91)，但仍然会很困难，并且需要进行广泛的筛选和优化。结晶和结构精修中所需的数天到数月的个别关注使得这两个步骤在从序列到最终结构的过程中成本最高。困难情况对整体平均值是尤其且负面影响的。fab结晶所需的努力可能解释为何已经用于工程改造或计算的结构如此之少。
7.edmundson和borrebaeck检查了人类fab的轻链恒定结构域(cl)和重链第一恒定结构域(ch1)之间的晶体堆积相互作用和β-折叠形成，并观察了“堆积三联体”(倾向于形成β-折叠的三个交替残基)的重要性。(edmundson和borrebaeck, immunotechnology, 1998. 3(4):309-17)。
8.需要改进包含κ链的人cl结构域的fab (例如人fab)和/或人fab:抗原复合物的结晶。
9.详述本文提供了显著改进人抗体、抗原-结合片段(例如人fab或fab')或包含人抗体轻链κ恒定结构域(cκ)的融合蛋白和fab/fab'/mab:抗原复合物的结晶的方法和组合物。本文所述的方法和组合物可普遍应用于大多数人fab、一些人mab和包含人fab或mab的融合蛋白，其包含人cκ，并显著改善它们的结晶，包括使它们更可能更快地结晶，至更高的分辨率，以在更低的浓度和/或由异质混合物结晶。
10.在一个方面，本文提供了包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203 (根据kabat编号法编号的位置，其对应于seq id no:1的位置92至96)处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204 (根据kabat编号法编号的位置，其对应于seq id no:1的位置91和97)处的氨基酸在所述变体cκ中缺失。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置126 (根据kabat编号法，其对应于seq id no:1的位置19)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置214 (根据kabat编号法，其对应于seq id no:1的位置107)处的脯氨酸。
11.除非另有指明，否则本文所述的抗体或抗原-结合片段中的氨基酸残基的编号遵循kabat编号系统(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，bethesda, md: u.s. dept. of health and human services, public health service, national institutes of health, 1991)。
12.在一些实施方案中，本文提供了包含变体cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，所述变体cκ结构域包含seq id no:3。在一些实施方案中，本文提供了包含变体cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，所述变体cκ结构域包含seq id no:4。在一些实施方案中，本文提供了包含变体cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，所述变体cκ结构域包含seq id no:5。在一些实施方案中，本文提供了包含变体cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，所述变体cκ结构域包含seq id no:6。
13.在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白进一步包含人轻链可变结构域(vl)和人重链可变结构域(vh)。在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白进一步包含人igg ch1结构域，例如人igg1或igg4 ch1结构域。在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白进一步包含人igg铰链区(例如，人iggl或igg4铰链区)的一部分。
14.在另一个方面，本文提供了包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白的文库，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)。
15.在另一个方面，本文提供了生成本文所述的包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白的晶体结构的方法。此类方法可以包括使包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白结晶，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括构建本文所述的包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白的文库。例如，所述变体cκ可以包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:3。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:4。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:5。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:6。
16.本文还提供了生成包含人cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白的晶体结构的方法。此类方法可以包括：生成包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)；和使包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白结晶。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置126(根据kabat编号法)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置214(根据kabat编号法)处的脯氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:3。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:4。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:5。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:6。
17.在另一个方面，本文提供了生成抗原和结合所述抗原的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白(例如，人fab或fab')的复合物的晶体结构的方法，其中所述抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白包含人cκ，所述方法包括：生成包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)；和使抗原和包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白共结晶。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置126(根据kabat编号法)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置214(根据kabat编号法)处的脯氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:3。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:4。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:5。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:6。
18.如本文所用，在本公开的上下文中(特别是权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“该/所述(the)”和类似术语应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。
19.如本文所用的术语“抗体”是指结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体的实施方案包括
单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。所述抗体可以是任何类别(例如，igg、ige、igm、igd、iga)和任何亚类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4)。
20.示例性抗体是由经由链间二硫键交联的以下四条多肽链构成的免疫球蛋白g (igg)型抗体：两条重链(hc)和两条轻链(lc)。四条多肽链各自的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-125个或更多氨基酸的可变区。四条多肽链各自的羧基末端部分都含有恒定区，所述恒定区主要负责效应子功能。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区构成。igg同种型可进一步分为亚类(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)。
