黄芩新素作为NQO1抑制剂在预防或治疗相关疾病中的应用

黄芩新素作为nqo1抑制剂在预防或治疗相关疾病中的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，具体地说，是黄芩新素在制备nqo1抑制剂中的应用，以及在制备预防或治疗马兜铃酸肝肾损伤药物中的应用。


背景技术：

[0002][0003]
nadph醌氧化还原酶(nadph:quinone oxidoreductase，nqo1)是由274 个氨基酸构成的两个互锁单体形成的二聚体。nqo1大部分位于胞质酶，是一种专性的双电子还原酶，可以催化醌类，偶氮和硝基芳香化合物的还原反应。 nrf2/nqo1信号通路与氧化应激有关，活性物质可以通过调节nrf2/nqo1信号通路来发挥其抗氧化作用(jiang xp,tang jy,xu z,han p,qin zq,yang cd, wang sq,tang m,wang w,qin c,et al.sulforaphane attenuatesdi-n-butylphthalate-induced reproductive damage in pubertal mice:involvement ofthe nrf2-antioxidant system.environ toxicol.2017；32:1908
–
1917.)。nqo1作用广泛，在马兜铃酸引起的药物损伤及多种疾病的进展中均有报道。
[0004]
已知的马兜铃酸类化合物主要有4种，分别为马兜铃酸ⅰ、ⅱ、ⅲ、ⅳ，其中马兜铃酸ⅰ(aristolochic acid i，aai)为主要毒性成分(zhang h c,liu r,anz p,li h,zhang r,zhou f.aristolactam-type alkaloids and aristolochic acids fromaristolochia moupinensis and aristolochia cathcartii[j].biochemical systematics& ecology,2016,65:198-201.)。马兜铃酸i的毒性机制主要是将硝基还原与dna 碱基环结合生成相应的aa-dna加合物(图1)，进而造成器官组织损伤，甚至诱导突变促进癌症发生(li j,zhang l,jiang z,shu b,li f,bao q,zhang l. toxicities of aristolochic acid i and aristololactam i in cultured renal epithelialcells[j].toxicology in vitro,2010,24(4):1092-7.)。而nqo1是胞质中还原激活 aai最高效的酶，nqo1酶活性的增强与aai的代谢活化密切相关(marie s, eva f,bruno s,kl
á
ra s,vladim
í
ra m,martina l,tereza k,manfred w,schmeiserh h.human cytosolic enzymes involved in the metabolic activation ofcarcinogenic aristolochic acid:evidence for reductive activation by humannad(p)h:quinone oxidoreductase[j].carcinogenesis,(10):1695-703；levova k, moserova m,nebert d w,phillips d h,frei e,schmeiser h h,arlt v m, stiborova m.nad(p)h:quinone oxidoreductase expression in cyp1a-knockout andcyp1a-humanized mouse lines and its effect on bioactivation of the carcinogenaristolochic acid i[j].toxicol appl pharmacol,2012,265(3):360-7)。
[0005]
