玉米的耐旱性的制作方法

玉米的耐旱性发明领域1.本发明涉及植物和植物部分(例如玉米)的数量性状位点(qtl)和相关标记，所述qtl和相关标记涉及耐旱性、碳同位素组成、气孔参数和农艺表现和/或与之相关。本发明还涉及这种qtl或标记在用于鉴定和/或选择目的，以及在转基因或非转基因植物中的用途。2.发明背景3.干旱胁迫是全世界农业系统中生产力最严重的自然限制之一。随着气候变化，作物将经历更频繁的干旱和高温事件，这阻碍了所有植物阶段的生长和发育(ipcc，2014)。尤其是，当这些条件在开花之前、期间和之后影响植物发育时，植物发育和产量的降低几乎是确定的。培育抗旱作物品种是应对上述环境挑战并为农民提供可持续生产系统所需的作物的当务之急。4.gresset等人(2014.stablecarbonisotopediscriminationisundergeneticcontrolinthec4speciesmaizewithseveralgenomicregionsinfluencingtraitexpression.plantphysiology,164(1),131-143)报道了对专有玉米(zeamaysl.)基因渗入文库(il)的分析，以揭示碳同位素组成(δ13c)的潜在遗传控制，其中基因渗入文库(il)衍生自欧洲优良马齿型(europeanelitedent)作为轮回亲本(rp)和flint系作为供体亲本(dp)获得的两个kwssaatse近交系。在田间和温室条件下检测到δ13c的高度遗传性显著遗传变异。根据77个il系的评价，作者能够鉴定影响δ13c的22个基因组区域。其位于染色体6和7上的两个靶区域似乎特别相关(图1a)。5.碳同位素组成可用作推断有关c3物种蒸腾效率信息的代表(farquharetal.,1989.carbonisotopediscriminationandphotosynthesis.annualreviewofplantbiology,40(1),503-537)。在c4物种中的若干研究已经显示δ13c和水分利用效率之间呈负相关(wue；hendersonetal.,1998.correlationbetweencarbonisotopediscriminationandtranspirationefficiencyinlinesofthec4speciessorghumbicolorintheglasshouseandthefield.functionalplantbiology,25(1),111-123；derconetal.,2006.differential13cisotopicdiscriminationinmaizeatvaryingwaterstressandatlowtohighnitrogenavailability.plantandsoil,282(1-2),313-326；sharwoodetal.,2014.photosyntheticflexibilityinmaizeexposedtosalinityandshade.journalofexperimentalbotany,65(13),3715-3724.)，其定义为每单位用水量所积累的生物量或产量。6.avramova等人(2019.carbonisotopecomposition,wateruseefficiency,anddroughtsensitivityarecontrolledbyacommongenomicsegmentinmaize.theoreticalandappliedgenetics,132:53-63)进一步分析了2014年gresset等人在7号染色体上携带重叠供体片段的近等基因系，两个近等基因系nila和nilb是从来自基因渗入文库的系之间的杂交开发的。用600kaxiomtm玉米基因分型芯片(unterseeretal.,2014.apowerfultoolforgenomeanalysisinmaize:developmentandevaluationofthehighdensity600ksnpgenotypingarray.bmcgenomics,15:823)进行的基因型分析显示，两种nil均携带来源于7号染色体上的dp的基因组片段，与rp相比，其显示出籽粒δ13c显著增加。作者假设nilb(图1c)携带的chr7(110.76-166.10mb)上的基因渗入片段具有影响不同性状的若干qtl，并且对个体性状具有累积效应。后者可以从chr7上具有比nilb更小的片段并且对测量参数具有不太显著的影响的nila(图1b)推断。此外，nila在chr2上携带第二个大片段，其中定位了先前鉴定的δ13c的qtl(gresset等，2014)，这可能改变基因渗入对chr7的影响。7.根据alvarezprado等人的研究(2018.phenomicsallowsidentificationofgenomicregionsaffectingmaizestomatalconductancewithconditionaleffectsofwaterdeficitandevaporativedemand.plant,cell&environment,41(2),314-326.)，在玉米多样性检测panel中与avramova等人(124.35-160.14mb)在7号染色体上相同的基因组区域中鉴定了影响全植物气孔导度的三个额外qtl(两个具有正效应，一个具有负效应)。8.尽管玉米中7号染色体上的区域已经根据影响碳同位素组成、气孔参数和农艺表现进行了深入研究，但焦点通常更多地针对表型方面和生理学参数而不是基因组性质。已经发现了若干qtl部分地正面、部分地负面地影响耐旱性。这些qtl之间的相互作用尚未充分研究且尚未完全了解。此外，2019年avramova等人研究的可能携带若干相关qtl的基因组区域具有超过20mb的相当大，并且合适的分子标记的可用性非常有限，这就是为什么到目前为止这种性状不能有效地用于育种和植物开发的原因。需要对小的基因组区域或致病基因以及分子标记进行基因组表征，以允许在育种过程期间追踪这些基因组区域或基因，并将它们渐渗到新的优良种系中而没有可能的连接的连锁累赘。9.因此，本发明的目的是解决现有技术的一个或多个缺点。对于改善饲料作物的耐旱性以及植物的鉴定，包括具有改变的耐旱性的特定植物部分或衍生物存在持续的需求。特别地，本发明的目的是提供新的重要的qtl，尤其是耐旱性和相关参数，例如碳同位素组成、气孔参数和农艺表现，以及致病基因，并提供允许在玉米开发和育种中经济使用这些qtl的标记。10.发明简述11.本发明基于在稳定碳同位素组成、气孔导度和干旱下的植物性能等方面，鉴定有助于遗传变异的qtl。12.本发明特别涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含特异性分子标记的染色体区间上。所述qtl等位基因优选包含分子标记a和/或b，其中参照b73参照基因组agpv2，分子标记a和b分别是对应于位置125861690的c和对应于位置126109267的a，或者分别是对应于位置125861690的t和对应于位置126109267的g的snps(单核苷酸多态性)。在某些实施方案中，分子标记a和/或b位于所述qtl等位基因的两侧。在某些实施方案中，所述qtl等位基因包含分子标记c、d、e和/或f，其中参照b73参照基因组agpv2，分子标记c、d、e和f分别是对应于位置125976029的a、对应于位置127586792的a、对应于位置129887276的c和对应于位置130881551的c，或者它们分别是对应于位置125976029的g、对应于位置127586792的g、对应于位置129887276的t和对应于位置130881551的t的snps。在某些实施方案中，分子标记a和/或f位于所述qtl等位基因的两侧。13.本发明还涉及用于检测标记或标记等位基因的所述标记或标记等位基因和多核酸，例如引物和探针，以及包含它们的试剂盒。本发明还涉及用于改变植物耐旱性或耐受性的方法，特别是通过在植物中天然或人工引入和/或选择包含本文所述qtl(等位基因)和/或标记等位基因的植物，以及改变如本文所定义的根据本发明的qtl(等位基因)中所包含基因的基因表达或基因活性。本发明还涉及包含如本文定义的根据本发明的qtl(等位基因)和/或标记等位基因的植物。14.本发明特别允许使用分子标记来推断下述基因组状态，并基于定位到5.02mb区间的基因进行选择。：15.i)位于7号染色体上两侧的标记7(125.861.690bp)和11(130.881.551bp)之间的5.02mb的qtl影响δ13c和气孔参数，16.ii)该qtl从标记7(125.861.690bp)到标记8b(126.109.267bp)的长度为248kb的一个截短部分对气体交换参数具有特异性作用。基因渗入系与供体亲本(dp)片段和回归亲本(rp)的基因型/表型相关性允许推导和改变碳同位素组成、气孔参数的反应模式和种质中农艺性状的表达。在这方面，在轻度应激情况下，甚至在水胁迫下，供体基因渗入可用于将气孔导度保持在升高的水平。因此，实现了延长的光合作用和恢复后的轻微生长优势，这改善了农业经济学和产量。此外，该信息还可用于渐渗dp等位基因以促进易旱种质中更快的干旱响应。17.通常，本发明允许使用标记信息来表征材料的气孔参数、碳同位素组成、水分利用效率和干旱下的性能。相应地，使用产生单倍型的单一标记信息以及组合信息是在共同选择过程期间快速、精确和改进遗传物质分类的基础。18.最后，通过调节候选基因的表达、改变这些基因和基因产物的分子活性或产生源自这些基因的任何等位基因形式，候选基因水平的等位变异可用于改善上述表型。19.本发明特别地通过下述编号1至25的一个或多个与任何其他描述和/或实施例的任何一个或任何组合来实现。20.[1]用于鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和/或b的染色体区间上，其中分子标记a和b是参照b73参考基因组agpv2分别对应于位置125861690的c和对应于位置126109267的a的snps，或分别对应于位置125861690的t和对应于位置126109267的g的snps。[0021][2]根据陈述1所述的方法，其中分子标记a和/或b位于所述qtl等位基因的侧翼，优选两者，任选地其中所述qtl等位基因包含分子标记(等位基因)a和/或b，优选两者。[0022][3]根据陈述1-2任一项所述的方法，其中所述qtl等位基因包含分子标记(等位基因)c、d、e和/或f，其中分子标记c、d、e和f是参照b73参考基因组agpv2分别对应于位置125976029的a、对应于位置127586792的a、对应于位置129887276的c和对应于位置130881551的c的snps，或者分别对应于位置125976029的g、对应于位置127586792的g、对应于位置129887276的t和对应于位置130881551的snps。[0023][4]根据陈述3所述的方法，其中分子标记a和/或f位于所述qtl等位基因侧翼，优选两者，任选地其中所述qtl等位基因包含分子标记(等位基因)a和/或f，优选两者。[0024][5]根据陈述1至4中任一项所述的方法，其中筛选所述qtl等位基因的存在包括鉴定分子标记a和b中的任何一个或多个。[0025][6]根据陈述3至5中任一项所述的方法，其中筛选所述qtl等位基因的存在包括鉴定分子标记a、b、c、d、e和f中的任何一个或多个。[0026][7]根据陈述3至5中任一项的方法，其中筛选所述qtl等位基因的存在包括确定根据陈述1至[6]中任一项中所定义的位于qtl中的一种或多种基因的表达水平、活性和/或序列。[0027][8]用于鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括确定位于根据陈述1至6中任一项中所定义的位于qtl中的一种或多种基因的表达水平、活性和/或序列。[0028][9]根据陈述7或8的方法，其还包括将所述一种或多种基因的表达水平和/或活性与预定阈值进行比较。[0029][10]根据陈述7至9中任一项所述的方法，其还包括比较所述一种或多种基因在控制条件和干旱胁迫条件下的表达水平和/或活性。[0030][11]一种修饰玉米植物的方法，其包括改变位于根据陈述1至6中任一项所定义的qtl中的一种或多种基因的表达水平和/或活性。[0031][12]根据陈述7至11中任一项的方法，其中所述一种或多种基因选自abh4、csle1、web1、rmzm2g3977260和hsftf21，优选abh4。