异株和宿主细胞相互作用的体系中，至少包括单克隆抗体mw06。
39.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个位点的突变：
40.446g、501n、455l、417k、475a、505y、493q、453y、486f、446g、501n、417k、456f、477s、439n、520a、344a、382v、367v、330p、479p、483v、494s、518l、444k、477s、341v、384p、354n、478t、408r、459s、483v、476g、484e、385t、348a、506q、334n、370n、373s、403r、411a、481n、508y、414q，
41.其中，所述突变包括缺失、取代、插入。
42.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个突变：
43.446g》v、501n》y、455l》f、417k》n、475a》v、505y》c、493q》l、453y》f、486f》l、446g》s、501n》t、417k》r、456f》l、477s》n/i/t、439n》k、520a》s、344a》t/s、382v》l、367v》f/l、330p》s/a、479p》s、483v》a、494s》p/a、518l》i、444k》n、477s》r、341v》i、384p》l、354n》k、478t》k/i/r、408r》k/i/t、459s》y/f、483v》i/f、476g》s000、484e》k/q、385t》n/i、348a》t/s、506q》k/*、334n》k、370n》s、373s》l、403r》k、411a》s、481n》d、508y》h、414q》k/*/x。
44.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变位点如下：
45.k444、v445、g446、y449、n450、l452、y453、l455、f456、t470、v483、e484、g485、f486、c488、f490、q493、s494、n501、k417 n501 e484、d614。
46.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变如下：
47.k444n、k444r、v445f、g446v、y449f、n450k、l452r、l452m、y453f、l455f、f456l、t470n、v483a、v483i/f、e484d、e484k/q、g485s/r、f486l、c488r、f490s、f490l/v、q493l、s494l、s494p、n501y、k417t n501y e484k、d614g。
48.第五方面，本发明提供一种提高抗sars-cov-2s蛋白抗体对sars-cov-2变异株中和活性的方法。根据本发明的实施例，该方法利用前述的预防或治疗sars-cov-2变异株感染的药物增强抗sars-cov-2s蛋白抗体对sars-cov-2变异株中和活性。
49.第六方面，本发明提供一种提高抗sars-cov-2s蛋白抗体对sars-cov-2变异株中和活性的方法。根据本发明的实施例，该方法利用mw06增强抗sars-cov-2s蛋白抗体对sars-cov-2变异株中和活性，其中，所述mw06的轻链可变区具有seq id no:13所示的lcdr1、seq id no:14所示的lcdr2和seq id no:15所示的lcdr3，且所述mw06的重链可变区具有seq id no:16所示的hcdr1、seq id no:17所示的lcdr2和seq id no:18所示的hcdr3。
50.进一步，根据本发明的实施例，抗sars-cov-2s蛋白抗体能够中和sars-cov-2野生株对宿主细胞的感染，但对sars-cov-2变异株的中和活性显著降低。
51.进一步，根据本发明的实施例，使抗sars-cov-2s蛋白抗体阻止sars-cov-2变异株与宿主细胞相互作用的体系中，至少包括单克隆抗体mw06。
52.进一步，根据本发明的实施例，抗sars-cov-2s蛋白抗体包括mw05、mw07，其中
53.所述mw05的轻链可变区具有seq id no:7所示的lcdr1、seq id no:8所示的lcdr2和seq id no:9所示的lcdr3，且所述mw05的重链可变区具有seq id no:10所示的hcdr1、seq id no:11所示的hcdr2和seq id no:12所示的hcdr3；
54.所述mw07的轻链可变区具有seq id no:19所示的lcdr1、seq id no:20所示的lcdr2和seq id no:21所示的lcdr3，且所述mw07的重链可变区具有seq id no:22所示的hcdr1、seq id no:23所示的hcdr2和seq id no:24所示的hcdr3。
55.根据本发明的实施例，所述mw05的轻链可变区包括seq id no:1所示的氨基酸序列，且重链可变区包括seq id no:2所示的氨基酸序列。
56.根据本发明的实施例，所述mw06的轻链可变区包括seq id no:3所示的氨基酸序列，且重链可变区包括seq id no:4所示的氨基酸序列。
57.根据本发明的实施例，所述mw07的轻链可变区包括seq id no:5所示的氨基酸序列，且重链可变区包括seq id no:6所示的氨基酸序列。
58.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个位点的突变：