除了介导马兜铃酸毒性导致的组织损伤外，nqo1也参与了多种疾病的发生及进展。研究发现在慢性乙型肝炎中，nqo1通过调节hbx蛋白的稳定性在hbv病毒dna复制中发挥作用。具体机制为:内源性的nqo1可以结合并保护hbx蛋白免受20s蛋白酶体介导的降解，促进hbv cccdna的转录，进而利于hbv病毒的复制(cheng st,hu jl,ren jh,yu hb,zhong s,
induced allergic rhinitis through the blocking of th2 cytokineproduction and mast cell histamine release[j].international iμmunopharmacology, 2017,52:77-84.；skullcapflavone ii inhibits osteoclastogenesis by regulatingreactive oxygen species and attenuates the survival and resorption function ofosteoclasts by modulating integrin signaling.[j].faseb journal official publicationof the federation of american societies for experimental biology,2018.；parsafars,nayeri z,aliakbari f,et al.multiple neuroprotective features of scutellariapinnatifida
–
derived small molecule[j].heliyon,2020,6(8):e04737.；najaran z t, mousavi s h,rasoulinejad m,et al.growth inhibition and apoptosis inductionby vincetoxicum pumilum decne.on hl-60 and k562 leukemic cell lines[j]. jundishapur journal of natural pharmaceutical products,2016.)。
[0009]
目前尚无有关黄芩新素抑制nqo1的活性，及其应用于减轻马兜铃酸毒性损伤等相关疾病的文献报道。


技术实现要素：

[0010]
本发明的目的在于提供一种新的低不良反应的nadph醌氧化还原酶 (nqo1)抑制剂——黄芩新素(skullcapflavone ii，sfii)，分子式为5,2'-二羟基-6,7,8,6'-四甲氧基黄酮，其化学结构式如式(i)所示；并进一步根据酶活抑制筛选，确定了黄芩新素在制备nqo1抑制剂中的应用，以及在制备预防或治疗nqo1介导的马兜铃酸肝肾损伤药物中的应用。
[0011][0012]
本发明的第一方面，提供黄芩新素作为nqo1抑制剂的应用。
[0013]
进一步的，所述的nqo1抑制剂为抑制nqo1活性的试剂或药物。
[0014]
本发明对黄芩提取液(共60种化合物)进行全二维生物色谱筛选，通过生物色谱系统筛选出可与nqo1蛋白结合的天然候选单体分子，分别为黄芩新素，千层纸素，汉黄芩素，杨芽黄素。进一步根据nqo1酶活抑制实验及spr 亲和力实验(图2)，确定了黄芩新素为优选的nqo1抑制剂。同时，小鼠凝血检测显示，与已有nqo1抑制剂双香豆素相比，黄芩新素无显著抑制凝血功能。
[0015]
本发明的第二方面，提供黄芩新素作为nqo1抑制剂在制备预防或治疗 nqo1介导
疾病的药物中的应用。
[0016]
进一步的，所述的nqo1介导疾病为nqo1参与调控(包括nqo1表达水平升高或酶活性异常等)其病理过程的一系列疾病。这些疾病包括但不限于马兜铃酸毒性作用导致的肝肾损伤，hbv病毒感染导致的慢性肝炎，肝癌，乳腺癌，结直肠癌等。
[0017]
本发明通过体内外实验验证nqo1抑制剂黄芩新素能有效抑制马兜铃酸的毒性，治疗或预防马兜铃酸导致的肝肾损伤。
[0018]
本发明的第三方面，提供黄芩新素在制备抑制马兜铃酸毒性的药物中的应用。