[0032][13]根据陈述12所述的方法，其中[0033]abh4选自[0034](i)包含seqidno：9或18的序列或由其组成的核苷酸序列；[0035](ii)具有seqidno：11、14、17或20的cdna的核苷酸序列；[0036](iii)编码具有seqidno：12、15或21的氨基酸序列的核苷酸序列；[0037](iv)与seqidno：9、11、14、17、18或20的序列具有至少60％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％同一性的核苷酸序列；[0038](v)编码与seqidno：12、15或21的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性的多肽的核苷酸序列；[0039](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0040](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质；[0041]csle1选自[0042](i)包含seqidno：1或4的序列或由其组成的核苷酸序列；[0043](ii)具有seqidno：2或5的cdna的核苷酸序列；[0044](iii)编码具有seqidno：3或6的氨基酸序列的核苷酸序列；[0045](iv)与seqidno：1、2、4或5的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性的核苷酸序列；[0046](v)编码与seqidno：3或6的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性的多肽的核苷酸序列；[0047](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0048](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质；[0049]web1选自[0050](i)包含seqidno：24或27的序列或由其组成的核苷酸序列；[0051](ii)具有seqidno：25或28的cdna的核苷酸序列；[0052](iii)编码具有seqidno：26或29的氨基酸序列的核苷酸序列；[0053](iv)与seqidno：24、25、27或28的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性的核苷酸序列；[0054](v)编码与seqidno：26或29的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性的多肽的核苷酸序列；[0055](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0056](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质；[0057]grmzm2g3977260选自[0058](i)包含seqidno：32的序列或由其组成的核苷酸序列；[0059](ii)具有seqidno：33的cdna的核苷酸序列；[0060](iii)编码具有seqidno：34的氨基酸序列的核苷酸序列；[0061](iv)与seqidno：32或33的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性的核苷酸序列；[0062](v)编码与seqidno：34的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性的多肽的核苷酸序列；[0063](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0064](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质；[0065]hsftf21选自[0066](i)包含seqidno：36或39的序列或由其组成的核苷酸序列；[0067](ii)具有seqidno：37或40的cdna的核苷酸序列；[0068](iii)编码具有seqidno：38或41的氨基酸序列的核苷酸序列；[0069](iv)与seqidno：36、37、39或40的序列具有至少60％、优选至少80％、更优选至少90％、甚至更优选至少95％同一性的核苷酸序列；[0070](v)编码与seqidno：38或41的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％同一性的多肽的核苷酸序列；[0071](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0072](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质。[0073][14]用于产生玉米植物的方法，其包括将根据陈述1至6的任一项中定义的qtl等位基因引入植物的基因组中。[0074][15]获得玉米植物部分的方法，其包括(a)提供具有如陈述1至6中任一项定义的qtl等位基因或一种或多种分子标记的第一玉米植物，(b)将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交，(c)选择具有所述qtl等位基因或所述一种或多种分子标记的后代植物，和(d)从所述后代收获所述植物部分。[0075][16]根据陈述1至15中任一项的方法，其中所述qtl与干旱抗性或耐受性和/或δ13c相关联。[0076][17]根据陈述1至16中任一项的方法，其中所述qtl影响气孔参数和/或气体交换参数。[0077][18]根据陈述1-17任一项的方法，其中所述qtl影响(内在或整个植物)水分利用效率、气孔导度、净co2同化速率、蒸腾作用、气孔密度、(叶)aba含量、(叶)生长对干旱的敏感性、蒸发需求和/或土壤水分状态和/或光合反应。[0078][19]一种玉米植物或植物部分，其包含如陈述1至18中任一项所定义的qtl等位基因和/或一种或多种分子标记。[0079][20]根据陈述19的植物或植物部分，其中所述植物来源于包含通过基因渗入获得的所述qtl等位基因或标记等位基因的植物。[0080][21]根据陈述19或20的植物或植物部分，其中所述植物是转基因的或基因编辑的。[0081][22]根据前述陈述中任一项的方法、植物或植物部分，其中所述植物部分不是繁殖材料。[0082][23]一种分离的多核酸，其与玉米基因组核苷酸序列特异性杂交，所述玉米基因组核苷酸序列包含分子标记a、b、c、d、e和f中的任何一种或多种，或其互补序列或反向互补序列。[0083][24]根据陈述23的分离的多核酸，它是能够特异性检测陈述1-6中任一项所定义的qtl等位基因或任何一种或多种分子标记的引物或探针。[0084][25]一种分离的多核酸，其包含和/或侧翼具有分子标记a、b、c、d、e或f中的任何一个或多个。[0085]附图简述及序列[0086]图1il-005(图1a)、nila(图1b)和nilb(图1c)的图示基因型。显示了具有标记分布和相应的rp(黑色)和dp(灰色)识别(call)的染色体(chr)和数个着丝粒(中心体)。物理坐标涉及agpv02。从600k芯片接收详细数据。[0087]图2关于7号染色体在il-005、nila和nilb中基因渗入的大小和状态以及gresset等人(2014)报道的显著区间的概述。下图给出了600个标记(黑色柱)和基因模型(基因)在玉米agpv02chr7上的整体分布。显示了在具有许多dp状态(dp识别)的标记的il中基因渗入(供体靶标)的大小以及基因渗入中相应的基因模型数目。上图给出了gresset等人(2014)报道的靶分子状态的概述。[0088]图3新产生的重组体的选择过程的概述。kasp标记由垂直橙色线和具有各自名称的点显示。在筛选期间检测到的可能的重组事件由黑色/灰色阶梯图表示。[0089]图4鉴定了qtl的重组体和分子状态。用它们相应的名称绘制重组体。描述了具有涉及纯合rp(黑色)和纯合dp(灰色)的大小和状态的序列区间。5.02mb的目标区间由两条线(箭头)位于框中。[0090]图5zmabh4(所有转录本在一起)和转录本t01和t03的基因表达分别在充分浇水的植物(对照；c)、干旱胁迫的植物(d)和复水的植物(r)中进行。在回归亲本(基因型rp)和携带该基因的供体亲本等位基因的近等基因系(基因型nilb)之间比较基因表达。进行双因素方差分析关于所有zmabh4转录本一起的表达以评价基因型、处理和它们之间的相互作用之间的显著差异，并且p-值显示在第一图下方。nd：未被检测到。[0091]图6.由abh4催化的化学反应。该图取自saitoetal.(2004).arabidopsiscyp707asencode( )-abscisicacid8'-hydroxylase,akeyenzymeintheoxidativecatabolismofabscisicacid.plantphysiol.134(4):1439–1449。arabidopsiscyp707asencode( )-abscisicacid8'-hydroxylase,akeyenzymeintheoxidativecatabolismofabscisicacid.plantphysiol.134(4):1439–1449。[0092]图7.图4示出了重组体，abh4催化的反应的产物(pa红花菜豆酸，dpa二氢红花菜豆酸)与底物(aba脱落酸)的比例，描述了涉及纯合rp(深灰色)和纯合dp(浅灰色)的序列区间大小和状态。所显示的是agpv02坐标。具有相同表型的重组体的重叠区间位于框中。进行rp与各重组体的lsd比较(n＝10)，并且*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。[0093]图8.对于携带突变p377l(377mut)或g453e(453mut)的tilling系，及其各自的野生型(377wt，453wt)以及突变g453e(453het)的杂合植物和用于产生突变体ph207的近交系，abh4催化的反应的产物(pa菜豆酸，dpa二氢红花菜豆酸)与底物(aba脱落酸)的比例。n＝7-12.*p《0.05。[0094]图9.携带突变p377l(377mut)或g453e(453mut)的tilling系和它们各自的野生型(377wt、453wt)以及突变g453e(453het)和ph207的杂合植物的最后发育的叶的碳同位素判别(δ13c)。n＝8-12。[0095]图10.a.测量mo17、b73、ph207和三个nils的气孔导度(gs)和b.测量瞬时水分利用效率(iwue)，背景为mo17和源自7号染色体上的b73的基因渗入片段(m031,m007,m046；eichtenetal.2011)。颜色编码取决于该系携带的abh4等位基因。n＝10-11。显著差异(p《0.05)用离散字母标记。[0096]图11.a.由zmabh4催化的ph207、b73和两个nils的反应的产物(pa菜豆酸、dpa二氢红花菜豆酸)与底物(aba脱落酸)的比例，背景为b73和源自mo17的7号染色体上的基因渗入片段(b004,b102；eichtenetal.2011)。n＝12。b.气孔导度(gs)和c.测量b73、ph207和两种nils的瞬时水分利用效率(iwue)。n＝13-14。颜色编码取决于该系携带的abh4等位基因。显著差异(p《0.05)用离散字母标记。[0097]图12.aba和ist在温室中生长的t1代crispr/cas9突变体的分解代谢物pa、dpa和aba-glc。与携带两个野生型(wt，n＝4)拷贝的zmabh4的植物相比，携带两个zmabh4突变拷贝(突变，n＝3)的植物叶中的浓度(平均值±sd)。[0098]图13.温室中生长的t1代中crispr/cas9突变体的叶6(v6)的气体交换测量。野生型株系b104(n＝17)、野生型突变体植物的同胞(wtsib，n＝5)、在zmabh4中显示突变但在zmabh1中不显示突变的植物(zmabh4，n＝9)和在两个基因zmabh4和zmabh1中显示突变的植物(zmabh4zmabh1，n＝15)进行了测量。由于t1的高度异质性，没有多次测试校正。[0099]图14.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的轮回亲本(rp)在整株水分利用效率(wueplant)方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。从盆中的相同数量的土壤和水开始，使植物经受逐渐的土壤干燥条件。通过塑料盖在盆上来防止水通过土壤表面蒸发。在实验结束时当植物停止生长时测量最终的干生物量，并将wueplant计算为最终干生物量与消耗的水的比率。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标是根据b73v4(www.maizegdb.org)。[0100]图15.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的轮回亲本(rp)在内在水分利用效率(iwue)方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在温室实验中，在v5发育阶段，使用li-6800(li-corbiosciencesgmbh，usa)对完全发育的叶5进行叶气体交换测量，并将iwue计算为co2同化作用与气孔导度之间的比率。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标依据b73v4(www.maizegdb.org)。[0101]图16.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的轮回亲本(rp)在气孔导度(gs)方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在v5发育阶段，使用li-6800(li-corbiosciencesgmbh，usa)对完全发育的叶5进行叶气体交换测量，以在温室实验中测定gs。数据为平均±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标依据b73v4(www.maizegdb.org)。[0102]图17.近等基因系b(nilb)和九种重组nil(d-l)与它们的轮回亲本(rp)在气孔密度方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在温室实验中，在v5发育阶段在完全发育的叶5上采取的表皮印记中计数气孔。