21.vh和vl区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其散布于更保守的区域，称为框架区(fr)。cdr暴露在蛋白的表面上，并且是抗体对于抗原结合特异性重要的区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr构成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本文中，重链的三个cdr被称为“hcdr1、hcdr2和hcdr3”，且轻链的三个cdr被称为“lcdr1、lcdr2和lcdr3”。所述cdr含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。可以根据众所周知的方案，包括kabat (kabat等人,
ꢀ“
sequences of proteins of immunological interest,
”ꢀ
national institutes of health, bethesda, md. (1991))、chothia (chothia等人,
ꢀ“
canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”, journal of molecular biology, 196, 901-917 (1987); al-lazikani等人,
ꢀ“
standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”, journal of molecular biology, 273, 927-948 (1997))、north (north等人,
ꢀ“
a new clustering of antibody cdr loop conformations”, journal of molecular biology, 406, 228-256 (2011))或imgt (国际immunogenetics数据库可在www.imgt.org获得; 参见lefranc等人, nucleic acids res. 1999; 27:209-212)中描述的那些，将氨基酸残基分配给cdr。
22.术语“抗原-结合片段”是指保留与抗原的表位特异性相互作用的能力的抗体部分。抗原-结合片段的实例包括但不限于fab或fab'。“fab”片段由包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的完整抗体轻链以及重链可变区(vh)和重链第一恒定区(ch1)组成。每个fab片段就抗原结合而言是单价的，即它具有单个抗原-结合位点。fab'片段与fab片段的不同在于在ch1结构域的羧基末端具有几个额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个残基。本文所述的fab或fab'可以是人fab或fab'或包含人cl的嵌合fab或fab'。
23.如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含在人抗体或抗体片段的重链或轻链的氨基或羧基末端直接连接至异源肽或多肽的人抗体或抗体片段的重组蛋白。
24.附图简要说明图1a-1b显示兔fab晶体结构中的示例性g-链β折叠堆积。图1a显示4zto.pdb中的hc:hc和lc:lc β堆积。重链呈黑色和浅灰色。轻链呈深灰色和白色。图1b显示4jo1.pdb中的hc:lc β堆积。
25.图2a-2c显示人cκ fg环与兔样lc:lc堆积的不相容性。图2a显示来自4nzu.pdb的人fab(深灰色)在来自4zto的兔fab晶体堆积(中等和浅灰色)上的结构比对，其显示，兔cκ fg环(中灰色)比更长和凸出的人cκ fg环更紧凑，并且与β折叠堆积相容，而更长和凸出的人cκ fg环不会如此。图2b显示人、小鼠和兔cκ结构域和cλ结构域的fg环的序列比对。兔fg
4jo42.27xx 4zto2.30xx 4ztp1.63 x 5drn1.99 x 5ds81.95 x 5dsc2.40 x 5dtf1.90x
ꢀꢀ
5dub2.00
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5m632.74xx 5v6l2.55xx 6cez2.40
ꢀꢀꢀ
6cjk1.80 x 6i9i1.98
ꢀꢀ
x6peh2.30xx 6t3f3.20 x 总pdb1937h%hc:hc&lc:lc632%
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任何1784%
ꢀꢀ
lilly内部1729Y%6%hc:hc&lc:lc1059%
ꢀꢀ
任何1482%
ꢀꢀ
*具有hc:hc、lc:lc或hc:lc g-链β折叠形成的储存pdb结构的百分比。还指示具有hc:hc和lc:lc堆积的百分比以及具有任何g-链β堆积的结构的百分比。lilly内部统计信息列在pdb统计信息下方。
33.对数十种人fab结构的调查显示没有这种相互作用。人fab结构向兔fab上的对齐显示，人cκ结构域中存在的较长fg环形成弯曲和凸出的构象，其会干扰β折叠堆积相互作用(图2a)。该较长的fg环由小鼠cκ共享，但不由兔cκ结构域(也不由λ恒定结构域cλ)共享(图2b)。对兔堆积相互作用上对齐的人fab的目视检查还表明，人cκ赖氨酸126 (k126，kabat编号)可能是该结构域的对侧上的β折叠堆积的障碍(图2c)。
34.通过突变cκ的fg环或k126生成几种六组氨酸(h6)标记的fab片段的变体，并测试它们对结晶的影响。在fg环的情况下，这包括用五聚体兔序列qgtts(根据kabat编号，位置199至203)替换结构上同源的t和v(根据kabat编号，分别为位置197和205)之间的七聚体人序列hqglssp(根据kabat编号，位置198至204)。所得的突变体短两个残基，其中缺失位置198处的组氨酸和位置205处的脯氨酸，并且在本文中称为δqgttsδ (根据kabat编号，位置198至204，参见seq id no:3)或“crystal kappa”设计。在一些变体中，k126被突变为丙氨酸(k126a，kabat编号，参见seq id no:2、4、6)。
35.独立于晶体堆积分析，观察到c-末端链间二硫键很少在fab结构中有序。这可能是由于构象异质性或由于异质氧化。为了解决这一点，设计了两种变体。一种称为“gep*”的变体通过经由将c-末端κ链半胱氨酸突变为脯氨酸(根据kabat编号，c214p，参见seq id no:5
或6)和将igg4重链半胱氨酸127突变为丙氨酸(根据kabat编号，c127a)，来除去二硫键而生成。第二种称为“eskcggh6”的设计通过将κ半胱氨酸突变为脯氨酸(根据kabat编号，c214p)并通过将tyr 229突变为半胱氨酸(根据kabat编号，y229c)在重链的c-末端创建新的二硫键配偶体而生成。
36.fab的结晶在单独或组合并入这些突变之前和之后的两种fab (g6和度普利尤单抗)的结晶结果显示于表ii中。一种fab源自公开的度普利尤单抗(dupixent
ꢀ™
)序列(可在https://www.kegg.jp/entry/ d10354获得)。第二种fab是针对细胞表面受体的内部发现努力的一部分。使用具有相同纯化的fab的两个96-孔结晶筛选，设置为近似10 mg/ml，用不相关的fab晶体划线接种(以消除由于成核导致的随机差异)并在同一时间点(9天)进行分析。两种亲本fab在一些条件下产生结晶命中，并且度普利尤单抗fab晶体甚至产生2.0
å
数据集和结构。k126a突变(表ii)和任何二硫键变体(未显示)都没有产生显著更多的晶体条件。最显著的差异在于并入δqgttsδ fg环(即，crystal kappa设计)。具有该设计的fab在g6 fab的192种条件中的近似90-114种条件下得到晶体；并且对于度普利尤单抗fab，在192种条件中的近似113-136种条件下得到晶体。直接从这些筛选中收获(即未在后续筛选中优化)的晶体产生高分辨率数据集(表ii)。最好的度普利尤单抗fab从单独的δqgttsδ衍射至1.4
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(ck1.0)；并且最好的g6 fab从δqgttsδ突变与k126a和链内二硫键的组合衍射至1.15
åꢀ
(ck1.5)。
37.表ii. 两种fab及其变体的结晶
hclcg6xtal**g6res(
å
)dupxtal**dupres(
å
)亲本*eskygh6野生型κ1 42.0ck0.1eskygh6k126a23.4na ck1.0eskygh6∆
qgtts
∆
941.51131.4ck1.1eskygh6k126a
∆
qgtts
∆
1141.31362.1ck1.2eskygh6c127a
∆
qgtts
∆
gep*931.71231.9ck1.3eskcggh6∆
qgtts
∆
gep*901.21251.7ck1.4eskygh6c127ak126a
∆
qgtts
∆
gep*1041.4na ck1.5eskcggh6k126a
∆
qgtts
∆
gep*1101.151212.2
*亲本轻链是野生型κ。亲本重链终止于序列eskyg并包括用于纯化目的的h6标签。**“xtal”列表示在近似第9天，来自两个96-孔筛选的条件有多少产生任何类型的晶体。从具有可收获晶体的每个构建体发送几种晶体，并指示最佳分辨率数据集。