59.446g、501n、455l、417k、475a、505y、493q、453y、486f、446g、501n、417k、456f、477s、439n、520a、344a、382v、367v、330p、479p、483v、494s、518l、444k、477s、341v、384p、354n、478t、408r、459s、483v、476g、484e、385t、348a、506q、334n、370n、373s、403r、411a、481n、508y、414q，
60.其中，所述突变包括缺失、取代、插入。
61.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个突变：
62.446g》v、501n》y、455l》f、417k》n、475a》v、505y》c、493q》l、453y》f、486f》l、446g》s、501n》t、417k》r、456f》l、477s》n/i/t、439n》k、520a》s、344a》t/s、382v》l、367v》f/l、330p》s/a、479p》s、483v》a、494s》p/a、518l》i、444k》n、477s》r、341v》i、384p》l、354n》k、478t》k/i/r、408r》k/i/t、459s》y/f、483v》i/f、476g》s000、484e》k/q、385t》n/i、348a》t/s、506q》k/*、334n》k、370n》s、373s》l、403r》k、411a》s、481n》d、508y》h、414q》k/*/x。
63.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变位点如下：
64.k444、v445、g446、y449、n450、l452、y453、l455、f456、t470、v483、e484、g485、f486、c488、f490、q493、s494、n501、k417 n501 e484、d614。
65.进一步，本根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变如下：
66.k444n、k444r、v445f、g446v、y449f、n450k、l452r、l452m、y453f、l455f、f456l、t470n、v483a、v483i/f、e484d、e484k/q、g485s/r、f486l、c488r、f490s、f490l/v、q493l、s494l、s494p、n501y、k417t n501y e484k、d614g。
67.第七方面，本发明提供一种稳定sars-cov-2s蛋白构象、和/或使sars-cov-2变异株s蛋白恢复或部分恢复野生株s蛋白构象的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使sars-cov-2变异株接触前述的预防或治疗sars-cov-2变异株感染的药物。
68.第八方面，本发明提供一种稳定sars-cov-2s蛋白构象、和/或使sars-cov-2变异株s蛋白恢复或部分恢复野生株s蛋白构象的方法。根据本发明的实施例，该方法包括使sars-cov-2变异株接触mw06，其中，所述mw06的轻链可变区具有seq id no:13所示的lcdr1、seq id no:14所示的lcdr2和seq id no:15所示的lcdr3，且所述mw06的重链可变区具有seq id no:16所示的hcdr1、seq id no:17所示的hcdr2和seq id no:18所示的hcdr3。
69.根据本发明的实施例，所述mw06的轻链可变区包括seq id no:3所示的氨基酸序列，且重链可变区包括seq id no:4所示的氨基酸序列。进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个位点的突变：
70.446g、501n、455l、417k、475a、505y、493q、453y、486f、446g、501n、417k、456f、477s、439n、520a、344a、382v、367v、330p、479p、483v、494s、518l、444k、477s、341v、384p、354n、478t、408r、459s、483v、476g、484e、385t、348a、506q、334n、370n、373s、403r、411a、481n、508y、414q，
71.其中，所述突变包括缺失、取代、插入。
72.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个突变：
73.446g》v、501n》y、455l》f、417k》n、475a》v、505y》c、493q》l、453y》f、486f》l、446g》s、501n》t、417k》r、456f》l、477s》n/i/t、439n》k、520a》s、344a》t/s、382v》l、367v》f/l、330p》s/a、479p》s、483v》a、494s》p/a、518l》i、444k》n、477s》r、341v》i、384p》l、354n》k、478t》k/i/r、408r》k/i/t、459s》y/f、483v》i/f、476g》s000、484e》k/q、385t》n/i、348a》t/s、506q》k/*、334n》k、370n》s、373s》l、403r》k、411a》s、481n》d、508y》h、414q》k/*/x。
74.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变位点如下：