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nil之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标依据b73v4(www.maizegdb.org)。[0103]图18.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的轮回亲本(rp)在叶脱落酸(aba)浓度方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在温室实验中，在v5发育阶段测定从完全发育的叶5收获的样品中的aba浓度。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标依据b73v4(www.maizegdb.org)。[0104]图19.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的轮回亲本(rp)在叶红花菜豆酸(pa)浓度方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在温室实验中，测定从v5发育阶段完全发育的叶5收获的样品中pa浓度。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标依据b73v4(www.maizegdb.org)。[0105]图20.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的轮回亲本(rp)在分解代谢产物红花菜豆酸(pa)和二氢红花菜豆酸(dpa)与它们的底物脱落酸(aba)的比例方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在温室实验中，测定从v5发育阶段完全发育的叶5收获的样品中代谢物浓度。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标依据b73v4(www.maizegdb.org)。[0106]图21.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的回归亲本(rp)在籽粒碳同位素组成(δ13c)方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在温室实验中收获的谷粒中测定δ13c。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet氏试验，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标是根据b73v4(www.maizegdb.org)。[0107]图22.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的回归亲本(rp)在籽粒碳同位素组成(δ13c)方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在良好灌溉条件下在田间实验中收获的谷粒中测定δ13c。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标依据b73v4(www.maizegdb.org)。[0108]图23.近等基因系b(nilb)和九个重组nils(d-l)与它们的回归亲本(rp)在籽粒碳同位素组成(δ13c)方面的比较。每个nil携带来自马齿型rp(浅灰色)的遗传背景中的flint供体亲本的基因渗入(用深灰色标记)。在轻度干旱条件下在遮雨棚中收获的籽粒中测定δ13c。数据为平均值±标准误差(n＝10)。根据dunnet’stest，rp与每个nils之间的显著差异用深灰色柱表示(浅灰色柱与rp没有显著差异)。黑色方框表示与性状相关的靶基因组区域。最后一行中指示的坐标依据b73v4(www.maizegdb.org)。[0109]序列[0110][0111][0112]发明详述[0113]在描述本发明的系统和方法之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定系统和方法或组合，因为这样的系统和方法以及组合当然可以变化。还应理解，本文所用的术语不是限制性的，因为本发明的范围仅由所附权利要求限定。[0114]如本文所用，单数形式“一”(a)、“一个”(an)和“所述”(the)包括单数和复数指代物，除非上下文另外明确指出。[0115]如本文所用，术语“包含(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括...(comprisedof)”与“包括(including)”、“包含(includes)”或“含有(containing)”、“包含(contains)”同义，并且是包含性的或开放式的，并且不排除另外的未叙述的成员、元件或方法步骤。应当理解，本文所用的术语“包含(comprising)”、“包括(comprises)”和“包括...(comprisedof)”包括术语“由...组成(consistingof)”、“组成(consists)”和“由...组成(consistsof)”，以及术语“基本上由...组成”、“基本上由其组成”和“基本上由其组成”。[0116]由端点表述的数值范围包括包含在相应范围内的所有数值和分数，以及所表述的端点。[0117]当涉及可测量值如参数、量、持续时间等时，本文所用的术语“约”或“大约”是指包括指定值的 /-20％或更小、优选 /-10％或更小、更优选 /-5％或更小、还更优选 /-1％或更小的变化，只要这些变化适于在所公开的发明中实施。应当理解，修饰语“约”或“大约”所指的值本身也是具体地和优选地公开的。[0118]然而，通过进一步的示例，术语“一个或多个”或“至少一个”本身是清楚的，例如一组成员中的一个或多个或至少一个成员，该术语包括对所述成员中的任何一个或对所述成员中的任何两个或更多个的引用，例如所述成员中的任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7等，以及所有所述成员。[0119]本说明书中引用的所有参考文献都通过引用整体并入本文。特别地，本文中特别提及的所有参考文献的教导通过引用并入本文。[0120]除非另有定义，否则在公开本发明时使用的所有术语，包括技术和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。[0121]阐述重组dna技术一般原理的标准参考文献包括：molecularcloning:alaboratorymanual,2nded.,vol.1-3,ed.sambrooketal.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989；currentprotocolsinmolecularbiology,ed.ausubeletal.,greenepublishingandwiley-interscience,newyork,1992(withperiodicupdates)(“ausubeletal.1992”)；theseriesmethodsinenzymology(academicpress,inc.)；innisetal.,pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,academicpress:sandiego,1990；pcr2:apracticalapproach(m.j.macpherson,b.d.hamesandg.r.tayloreds.(1995)；harlowandlane,eds.(1988)antibodies,alaboratorymanual；andanimalcellculture(r.i.freshney,ed.(1987).generalprinciplesofmicrobiologyaresetforth,forexample,indavis,b.d.etal.,microbiology,3rdedition,harper&row,publishers,philadelphia,pa.(1980)。[0122]在以下段落中，更详细地限定本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其它一个或多个方面组合，除非有清楚的相反指示。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与任何其他被指示为优选或有利的一个或多个特征组合。[0123]在整个说明书中，对“一个实施方案”或“实施方案”的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书中的各个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定全部指代同一实施方案，而是可以指代同一实施方案。此外，如本领域技术人员从本公开中将显而易见的，在一个或多个实施方案中，可以以任何合适的方式组合特定特征、结构或特性。此外，虽然本文描述的一些实施方案包括一些但不包括其他实施方案中所包括的其他特征，但是不同实施方案的特征的组合意味着在本发明的范围内，并且形成不同的实施方案，如本领域技术人员将理解的。例如，在所附权利要求中，任何要求保护的实施方案可以以任何组合使用。[0124]在本发明的以下详细描述中，参考形成本发明的一部分的附图，且在附图中仅以说明的方式展示可实践本发明的特定实施方案。应该理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以使用其它实施方案，并且可以进行结构或逻辑上的改变。因此，以下详细描述不应被理解为限制性的，并且本发明的范围由所附权利要求限定。[0125]本发明的优选陈述(特征)和实施方案在下文中阐述。除非有清楚的相反指示，如此定义的本发明的每个陈述和实施方案可以与任何其它陈述和/或实施方案组合。特别地，任何被指示为优选或有利的特征可以与任何其他被指示为优选或有利的一个或多个特征或陈述组合。[0126]如本文所用，“玉米”指玉米种的植物，优选玉米(zeamayssspmays)。[0127]术语“植物”包括完整植物，包括其后代或子代。术语“植物部分”包括植物的任何部分或衍生物，包括特定的植物组织或结构、植物细胞、植物原生质体、植物细胞或从中可以再生植物的组织培养物、植物愈伤组织、植物中完整的植物团块和植物细胞或植物部分，例如种子、籽粒、穗轴、花、子叶、叶、茎、芽、根、根尖、秸秆等。植物部分可以包括加工的植物部分或衍生物，包括花、油、提取物等。[0128]在某些实施方案中，植物部分或衍生物包含下述中的一种或多种、由下述中的一种或多种组成或基本上由下述中的一种或多种组成：茎、叶和穗轴，优选全部。在某些实施方案中，植物部分或衍生物是叶。在某些实施方案中，植物部分或衍生物是茎。在某些实施方案中，植物部分或衍生物是穗轴。在某些实施方案中，植物部分或衍生物包含下述中的一种或多种、由下述中的一种或多种组成或基本上由下述中的一种或多种组成：茎和叶，优选全部。在某些实施方案中，植物部分或衍生物包含下述中的一种或多种、由下述中的一种或多种组成或基本上由下述中的一种或多种组成：茎和穗轴，优选全部。在某些实施方案中，植物部分或衍生物包含下述中的一种或多种、由下述中的一种或多种组成或基本上由下述中的一种或多种组成：叶和穗轴，优选全部。在某些实施方案中，植物部分或衍生物不是(功能性)繁殖材料，例如种质、种子或植物胚或可再生植物的其它材料。在某些实施方案中，植物部分或衍生物不包含(功能性)雄性和雌性生殖器官。在某些实施方案中，植物部分或衍生物是或包含繁殖材料，但不(或不能(再)用于产生或生成新的植物的繁殖材料，例如已经通过化学、机械或其他方式例如热处理、酸处理、压实、压碎、切碎等而变得无功能的繁殖材料。在某些优选的实施方案中，植物部分是玉米穗轴或秸秆。[0129]本文所指的抗旱性或耐旱性涉及植物在干燥或干旱条件下，即在次优供水或供水可用性条件下维持其生物量生产的能力。耐旱性背后的机制是复杂的，并且涉及允许植物在任何给定时间对特定条件集合作出响应的多种途径。这些相互作用中的一些包括气孔导度、类胡萝卜素降解和花色素苷积累、渗透调节剂(例如蔗糖、甘氨酸和脯氨酸)的干预、ros清除酶。耐旱性的分子控制也非常复杂，并且受其他因素如环境和植物发育阶段的影响。这sorghumbicolorintheglasshouseandthefield.functionalplantbiology,25(1),111-123；derconetal.,2006.differential13cisotopicdiscriminationinmaizeatvaryingwaterstressandatlowtohighnitrogenavailability.plantandsoil,282(1-2),313-326；sharwoodetal.,2014.photosyntheticflexibilityinmaizeexposedtosalinityandshade.journalofexperimentalbotany,65(13),3715-3724.)，其定义为单位用水累积的生物量或产量。[0136]在本发明的上下文中，如果性状或参数值根据qtl或标记(即序列)的同一性而变化(即表现出表型差异)，则认为特定qtl或标记“关联”或“影响”特定性状或参数，例如耐旱性/抗旱性或δ13c。