38.工程改造的fab的晶体结构为g6变体收集59个数据集，涵盖11种晶体形式。为7种晶体形式解析结构并为5种晶体形式进行精修：p212121，具有43x75x165
ꢀå
晶胞(5个精修结构)，p43212 77x77x330 (3)，p21212
1 66x74x91 (1)，p1 53x65x67 85x71x84 (1)，和c2 206x103x70 β=92.7
ºꢀ
(1)。为度普利尤单抗fab变体收集44个数据集，涵盖11种晶体形式。为4个数据集解析结构并为3个数据集进行精修：p2
1 53x66x135 β=91.6
ºꢀ
(1)，p21212
1 59x73x105 (1)，p43212 74x74x185 (1)。
39.没有δqgttsδ的fab变体(包括亲本)的结构没有具有扩展的β折叠相互作用的堆积。例如，亲本度普利尤单抗fab以各种类型的相互作用堆积，但无一形成连续的β-折叠(图
3a)。在另一方面，所有源自具有δqgttsδ fg环的fab的结构都堆积，在cκ结构域的g链和ch1结构域的g链之间形成β折叠(图3b和3c)。这种相互作用与在兔fab晶体堆积中看到的相似但不相同。它涉及与图1b中所看到的相同的链，但更广泛，涉及两侧的7个残基，如图1a中所看到的h:h或l:l相互作用。该β折叠的伪对称中心在cκ v208 (根据kabat编号，位置205)和ch1 v219 (kabat编号)之间。
40.k126a突变似乎不影响晶体堆积或衍射质量。g6 fab的最高分辨率结构并入该突变，但该突变的影响不是系统性的。例如，度普利尤单抗fab的最高分辨率结构仅并入fg环突变δqgttsδ。二硫化物除去(c127a gep*)或链内二硫键(eskc gep*)似乎也不影响晶体堆积或衍射。结构用有序的链内二硫键获得。该区域中的温度因子高于如在其他具有有序链间二硫键的结构中所看到的平均值。
41.fab:抗原复合物的结晶将结晶突变应用于fab:抗原复合物。在g6 fab的情况下，利用fab的ck1.5变体，因为它作为单独的fab衍射最好。对于度普利尤单抗fab和其他四种复合物，利用ck1.0 (即仅δqgttsδ)。所有ch1结构域都是igg4，并具有相同的c-末端六组氨酸(h6)标签(seq id no:7)。在有限的筛选和采用的时间范围内，亲本复合物(即没有任何结晶工程改造应用于fab的抗原:fab复合物)无一产生任何晶体(表iii)。所有工程改造的复合物都产生晶体，从g6-受体复合物的4种条件(192种条件中的)到h4-受体复合物的87种条件(图4c和表iii)。六种复合物中的四种产生结构，大部分分辨率较低。gitr复合物晶体在解析结构后实际上是单独的fab，并且tigit复合物晶体的衍射没有足够好，不足以产生数据集。度普利尤单抗和苏金单抗两者的晶体都需要优化以达到各自的3和3.2
å
分辨率(图4a-4b)。在前者的情况下，来自初始筛选的晶体衍射至5
å
，而对于后者则完全没有。
42.表iii. fab:抗原复合物的结晶
fab抗原亲本晶体ck晶体分辨率(
å
)注释参考g6受体043.6ck1.5未公开的分子度普利尤单抗il4ra0343.0优化的cas:1190264-60-8;序列可得自https://www.kegg.jp/entry/d10354苏金单抗il17a0543.2优化的cas:1229022-83-6;序列可得自https://www.kegg.jp/entry/d09967h2155gitr0542.6仅fabus2013108641h22g2tigit0309仅衍射us2016176963h4受体0872.6 未公开的分子
在9天后在两个结晶筛选中筛选复合物并评分。来自亲本复合物(没有结晶突变)的任何种类的晶体的条件数量在“亲本晶体”列中指示。来自ck1.0 fab抗原复合物的晶体的条件在标记为“ck晶体”的列中。来自这些筛选或后续优化的最佳衍射或数据集在“分辨率”列中指示。
43.由于苏金单抗:il17复合物产生低分辨率但衍射的晶体，因此选择它用于进一步比较ch1结构域同种型和c-末端。创建四种新构建体：短5个残基并以序列dkrvesk结束的igg4版本(无标签，seq id no:11)，以dkrvh6结束的igg4版本(带标签，seq id no:12)，和以具有h6标签(seq id no:10)或不具有h6标签(seq id no:9)的序列ksc结束的igg1版本。对这些进行纯化且如前以10 mg/ml、但也以5mg/ml进行筛选。较短的igg4版本比原始版本产生的晶体更少(标记版本为24个，且未标记版本为18个，相比之下，原始标记版本为54个)。igg1版本给出类似数量的晶体条件(标记版本为88个，且未标记版本为43个，相比之下，原始标记版本为54个)。10 mg/ml igg4标记的版本衍射到4.2
å
，就像最初不衍射但优化
后产生3.2
å
的亲本版本一样。另一方面，10 mg/ml的igg1标记版本直接从初始筛选产生2.7
å
数据集，并且5 mg/ml的igg1未标记版本从初始筛选产生2.4
å
数据集。
44.柱级分结晶(cfc)工程改造的fab的稳健结晶允许直接从柱级分结晶。当直接从柱级分结晶时，g6 fab的δqgttsδ变体产生与10 mg/ml的纯化和浓缩样品相同的晶体形式(图5a-5c)。cfc结构具有2.4
å
的相当好的分辨率(相比于1.4
å
)。
45.此处描述的设计应用于几个目标，利用相当的同种型和c-末端，使用相同的纯化、结晶和晶体收获程序(尽可能并行)，利用晶体接种来减少成核的可变性，评估相同经过时间的结晶实验，并在所有实验中让相同的科学家进行纯化和结晶。
46.变体cκ结构域(δqgttsδ)将人fab的结晶频率提高50倍。g6亲本fab(完全人)仅在一种条件下产生晶体，但含有δqgttsδ的g6变体在近似90-114种条件下产生晶体。度普利尤单抗亲本fab在4种条件下产生晶体，但含有δqgttsδ的度普利尤单抗变体在近似113-136种条件下产生晶体。此外，cκ结构域的修饰fg环(“可结晶kappa”或“crystal kappa”)使得fab:抗原复合物能够结晶，但无法计算提高倍数，因为在没有crystal kappa设计的情况下无一产生晶体。大多数crystal kappa版本为复合物产生30至90种结晶条件(注意：统计数据来自在一个相对保守的时间点的两个板)。
47.相对于fab结果，复合物的结果不太令人鼓舞。尽管使用crystal kappa的复合物都产生晶体，这是相对于任何努力的显著优势，但6种中只有4种产生好得足以分辨和精修的复杂数据集，并且这些往往分辨率较低。一种(h2155 gitr)产生仅fab的晶体。
48.与人il4r复合的度普利尤单抗fab的3.0
å
结构显示与il4和il13结合基本上重叠的表位，解释了其阻断活性(图4a)。表位的中心部分是cd环(ul-haq2016)，解释了为什么度普利尤单抗与在该区域中具有非常不同序列(l
67
l
68 vs. q
67s68
)的食蟹猴il4r没有交叉反应性。3.0
å
苏金单抗il17复合物(及其2.4
å
改进结构)显示两个fab与具有不连续表位的il17二聚体结合，每个fab结合两条il17链的部分(图4b)。h4复合物产生与不对称单元中的3个fab的晶体堆积排列(未显示)。fab之一形成对于ck设计典型的两个hc:lc β堆积相互作用。另一个fab在lc侧形成一个，而在hc侧则没有。并且第三个fab与第二个fab形成hc:lc相互作用，并且其lc形成lc:lc β堆积相互作用，这是已经见到的唯一的这种相互作用。
49.苏金单抗构建体的额外精修缩短igg4构建体的c-末端，并首次包括igg1版本，并比较h6标记版本与未标记版本。将10 mg/ml与5 mg/ml进行比较，以使晶体对于收获目的不那么拥挤。在本系列中，igg1版本比igg4表现更好，并且直接为标记(10 mg/ml)版本产生2.7
å
数据集且为未标记fab (5mg/ml)版本产生2.4
å
数据集，而来自ck1.0构建体的3.0
å
数据集在优化和筛选大量晶体后获得。有趣的是，g1、g4(两个版本)、有标签的和无标签的，都产生同形晶体。
50.关于结晶速度，所有描述的晶体都在一周内生长，并且对于更频繁检查的那些，晶体在数小时内出现。关于浓度，柱级分结晶实验显示，可以从稀释至0.1mg/ml的样品获得晶体，至少对于单独的fab是这样。除了对所需浓度的影响外，cfc还具有其他潜在优势。例如，柱峰前缘的蛋白的特征可能与后缘不同，并且一个或另一个可能在确定结构中更多产。cfc实验和fab在超过一半的高浓度结晶条件下结晶的事实表明，对于fab，crystal kappa设计应允许显著简化的筛选条件集合。
51.总之，本文提供了人恒定κ结构域(变体cκ)的可结晶变体，其显著提高fab和fab:抗原复合物的晶体形成的频率，产生fab (和fab:肽复合物)的高分辨率结构，并且在大多数情况下，可以产生fab:蛋白复合物的至少低分辨率数据集和结构。crystal kappa设计似乎允许在少数条件的筛选中从稀释样品过夜结晶。crystal kappa设计应使得甚至使用更小的筛选和更少的蛋白，fab结构确定也是稳健的，并加快复合物结构确定，包括具有困难目标的fab伴侣复合物。
52.材料和方法工程改造和分子生物学利用蛋白数据库和eli lilly的专有结构数据库中可用的结构，在pymol中对兔fab晶体堆积进行分析。来自不同物种的lc恒定结构域的比对利用blast。度普利尤单抗和苏金单抗的可变结构域的氨基酸序列获得自京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes)网站(www.kegg.jp; kanehisa2000)，条目d10354和d09967。h2155和h22g2的序列获得自专利us2013108641和us2016176963。通过将相应的dna片段合成为gblocks (idt, coralvilleia)并使用标准技术克隆至哺乳动物表达载体中来创建表达载体。