75.k444、v445、g446、y449、n450、l452、y453、l455、f456、t470、v483、e484、g485、f486、c488、f490、q493、s494、n501、k417 n501 e484、d614。
76.进一步，根据本发明的实施例，所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变如下：
77.k444n、k444r、v445f、g446v、y449f、n450k、l452r、l452m、y453f、l455f、f456l、
t470n、v483a、v483i/f、e484d、e484k/q、g485s/r、f486l、c488r、f490s、f490l/v、q493l、s494l、s494p、n501y、k417t n501y e484k、d614g。
78.第九方面，本发明提供一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的方法。根据本发明的实施例，该方法包括对受试者施用前述的预防或治疗sars-cov-2变异株感染的药物。
79.第十方面，本发明提供一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的方法。根据本发明的实施例，该方法包括对受试者施以选自单克隆抗体mw05、mw06、mw07中的一种、两种或三种抗体；
80.其中，
81.所述mw05具有seq id no:1所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:2所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3；
82.所述mw06具有seq id no:3所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:4所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3；
83.所述mw07具有seq id no:5所示轻链中的lcdr1、lcdr2、lcdr3，以及seq id no:6所示重链中的hcdr1、hcdr2、hcdr3。
84.进一步，本发明所述一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的方法，其特征在于至少包括单克隆抗体mw06。
85.进一步，本发明所述一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的方法，其特征在于所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个位点的突变：
86.446g、501n、455l、417k、475a、505y、493q、453y、486f、446g、501n、417k、456f、477s、439n、520a、344a、382v、367v、330p、479p、483v、494s、518l、444k、477s、341v、384p、354n、478t、408r、459s、483v、476g、484e、385t、348a、506q、334n、370n、373s、403r、411a、481n、508y、414q，
87.其中，所述突变包括缺失、取代、插入。
88.进一步，本发明所述一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的方法，其特征在于所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区中以下位点中的一个或多个突变：
89.446g》v、501n》y、455l》f、417k》n、475a》v、505y》c、493q》l、453y》f、486f》l、446g》s、501n》t、417k》r、456f》l、477s》n/i/t、439n》k、520a》s、344a》t/s、382v》l、367v》f/l、330p》s/a、479p》s、483v》a、494s》p/a、518l》i、444k》n、477s》r、341v》i、384p》l、354n》k、478t》k/i/r、408r》k/i/t、459s》y/f、483v》i/f、476g》s000、484e》k/q、385t》n/i、348a》t/s、506q》k/*、334n》k、370n》s、373s》l、403r》k、411a》s、481n》d、508y》h、414q》k/*/x。
90.进一步，本发明所述一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的方法，其特征在于所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变位点如下：
91.k444、v445、g446、y449、n450、l452、y453、l455、f456、t470、v483、e484、g485、f486、c488、f490、q493、s494、n501、k417 n501 e484、d614。
92.进一步，本发明所述一种预防或治疗sars-cov-2变异株感染的方法，其特征在于所述sars-cov-2变异株具有选自s蛋白rbd区的突变如下：
93.k444n、k444r、v445f、g446v、y449f、n450k、l452r、l452m、y453f、l455f、f456l、t470n、v483a、v483i/f、e484d、e484k/q、g485s/r、f486l、c488r、f490s、f490l/v、q493l、s494l、s494p、n501y、k417t n501y e484k、d614g。