这种相关性可以是成因性的或非成因性的。[0137]如本文所用，术语“气孔参数”是指与气孔功能、结构(包括尺寸、分布、密度)等相关、影响气孔功能、结构或由气孔功能、结构、分布、密度等产生的任何参数。如本文所用，术语“气体交换参数”是指涉及、影响或由气体(例如co2、o2、h2o)向和从植物的摄取和/或释放产生的任何参数。技术人员将理解，在某种程度上，气孔和气体交换参数可以是相互关联或重叠的。[0138]如本文所用，术语水分利用效率(wue)是指有效水利用与实际水排出之间的比率。在具体的方法中，其表征了水的利用如何有效。wue可以表示为植物代谢中利用的水与植物通过蒸腾作用损失的水的比例。wue可以以不同的比例测量，从叶上的瞬时测量到植物和作物水平上的更完整的测量。内在水分利用效率(iwue)是净co2同化速率与气孔导度(a/gs；以molco2/molh2o表示)的比值。整株植物水分利用效率(wueplant)是最终和初始植物生物量之间的差异与所消耗的水总量(以g/l表示)的比率。wue的生命周期综合指标被测量为13c与12c的比率(δ13c或δ13c)。[0139]如本文所用，术语气孔导度(gs；以mol/m2/s表示)是指二氧化碳(co2)进入或水蒸气通过叶的气孔离开的通过速率。气孔导度取决于气孔密度、气孔孔径和气孔大小。气孔导度可以通过本领域已知的方法测量，例如稳态气孔计法、动态气孔计法或零平衡气孔计法。[0140]如本文所用，术语净co2同化速率(a；以mol/m2/s表示)是指在给定时间范围内co2在每叶面积上的光合同化。净co2同化速率可通过本领域已知的方法测量。[0141]如本文所用，术语蒸腾(e；表示为ml/g或ml/m2或ml/g/s或ml/m2/s的蒸腾速率)是指水移动通过植物并从地上部分(如叶，茎和花)蒸发的过程。蒸腾作用通过气孔开口发生。蒸腾作用可以通过本领域已知的方法测量。[0142]如本文所用，术语气孔密度是指每叶面积的气孔量。[0143]如本文所用，术语aba含量是指脱落酸的量或浓度。aba含量可以例如测定为各种植物组织或器官中的aba含量，例如aba叶含量。[0144]如本文所用，术语生长对干旱的敏感性是指干旱或水可用性通常对生长特征(例如生物质生产)的影响。干旱对生长的更高(负面)影响反映了生长对干旱的敏感性增加。[0145]如本文所用，b73参照基因组agpv2是指组装b73refgen_v2(也称为agpv2，b73refgen_v2)，如玉米遗传学和基因组数据库(https://www.maizegdb.org/genome/genome_assembly/b73％20refgen_v2)提供的。[0146]如本文所用，b73参考基因组agpv4是指组装b73refgen_v2(也称为agpv4，b73refgen_v4)，如玉米遗传学和基因组数据库(https://www.maizegdb.org/genome/genome_assembly/zm-b73-reference-gramene-4.0)提供的。[0147]如本文所述，如果多聚核酸包含在多聚核酸中，则多聚核酸，例如本文所述的qtl(等位基因)被认为侧翼是某些分子标记或分子标记等位基因，其中第一标记(等位基因)分别位于所述多聚核酸的上游(即5’)，第二标记(等位基因)位于所述多聚核酸的下游(即3’)。这种第一和第二标记(等位基因)可以与多核酸邻接。核酸同样可以包含这样的第一和第二标记(等位基因)，例如分别在5’和3’端或其附近，例如分别在5’和3’端的50kb内，优选在5’和3’端的10kb内，例如在5’和3’端的5kb内，在5’和3’端的1kb内，或更少。[0148]如本文所用，增加的(蛋白质和/或mrna)表达水平是指增加的表达水平约为至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，例如至少20％、40％、60％、80％或更多，例如至少85％、至少90％、至少95％或更多。如本文所用，(蛋白质和/或mrna)表达水平降低是指表达水平降低约至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，例如至少20％、40％、60％、80％或更多，例如至少85％、至少90％、至少95％或更多。如果表达水平降低至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，则表达(基本)不存在或消除。在某些实施方案中，如果没有检测到蛋白质和/或mrna，特别是野生型或天然蛋白质和/或mrna，则表达(基本上)不存在。表达水平可以通过本领域已知的任何方法来测定，例如通过标准检测方法，包括例如(定量)pcr、northern印迹、western印迹、elisa等。[0149]如本文所用，增加的(蛋白质)活性是指增加的活性约为至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，例如至少20％、40％、60％、80％或更多，例如至少85％、至少90％、至少95％或更多。如本文所用，(蛋白质)活性降低是指活性降低约至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，例如至少20％、40％、60％、80％或更多，例如至少85％、至少90％、至少95％或更多。如果活性降低至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，则活性(基本)不存在或消除。在某些实施方案中，如果没有检测到活性，特别是野生型或天然蛋白活性，则活性(基本上)不存在。(蛋白质)活性水平可以通过本领域已知的任何方法来确定，这取决于蛋白质的类型，例如通过标准检测方法，包括例如酶活性测定(对于酶)、转录分析(对于转录因子)、分析表型输出的测定等。[0150]可以在不同植物(或植物部分)之间比较表达水平或活性，例如包含本发明的qtl(等位基因)和/或标记(等位基因)的植物(部分)和不包含本发明的qtl(等位基因)和/或标记(等位基因)的植物(部分)。可以在不同条件，例如干旱条件和非干旱条件之间比较表达水平或活性。表达水平或活性可以与预定阈值比较。这种预定阈值可以例如对应于特定基因型中(例如在不包含本发明的qtl(等位基因)和/或标记(等位基因)的植物中)或在特定条件下(例如在非干旱条件下)的表达水平或活性。[0151]术语“位点”(loci复数)是指染色体上发现的例如qtl、基因或遗传标记的一个或多个特定位置或位点。如本文所用，术语“数量性状位点”或“qtl”具有本领域已知的普通含义。通过进一步的指导，而不是限制，qtl可以指与数量表型性状在至少一种遗传背景中，例如在至少一个育种群体中的差异表达相关的dna区域。qtl的区域包含或紧密连锁于影响所述性状的基因。“qtl的等位基因”可以在连续的基因组区域或连锁群内包含多个基因或其它遗传因子，例如单倍型。qtl的等位基因可以表示在特定窗口内的单倍型，其中所述窗口是可以用一组一个或多个多态性标记物定义和跟踪的连续基因组区域。单倍型可以由在指定窗口内的每个标记处的等位基因的独特指纹图谱来定义。qtl可编码影响连续分布的(定量的)表型的表达性的一个或多个等位基因。在某些实施方案中，本文所述的qtl可以是纯合的。在某些实施方案中，本文所述的qtl可以是杂合的。[0152]如本文所用，术语“等位基因”或“多个等位基因”是指基因座的一种或多种替代形式，即不同的核苷酸序列。[0153]本文所用的术语“突变等位基因”或等位基因的“突变”包括具有一个或多个突变的等位基因，所述突变例如插入、缺失、终止密码子、碱基改变(例如转换或颠换)或剪接点的改变，其可以产生或不产生改变的基因产物。等位基因中的修饰可出现在编码区或非编码区(例如启动子区、外显子、内含子或剪接点)。[0154]如本文所用，术语“基因渗入”、“基因渗入的”和“使基因渗入”是指天然和人工过程，由此通过杂交一个物种、品种或栽培品种的染色体片段或基因，将这些物种移至另一个物种、品种或栽培品种的基因组中。该过程可任选地通过与轮回亲本回交来完成。例如，所需等位基因在特定位点的基因渗入可通过同一物种的两个亲本之间的有性杂交传递到至少一个后代，其中至少一个亲本在其基因组中具有所需等位基因。或者，例如，等位基因的传递可通过两个供体基因组之间的重组发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所需的等位基因。所需等位基因可例如通过与表型相关的标记物在qtl、转基因等处检测。在任何情况下，包含所需等位基因的后代可以重复地与具有所需遗传背景的品系回交并且针对所需等位基因进行选择，以导致等位基因固定在选择的遗传背景中。当该过程重复两次或更多次时，“渗入”过程通常被称为“回交”。“基因渗入片段”或“基因渗入区域”是指已经人工或自然地引入相同或相关物种的另一植物中的染色体片段(或染色体部分或区域)，例如通过杂交或传统育种技术，例如回交，即基因渗入片段是动词“基因渗入”(例如回交)所指的育种方法的结果。应当理解，术语“基因渗入片段”从不包括整个染色体，而是仅包括染色体的一部分。基因渗入片段可以是大的，例如甚至是染色体的四分之三或一半，但优选更小，例如约15mb或更小，例如约10mb或更小、约9mb或更小、约8mb或更小、约7mb或更小、约6mb或更小、约5mb或更小、约4mb或更小、约3mb或更小、约2.5mb或2mb或更小、约1mb(等于1,000,000个碱基对)或更小、或约0.5mb(等于500,000个碱基对)或更小，例如约200,000bp(等于200千碱基对)或更小、约100,000bp(100kb)或更小、约50,000bp(50kb)或更小、约25,000bp(25kb)或更小。在某些实施方案中，基因渗入片段包含如本文所述的根据本发明的qtl，由其组成，或基本上由其组成。[0155]如果使用传统育种技术，可以将赋予性状(如改善的消化率)的遗传元件、基因渗入片段、或基因或等位基因从本文别处所述的植物或植物部分“获得”或“从其衍生”或“存在于其”或“发现于其”中，而除了添加由遗传元件、位点、基因渗入片段、基因或等位基因赋予的性状外，不导致受体植物的表型改变，则可以将其从存在其的植物转移到不存在其的另一植物(如品系或品种)中。这些术语可互换使用，因此遗传元件、位点、基因渗入片段、基因或等位基因可被转移到缺乏该性状的任何其它遗传背景中。不仅可以使用包含遗传元件、位点、基因渗入片段、基因或等位基因的植物，而且可以使用来自这样的植物的后代，其已经被选择以保留遗传元件、位点、基因渗入片段、基因或等位基因，并且其包括在本文内。植物(或植物的基因组dna、细胞或组织)是否包含与可从所述植物获得的相同的遗传元件、位点、基因渗入片段、基因或等位基因，可由技术人员使用本领域已知的一种或多种技术来确定，所述技术例如表型鉴定、全基因组测序、分子标记分析、性状定位、染色体涂染、等位性测验等，或技术的组合。应当理解，也可以包括转基因植物。[0156]本文所用的术语“遗传工程”、“转化”和“遗传修饰”在本文中都用作将分离和克隆的基因转移到另一生物体的dna(通常是染色体dna或基因组)中的同义词。[0157]本文所用的“转基因”或“遗传修饰的生物体”(gmo)是其遗传物质已经用通常称为“重组dna技术”的技术改变的生物体。重组dna技术包括将来自不同来源的dna分子离体(例如在试管中)组合成一个分子的能力。该术语通常不包括其遗传组成已经通过常规杂交育种或“诱变”育种改变的生物，因为这些方法先于重组dna技术的发现。本文所用的“非转基因”是指不是如上定义的“转基因”或“遗传修饰的生物体”的植物和源自植物的食品。[0158]“转基因”或“嵌合基因”是指包含dna序列如重组基因的位点，所述dna序列通过转化如农杆菌介导的转化而被引入植物的基因组中。包含稳定整合到其基因组中的转基因的植物被称为“转基因植物”。[0159]“基因编辑”或“基因组编辑”是指其中dna或rna在活生物体的基因组中插入、缺失、修饰或替换的基因工程。基因编辑可以包括靶向或非靶向(随机)诱变。靶向诱变可以例如用设计者核酸酶来完成，例如用巨核酶、锌指核酸酶(zfns)、基于转录激活因子样效应物核酸酶(talen)和成簇的规律区间的短回文重复序列(crispr/cas9)系统。这些核酸酶在基因组中的所需位置产生位点特异性双链断裂(dsbs)。诱导的双链断裂通过非同源末端连接(nhej)或同源重组(hr)修复，导致靶向突变或核酸修饰。设计者核酸酶的使用特别适合于产生基因敲除或敲减。在某些实施方案中，开发了设计者核酸酶，其特异性诱导f35h基因中的突变，如本文别处所述，例如产生突变的f35h或f35h基因的敲除。在某些实施方案中，开发了设计的核酸酶，特别是rna特异性crispr/cas系统，其特异性靶向f35hmrna，例如切割f35hmrna并产生f35h基因/mrna/蛋白质的敲减。设计者核酸酶系统的递送和表达系统是本领域公知的。[0160]在某些实施例中，核酸酶或靶向/位点特异性/归巢核酸酶是(经修饰的)crispr/cas系统或复合物，(经修饰的)cas蛋白质，(经修饰的)锌指，(经修饰的)锌指核酸酶(zfn)，(经修饰的)转录因子样效应物(tale)，(经修饰的)转录因子样效应物核酸酶(talen)或(经修饰的)巨核酶，包含(经修饰的)crispr/cas系统或复合物，(经修饰的)cas蛋白质，(经修饰的)锌指核酸酶(zfn)，(经修饰的)转录因子样效应物核酸酶(talen)或(经修饰的)巨核酶。在某些实施方案中，所述(经修饰的)核酸酶或靶向/位点特异性/归巢核酸酶是(经修饰的)rna引导的核酸酶，包含(经修饰的)rna引导的核酸酶，基本上由(经修饰的)rna引导的核酸酶组成，或由(经修饰的)rna引导的核酸酶组成。