53.表达和纯化fab和抗原ecd在哺乳动物细胞培养cho细胞中表达。收获含有蛋白的细胞培养上清液，并使用his trap
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excel (ge healthcare)，使用pbs缓冲液加15mm咪唑，ph 7.5作为结合缓冲液，通过固定化金属亲和色谱(imac)纯化澄清的培养基。然后将蛋白在pbs加0.3m咪唑，ph7.4中在10柱体积梯度洗脱上洗脱。收集洗脱液并使用millipore 10kda旋转浓缩器进行浓缩。将浓缩imac合并物加载于superdex75或superdex200 (gehealthcare)柱上。对于结晶托盘，将蛋白再次浓缩至10mg/ml。
54.通过分析型大小排阻色谱法(waters)和sds-page凝胶表征蛋白(数据未显示)。
55.结晶和结构测定将所有样品浓缩至5-10 mg/ml，并在室温下使用qiagen classics ii和pegs结晶筛选以1:1的比率置设置于蒸汽扩散坐滴中。液滴立即用相关fab晶种交叉接种以用于fab结晶，并且用复合物-晶种交叉接种以用于复合物结晶。在第1天、第4天和第9天拍摄结晶托盘的图像。在液氮中冷冻之前，将晶体转移至冷冻保护剂溶液中，所述冷冻保护剂溶液由补充有额外10%用于该结晶孔中的沉淀剂和25%的甘油的孔溶液或来自母液的孔溶液组成，如果母液包含浓度足以进行冷冻保护的具有冷冻保护特性的沉淀剂(诸如peg 400、peg mme 550、peg mme 2k等)的话。
56.结构测定衍射数据集在以下来源收集：lilly research collaborative access team (lrl-cat) beamline 31-id at advanced proton source (argonne, il); beamline als-502 at advanced light source (berkley, ca); beamline i04-1 at diamond light source (oxfordshire, uk)。使用mosflm (leslie agw & powell hr. in: read rj, & sussman jl (编), evolving methods for macromolecular crystallography: the structural path to the understanding of the mechanism of action of cbrn agents. dordrecht: springer netherlands. 2007)和ccp4程序套件(winn, 等人, acta crystallogr d biol crystallogr, 2011. 67(pt 4):235-42)将数
据整合和简化。使用phaser (ccp4套件) (mccoy, 等人, j. appl. crystallogr., 2007. 40(pt 4):658-674)获得初始分子置换解决方案。该模型使用coot (emsley, 等人, acta crystallogr d biol crystallogr, 2010. 66(pt 4):486-501)构建，并使用refmac (murshudov, 等人, acta crystallogr d biol crystallogr, 2011. 67(pt 4):355-67)或buster (bricogne, 等人 buster version 2.11.5. cambridge, united kingdom: global phasing ltd. 2011)精修并使用内部开发的方案进行验证。
57.实施例2：全长单克隆抗体(mab)的结晶和x-射线结构测定除了fab片段以外，crystal kappa设计还可用于结晶全长igg抗体，如下所示。使用标准分子生物学技术，在标准表达载体中用crystal kappa设计修饰抗体的轻链。然后，轻链与相应的重链在适合用于分泌抗体的表达系统(诸如，hek293或中国仓鼠卵巢细胞)中表达。然后，使用诸如用mabselect柱(ge healthcare)的柱纯化的技术，从培养基纯化抗体并浓缩至例如5 mg/ml。利用蒸气扩散方法，然后筛选条件以从纯化的抗体生长蛋白晶体。然后分离、转移和冷冻晶体，然后收集x-射线数据。使用标准技术，然后可以通过分子置换(例如，使用软件phaser，且然后使用精修的原子模型)，从该数据确定结构。
58.一种抗体结构是通过将crystal kappa设计并入igg4-p (具有s241p (根据kabat编号)或s228p (根据eu索引编号)的igg4)同种型抗体的κ轻链产生。从21℃的96-孔筛选(compas, qiagen)，几种条件产生晶体，包括18%乙醇 100mm tris hcl(ph 8.5)。通过优化这些条件，从20%乙醇、21℃获得衍射晶体和4
å
数据集。该数据集的分子置换解决方案产生全长抗体的结构(两条重链、两条轻链和糖基化)，其构象与两种已知的人igg4结构的构象(5dk3.pdb和6gfe.pdb)显著不同并且更类似于已知的人igg1结构(1hzh.pdb)。crystal kappa设计有助于晶体堆积，抗体中的其他接触点也是如此。
59.图6a-6b显示全长mab的结晶和结构测定。图6a是显示全长mab的晶体的图像。图6b是所得结构的带状图，其中抗体重链呈黑色(包括呈棒的fc糖基化)且抗体轻链呈浅灰色。
60.实施例3：通过生成融合蛋白结晶fab:抗原肽复合物fab与其抗原肽的复合物的晶体结构测定可以通过两种方式实现。首先且更典型地，抗原肽可以购买或使用各种技术(chandrudu s, simerska p, toth i. chemical methods for peptide and protein production. molecules. 2013 apr 12;18(4):4373-88)制备。然后，可以将该肽溶解并以等于或超过以摩尔计的fab浓度的最终浓度添加至fab中。然后，如同单独的crystal kappa fab一样，实现复合物的结晶和结构测定。无需购买肽的第二种技术是将肽的编码序列直接插入fd或κ轻链的开放阅读框中，以便在构建fab表达载体期间生成在肽和fd/κ轻链之间具有适当接头的融合蛋白。然后，在融合蛋白中，该肽将通过接头以精确的一对一化学计量栓系至fab。该栓系还具有增加肽的有效浓度和避免低亲和力肽不出现在晶体或所得结构中的情况的益处。栓系保证了晶体中抗原肽的存在。
61.如下获得抗tau抗体l14h18 (wo 2017/005734)与其同源tau肽抗原的fab:抗原肽复合物。通过在开放阅读框的信号序列和fab链的成熟开始之间并入dna序列(翻译成如下那27个氨基酸)，将包含已知表位tppkspssaksrlqtapvpm (seq id no:18)的tau肽(氨基酸231-250)用gs接头(seq id no:19)融合至fd-his6或l14h18 fab的crystal kappa轻链的n-末端。tau肽-接头-fd-his/crystal kappa轻链和fd-his/tau肽-接头-crystal kappa轻
链版本均在cho细胞中表达，通过固定化金属亲和色谱法和凝胶过滤纯化，浓缩至4.5 mg/ml并在市售筛选中结晶。在classics和peg筛选(qiagen)中，数十种条件对两种版本产生晶体。对于crystal kappa融合体解析并精修两种复合物结构：来自20% peg 3350/200mm酒石酸钠钾的1.22
å
结构和来自100mm醋酸钠ph4.6/25% peg 4000/200mm硫酸铵的2.3
å
结构。两种结构都显示大部分延伸的肽，其中一个螺旋转角与fab的cdr结合，并且仅在接头部分的顺序程度上不同。
62.图7a-7b显示tau肽-fab复合物的结晶。图7a是显示4小时后与tau肽融合的l14h18的crystal kappa轻链的晶体的图像。图7b是与l14h18 fab结合的tau肽(白色)的所得2.3
å
结构的带状图，其中大部分有序的gs接头连接至fab轻链(灰色)的n-末端。fab重链以黑色显示。
63.序列表野生型人κ轻链恒定结构域氨基酸序列(seq id no:1)人变体氨基酸序列(seq id no:2)人变体氨基酸序列(seq id no:3)人变体氨基酸序列(seq id no:4)人变体氨基酸序列(seq id no:5)人变体氨基酸序列(seq id no:6)人igg4 ch1结构域eskygh6变体氨基酸序列(seq id no:7)人igg4 ch1结构域eskygh6 c127a变体氨基酸序列(seq id no:8)野生型人igg1无标签ch1结构域氨基酸序列(seq id no:9)人igg1有标签ch1结构域氨基酸序列(seq id no:10)
人igg4无标签ch1结构域(seq id no:11)人igg4有标签ch1结构域(seq id no:12)野生型小鼠氨基酸序列(seq id no:13)野生型兔氨基酸序列(seq id no:14)野生型人λ轻链恒定结构域氨基酸序列(seq id no:15)野生型小鼠氨基酸序列(seq id no:16)野生型兔氨基酸序列(seq id no:17)tau肽(seq id no:18)gs接头(seq id no:19)
7.edmundson和borrebaeck检查了人类fab的轻链恒定结构域(cl)和重链第一恒定结构域(ch1)之间的晶体堆积相互作用和β-折叠形成，并观察了“堆积三联体”(倾向于形成β-折叠的三个交替残基)的重要性。(edmundson和borrebaeck, immunotechnology, 1998. 3(4):309-17)。