94.为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。
95.术语“冠状病毒”是指套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)的成员。本发明所述冠状病毒主要涉及感染人的冠状病毒，包括hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov、mers-cov、sars-cov-2(2019-ncov)，本发明所述冠状病毒特别涉及sars-cov、mers-cov、sars-cov-2(2019-ncov)。
96.术语“特异性”是指在蛋白和/或其他生物异质群体中确定是否存在所述蛋白，例如本发明所述单抗与sars-cov-2rbd蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著的量与样本中存在的其它蛋白结合。
97.本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称vh)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即ch1、ch2和ch3。各轻链由轻链可变区(简称vl)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域cl构成。vh和vl区还可以划分为称作互补决定区(cdr)的高变区，其由较为保守的框架区(fr)区分隔开。各vh和vl由三个cdr以及四个fr构成，从氨基端到羧基端以fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(c1q)。
98.术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。
99.本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1构成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1构成的fd片段；(iv)由抗体单臂vl和vh构成的fv片段；(v)由vh构成的dab片段(ward et al.，(1989)nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(cdr)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中vl和vh区配对形成单价分子(称为单链fc(scfv)；参见例如bird et al.，(1988)science 242：423-426；and huston et al.，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。
100.本发明的抗原结合片段包括能够特异性结合冠状病毒rbd的那些。抗体结合片段的实例包括例如但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv片段、单链fv(scfv)片段和单结构域片段。
101.fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段与fab片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在f(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。fab和f(ab')2片段缺乏完整抗体的片段可结晶(fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能
具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，wahl等人，1983，j.nucl.med.24:316)。
102.如本领域通常理解的，“fc”区是不包含抗原特异性结合区的抗体的片段可结晶恒定区。在igg、iga和igd抗体同种型中，fc区由两个相同的蛋白质片段组成，衍生自抗体的两条重链的第二和第三恒定结构域(分别为ch2和ch3结构域)。igm和ige fc区在每条多肽链中含有三个重链恒定结构域(ch2、ch3和ch4结构域)。
[0103]“fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(vh-vl二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个cdr相互作用，以限定在vh-vl二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个cdr对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域(或仅包含对于靶特异性的三个cdr的fv的一半)可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。
[0104]“单链fv”或“scfv”抗体结合片段包含抗体的vh和vl结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，fv多肽进一步包含在vh和vl结构域之间的多肽接头，其致使scfv能够形成有利于靶结合的结构。