[0019]
本发明的第四方面，提供黄芩新素在制备预防或治疗马兜铃酸导致的肝肾损伤的药物中的应用。
[0020]
进一步的，所述的应用中，黄芩新素抑制马兜铃酸i造成的细胞毒性损伤，减轻马兜铃酸i对细胞的增殖抑制，减少细胞的dna损伤及凋亡。
[0021]
进一步的，所述的应用中，黄芩新素抑制马兜铃酸i造成的肝肾组织中的细胞凋亡，减轻马兜铃酸i导致的肾脏纤维化和肝肾组织损伤。
[0022]
本发明的第五方面，提供黄芩新素在制备预防或治疗马兜铃酸导致的肾脏纤维化的药物中的应用。
[0023]
本发明的第六方面，提供一种预防或治疗马兜铃酸导致的肝肾损伤的药物，所述的药物是以nqo1抑制剂——黄芩新素为唯一的活性成份，或包含黄芩新素的药物组合物。
[0024]
进一步的，所述的包含黄芩新素的药物组合物是指黄芩新素与药学上允许的一种或多种辅料构成的药物组合物。
[0025]
进一步的，所述的辅料为稀释剂、赋形剂、粘合剂、填充剂、崩裂剂、香味剂、甜味剂中的至少一种。所述的药学上允许的一种或多种辅料是指药学领域常规的药物辅料，其中，稀释剂、赋形剂如水等；粘合剂如纤维素衍生物、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂如淀粉等；崩裂剂如碳酸钙或碳酸氢钠；也可以在药物组合物中加入其他辅助剂如香味剂和/或甜味剂。
[0026]
本发明优点在于：
[0027]
1、本发明提供了一种新的低不良反应的nqo1抑制剂——黄芩新素，为基于nqo1活性抑制的药物提供了新的选择，具有较好的市场价值和临床应用前景；
[0028]
2、本发明对黄芩中的活性化合物与nqo1蛋白进行结合分析，从黄芩的 60种活性化合物中筛选出强效的nqo1活性抑制化合物，并利用nqo1酶活抑制实验和小鼠凝血实验等，筛选出酶活抑制效率高安全性较好的化合物——黄芩新素。通过cck8细胞增殖实验，流式细胞术及western blot对人肝细胞 lo2、人肾近曲小管上皮细胞hk-2的增殖，凋亡及dna损伤等指标进行测定；结果显示，nqo1抑制剂黄芩新素能有效抑制马兜铃酸i对lo2和hk-2 造成的细胞毒性损伤，减少细胞的dna损伤及凋亡。单用黄芩新素几乎对细胞的增殖、凋亡、dna损伤等方面无影响。动物体内实验结果表明，nqo1 抑制剂黄芩新素预给药使小鼠的肝肾组织损伤明显减少，说明nqo1抑制剂黄芩新素可以有效预防或治疗马兜铃酸对小鼠导致的脏器毒性。因此nqo1抑制剂黄芩新素在预防或治疗马兜铃酸导致的毒性损伤时具有良好的应用前景，能够作为潜在的抗马兜铃酸毒性药物，具有进一步开发前景，为基于抑制nqo1 活性的药物开发提供了新的选择。
附图说明
[0029]
图1.马兜铃酸i的毒性机制。
[0030]
图2.nqo1酶活抑制实验及spr亲和力实验；(a)sfii与nqo1蛋白spr 亲和力检测；(b)分子对接模。
[0031]
图3.通过二维生物色谱系统筛选黄芩中与nqo1蛋白结合的候选分子；其中，a图是oroxylin a和wogonin结合信号、b图是tectochrysin结合信号、 c图是sfii结合信号。
[0032]
图4.候选分子对nqo1蛋白酶活抑制ic50曲线。
[0033]
图5.活性候选分子细胞内nqo1酶活抑制检测。
[0034]
图6.活性候选分子对小鼠凝血功能影响示意图。
[0035]
图7.人肝细胞(lo2)和人肾近曲小管上皮细胞(hk-2)给药nqo1抑制剂黄芩新素后增殖变化比较示意图。
[0036]
图8.免疫荧光检测人肝细胞lo2和人肾近曲小管上皮细胞(hk-2)给药 nqo1抑制剂黄芩新素后细胞原位凋亡变化比较示意图。
[0037]
图9.western blot检测c57bl/6小鼠nqo1抑制剂黄芩新素给药后肝肾组织dna损伤及凋亡细胞变化情况。
[0038]
图10.c57bl/6小鼠nqo1抑制剂黄芩新素给药后肝肾组织细胞凋亡差异比较示意图。
具体实施方式
[0039]
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
[0040]
本发明实施例所用黄芩新素可以通过市售方式购买得到。
[0041]
实施例1：nqo1抑制剂的筛选
[0042]