可以理解的是，在某些实施方案中，可以对核酸酶进行密码子优化以在植物中表达。本文所用的术语“靶向”所选核酸序列是指核酸酶或核酸酶复合物以核苷酸序列特异性方式起作用。例如，在crispr/cas系统的上下文中，向导rna能够与选择的核酸序列杂交。如本文所用，“杂交”或“杂交的”是指其中一个或多个多核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物通过核苷酸残基的碱基之间的氢键而稳定。氢键可通过沃森克里克碱基配对，hoogsteinbinding或以任何其它序列特异性方式发生。复合物可以包含形成双链结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，单条自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可以在更广泛的过程中构成一个步骤，例如pgr的引发，或通过酶切割多核苷酸。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“互补序列”。[0161]基因编辑可涉及基因编辑成分或系统的瞬时、可诱导或组成型表达。基因编辑可涉及基因编辑成分或系统的基因组整合或附加体的存在。基因编辑成分或系统可以在载体上提供，例如质粒，其可以通过合适的递送载体递送，如本领域已知的。优选的载体是表达载体。[0162]基因编辑可包括提供重组模板，以实现同源定向修复(hdr)。例如，遗传元件可以被基因编辑代替，其中提供了重组模板。dna可以在需要替换的序列的上游和下游切割。因此，从dna中切除待替换的序列。通过hdr，切除的序列然后被模板替换。在某些实施方案中，可以在模板上/作为模板提供本文所述的本发明的qtl等位基因。通过设计系统使得双链断裂被引入到不包含qtl等位基因的植物的基因组中相应区域的上游和下游，切除该区域并且可以用包含本发明的qtl等位基因的模板替换。这样，在植物中导入本发明的qtl等位基因不需要涉及多次回交，特别是在具有特定遗传背景的植物中。类似地，本发明的突变f35h可作为模板提供。然而，更有利的是，本发明的突变f35h可以在不使用重组模板的情况下产生，而仅仅通过导致双链dna断裂的内切核酸酶作用产生，所述双链dna断裂由nhej修复，导致缺失突变的产生。[0163]在某些实施方案中，通过(修饰的)转录激活物样效应物核酸酶(talen)系统实现核酸修饰或突变。转录激活物样效应物(tales)可被改造以实际上结合任何所需的dna序列。使用talen系统进行基因组编辑的示例性方法可以在例如cermakt.doyleel.christianm.wangl.zhangy.schmidtc,etal.efficientdesignandassemblyofcustomtalenandothertaleffector-basedconstructsfordnatargeting.nucleicacidsres.2011；39:e82；zhangf.congl.lodatos.kosuris.churchgm.arlottapefficientconstructionofsequence-specifictaleffectorsformodulatingmammaliantranscription.natbiotechnol.2011；29:149–153anduspatentnos.8,450,471,8,440,431and8,440,432中找到，所有这些文献通过引用具体地并入本文。通过进一步的指导，而非限制，天然存在的tales或“野生型tales”是由许多种类的蛋白细菌分泌的核酸结合蛋白。tale多肽含有由高度保守的单体多肽的串联重复组成的核酸结合结构域，所述单体多肽的长度主要为33、34或35个氨基酸并且彼此主要在氨基酸位置12和13上不同。在有利的实施方案中，核酸是dna。如本文所用，术语“多肽单体”或“tale单体”用于指在tale核酸结合结构域内高度保守的重复多肽序列，术语“重复数可变的双氨基酸”或“rvd”用于指在多肽单体的位置12和13处高度可变的氨基酸。如本公开通篇提供的，使用氨基酸的iupac单字母代码描绘rvd的氨基酸残基。dna结合结构域中包含的tale单体的一般代表是x1-11-(x12x13)-x14-33或34或35，其中下标表示氨基酸位置，x表示任何氨基酸。x12x13表示rvds。在一些多肽单体中，位置13处的可变氨基酸缺失或不存在，并且在此类多肽单体中，rvd由单个氨基酸组成。在这种情况下，rvd可替代地表示为x*，其中x表示x12并且(*)表示x13不存在。dna结合结构域包含tale单体的几个重复，并且这可以表示为(x1-11-(x12x13)-x14-33或34或35)z，其中在有利的实施方案中，z为至少5至40。在另一个优选实施例中，z至少为10至26。tale单体具有通过其rvd中氨基酸的同一性确定的核苷酸结合亲和力。例如，具有ni的rvd的多肽单体优先结合腺嘌呤(a)，具有ng的rvd的多肽单体优先结合胸腺嘧啶(t)，具有hd的rvd的多肽单体优先结合胞嘧啶(c)，具有nn的rvd的多肽单体优先结合腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)。在本发明的另一个实施方案中，具有ig的rvd的多肽单体优先结合t。因此，tale的核酸结合结构域中多肽单体重复的数目和顺0186958(美国申请号14/105,017)、us2014-0186919a1(美国申请号14/104,977)、us2014-0186843a1(美国申请号14/104,900)、us2014-0179770a1(美国申请号14/104,837)和us2014-0179006a1(美国申请号14/183,486)、us2014-0170753(美国申请号14/183,429)；us2015-0184139(美国申请号14/324,960)；14/054,414欧洲专利申请ep2771468(ep13818570.7)、ep2764103(ep13824232.6)和ep2784162(ep14170383.5)；和pct专利公开wo2014/093661(pct/us2013/074743)、wo2014/093694(pct/us2013/074790)、wo2014/093595(pct/us2013/074611)、wo2014/093718(pct/us2013/074825)、wo2014/093709(pct/us2013/074812)、wo2014/093622(pct/us2013/074667)、wo2014/093635(pct/us2013/074691)、wo2014/093655(pct/us2013/074736)、wo2014/093712(pct/us2013/074819)、wo2014/093701(pct/us2013/074800)、wo2014/018423(pct/us2013/051418)、wo2014/204723(pct/us2014/041790)、wo2014/204724(pct/us2014/041800)、wo2014/204725(pct/us2014/041803)、wo2014/204726(pct/us2014/041804)、wo2014/204727(pct/us2014/041806)、wo2014/204728(pct/us2014/041808)、wo2014/204729(pct/us2014/041809)、wo2015/089351(pct/us2014/069897)、wo2015/089354(pct/us2014/069902)、wo2015/089364(pct/us2014/069925)、wo2015/089427(pct/us2014/070068)、wo2015/089462(pct/us2014/070127)、wo2015/089419(pct/us2014/070057)、wo2015/089465(pct/us2014/070135)、wo2015/089486(pct/us2014/070175)、pct/us2015/051691、pct/us2015/051830。还参考美国临时专利申请61/758,468、61/802,174、61/806,375、61/814,263；61/819,803和61/828,130；分别于2013年1月30日；2013年3月15日；2013年3月28日；2013年4月20日；2013年5月6日和2013年5月28日提交。还参考2013年6月17日提交的美国临时专利申请61/836,123。另外参考各自于2013年6月17日提交的美国临时专利申请61/835,931、61/835,936、61/835,973、61/836,080、61/836,101和61/836,127。进一步参考2013年8月5日提交的美国临时专利申请61/862,468和61/862,355；2013年8月28日申请的61/871,301；2013年9月25日提交的61/960,777和2013年10月28日提交的61/961,980。还进一步参考：2014年10月28日提交的pct/us2014/62558和美国临时专利申请号：61/915,148、61/915,150、61/915,153、61/915,203、61/915,251、61/915,301、61/915,267、61/915,260和61/915,397分别于2013年12月12日提交；2013年1月29日和2013年2月25日提交的61/757,972和61/768,959；62/010,888和62/010,879，均于2014年6月11日提交；62/010,329、62/010,439和62/010,441分别于2014年6月10日提交；61/939,228和61/939,242分别于2014年2月12日提交；61/980,012于2014年4月15日提交；62/038,358于2014年8月17日提交；62/055,484、62/055,460和62/055,487分别于2014年9月25日提交；和2014年10月27日提交的62/069,243。参考特别指定2014年6月10日提交的美国申请号pct/us14/41806的pct申请。参考2014年1月22日提交的美国临时专利申请61/930,214。参考特别指定2014年6月10日提交的美国申请号pct/us14/41806的pct申请。还提及2015年6月17日提交的美国申请62/180,709，protectedguidernas(pgrnas)；2014年12月12日提交的美国申请62/091,455，protectedguidernas(pgrnas)；2014年12月24日提交的美国申请62/096,708，protectedguidernas(pgrnas)；美国申请62/091,462,2014年12月12日,62/096,324,2014年12月23日,62/180,681,2015年6月17日和62/237,496,2015年8月5日,deadguidesforcrisprtranscriptionfactors；美国申请62/091,456,2014年12月14日和62/180,692,2015年6月17日,escortedandfunctionalizedguidesforcrispr-cassystems；美国申请62/091,461,2014年12月14日,delivery,useandtherapeuticapplicationsofthecrispr-cassystemsandcompositionsforgenomeeditingastohematopoeticstemcells(hscs)；美国申请62/094,903,2014年12月19日,unbiasedidentificationofdouble-strandbreaksandgenomicrearrangementbygenome-wiseinsertcapturesequencing；美国申请62/096,761,2014年12月24日,engineeringofsystems,methodsandoptimizedenzymeandguidescaffoldsforsequencemanipulation；美国申请62/091,462，2014年12月12日,62/096,324，2014年12月23日，62/180,681，2015年6月17日，和62/237,496，2015年8月5日，deadguidesforcrisprtranscriptionfactors；美国申请62/091,456，2014年12月12日和62/180,692，2015年6月17日，escortedandfunctionalizedguidesforcrispr-cassystems；62/091,461，2014年12月12日，delivery,useandtherapeuticapplicationsofthecrispr-cassystemsandcompositionsforgenomeeditingastohematopoeticstemcells(hscs)；美国申请62/094,903，2014年12月19日，unbiasedidentificationofdouble-strandbreaksandgenomicrearrangementbygenome-wiseinsertcapturesequencing；美国申请62/096,761，2014年12月24日，engineeringofsystems,methodsandoptimizedenzymeandguidescaffoldsforsequencemanipulation；美国申请2/098,059,2014年12月30日,62/181,641,2015年6月18日,和62/181,667,2015年6月18日,rna-targetingsystem；美国申请62/096,656,2014年12月24日和62/181,151,2015年6月17日,crisprhavingorassociatedwithdestabilizationdomains；美国申请62/096,697,2014年12月24日,crisprhavingorassociatedwithaav；美国申请62/098,158,2014年12月30日,engineeredcrisprcomplexinsertionaltargetingsystems；美国申请62/151,052,2015年4月22日,cellulartargetingforextracellularexosomalreporting；美国申请62/054,490,2014年9月24日,delivery,useandtherapeuticapplicationsofthecrispr-cassystemsandcompositionsfortargetingdisordersanddiseasesusingparticledeliverycomponents；美国申请61/939,154,2014年2月12日,systems,methodsandcompositionsforsequencemanipulationwithoptimizedfunctionalcrispr-cassystems；美国申请62/055,484,2014年9月25日,systems,methodsandcompositionsforsequencemanipulationwithoptimizedfunctionalcrispr-cassystems；美国申请62/087,537,2014年12月4日,systems,methodsandcompositionsforsequencemanipulationwithoptimizedfunctionalcrispr-cassystems；美国申请62/054,651,2014年9月24日,delivery,useandtherapeuticapplicationsofthecrispr-cassystemsandcompositionsformodelingcompetitionofmultiplecancermutationsinvivo；美国申请62/067,886,2014年8月23日,delivery,useandtherapeuticapplicationsofthecrispr-cassystemsandcompositionsformodelingcompetitionofmultiplecancermutationsinvivo；美国申请62/054,675,2014年9月24日和62/181,002,2015年6月17日,delivery,useandtherapeuticapplicationsofthecrispr-cassystemsandcompositionsinneuronalcells/tissues；美国申请62/054,528,2014年9月24日,delivery,useandtherapeuticapplicationsofthecrispr-cassystemsandcompositionsinimmunediseasesordisorders；美国申请62/055,454,2014年9月25日,delivery,useandtherapeuticapplicationsofthecrispr-cassystemsandcompositionsfortargetingdisordersanddiseasesusingcellpenetrationpeptides(cpp)；美国申请62/055,460,2014年9月25日,multifunctional-crisprcomplexesand/oroptimizedenzymelinkedfunctional-crisprcomplexes；美国申请62/087,475,2014年12月4日和62/181,690,2015年6月18日,functionalscreeningwithoptimizedfunctionalcrispr-cassystems；美国申请62/055,487,2014年9月25日,functionalscreeningwithoptimizedfunctionalcrispr-cassystems；美国申请62/087,546,2014年12月4日and62/181,687,2015年6月18日,multifunctionalcrisprcomplexesand/oroptimizedenzymelinkedfunctional-crisprcomplexes；和美国申请62/098,285,2014年12月30日,crisprmediatedinvivomodelingandgeneticscreeningoftumorgrowthandmetastasis.提及美国申请62/181,659,2015年6月18日和62/207,318,2015年8月19日,engineeringandoptimizationofsystems,methods,enzymeandguidescaffoldsofcas9orthologsandvariantsforsequencemanipulation.提及美国申请62/181,663,2015年6月18日和62/245,264,2015年8月22日,novelcrisprenzymesandsystems,美国申请62/181,675,2015年6月18日,和2015年8月22日提交的律师代理案号46783.01.2128,novelcrisprenzymesandsystems,美国申请62/232,067,2015年9月24日,美国申请62/205,733,2015年8月16日,美国申请62/201,542,2015年8月5日,美国申请62/193,507,2015年87月16日和美国申请62/181,739,2015年6月18日,其每个发明的名称为novelcrisprenzymesandsystems和美国申请62/245,270,2015年8月22日,novelcrisprenzymesandsystems.提及美国申请61/939,256,2014年2月12日和wo2015/089473(pct/us2014/070152),2014年12月12日,其每个发明的名称为engineeringofsystems,methodsandoptimizedguidecompositionswithnewarchitecturesforsequencemanipulation.还提及pct/us2015/045504,2015年8月15日,美国申请62/180,699,2015年6月17日和美国申请62/038,358,2014年8月17日,其每个发明的名称为genomeeditingusingcas9nickases.欧洲专利申请ep3009511.进一步参考multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.cong,l.,ran,f.a.,cox,d.,lin,s.,barretto,r.,habib,n.,hsu,p.d.,wu,x.,jiang,w.,marraffini,l.a.,&zhang,f.sciencefeb15；339(6121):819-23(2013)；rna-guidededitingofbacterialgenomesusingcrispr-cassystems.jiangw.,bikardd.,coxd.,zhangf,marraffinila.natbiotechnolmar；31(3):233-9(2013)；one-stepgenerationofmicecarryingmutationsinmultiplegenesbycrispr/cas-mediatedgenomeengineering.wangh.,yangh.,shivalilacs.,dawlatymm.,chengaw.,zhangf.,jaenischr.cellmay9；153(4):910-8(2013)；opticalcontrolofmammalianendogenoustranscriptionandepigeneticstates.konermanns,brighammd,trevinoae,hsupd,heidenreichm,congl,plattrj,scottda,churchgm,zhangf.nature.2013aug22；500(7463):472-6.doi:10.1038/nature12466.epub2013aug23；doublenickingbyrna-guidedcrisprcas9forenhancedgenomeeditingspecificity.ran,fa.,hsu,pd.,lin,cy.,gootenberg,js.,konermann,s.,trevino,ae.,scott,da.,inoue,a.,matoba,s.,zhang,y.,&zhang,f.cellaug28.pii:s0092-8674(13)01015-5.(2013)；dnatargetingspecificityofrna-guidedcas9nucleases.hsu,p.,scott,d.,weinstein,j.,ran,fa.,konermann,s.,agarwala,v.,li,y.,fine,e.,wu,x.,shalem,o.,cradick,tj.,marraffini,la.,bao,g.,&zhang,f.natbiotechnoldoi:10.1038/nbt.2647(2013)；genomeengineeringusingthecrispr-cas9system.ran,fa.,hsu,pd.,wright,j.,agarwala,v.,scott,da.,zhang,f.natureprotocolsnov；8(11):2281-308.(2013)；genome-scalecrispr-cas9knockoutscreeninginhumancells.shalem,o.,sanjana,ne.,hartenian,e.,shi,x.,scott,da.,mikkelson,t.,heckl,d.,ebert,bl.,root,de.,doench,jg.,zhang,f.sciencedec12.(2013).[epubaheadofprint]；crystalstructureofcas9incomplexwithguidernaandtargetdna.nishimasu,h.,ran,fa.,hsu,pd.,konermann,s.,shehata,si.,dohmae,n.,ishitani,r.,zhang,f.,nureki,o.cellfeb27.(2014).156(5):935-49；genome-widebindingofthecrisprendonucleasecas9inmammaliancells.wux.,scottda.,krizaj.,chiuac.,hsupd.,dadondb.,chengaw.,trevinoae.,konermanns.,chens.,jaenischr.,zhangf.,sharppa.natbiotechnol.(2014)apr20.doi:10.1038/nbt.2889；crispr-cas9knockinmiceforgenomeeditingandcancermodeling,plattetal.,cell159(2):440-455(2014)doi:10.1016/j.cell.2014.09.014；developmentandapplicationsofcrispr-cas9forgenomeengineering,hsuetal,cell157,1262-1278(june5,2014)(hsu2014)；geneticscreensinhumancellsusingthecrispr/cas9system,wangetal.,science.2014january3；343(6166):80–84.doi:10.1126/science.1246981；rationaldesignofhighlyactivesgrnasforcrispr-cas9-mediatedgeneinactivation,doenchetal.,naturebiotechnology32(12):1262-7(2014)，于2014年9月3日在线发表；doi为10.1038/nbt.3026,和invivointerrogationofgenefunctioninthemammalianbrainusingcrispr-cas9,swiechetal,naturebiotechnology33,102–106(2015),于2014年10月19日在线发表；doi为10.1038/nbt.3055,cpf1isasinglerna-guidedendonucleaseofaclass2crispr-cassystem,zetscheetal.,cell163,1-13(2015)；discoveryandfunctionalcharacterizationofdiverseclass2crispr-cassystems,shmakovetal.,molcell60(3):385-397(2015)；c2c2isasingle-componentprogrammablerna-guidedrna-targetingcrispreffector,abudayyehetal,science(2016),于2014年6月2日在线发表；doi为10.1126/science.aaf5573.