[0105]“单结构域片段”由对冠状病毒rbd显示出足够亲和力的单个vh或vl结构域组成。在一个具体实施方案中，单结构域片段是骆驼化的(参见例如，riechmann，1999，journal ofimmunological methods 231:25
–
38)。
[0106]
本发明的抗冠状病毒rbd的抗体包括衍生化抗体。例如，衍生化抗体通常通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白酶解切割、与细胞配体或其它蛋白质的连接来修饰。可以通过已知技术进行众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多种非天然氨基酸，例如，使用ambrx技术(参见例如，wolfson，2006，chem.biol.13(10):1011-2)。
[0107]“人源抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或动物中分离的抗体，所述动物对于一种或多种人免疫球蛋白是转基因的，并且不表达内源免疫球蛋白。人抗体可以通过本领域已知的各种方法制备，所述方法包括使用衍生自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及pct公开wo 98/46645；wo 98/50433；wo 98/24893；wo 98/16654；wo 96/34096；wo96/33735；和wo 91/10741。还可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人抗体。参见例如，pct公开wo 98/24893；wo 92/01047；wo 96/34096；wo 96/33735；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；和5,939,598。另外，使用与上述类似的技术，公司例如lakepharma，inc.
[0108]
(belmont，ca)或creative biolabs(shirley，ny)可以从事于提供针对所选抗原的人抗体。可以使用被称为“引导选择”的技术生成识别所选表位的全人抗体。在该方法中，选择的非人单克隆抗体，例如小鼠抗体，用于引导识别相同表位的完全人抗体的选择(参见，jespers等人，1988，biotechnology12:899-903)。
[0109]
术语“识别抗原的抗体”以及“对抗原特异的抗体”在本文中与术语“特异结合抗原的抗体”交替使用。
[0110]
术语“高亲和性”对于igg抗体而言，是指对于抗原的kd为1.0
×
10-6
m以下，优选5.0
×
10-8
m以下，更优选1.0
×
10-8
m以下、5.0
×
10-9
m以下，更优选1.0
×
10-9
m以下。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，igm亚型的“高亲和性”结合是指kd为10-6
m以下，优选10-7
m以下，更优选10-8
m以下。
[0111]
术语“kassoc”或“ka”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而术语“kdis”或“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。术语“kd”是指解离常数，由kd与ka比(kd/ka)得到，并以摩尔浓度(m)表示。抗体的kd值可以通过领域内已知的方法确定。优选的确定抗体kd的方式是使用表面等离子共振仪(spr)测得的，优选使用生物传感系统例如biacoretm系统测得。
[0112]
术语“ec50”，又叫半最大效应浓度，是指引起50％最大效应的抗体浓度。
[0113]
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
[0114]
第一，系统研究了mw05、mw06、mw07对多种sars-cov-2变异毒株的中和能力，发现三种毒株对b.1.1.7株仍具有较好的中和活性，但对b.1.351株的中和活性则出现明显分化，mw05对野生株中和活性较好，然而对b.1.351则丧失了中和活性；mw06对野生型中和活性一般，但对b.1.351的中和活性无显著降低；mw07对b.1.351的中和活性也显著降低。
[0115]
第二，本发明通过将抗体联用，取得了对sars-cov-2变异毒株良好的中和效果。不希望受理论的束缚，本发明mw06增强mw05、mw07对变异株中和活性的机理在于通过mw06的结合稳定了变异株s蛋白的构象，使得变异株s蛋白在构象上向着野生株s蛋白的构象恢复，因而经过mw06结合诱导的sars-cov-2变异毒株恢复了对mw05、mw07的敏感性，上述机理是本发明抗体mw05、mw06、mw07组合协同增效的原因之一。
[0116]
第三，本发明证实了尽管sars-cov-2变异众多，某些变异体对部分单抗具有逃避作用，但利用针对野生株s蛋白的多个抗体组合仍然能够有效中和变异毒株。为抗sars-cov-2抗体鸡尾酒疗法提供了理论依据和具体方案，即使抗sars-cov-2单抗mw05和mw07对变异株的中和活性均产生较大下降，将二者组合仍能取得较好中和效果。
附图说明
[0117]
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
[0118]
图1：mw05对野生型、b.1.1.7株和b.1.351株假病毒中和活性
[0119]
图2：mw06对野生型、b.1.1.7株和b.1.351株假病毒中和活性
[0120]
图3：mw07对野生型、b.1.1.7株和b.1.351株假病毒中和活性