8.需要改进包含κ链的人cl结构域的fab (例如人fab)和/或人fab:抗原复合物的结晶。
9.详述本文提供了显著改进人抗体、抗原-结合片段(例如人fab或fab')或包含人抗体轻链κ恒定结构域(cκ)的融合蛋白和fab/fab'/mab:抗原复合物的结晶的方法和组合物。本文所述的方法和组合物可普遍应用于大多数人fab、一些人mab和包含人fab或mab的融合蛋白，其包含人cκ，并显著改善它们的结晶，包括使它们更可能更快地结晶，至更高的分辨率，以在更低的浓度和/或由异质混合物结晶。
10.在一个方面，本文提供了包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203 (根据kabat编号法编号的位置，其对应于seq id no:1的位置92至96)处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204 (根据kabat编号法编号的位置，其对应于seq id no:1的位置91和97)处的氨基酸在所述变体cκ中缺失。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置126 (根据kabat编号法，其对应于seq id no:1的位置19)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置214 (根据kabat编号法，其对应于seq id no:1的位置107)处的脯氨酸。
11.除非另有指明，否则本文所述的抗体或抗原-结合片段中的氨基酸残基的编号遵循kabat编号系统(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest，第5版，bethesda, md: u.s. dept. of health and human services, public health service, national institutes of health, 1991)。
12.在一些实施方案中，本文提供了包含变体cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，所述变体cκ结构域包含seq id no:3。在一些实施方案中，本文提供了包含变体cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，所述变体cκ结构域包含seq id no:4。在一些实施方案中，本文提供了包含变体cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，所述变体cκ结构域包含seq id no:5。在一些实施方案中，本文提供了包含变体cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，所述变体cκ结构域包含seq id no:6。
13.在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白进一步包含人轻链可变结构域(vl)和人重链可变结构域(vh)。在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白进一步包含人igg ch1结构域，例如人igg1或igg4 ch1结构域。在一些实施方案中，所述抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白进一步包含人igg铰链区(例如，人iggl或igg4铰链区)的一部分。
14.在另一个方面，本文提供了包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白的文库，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)。
15.在另一个方面，本文提供了生成本文所述的包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白的晶体结构的方法。此类方法可以包括使包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白结晶，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括构建本文所述的包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白的文库。例如，所述变体cκ可以包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:3。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:4。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:5。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:6。
16.本文还提供了生成包含人cκ结构域的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白的晶体结构的方法。此类方法可以包括：生成包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)；和使包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白结晶。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置126(根据kabat编号法)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置214(根据kabat编号法)处的脯氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:3。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:4。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:5。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:6。
17.在另一个方面，本文提供了生成抗原和结合所述抗原的抗体、抗原-结合片段或融合蛋白(例如，人fab或fab')的复合物的晶体结构的方法，其中所述抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白包含人cκ，所述方法包括：生成包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白，其中所述变体cκ包含人cκ的位置199至203处的氨基酸qgtts，且人cκ的位置198和204处的氨基酸在变体cκ中缺失(所有位置都根据kabat编号法进行编号)；和使抗原和包含变体cκ的抗体、抗原-结合片段(例如，人fab或fab')或融合蛋白共结晶。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置126(根据kabat编号法)处的丙氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ进一步包含人cκ的位置214(根据kabat编号法)处的脯氨酸。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:3。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:4。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:5。在一些实施方案中，所述变体cκ包含seq id no:6。
18.如本文所用，在本公开的上下文中(特别是权利要求的上下文中)使用的术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“该/所述(the)”和类似术语应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另有指明或与上下文明显矛盾。
19.如本文所用的术语“抗体”是指结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体的实施方案包括
单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。所述抗体可以是任何类别(例如，igg、ige、igm、igd、iga)和任何亚类(例如，igg1、igg2、igg3、igg4)。
20.示例性抗体是由经由链间二硫键交联的以下四条多肽链构成的免疫球蛋白g (igg)型抗体：两条重链(hc)和两条轻链(lc)。四条多肽链各自的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-125个或更多氨基酸的可变区。四条多肽链各自的羧基末端部分都含有恒定区，所述恒定区主要负责效应子功能。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区构成。igg同种型可进一步分为亚类(例如，igg1、igg2、igg3和igg4)。
21.vh和vl区域可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其散布于更保守的区域，称为框架区(fr)。cdr暴露在蛋白的表面上，并且是抗体对于抗原结合特异性重要的区域。每个vh和vl均由三个cdr和四个fr构成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本文中，重链的三个cdr被称为“hcdr1、hcdr2和hcdr3”，且轻链的三个cdr被称为“lcdr1、lcdr2和lcdr3”。所述cdr含有与抗原形成特异性相互作用的大部分残基。可以根据众所周知的方案，包括kabat (kabat等人,