这些出版物、专利、专利出版物和申请，以及其中或在其申请过程中引用的所有文献(“申请引用的文献”)和在申请引用的文献中引用或引用的所有文献，连同其中或其中的任何文献中提及的并且通过引用结合在此的任何产品的任何说明书、产品规格和产品页，通过引用结合在此，并且可以在本发明的实践中使用。所有文献(例如，这些专利、专利公开和申请以及申请引用的文献)通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被具体和单独地指出通过引用并入。[0167]在某些实施例中，该crispr/cas系统或复合物是2类crispr/cas系统。在某些实施方案中，所述crispr/cas系统或复合物是ii型、v型或vi型crispr/cas系统或复合物。crispr/cas系统不需要产生针对靶特异性序列的定制蛋白，而是可以通过rna向导(grna)对单个cas蛋白编程以识别特异性核酸靶标，换言之，可以使用所述短rna向导将cas酶蛋白募集至感兴趣的特异性核酸靶位点(其可以包含rna和/或dna或由rna和/或dna组成)。[0168]一般而言，如本文所用的crispr/cas或crispr系统，前述文献共同地指参与crispr相关(“cas”)基因的表达或指导其活性的转录本和其他元件，包括编码cas基因和一种或多种tracr(反式激活crispr)序列(例如tracrrna或活性部分tracrrna)，tracr配对序列(在内源crispr系统的上下文中包括“直接重复序列”和tracrrna加工的部分直接重复序列)的序列。引导序列(在内源crispr系统的上下文中也被称为“间隔区”)，或如在此使用的术语“rna(s)”(例如，用于引导cas，如cas9的rna(s)，例如crisprrna，并且在适用时，反式激活(tracr)rna或单链向导rna(sgrna)(嵌合rna))或来自crispr位点的其他序列和转录本。通常，crispr系统的特征在于促进crispr复合物在靶序列的位点形成的元件(在内源crispr系统的上下文中也称为前间隔序列)。在形成crispr复合物的上下文中，“靶序列”是指设计成与引导序列具有互补性的序列，其中靶序列与引导序列之间的杂交促进crispr复合物的形成。靶序列可包含任何多核苷酸，如dna或rna多核苷酸。[0169]在某些实施方案中，该grna是嵌合向导rna或单链向导rna(sgrna)。在某些实施方案中，grna包含引导序列和tracr配对序列(或直接重复序列)。在某些实施方案中，grna包含引导序列，tracr配对序列(或直接重复序列)和tracr序列。在某些实施例中，如在此描述的crispr/cas系统或复合物不包含和/或不依赖于tracr序列的存在(例如，如果该cas蛋白质是cpf1)。[0170]如本文所用，术语crispr/cas位点效应物蛋白的“crrna”或“向导rna”或“单链向导rna”或“sgrna”或“一种或多种核酸组分”在适用时包括与靶核酸序列具有足够互补性以与靶核酸序列杂交并引导核酸靶向复合物与靶核酸序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法最佳比对时，互补性程度约为50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高。最佳比对可以使用用于比对序列的任何合适的算法来确定，其非限制性实例包括smith-waterman算法、needleman-wunsch算法、基于burrows-wheeler变换的算法(例如burrowswheeleraligner)、clustalw、clustalx、blat、novoalign(novocrafttechnologies；可在www.novocraft.com获得)、eland(illumina、sandiego、ca)，soap(可在soap.genomics.org.cn获得)和maq(可在maq.sourceforge.net获得)。引导序列(在核酸靶向向导rna内)引导核酸靶向复合物与靶核酸序列的序列特异性结合的能力可通过任何合适的测定来评估。[0171]可以选择引导序列并因此选择核酸靶向向导rna以靶向任何靶核酸序列。靶序列可以是dna。靶序列可以是基因组dna。靶序列可以是线粒体dna。靶序列可以是任何rna序列。在一些实施方案中，靶序列可以是选自信使rna(mrna)、前信使mrna、核糖体rna(rrna)、转移rna(trna)、微小rna(mirna)、小干扰rna(sirna)、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)、双链rna(dsrna)、非编码rna(ncrna)、长链非编码rna(lncrna)和小细胞质rna(scrna)的rna分子内的序列。在一些优选的实施方案中，靶序列可以是选自mrna、前信使mrna和rrna的rna分子内的序列。在一些优选的实施方案中，靶序列可以是选自ncrna和lncrna的rna分子内的序列。在一些更优选的实施方案中，靶序列可以是mrna分子或前信使mrna分子内的序列。[0172]在某些实施方案中，grna包含茎环，优选地单一茎环。在某些实施方案中，直接重复序列形成茎环，优选单个茎环。在某些实施方案中，向导rna的间隔区长度为15至35nt。在某些实施方案中，所述向导rna的间隔区长度为至少15个核苷酸。在某些实施方案中，间隔区长度为15至17nt，例如15、16或17nt、17至20nt，例如17、18、19或20nt、20至24nt，例如20、21、22、23或24nt、23至25nt，例如23、24或25nt、24至27nt，例如24、25、26或27nt、27至30nt，例如27、28、29或30nt、30至35nt，例如30、31、32、33、34或35nt。或35nt或更长。在具体的实施方案中，crispr/cas系统需要tracrrna。“tracrrna”序列或类似术语包括与crrna序列具有足够互补性以杂交的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当最佳比对时，tracrrna序列和crrna序列之间沿着两者中较短者的长度的互补性程度约为25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更高。在一些实施方案中，tracr序列的长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多个核苷酸。在一些实施方案中，tracr序列和grna序列包含在单个转录本内，使得两者之间的杂交产生具有二级结构的转录本，例如发夹。在本发明的一个实施方案中，转录本或转录的多核苷酸序列具有至少两个或更多个发夹。在优选的实施方案中，转录本具有两个、三个、四个或五个发夹。在本发明的另一个实施方案中，转录本具有至多5个发夹。在发夹结构中，末端“n”的序列5’的部分和环的上游可对应于tracr配对序列，而环的序列3’的部分则对应于tracr序列。在发夹结构中，末端“n”的序列5’的部分和环的上游可替代地对应于tracr序列，并且环的序列3’的部分对应于tracr配对序列。在可选的实施方案中，如本领域技术人员已知的，crispr/cas系统不需要tracrrna。[0173]在某些实施方案中，向导rna(能够将cas引导至靶位点)可以包含(1)能够与靶位点杂交的引导序列和(2)tracr配对或直接重复序列(在5’至3’方向，或可替代地在3’至5’方向，如技术人员已知的，取决于cas蛋白的类型)。在具体的实施方案中，crispr/cas蛋白的特征在于其利用包含能够与靶位点杂交的引导序列和直接重复序列的向导rna，并且不需要tracrrna。在特定实施方案中，当crispr/cas蛋白的特征在于其利用tracrrna时，引导序列、tracr配对和tracr序列可以存在于单一rna中，即sgrna(以5’至3’方向排列或可替代地以3’至5’方向排列)，或tracrrna可以是与含有引导序列和tracr配对序列的rna不同的rna。在这些实施方案中，tracr与tracr配对序列杂交并将crispr/cas复合物导向靶序列。[0174]通常，在内源核酸靶向系统的情况下，核酸靶向复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种核酸靶向效应蛋白复合的向导rna)的形成导致在靶序列中或附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)的dna或rna链之一或两者的修饰(例如切割)。如本文所用，术语“与感兴趣靶位点相关的序列”是指靠近靶序列附近的序列(例如在靶序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内，其中靶序列包含在感兴趣的靶位点内)。本领域技术人员将知道所选择的crispr/cas系统相对于靶序列的特异性切割位点，如本领域已知的，其可以在靶序列内或可替代地在靶序列的3’或5’。[0175]在一些实施方案中，未修饰的核酸靶向效应蛋白可具有核酸切割活性。在一些实施方案中，本文所述的核酸酶可以在靶序列的位置或附近，例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内或在与靶序列相关的序列处直接切割一条或两条核酸(dna、rna或杂交体，其可以是单链或双链的)链。在一些实施方案中，核酸靶向效应蛋白可指导一条或两条dna或rna链在距离靶序列的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多个碱基对内切割。在一些实施方案中，切割可以是平端(例如对于cas9，如sacas9或spcas9)。在一些实施方案中，切割可以是交错的(例如对于cpf1)，即产生粘性末端。在一些实施方案中，所述切割是具有5’突出端的交错切割。在一些实施方案中，所述切割是具有1至5个核苷酸，优选4或5个核苷酸的5’突出端的交错切割。在一些实施方案中，切割位点在pam的上游。在一些实施方案中，切割位点在pam的下游。在一些实施方案中，核酸靶向效应蛋白可以相对于相应的野生型酶突变，使得突变的核酸靶向效应蛋白缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的dna或rna链之一或两者的能力。作为进一步的实例，可以突变cas蛋白的两个或更多个催化结构域(例如ruvci、ruvcii和ruvciii或cas9蛋白的hnh结构域)以产生基本上缺乏所有dna切割活性的突变cas蛋白。在一些实施方案中，当突变的酶的切割活性不超过非突变形式的酶的核酸切割活性的25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更低时，靶向核酸的效应蛋白可被认为基本上缺乏所有dna和/或rna切割活性；一个实例可以是，与非突变形式相比，突变形式的核酸切割活性为零或可忽略不计。如本文所用，术语“修饰的”cas通常是指与衍生它的野生型cas蛋白相比具有一个或多个修饰或突变(包括点突变、截短、插入、缺失、嵌合体、融合蛋白等)的cas蛋白。“衍生的”是指衍生的酶在很大程度上基于与野生型酶具有高度序列同源性的意义，但是其已经以本领域已知的或本文所述的某种方式突变(修饰)。[0176]在某些实施方案中，靶序列应与pam(前间隔序列邻近基序)或pfs(前间隔序列侧翼序列或位点)相关联；即，由crispr复合物识别的短序列。pam的精确序列和长度要求根据所使用的crispr酶而不同，但是pam典型地是邻近前间隔序列的2至5个碱基对的序列(即，靶序列)。pam序列的实例在以下实例部分中给出，并且本领域技术人员将能够鉴定用于给定crispr酶的另外的pam序列。此外，pam相互作用(pi)结构域的工程化可以允许pam特异性的编程，改善靶位点识别保真度，并且增加cas(例如cas9)基因组工程化平台的多功能性。cas蛋白，如cas9蛋白可以被工程化以改变它们的pam特异性，例如kleinstiverbpetal.engineeredcrispr-cas9nucleaseswithalteredpamspecificities.nature.2015jul23；523(7561):481-5.doi:10.1038/nature14592中所述。在一些实施方案中，该方法包括允许crispr复合物结合至靶多核苷酸以实现所述靶多核苷酸的切割，由此修饰该靶多核苷酸，其中该crispr复合物包含与杂交至所述靶多核苷酸内的靶序列的引导序列复合的crispr酶，其中所述引导序列连接至进而杂交至tracr序列的tracr配对序列。技术人员将理解，可以类似地修饰其它cas蛋白。[0177]如本文所提及的cas蛋白，例如但不限于cas9、cpf1(cas12a)、c2c1(cas12b)、c2c2(cas13a)、c2c3、cas13b蛋白，其可以源自任何合适的来源，并且因此可以包括源自多种(原核)生物体的不同直系同源物，如本领域中充分记载的。