一、实验药物、试剂及材料
[0043]
1.化合物：黄芩提取液，黄芩新素，千层纸素，汉黄芩，杨芽黄素，购自中国上海汇州生化科技有限公司；
[0044]
2.材料：人重组nqo1蛋白，3-巯丙基三甲氧基硅烷(mpts)，n-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酰亚胺(gmbs)，硅胶。
[0045]
3.人肝细胞(lo2)和人肾近曲小管上皮细胞(hk-2)由中国人民解放军海军军医大学第三附属医院信号转导国际合作实验室保存。
[0046]
4.nqo1蛋白活性检测使用abcam公司开发的nqo1酶活检测试剂盒。
[0047]
5.8周龄c57bl/6雄性小鼠，购自南京模式动物中心。
[0048]
二、实验方法：
[0049]
(一)通过二维nqo1柱/c18柱/tofms系统筛选黄芩中与nqo1蛋白结合的组分
[0050]
将硅胶与mpts在n-二甲基甲酰胺(n,n-dimethylformamide，dmf)溶液体系中充分地进行搅拌，使mpts的烷氧基与硅胶表面的硅醇基发生缩合反应，使硅胶表面与mpts键合，并留存游离的巯基基团。再将mpts硅胶与n-(4-马来酰亚胺丁酰基氧)琥珀酰亚胺(gmbs)在dmso溶液中充分反应，获得mpts/gmbs修饰硅胶。最后将nqo1重组蛋白与mpts/gmbs修饰硅胶在pbs中混合，实现nqo1蛋白在硅胶相上的共价固定。将nqo1色谱柱搭载于全二维生物色
counting kit-8assay(cck-8试剂盒)。
[0068]
6.细胞凋亡检测试剂为碧云天公司开发的annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒。
[0069]
二、实验方法：
[0070]
(一)黄芩新素减轻马兜铃酸i导致的细胞增殖抑制
[0071]
将培养中的lo2/hk-2接种于96孔板内，每孔内1
×
105个细胞，培养基 100μl，置于37℃、5％co2培养箱培养过夜。去培养基，设置空白对照(完全dmem培养液)，阳性对照组(马兜铃酸i)，实验组(马兜铃酸i 黄芩新素)，溶剂是完全dmem培养液。置于37℃、5％co2孵箱内，分别于0h，24h， 48h时间点，吸除孔内培养基，每孔内加入用生理盐水稀释的cck-8试剂100 μl，置于37℃、5％co2孵箱内，2h后，于酶标仪上检测每个孔细胞在450nm 的光密度值。每种药物浓度设三个重复孔，计算测出的光密度值的平均值。
[0072]
结果见图7，从图中可以看出，20μm浓度的aai(马兜铃酸ⅰ)对人肝细胞lo-2有非常明显的增殖抑制作用，当黄芩新素(sfii)与aai同时处理细胞时，细胞的增殖较单纯aai处理组明显升高(图7a)，甚至接近空白对照(完全培养基组)。与此同时，当黄芩新素浓度低于或等于10μm时，黄芩新素对 lo2细胞系没有明显毒性，即在这些浓度下，细胞增殖状态与培养基中不含有黄芩新素的细胞相似。在人肾近曲小管上皮细胞(hk-2)中也能看到类似的结果，sfii能显著减轻aai对于hk-2细胞的增殖抑制，且sfii对hk-2细胞也未见明显毒性(图7b)。
[0073]
(二)黄芩新素抑制马兜铃酸i导致的细胞凋亡
[0074]
将培养中的lo2/hk-2接种于48孔板内，每孔内5
×
105个细胞，培养基 300μl，置于37℃、5％co2培养箱培养过夜。去培养基，设置空白对照(完全dmem培养液)，阳性对照组(马兜铃酸i)，实验组(马兜铃酸i 黄芩新素)，溶剂是完全dmem培养液。置于37℃、5％co2孵箱内，于24h时间点，结束诱导。对48孔板进行离心的离心机1000g离心5分钟。吸除细胞培养液，加入pbs洗涤一次。在吸除pbs前1000g离心5分钟。加入195μl annexinv-fitc结合液。加入5μl annexin v-fitc，轻轻混匀。加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。随即在荧光显微镜下观察，annexin v-fitc为绿色荧光，碘化丙啶(pi)为红色荧光。
[0075]