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sequences of proteins of immunological interest,
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national institutes of health, bethesda, md. (1991))、chothia (chothia等人,
ꢀ“
canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins”, journal of molecular biology, 196, 901-917 (1987); al-lazikani等人,
ꢀ“
standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”, journal of molecular biology, 273, 927-948 (1997))、north (north等人,
ꢀ“
a new clustering of antibody cdr loop conformations”, journal of molecular biology, 406, 228-256 (2011))或imgt (国际immunogenetics数据库可在www.imgt.org获得; 参见lefranc等人, nucleic acids res. 1999; 27:209-212)中描述的那些，将氨基酸残基分配给cdr。
22.术语“抗原-结合片段”是指保留与抗原的表位特异性相互作用的能力的抗体部分。抗原-结合片段的实例包括但不限于fab或fab'。“fab”片段由包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的完整抗体轻链以及重链可变区(vh)和重链第一恒定区(ch1)组成。每个fab片段就抗原结合而言是单价的，即它具有单个抗原-结合位点。fab'片段与fab片段的不同在于在ch1结构域的羧基末端具有几个额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个残基。本文所述的fab或fab'可以是人fab或fab'或包含人cl的嵌合fab或fab'。
23.如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含在人抗体或抗体片段的重链或轻链的氨基或羧基末端直接连接至异源肽或多肽的人抗体或抗体片段的重组蛋白。
24.附图简要说明图1a-1b显示兔fab晶体结构中的示例性g-链β折叠堆积。图1a显示4zto.pdb中的hc:hc和lc:lc β堆积。重链呈黑色和浅灰色。轻链呈深灰色和白色。图1b显示4jo1.pdb中的hc:lc β堆积。
25.图2a-2c显示人cκ fg环与兔样lc:lc堆积的不相容性。图2a显示来自4nzu.pdb的人fab(深灰色)在来自4zto的兔fab晶体堆积(中等和浅灰色)上的结构比对，其显示，兔cκ fg环(中灰色)比更长和凸出的人cκ fg环更紧凑，并且与β折叠堆积相容，而更长和凸出的人cκ fg环不会如此。图2b显示人、小鼠和兔cκ结构域和cλ结构域的fg环的序列比对。兔fg
4jo42.27xx 4zto2.30xx 4ztp1.63 x 5drn1.99 x 5ds81.95 x 5dsc2.40 x 5dtf1.90x
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5m632.74xx 5v6l2.55xx 6cez2.40
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6cjk1.80 x 6i9i1.98
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x6peh2.30xx 6t3f3.20 x 总pdb1937h%hc:hc&lc:lc632%
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lilly内部1729Y%6%hc:hc&lc:lc1059%
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任何1482%
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*具有hc:hc、lc:lc或hc:lc g-链β折叠形成的储存pdb结构的百分比。还指示具有hc:hc和lc:lc堆积的百分比以及具有任何g-链β堆积的结构的百分比。lilly内部统计信息列在pdb统计信息下方。
33.对数十种人fab结构的调查显示没有这种相互作用。人fab结构向兔fab上的对齐显示，人cκ结构域中存在的较长fg环形成弯曲和凸出的构象，其会干扰β折叠堆积相互作用(图2a)。该较长的fg环由小鼠cκ共享，但不由兔cκ结构域(也不由λ恒定结构域cλ)共享(图2b)。对兔堆积相互作用上对齐的人fab的目视检查还表明，人cκ赖氨酸126 (k126，kabat编号)可能是该结构域的对侧上的β折叠堆积的障碍(图2c)。
34.通过突变cκ的fg环或k126生成几种六组氨酸(h6)标记的fab片段的变体，并测试它们对结晶的影响。在fg环的情况下，这包括用五聚体兔序列qgtts(根据kabat编号，位置199至203)替换结构上同源的t和v(根据kabat编号，分别为位置197和205)之间的七聚体人序列hqglssp(根据kabat编号，位置198至204)。所得的突变体短两个残基，其中缺失位置198处的组氨酸和位置205处的脯氨酸，并且在本文中称为δqgttsδ (根据kabat编号，位置198至204，参见seq id no:3)或“crystal kappa”设计。在一些变体中，k126被突变为丙氨酸(k126a，kabat编号，参见seq id no:2、4、6)。
35.独立于晶体堆积分析，观察到c-末端链间二硫键很少在fab结构中有序。这可能是由于构象异质性或由于异质氧化。为了解决这一点，设计了两种变体。一种称为“gep*”的变体通过经由将c-末端κ链半胱氨酸突变为脯氨酸(根据kabat编号，c214p，参见seq id no:5
或6)和将igg4重链半胱氨酸127突变为丙氨酸(根据kabat编号，c127a)，来除去二硫键而生成。第二种称为“eskcggh6”的设计通过将κ半胱氨酸突变为脯氨酸(根据kabat编号，c214p)并通过将tyr 229突变为半胱氨酸(根据kabat编号，y229c)在重链的c-末端创建新的二硫键配偶体而生成。
36.fab的结晶在单独或组合并入这些突变之前和之后的两种fab (g6和度普利尤单抗)的结晶结果显示于表ii中。一种fab源自公开的度普利尤单抗(dupixent
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)序列(可在https://www.kegg.jp/entry/ d10354获得)。第二种fab是针对细胞表面受体的内部发现努力的一部分。使用具有相同纯化的fab的两个96-孔结晶筛选，设置为近似10 mg/ml，用不相关的fab晶体划线接种(以消除由于成核导致的随机差异)并在同一时间点(9天)进行分析。两种亲本fab在一些条件下产生结晶命中，并且度普利尤单抗fab晶体甚至产生2.0
å
数据集和结构。k126a突变(表ii)和任何二硫键变体(未显示)都没有产生显著更多的晶体条件。最显著的差异在于并入δqgttsδ fg环(即，crystal kappa设计)。具有该设计的fab在g6 fab的192种条件中的近似90-114种条件下得到晶体；并且对于度普利尤单抗fab，在192种条件中的近似113-136种条件下得到晶体。直接从这些筛选中收获(即未在后续筛选中优化)的晶体产生高分辨率数据集(表ii)。最好的度普利尤单抗fab从单独的δqgttsδ衍射至1.4
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(ck1.0)；并且最好的g6 fab从δqgttsδ突变与k126a和链内二硫键的组合衍射至1.15
åꢀ
(ck1.5)。
37.表ii. 两种fab及其变体的结晶
hclcg6xtal**g6res(
å
)dupxtal**dupres(
å
)亲本*eskygh6野生型κ1 42.0ck0.1eskygh6k126a23.4na ck1.0eskygh6∆
qgtts
∆
941.51131.4ck1.1eskygh6k126a
∆
qgtts
∆
1141.31362.1ck1.2eskygh6c127a
∆
qgtts
∆
gep*931.71231.9ck1.3eskcggh6∆
qgtts
∆
gep*901.21251.7ck1.4eskygh6c127ak126a
∆
qgtts
∆
gep*1041.4na ck1.5eskcggh6k126a
∆
qgtts
∆
gep*1101.151212.2
*亲本轻链是野生型κ。亲本重链终止于序列eskyg并包括用于纯化目的的h6标签。**“xtal”列表示在近似第9天，来自两个96-孔筛选的条件有多少产生任何类型的晶体。从具有可收获晶体的每个构建体发送几种晶体，并指示最佳分辨率数据集。