具体实施方式
[0121]
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0122]
实施例1突变体抗原重组蛋白制备
[0123]
1.s1rbd区流行突变株与mw05结合关键氨基酸的相关性
[0124]
根据国家生物信息中心-2019新型冠状病毒信息库数据(https://bigd.big.ac.cn/ncov)中基因组变异注释分析(https://bigd.big.ac.cn/ncov/variation/annotation)功能，将所有s基因区域突变株信息表格进行下载后，对其中发生氨基酸突变的突变株进行筛选、汇总；并对其中突变位点属于rbd区域(319-533aa)的突变株进行进一步汇总，进一步分析ace2结合区的突变株情况。同时根据表格中提供的突变株基因组位置信息，从基因组变异注释分析(https://bigd.big.ac.cn/ncov/variation/annotation)功能中查找到基因组位置对应的突变株详细信息，如突变株名称、数据来源、序列质量、采样地点、样本提供单位等信息。详见表1：
[0125]
表1.位于s1rbd区的流行突变株统计分析
[0126]
[0127][0128]
对比mw05关键位点和突变株录入频率，选择下述突变株的s1rbd突变体进行重组蛋白表达制备，并分别对mw05(vl如seq id no:1所示、vh如seq id no:2所示)、mw06(vl如seq id no:3所示、vh如seq id no:4所示)和mw07(vl如seq id no:5所示、vh如seq id no:6所示)与各突变体的结合和阻断活性进行分析，评估mw05对上述突变的抵抗情况以及联用mw06或mw07对突变失活的抵抗作用。
[0129]
表2.构建s1rbd突变体重组蛋白关键信息
[0130]
[0131][0132]
1.s1rbd-his和s1rbd-mfc突变体的制备
[0133]
将sars-cov-2 spike rbd(qhd43416.1，319-533aa)基因克隆至c端带有his tag或mfc的真核表达载体中，构建c端带有his或mfc标签的sars-cov-2spike rbd真核表达质粒。将质粒通过转染试剂293fectin(cat:12347019,life technologies)，转入hek293细胞中，进行瞬时表达，4天后收集上清，采用histrap hp亲和层析柱(cat:17-5248-01,ge)或mabselect亲和层析柱(cat:29-0491-04,ge)进行纯化，随后通过超滤浓缩管(cat:vs0122,sartorius stedim)超滤，将buffer置换为pbs。并通过sec-hplc及sds-page确定sars-cov-2 spike rbd的纯度及大小。
[0134]
2.hace2-hfc的制备
[0135]
将human ace2(np_068576.1，1-615aa)基因克隆至c端带有human fc tag的真核表达载体中，构建好human ace2-hfc真核表达质粒。将质粒通过转染试剂293fectin(cat:12347019,life technologies)，转入hek293细胞中，进行瞬时表达，4天后收集上清，采用mabselect亲和层析柱(cat:29-0491-04,ge)进行纯化，随后通过超滤浓缩管(cat:vs0122,
sartorius stedim)超滤，将buffer置换为pbs。并通过sec-hplc及sds-page确定human ace2-hfc的纯度及大小。
[0136]
3.重组抗s1rbd抗体mw05、mw06和mw07的制备
[0137]
将构建好的含有mw05、mw07或mw06轻重链基因的真核表达质粒，通过nucleorfectortm 2b电转染cho-k1(atcc,suspension)，msx(cat:m5379,sigma)加压筛选，获得稳定表达pool，通过收集表达pool fed-batch培养上清，采用mabselect亲和层析柱(cat:29-0491-04,ge)进行纯化。并通过sec-hplc及sds-page确定抗体的纯度及大小。
[0138]
实施例2mw05、mw06及mw07与s1rbd突变体的结合活性分析
[0139]
采用elisa方法分析抗体与野生型s1rbd及各突变体的结合活性。实验步骤描述如下：包被sars-cov-2spike rbd及rbd mutants，浓度为10μg/ml；100μl/孔；4℃过夜；5％bsa in pbs，37℃，120min,pbst洗板4次；将mw05、mw06、mw07、mw05 mw06、mw05 mw07(起始浓度为1μg/ml，3倍连续稀释，12个梯度)重组蛋白加入包被孔中，100μl/孔，37℃恒温培养箱反应60min；pbst洗板4次；加二抗hrp-anti-human fc(1:5000)(cat：109-035-098，jackson immuno research)，37℃，45min，pbst洗板4次；tmb(cat:me142，北京泰天河生物)显色，37℃，10min；2m hcl终止反应；读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值。
[0140]