结果见图8，从图中可以看出，当单纯aai给药时，对人肝细胞lo2有约20％处于凋亡状态，但是当黄芩新素同时处理细胞时，凋亡细胞的比例仅占 5％，该结果显示黄芩新素对aai诱导的细胞凋亡有非常显著的抑制作用(图 8a)。此外，当黄芩新素浓度等于10μm时，黄芩新素对lo-2细胞系没有凋亡作用，细胞的凋亡数量及状态与培养基中不含有黄芩新素的细胞相似。给药处理24h后，凋亡检测显示sfii可明显减少hk-2细胞凋亡的比例(图8b)。
[0076]
实施例3：nqo1抑制剂黄芩新素对小鼠肝、肾组织的保护作用
[0077]
一、实验药物、试剂及材料
[0078]
1.化合物：黄芩新素，cas:55084-08-7，购自selleck chemicals在上海设立的子公司上海蓝木化工有限公司。马兜铃酸i，cas:313-67-7，购自美国sigma公司。
[0079]
2.2周龄c57bl/6雄性小鼠，购自南京模式动物中心。
[0080]
二、实验方法：
[0081]
阳性对照组和实验组和空白对照组小鼠
[0082]
给药组小鼠提前12h单次腹腔给予黄芩新素(10mg/kg，橄榄油作为溶剂), 黄芩新
素预处理12h后再腹腔给予aai(20mg/kg)，阳性对照组提前12h单次腹腔给予同体积橄榄油，预处理12h后同样给予腹腔注射aai(20mg/kg)；空白对照组提前12h单次腹腔给予同体积橄榄油，预处理12h后腹腔注射同体积生理盐水。待各组aai给药处理24h后处死小鼠，取小鼠肝脏及肾脏。
[0083]
(一)利用蛋白免疫印迹检测各组小鼠肝脏组织损伤指标变化
[0084]
1)用蛋白裂解液分别提取不同处理组肝脏及肾脏组织的总蛋白。
[0085]
2)蛋白质定量后分别将30ug蛋白加到12.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并截取相应条带用电转仪转到nc膜上。
[0086]
3)蛋白的非特异性位点用5％的bsa封闭，裁膜后用cleaved-parp-1，p53， nqo1，cleaved-caspase-3，γ-h2ax等特异性抗体孵育，4℃过夜，用tbst 缓冲液洗三遍，洗去一抗。
[0087]
4)然后用hrp标记的二抗室温孵育2小时，继而用tbst缓冲液洗三遍。
[0088]
5)最后，扫膜分析。
[0089]
结果见图9，当对小鼠进行aai腹腔注射给药时，会对小鼠肝脏及肾脏造成明显的dna损伤及组织凋亡，但是当小鼠提前12h进行黄芩新素预处理后， cleaved-parp-1，cleaved-caspase-3，γ-h2ax等表示凋亡及dna损伤的指标明显表达下降，说明黄芩新素可有效减轻aai导致的肝肾组织损伤。
[0090]
(二)利用小鼠肝脏组织切片观察黄芩新素对马兜铃酸i导致组织损伤的保护
[0091]
he染色：
[0092]
1)开始实验之前将切片放在60℃烤箱烤一个小时，然后按照二甲苯浸泡 10分钟，3次；100％乙醇浸泡5分钟，95％乙醇浸泡5分钟；85％乙醇浸泡5 分钟；75％乙醇浸泡5分钟；ddh2o浸泡5分钟的顺序进行复水。
[0093]
2)用苏木素复染细胞核10分钟后在ddh2o中洗掉切片上多余的苏木素
[0094]
3)将切片浸泡在盐酸乙醇中1s后立即拿出，可重复1次，此步骤可轻微脱去苏木素染料。
[0095]
4)自来水流水冲洗切片反蓝约30分钟，冲洗时间越长蓝色会略深。反蓝结束后取出切片沥干水。
[0096]
5)按照以下顺序进行切片脱水：75％乙醇，5分钟；85％乙醇，5分钟； 95％乙醇，10分钟；换新的95％乙醇，10分钟。
[0097]
6)伊红染色约20秒，伊红染色后可以进行回收，若为新配的溶液，可以适当调整染色时间。
[0098]
7)按照下列顺序进行脱水：95％乙醇中5次；换新的95％乙醇中5次；100％乙醇10分钟；100％乙醇10分钟。石碳酸处理切片5分钟。二甲苯中处理切片10分钟，换新的二甲苯溶液继续处理5分钟。
[0099]
8)滴加中性树脂50ul，盖上干净的盖玻片，彻底干燥后扫片拍照。
[0100]
天狼星红染色(sirius red)：
[0101]
1)脱蜡至水：开始实验之前将切片放在60℃烤箱烤一个小时，然后按照二甲苯浸泡10分钟，3次；100％乙醇浸泡5分钟，95％乙醇浸泡5分钟；85％乙醇浸泡5分钟；75％乙醇浸泡5分钟后ddh2o浸泡5分钟的顺序进行复水。