38.工程改造的fab的晶体结构为g6变体收集59个数据集，涵盖11种晶体形式。为7种晶体形式解析结构并为5种晶体形式进行精修：p212121，具有43x75x165
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晶胞(5个精修结构)，p43212 77x77x330 (3)，p21212
1 66x74x91 (1)，p1 53x65x67 85x71x84 (1)，和c2 206x103x70 β=92.7
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(1)。为度普利尤单抗fab变体收集44个数据集，涵盖11种晶体形式。为4个数据集解析结构并为3个数据集进行精修：p2
1 53x66x135 β=91.6
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(1)，p21212
1 59x73x105 (1)，p43212 74x74x185 (1)。
39.没有δqgttsδ的fab变体(包括亲本)的结构没有具有扩展的β折叠相互作用的堆积。例如，亲本度普利尤单抗fab以各种类型的相互作用堆积，但无一形成连续的β-折叠(图
3a)。在另一方面，所有源自具有δqgttsδ fg环的fab的结构都堆积，在cκ结构域的g链和ch1结构域的g链之间形成β折叠(图3b和3c)。这种相互作用与在兔fab晶体堆积中看到的相似但不相同。它涉及与图1b中所看到的相同的链，但更广泛，涉及两侧的7个残基，如图1a中所看到的h:h或l:l相互作用。该β折叠的伪对称中心在cκ v208 (根据kabat编号，位置205)和ch1 v219 (kabat编号)之间。
40.k126a突变似乎不影响晶体堆积或衍射质量。g6 fab的最高分辨率结构并入该突变，但该突变的影响不是系统性的。例如，度普利尤单抗fab的最高分辨率结构仅并入fg环突变δqgttsδ。二硫化物除去(c127a gep*)或链内二硫键(eskc gep*)似乎也不影响晶体堆积或衍射。结构用有序的链内二硫键获得。该区域中的温度因子高于如在其他具有有序链间二硫键的结构中所看到的平均值。
41.fab:抗原复合物的结晶将结晶突变应用于fab:抗原复合物。在g6 fab的情况下，利用fab的ck1.5变体，因为它作为单独的fab衍射最好。对于度普利尤单抗fab和其他四种复合物，利用ck1.0 (即仅δqgttsδ)。所有ch1结构域都是igg4，并具有相同的c-末端六组氨酸(h6)标签(seq id no:7)。在有限的筛选和采用的时间范围内，亲本复合物(即没有任何结晶工程改造应用于fab的抗原:fab复合物)无一产生任何晶体(表iii)。所有工程改造的复合物都产生晶体，从g6-受体复合物的4种条件(192种条件中的)到h4-受体复合物的87种条件(图4c和表iii)。六种复合物中的四种产生结构，大部分分辨率较低。gitr复合物晶体在解析结构后实际上是单独的fab，并且tigit复合物晶体的衍射没有足够好，不足以产生数据集。度普利尤单抗和苏金单抗两者的晶体都需要优化以达到各自的3和3.2
å
分辨率(图4a-4b)。在前者的情况下，来自初始筛选的晶体衍射至5
å
，而对于后者则完全没有。
42.表iii. fab:抗原复合物的结晶
fab抗原亲本晶体ck晶体分辨率(
å
)注释参考g6受体043.6ck1.5未公开的分子度普利尤单抗il4ra0343.0优化的cas:1190264-60-8;序列可得自https://www.kegg.jp/entry/d10354苏金单抗il17a0543.2优化的cas:1229022-83-6;序列可得自https://www.kegg.jp/entry/d09967h2155gitr0542.6仅fabus2013108641h22g2tigit0309仅衍射us2016176963h4受体0872.6 未公开的分子
在9天后在两个结晶筛选中筛选复合物并评分。来自亲本复合物(没有结晶突变)的任何种类的晶体的条件数量在“亲本晶体”列中指示。来自ck1.0 fab抗原复合物的晶体的条件在标记为“ck晶体”的列中。来自这些筛选或后续优化的最佳衍射或数据集在“分辨率”列中指示。
43.由于苏金单抗:il17复合物产生低分辨率但衍射的晶体，因此选择它用于进一步比较ch1结构域同种型和c-末端。创建四种新构建体：短5个残基并以序列dkrvesk结束的igg4版本(无标签，seq id no:11)，以dkrvh6结束的igg4版本(带标签，seq id no:12)，和以具有h6标签(seq id no:10)或不具有h6标签(seq id no:9)的序列ksc结束的igg1版本。对这些进行纯化且如前以10 mg/ml、但也以5mg/ml进行筛选。较短的igg4版本比原始版本产生的晶体更少(标记版本为24个，且未标记版本为18个，相比之下，原始标记版本为54个)。igg1版本给出类似数量的晶体条件(标记版本为88个，且未标记版本为43个，相比之下，原始标记版本为54个)。10 mg/ml igg4标记的版本衍射到4.2
å
，就像最初不衍射但优化
后产生3.2
å
的亲本版本一样。另一方面，10 mg/ml的igg1标记版本直接从初始筛选产生2.7
å
数据集，并且5 mg/ml的igg1未标记版本从初始筛选产生2.4
å
数据集。
44.柱级分结晶(cfc)工程改造的fab的稳健结晶允许直接从柱级分结晶。当直接从柱级分结晶时，g6 fab的δqgttsδ变体产生与10 mg/ml的纯化和浓缩样品相同的晶体形式(图5a-5c)。cfc结构具有2.4
å
的相当好的分辨率(相比于1.4
å
)。
45.此处描述的设计应用于几个目标，利用相当的同种型和c-末端，使用相同的纯化、结晶和晶体收获程序(尽可能并行)，利用晶体接种来减少成核的可变性，评估相同经过时间的结晶实验，并在所有实验中让相同的科学家进行纯化和结晶。
46.变体cκ结构域(δqgttsδ)将人fab的结晶频率提高50倍。g6亲本fab(完全人)仅在一种条件下产生晶体，但含有δqgttsδ的g6变体在近似90-114种条件下产生晶体。度普利尤单抗亲本fab在4种条件下产生晶体，但含有δqgttsδ的度普利尤单抗变体在近似113-136种条件下产生晶体。此外，cκ结构域的修饰fg环(“可结晶kappa”或“crystal kappa”)使得fab:抗原复合物能够结晶，但无法计算提高倍数，因为在没有crystal kappa设计的情况下无一产生晶体。大多数crystal kappa版本为复合物产生30至90种结晶条件(注意：统计数据来自在一个相对保守的时间点的两个板)。
47.相对于fab结果，复合物的结果不太令人鼓舞。尽管使用crystal kappa的复合物都产生晶体，这是相对于任何努力的显著优势，但6种中只有4种产生好得足以分辨和精修的复杂数据集，并且这些往往分辨率较低。一种(h2155 gitr)产生仅fab的晶体。
48.与人il4r复合的度普利尤单抗fab的3.0
å
结构显示与il4和il13结合基本上重叠的表位，解释了其阻断活性(图4a)。表位的中心部分是cd环(ul-haq2016)，解释了为什么度普利尤单抗与在该区域中具有非常不同序列(l
67
l
68 vs. q
67s68
)的食蟹猴il4r没有交叉反应性。3.0
å
苏金单抗il17复合物(及其2.4
å
改进结构)显示两个fab与具有不连续表位的il17二聚体结合，每个fab结合两条il17链的部分(图4b)。h4复合物产生与不对称单元中的3个fab的晶体堆积排列(未显示)。fab之一形成对于ck设计典型的两个hc:lc β堆积相互作用。另一个fab在lc侧形成一个，而在hc侧则没有。并且第三个fab与第二个fab形成hc:lc相互作用，并且其lc形成lc:lc β堆积相互作用，这是已经见到的唯一的这种相互作用。
49.苏金单抗构建体的额外精修缩短igg4构建体的c-末端，并首次包括igg1版本，并比较h6标记版本与未标记版本。将10 mg/ml与5 mg/ml进行比较，以使晶体对于收获目的不那么拥挤。在本系列中，igg1版本比igg4表现更好，并且直接为标记(10 mg/ml)版本产生2.7
å
数据集且为未标记fab (5mg/ml)版本产生2.4
å
数据集，而来自ck1.0构建体的3.0
å
数据集在优化和筛选大量晶体后获得。有趣的是，g1、g4(两个版本)、有标签的和无标签的，都产生同形晶体。
50.关于结晶速度，所有描述的晶体都在一周内生长，并且对于更频繁检查的那些，晶体在数小时内出现。关于浓度，柱级分结晶实验显示，可以从稀释至0.1mg/ml的样品获得晶体，至少对于单独的fab是这样。除了对所需浓度的影响外，cfc还具有其他潜在优势。例如，柱峰前缘的蛋白的特征可能与后缘不同，并且一个或另一个可能在确定结构中更多产。cfc实验和fab在超过一半的高浓度结晶条件下结晶的事实表明，对于fab，crystal kappa设计应允许显著简化的筛选条件集合。
51.总之，本文提供了人恒定κ结构域(变体cκ)的可结晶变体，其显著提高fab和fab:抗原复合物的晶体形成的频率，产生fab (和fab:肽复合物)的高分辨率结构，并且在大多数情况下，可以产生fab:蛋白复合物的至少低分辨率数据集和结构。crystal kappa设计似乎允许在少数条件的筛选中从稀释样品过夜结晶。crystal kappa设计应使得甚至使用更小的筛选和更少的蛋白，fab结构确定也是稳健的，并加快复合物结构确定，包括具有困难目标的fab伴侣复合物。
52.材料和方法工程改造和分子生物学利用蛋白数据库和eli lilly的专有结构数据库中可用的结构，在pymol中对兔fab晶体堆积进行分析。来自不同物种的lc恒定结构域的比对利用blast。度普利尤单抗和苏金单抗的可变结构域的氨基酸序列获得自京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes)网站(www.kegg.jp; kanehisa2000)，条目d10354和d09967。h2155和h22g2的序列获得自专利us2013108641和us2016176963。通过将相应的dna片段合成为gblocks (idt, coralvilleia)并使用标准技术克隆至哺乳动物表达载体中来创建表达载体。