实验结果显示，mw05、mw06和mw07与野生型s1rbd(wt-s1rbd)均具有良好的结合活性(表3)，mw05对部分突变体结合活性未发生明显降低(比活性在50％-300％)，而有些突变株如g446v、l455f、s494p和n501y的结合活性发生较大幅度下降(＞300％)，同时，由于对关键的互作位点e484k、e484q以及南非突变株的s1rbd突变体k417n e484k n501y的结合活性完全丢失。而与mw05完全不同表位的mw06则完全可以抵抗mw05在个别突变株上的结合活性降低，包括对英国株的突变位点n501y和南非株的突变体k417n e484k n501y,当mw05和mw06以1:1联用时，不仅针对野生株的结合活性提高，同时，也可以拯救mw05对突变株的失活。另一个抗体mw07对大部分突变株的结合活性未发生明显降低(比活性在50％-300％)，仅对v483f、e489k、n501y以及k417n e484k n501y结合活性降低幅度大(比活性＞300％)，当mw05和mw07以1:1联用时，对野生型的结合活性明显提高的同时，虽然对部分突变株的结合活性与野生型相比在l455f、e484k/q以及n501y上比活性下降超过300％，但整体ec50仍维持在较高活性水平。对比mw05、mw06和mw07在突变株s1rbdmut上的活性变化，mw06可以完全弥补mw05在突变株活性上的降低，mw07可以部分弥补mw05的活性降低。
[0141]
表3.mw05/mw06/mw07对不同突变体的结合活性变化
[0142][0143]
实施例3mw05、mw06及mw07对s1rbd突变体/ace2结合的阻断活性分析
[0144]
采用竞争结合elisa方法分析抗体对野生型s1rbd及各突变体与ace2的阻断活性。实验步骤描述如下：
[0145]
1.包板：包被human ace2-hfc(1-615)，浓度为0.75ug/ml；每孔100ul；4℃过夜；
[0146]
2.封闭：5％bsa in pbs，37℃,120min,pbst洗板4次；
[0147]
3.加一抗：100ul 100ng/ml sars-cov-2spike rbd-mfc/sars-cov spikerbd-mfc，加入100ul mw06，mw05 mw06(40ug/ml，3倍稀释，12个梯度)，略震荡混匀放置50min，加入ace2包被孔，100ul/孔；37℃恒温培养箱反应60min；
[0148]
4.加二抗：hrp-anti-mouse igg(1:5000)(cat:115-035-071，jackson immunoresearch)，37℃，45min，pbst洗板4次；
[0149]
5.显色：tmb(cat:me142，北京泰天河生物)显色，37℃，10min；
[0150]
6.终止：2m hcl终止反应；
[0151]
7.读数：读取并记录波长450nm下孔板的吸光度值。
[0152]
实验结果显示，mw05、mw06和mw07与野生型s1rbd(wt-s1rbd)均具有良好的阻断活性(表4)，mw05对部分突变体阻断活性未发生明显降低(比活性在50％-300％)，而有些突变株如e484k、e484q、f490l、f490v、s494p、n501y以及组合突变的南非株突变体的阻断活性发
生较大幅度下降或完全丢失。而与mw05完全不同表位的mw06则完全对mw05所有阻断活性降低的突变株均保持良好的阻断活性，与针对野生型的阻断活性相比未发生明显变化，包括对英国株的突变位点n501y和南非株的突变体k417n e484k n501y。当mw05和mw06以1:1联用时，不仅针对野生株的阻断活性提高，同时，也可以拯救mw05对突变株的失活。
[0153]
另一个抗体mw07对大部分突变株的阻断活性未发生明显降低(比活性在50％-300％)，而对南非株突变k417n e484k n501y阻断活性完全丢失，当mw05和mw07以1:1联用时，对野生型的阻断活性略有提高的同时，对mw05的绝大部分突变体阻断活性的下降和丢失均具有拯救作用。
[0154]
表4.mw05/mw06/mw07对不同突变体与ace2结合的阻断活性变化
[0155][0156]
实施例4mw05、mw06和mw07对野生型、英国突变株、南非突变株假病毒中和活性评价。
[0157]
利用假病毒系统对mw05，mw06和mw07对野生、英国和南非突变株假病毒的中和活性进行评价，关键物料信息如下：
[0158][0159][0160]
将梯度稀释的供试品加入到细胞白板内，与750tcid 50/孔的假病毒混合后，置于37℃，5％co2培养箱内中和反应1h。待中和反应完成后，在上述培养板内分别加入huh-7/ace2细胞(2e5 cells/孔)，37℃，5％co2孵育20～28小时。取出细胞培养板，弃掉上清，按照100μl/孔加入荧光素酶分析试剂，避光反应2min后，进行酶标仪读数。
[0161]
研究结果显示(表5)，mw05(图1)和mw07(图3)对野生型和英国突变株均保持了良好的中和活性，但对南非株均丧失了中和活性。但mw06尽管对野生型假病毒中和活性不高，但对英国株和南非株均保持了较好的中和活性。假病毒中和活性实验结果显示，在英国突变株的中和活性上，尽管mw05和mw07在结合和阻断活性上有不同程度降低，但细胞中和活性并未发生明显变化，提示三个抗体在应对英国突变株的中和活性上均具有良好的效果。而针对多位点均发生突变的南非株，mw06仍然能够发挥中和作用。
[0162]
这些研究结果提示，mw05、mw06和mw07在表位上的互补性使其在针对新冠的不同流行突变株时，能够互相弥补单一抗体的活性下降或失活，从而为三者的鸡尾酒疗法应对新冠突变提供了更多的选择。
[0163]
表5.mw05/mw06/mw07对野生型及英国和南非突变株假病毒中和活性比较
[0164][0165]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。