[0102]
2)甩干玻片上的水，在组织上滴加sirius red染液，放入湿盒中37℃孵育30分钟。
[0103]
3)取出切片浸泡在ddh2o中洗去染液，每次5分钟，共3次。
[0104]
4)100％乙醇浸泡5分钟，
[0105]
5)二甲苯浸泡5分钟
[0106]
6)滴加中性树脂50ul，盖上干净的盖玻片，彻底干燥后扫片拍照。
[0107]
组织tunel凋亡检测：
[0108]
1)室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次5min，以彻底脱掉石蜡。注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。
[0109]
2)室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次，每次5min。
[0110]
3)室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇(95％、90％、80％、 70％)中，每种浓度各漂洗1次，每次5min。
[0111]
4)室温下，将切片浸没于纯水中漂洗1次，每次3min，再将切片浸没于 1
×
pbs中漂洗1次，每次3min，用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。
[0112]
5)用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。
[0113]
6)按1:100的比例，将2mg/ml的proteinase k溶液用1
×
pbs稀释，使其终浓度为20μg/ml。每个样本上滴加100μl稀释好的proteinase k溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20min。
[0114]
7)pbs浸润清洗切片两次，每次5min。
[0115]
8)封闭：加入适量配制于pbs中的0.3％h2o2溶液，室温孵育30min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。
[0116]
9)pbs浸润清洗切片两次，每次5min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
[0117]
10)每个样品加入50μl tunel反应液，37℃避光孵育2h。
[0118]
11)向样品滴加50μl streptavidin-hrp工作液，37℃避光孵育30min。
[0119]
12)pbs清洗反应后的样品3次，每次5min。
[0120]
13)向样品滴加50μl dab显色液，室温孵育5-30min。
[0121]
结果见图10，对各组小鼠肝脏及肾脏组织进行苏木精-伊红染色法 (hematoxylin-eosin staining，he)和及tunel凋亡检测及天狼星红(siriusred)染色。天狼星红染料会与肝脏组织切片中的胶原纤维结合，染色后胶原呈红色，以此观察肝脏的纤维化程度，阳性对照组与实验组小鼠的肝脏的纤维化没有明显差异。但是，阳性对照组小鼠肝脏中细胞凋亡的比例为11.4％；实验组小鼠经过黄芩新素预处理后，细胞凋亡的比例仅为3.6％，两组之间具有明显的统计学差异(图10a)。sfii预处理后，小鼠肝肾组织中凋亡细胞比例明显较单纯aai处理组降低；并且sfii联合处理组小鼠的肾脏纤维化显著低于单纯aai处理组(图10b)。sfii预处理后，小鼠肾脏组织中凋亡细胞比例明显较单纯aai处理组降低；并且sfii预处理组小鼠肾脏的纤维化显著低于单纯aai处理组(图10b)。通过小鼠肝肾组织切片he、sirius red及tunel 凋亡检测，说明黄芩新素可有效减轻aai导致的肝肾组织损伤。
[0122]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的
变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。