53.表达和纯化fab和抗原ecd在哺乳动物细胞培养cho细胞中表达。收获含有蛋白的细胞培养上清液，并使用his trap
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excel (ge healthcare)，使用pbs缓冲液加15mm咪唑，ph 7.5作为结合缓冲液，通过固定化金属亲和色谱(imac)纯化澄清的培养基。然后将蛋白在pbs加0.3m咪唑，ph7.4中在10柱体积梯度洗脱上洗脱。收集洗脱液并使用millipore 10kda旋转浓缩器进行浓缩。将浓缩imac合并物加载于superdex75或superdex200 (gehealthcare)柱上。对于结晶托盘，将蛋白再次浓缩至10mg/ml。
54.通过分析型大小排阻色谱法(waters)和sds-page凝胶表征蛋白(数据未显示)。
55.结晶和结构测定将所有样品浓缩至5-10 mg/ml，并在室温下使用qiagen classics ii和pegs结晶筛选以1:1的比率置设置于蒸汽扩散坐滴中。液滴立即用相关fab晶种交叉接种以用于fab结晶，并且用复合物-晶种交叉接种以用于复合物结晶。在第1天、第4天和第9天拍摄结晶托盘的图像。在液氮中冷冻之前，将晶体转移至冷冻保护剂溶液中，所述冷冻保护剂溶液由补充有额外10%用于该结晶孔中的沉淀剂和25%的甘油的孔溶液或来自母液的孔溶液组成，如果母液包含浓度足以进行冷冻保护的具有冷冻保护特性的沉淀剂(诸如peg 400、peg mme 550、peg mme 2k等)的话。
56.结构测定衍射数据集在以下来源收集：lilly research collaborative access team (lrl-cat) beamline 31-id at advanced proton source (argonne, il); beamline als-502 at advanced light source (berkley, ca); beamline i04-1 at diamond light source (oxfordshire, uk)。使用mosflm (leslie agw & powell hr. in: read rj, & sussman jl (编), evolving methods for macromolecular crystallography: the structural path to the understanding of the mechanism of action of cbrn agents. dordrecht: springer netherlands. 2007)和ccp4程序套件(winn, 等人, acta crystallogr d biol crystallogr, 2011. 67(pt 4):235-42)将数
据整合和简化。使用phaser (ccp4套件) (mccoy, 等人, j. appl. crystallogr., 2007. 40(pt 4):658-674)获得初始分子置换解决方案。该模型使用coot (emsley, 等人, acta crystallogr d biol crystallogr, 2010. 66(pt 4):486-501)构建，并使用refmac (murshudov, 等人, acta crystallogr d biol crystallogr, 2011. 67(pt 4):355-67)或buster (bricogne, 等人 buster version 2.11.5. cambridge, united kingdom: global phasing ltd. 2011)精修并使用内部开发的方案进行验证。
57.实施例2：全长单克隆抗体(mab)的结晶和x-射线结构测定除了fab片段以外，crystal kappa设计还可用于结晶全长igg抗体，如下所示。使用标准分子生物学技术，在标准表达载体中用crystal kappa设计修饰抗体的轻链。然后，轻链与相应的重链在适合用于分泌抗体的表达系统(诸如，hek293或中国仓鼠卵巢细胞)中表达。然后，使用诸如用mabselect柱(ge healthcare)的柱纯化的技术，从培养基纯化抗体并浓缩至例如5 mg/ml。利用蒸气扩散方法，然后筛选条件以从纯化的抗体生长蛋白晶体。然后分离、转移和冷冻晶体，然后收集x-射线数据。使用标准技术，然后可以通过分子置换(例如，使用软件phaser，且然后使用精修的原子模型)，从该数据确定结构。
58.一种抗体结构是通过将crystal kappa设计并入igg4-p (具有s241p (根据kabat编号)或s228p (根据eu索引编号)的igg4)同种型抗体的κ轻链产生。从21℃的96-孔筛选(compas, qiagen)，几种条件产生晶体，包括18%乙醇 100mm tris hcl(ph 8.5)。通过优化这些条件，从20%乙醇、21℃获得衍射晶体和4
å
数据集。该数据集的分子置换解决方案产生全长抗体的结构(两条重链、两条轻链和糖基化)，其构象与两种已知的人igg4结构的构象(5dk3.pdb和6gfe.pdb)显著不同并且更类似于已知的人igg1结构(1hzh.pdb)。crystal kappa设计有助于晶体堆积，抗体中的其他接触点也是如此。
59.图6a-6b显示全长mab的结晶和结构测定。图6a是显示全长mab的晶体的图像。图6b是所得结构的带状图，其中抗体重链呈黑色(包括呈棒的fc糖基化)且抗体轻链呈浅灰色。
60.实施例3：通过生成融合蛋白结晶fab:抗原肽复合物fab与其抗原肽的复合物的晶体结构测定可以通过两种方式实现。首先且更典型地，抗原肽可以购买或使用各种技术(chandrudu s, simerska p, toth i. chemical methods for peptide and protein production. molecules. 2013 apr 12;18(4):4373-88)制备。然后，可以将该肽溶解并以等于或超过以摩尔计的fab浓度的最终浓度添加至fab中。然后，如同单独的crystal kappa fab一样，实现复合物的结晶和结构测定。无需购买肽的第二种技术是将肽的编码序列直接插入fd或κ轻链的开放阅读框中，以便在构建fab表达载体期间生成在肽和fd/κ轻链之间具有适当接头的融合蛋白。然后，在融合蛋白中，该肽将通过接头以精确的一对一化学计量栓系至fab。该栓系还具有增加肽的有效浓度和避免低亲和力肽不出现在晶体或所得结构中的情况的益处。栓系保证了晶体中抗原肽的存在。
61.如下获得抗tau抗体l14h18 (wo 2017/005734)与其同源tau肽抗原的fab:抗原肽复合物。通过在开放阅读框的信号序列和fab链的成熟开始之间并入dna序列(翻译成如下那27个氨基酸)，将包含已知表位tppkspssaksrlqtapvpm (seq id no:18)的tau肽(氨基酸231-250)用gs接头(seq id no:19)融合至fd-his6或l14h18 fab的crystal kappa轻链的n-末端。tau肽-接头-fd-his/crystal kappa轻链和fd-his/tau肽-接头-crystal kappa轻
链版本均在cho细胞中表达，通过固定化金属亲和色谱法和凝胶过滤纯化，浓缩至4.5 mg/ml并在市售筛选中结晶。在classics和peg筛选(qiagen)中，数十种条件对两种版本产生晶体。对于crystal kappa融合体解析并精修两种复合物结构：来自20% peg 3350/200mm酒石酸钠钾的1.22
å
结构和来自100mm醋酸钠ph4.6/25% peg 4000/200mm硫酸铵的2.3
å
结构。两种结构都显示大部分延伸的肽，其中一个螺旋转角与fab的cdr结合，并且仅在接头部分的顺序程度上不同。
62.图7a-7b显示tau肽-fab复合物的结晶。图7a是显示4小时后与tau肽融合的l14h18的crystal kappa轻链的晶体的图像。图7b是与l14h18 fab结合的tau肽(白色)的所得2.3
å
结构的带状图，其中大部分有序的gs接头连接至fab轻链(灰色)的n-末端。fab重链以黑色显示。
63.序列表野生型人κ轻链恒定结构域氨基酸序列(seq id no:1)人变体氨基酸序列(seq id no:2)人变体氨基酸序列(seq id no:3)人变体氨基酸序列(seq id no:4)人变体氨基酸序列(seq id no:5)人变体氨基酸序列(seq id no:6)人igg4 ch1结构域eskygh6变体氨基酸序列(seq id no:7)人igg4 ch1结构域eskygh6 c127a变体氨基酸序列(seq id no:8)野生型人igg1无标签ch1结构域氨基酸序列(seq id no:9)人igg1有标签ch1结构域氨基酸序列(seq id no:10)
人igg4无标签ch1结构域(seq id no:11)人igg4有标签ch1结构域(seq id no:12)野生型小鼠氨基酸序列(seq id no:13)野生型兔氨基酸序列(seq id no:14)野生型人λ轻链恒定结构域氨基酸序列(seq id no:15)野生型小鼠氨基酸序列(seq id no:16)野生型兔氨基酸序列(seq id no:17)tau肽(seq id no:18)gs接头(seq id no:19)
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