在某些实施方案中，所述cas蛋白质是(经修饰的)cas9，优选(经修饰的)金黄色葡萄球菌cas9(sacas9)或(经修饰的)酿脓链球菌cas9(spcas9)。在某些实施方案中，所述cas蛋白质是(经修饰的)cpf1，优选氨基酸球菌属，例如氨基酸球菌属。bv3l6cpf1(ascpf1)或毛螺菌科细菌cpf1，例如毛螺菌科细菌ma2020或毛螺菌科细菌md2006(lbcpf1)。在某些实施方案中，所述cas蛋白是(经修饰的)c2c2，优选leptotrichiawadeic2c2(lwc2c2)或listerianewyorkensisfslm6-0635c2c2(lbfslc2c2)。在某些实施方案中，所述(经修饰的)cas蛋白是c2c1。在某些实施方案中，(经修饰的)cas蛋白是c2c3。在某些实施例中，该(经修饰的)cas蛋白质是cas13b。[0178]在某些实施方案中，通过随机诱变实现核酸修饰。可将细胞或生物体暴露于诱变剂如uv辐射或诱变化学品(如例如甲磺酸乙酯(ems))，然后选择具有所需特征的突变体。例如可以通过tilling(定向诱导基因组局部突变技术)鉴定突变体。该方法将诱变如使用化学诱变剂如甲磺酸乙酯(ems)的诱变与鉴定靶基因中的单碱基突变/点突变的灵敏dna筛选技术组合。tilling方法依赖于dna异源双链核酸分子的形成，所述dna异源双链核酸分子是当通过pcr扩增多个等位基因，然后加热并缓慢冷却时形成的。“气泡”在两条dna链的错配处形成，然后被单链核酸酶切割。然后通过大小分离产物，例如通过hplc。还参见mccallumetal.“targetedscreeningforinducedmutations”；natbiotechnol.2000apr；18(4):455-7和mccallumetal.“targetinginducedlocallesionsingenomes(tilling)forplantfunctionalgenomics”；plantphysiol.2000jun；123(2):439-42。[0179]rna干扰(rnai)是一种生物学过程，其中rna分子通过中和靶mrna分子来抑制基因表达或翻译。两种小核糖核酸(rna)分子-微小rna(mirna)和小干扰rna(sirna)-是rna干扰的核心。rnas是基因的直接产物，并且这些小rnas可以与其它特定的信使rna(mrna)分子结合并增加或降低它们的活性，例如通过防止mrna翻译成蛋白质。rnai途径在许多真核生物(包括动物)中发现，并且由dicer酶启动，该酶将长双链rna(dsrna)分子切割成约21个核苷酸的sirnas(小干扰rna)的短双链片段。每个sirna被展开成两个单链rnas(ssrnas)，过客链和引导链。过客链被降解，引导链被掺入到rna诱导的沉默复合物体(risc)中。成熟的mirnas在结构上类似于由外源dsrna产生的sirnas，但是在达到成熟之前，mirnas必须首先经历广泛的转录后修饰。mirna由长得多的rna编码基因表达为称为pri-mirna的初级转录本，其在细胞核中被微处理复合体加工成称为pre-mirna的70核苷酸茎环结构。该复合物由称为drosha的rnaseiii酶和dsrna结合蛋白dgcr8组成。该pre-mirna的dsrna部分被dicer结合并切割以产生可整合到risc复合体中的成熟mirna分子；因此，mirna和sirna共享相同的下游细胞机制。短发夹rna或小发夹rna(shrna/发夹载体)是具有紧密发夹转角的人工rna分子，其可用于通过rna干扰沉默靶基因表达。研究最多的结果是转录后基因沉默，其发生在当引导链与信使rna分子中的互补序列配对并诱导由risc的催化组分argonaute2(ago2)切割时。如本文所用，rnai分子可以是sirna、shrna或mirna。应当理解，rnai分子可以直接应用于植物中，或者可以由表达rnai分子的合适载体编码。rnai分子如sirnas、shrnas或mirnas的递送和表达系统是本领域熟知的。[0180]本文所用的术语“纯合子”是指在一个或多个或所有位点具有相同等位基因的单个细胞或植物。当术语用于指特定的位点或基因时，它至少是指位点或基因具有相同的等位基因。如本文所用，术语“纯合的”是指当相同的等位基因位于同源染色体上的相应位点时存在的遗传条件。本文所用的术语“杂合体”是指在一个或多个或所有位点具有不同等位基因的单个细胞或植物。当关于特定的位点或基因使用该术语时，至少意指位点或基因具有不同的等位基因。如本文所用，术语“杂合的”是指当不同等位基因位于同源染色体上的相应位点时存在的遗传条件。在某些实施方案中，本文所述的qtl和/或一个或多个标记物是纯合的。在某些实施方案中，本文所述的qtl和/或一种或多种标记物是杂合的。在某些实施方案中，本文所述的qtl等位基因和/或一个或多个标记等位基因是纯合的。在某些实施方案中，如本文所述的qtl等位基因和/或一个或多个标记等位基因是杂合的。[0181]“标记”是(找到位置的手段)遗传或物理图谱，或者标记和性状位点(影响性状的位点)之间的连接。标记检测的位置可以通过多态性等位基因的检测和它们的遗传定位，或者通过杂交，序列匹配或扩增已经物理定位的序列而获知。标记可以是dna标记(检测dna多态性)、蛋白质(检测所编码的多肽的变异)或简单遗传的表型(例如'蜡样'表型)。可以从基因组核苷酸序列或从表达的核苷酸序列(例如，从剪接的rna或cdna)开发dna标记。根据dna标记技术，标记可以由位点侧翼的互补引物和/或与位点处的多态性等位基因杂交的互补探针组成。术语标记位点是该标记检测到的位点(基因、序列或核苷酸)。“标记”或“分子标记”或“标记位点”也可用于表示足够独特以表征基因组上特定位点的核酸或氨基酸序列。任何可检测的多态性性状都可以用作标记，只要它是有差别地遗传的并且与感兴趣的表型性状表现出连锁不平衡即可。[0182]检测群体成员之间遗传多态性的标记在本领域中是公认的。标记可以通过它们检测的多态性类型以及用于检测多态性的标记技术来定义。标记类型包括但不限于例如限制性片段长度多态性(rflp)的检测、同工酶标记的检测、随机扩增多态性dna(rapd)、扩增片段长度多态性(aflps)、简单序列重复(ssrs)的检测、植物基因组的扩增可变序列的检测、自主序列复制的检测或单核苷酸多态性(snps)的检测。snps可例如通过dna测序、基于pcr的序列特异性扩增方法、通过等位基因特异性杂交(ash)、动态等位基因特异性杂交(dash)、分子信标、微阵列杂交、寡核苷酸连接酶测定、flap内切核酸酶、5’内切核酸酶、引物延伸、单链构象多态性(sscp)或温度梯度凝胶电泳(tgge)检测多核苷酸多态性来检测。dna测序，例如焦磷酸测序技术具有能够检测构成单倍型的一系列连接的snp等位基因的优点。单倍型比snp更具有信息性(检测更高水平的多态性)。[0183]“标记等位基因”，或者“标记位点的等位基因”，可以指在群体中标记位点处发现的多个多态性核苷酸序列之一。关于snp标记，等位基因是指在该单个植物中该snp位点处存在的特定核苷酸碱基。[0184]“精细定位”是指可以更精确地确定(缩小)qtl的位置并减小包含qtl的渐渗片段的大小的方法。例如，可以制备qtl的近等基因系(qtl-nils)，其在轮回亲本的其它均一遗传背景中含有不同的渐渗片段的重叠片段。这样的品系然后可用于比对定位qtl的片段并鉴定具有包含qtl的较短渐渗片段的品系。[0185]“分子标记辅助选择”(mas)是基于标记基因型选择单个植物的过程。“分子标记辅助反选择”是一种方法，通过该方法，标记基因型被用于鉴定将不被选择的植物，允许它们从育种程序或种植中除去。标记辅助选择使用与特定位点或特定染色体区域(例如渐渗性片段、转基因、多态性、突变等)遗传连接的分子标记的存在来选择存在特定位点或区域(渐渗性片段、转基因、多态性、突变等)的植物。例如，与本文定义的消化率qtl遗传连锁的分子标记可用于检测和/或选择在7号染色体上包含qtl的植物。分子标记与位点的遗传连锁越近(例如约7cm、6cm、5cm、4cm、3cm、2cm、1cm、0.5cm或更少)，标记通过减数分裂重组从位点解离的可能性就越小。同样地，两个标记彼此连接得越近(例如在7或5cm、4cm、3cm、2cm、1cm或更小的范围内)，两个标记彼此分离的可能性就越小(并且它们作为一个单元共同分离的可能性就越大)。另一标记的标记“在7cm内或在5cm、3cm、2cm或1cm内”是指基因定位于标记两侧的7cm或5cm、3cm、2cm或1cm区域内(即标记的任一侧)的标记。类似地，在另一标记的5mb、3mb、2.5mb、2mb、1mb、0.5mb、0.4mb、0.3mb、0.2mb、0.1mb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的标记是指物理上位于5mb、3mb、2.5mb、2mb、1mb、0.5mb、0.4mb、0.3mb、0.2mb、0.1mb、50kb、20kb、10kb、5kb、2kb、1kb或更小范围内的标记。标记两侧的基因组dna区域(即标记的任一侧)。“lod-评分”(几率的对数(以10为底))是指通常用于动物和植物群体的连锁分析的统计测试。如果两个位点(分子标记位点和/或表型性状位点)确实是连锁的，则lod得分将获得试验数据的可能性与仅偶然观察相同数据的可能性进行比较。阳性lod评分有利于连锁的存在，大于3.0的lod评分被认为是连锁的证据。 3的lod得分表示观察到的连接没有偶然发生的几率为1000-1。[0186]“标记单倍型”是指标记位点处等位基因的组合。[0187]“标记位点”是物种基因组中可发现特定标记的特定染色体位置。标记位点可用于追踪第二连锁位点的存在，例如影响表型性状表达的位点。例如，标记位点可用于监测遗传或物理连接的位点处等位基因的分离。[0188]“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记位点的存在的核酸序列或分子，例如与标记位点序列互补的核酸探针。包含标记位点的30个或更多个连续核苷酸(标记位点序列的“全部或部分”)的标记探针可用于核酸杂交。或者，在一些方面，标记探针是指能够区分标记位点处存在的特定等位基因(即基因型)的任何类型的探针。[0189]术语“分子标记”可用于指当鉴定连接的位点时用作参考点的遗传标记或其编码产物(例如，蛋白质)。标记可以源自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如，源自剪接的rna、cdna等)，或源自编码的多肽。该术语还指与标记序列互补或位于标记序列侧翼的核酸序列，例如用作能够扩增标记序列的探针或引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记位点的存在的核酸序列或分子，例如与标记位点序列互补的核酸探针。或者，在一些方面，标记探针是指能够区分标记位点处存在的特定等位基因(即基因型)的任何类型的探针。当核酸在溶液中例如根据watson-crick碱基配对规则特异性杂交时，它们是“互补的”。当位于插入缺失区，如本文所述的非共线区域上时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为根据定义，插入区域是没有插入的植物的多态性。因此，标记只需要指示插入缺失区是否存在。可以使用任何合适的标记检测技术来鉴定这种杂交标记，例如在本文提供的实施例中使用snp技术。[0190]“遗传标记”是群体中多态性的核酸，其等位基因可通过一种或多种分析方法检测和区分，例如rflp、aflp、同工酶、snp、ssr等。术语“分子标记”和“遗传标记”在本文中可互换使用。该术语还指与基因组序列互补的核酸序列，例如用作探针的核酸。对应于群体成员之间遗传多态性的标记可以通过本领域公知的方法检测。这些方法包括例如基于pcr的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性(rflp)的检测、同工酶标记的检测、通过等位基因特异性杂交(ash)的多核苷酸多态性的检测、植物基因组的扩增的可变序列的检测、自主序列复制的检测、简单序列重复(ssrs)的检测、单核苷酸多态性(snps)的检测或扩增片段长度多态性(aflps)的检测。用于检测表达序列标签(ests)和衍生自est序列和随机扩增多态性dna(rapd)的ssr标记的成熟方法也是已知的。[0191]“多态性”是群体中两个或多个个体之间dna的变异。多态性优选在群体中具有至少1％的频率。有用的多态性可包括单核苷酸多态性(snp)，简单序列重复(ssr)或插入/缺失多态性，本文也称为“indel”。术语“indel”是指插入或缺失，其中一行可被称为相对于第二行具有插入的核苷酸或dna片段，或第二行可被称为相对于第一行具有缺失的核苷酸或dna片段。[0192]同一染色体上位点之间(例如分子标记之间和/或表型标记之间)的“物理距离”是以碱基或碱基对(bp)，千碱基或千碱基对(kb)或兆碱基或兆碱基对(m)表示的实际物理距离。[0193]通过交叉频率或重组频率(rf)测量同一染色体上位点之间(例如分子标记之间和/或表型标记之间)的“遗传距离”，并以厘摩(cm)表示。一个cm对应于1％的重组频率。如果不能发现重组体，则rf为0，并且位点在物理上非常接近或相同。相隔越远，rf越高。[0194]基因组的“物理图谱”是显示染色体dna上可识别标志(包括基因、标记等)的线性顺序的图。然而，与遗传图谱相反、界标之间的距离是绝对的(例如，以碱基对或分离的和重叠的连续遗传片段测量)，而不是基于遗传重组(其可以在不同群体中变化)。[0195]当等位基因与其连接时，以及当等位基因的存在是在包含等位基因的植物中将不出现所需性状或性状形式的指示时，等位基因与性状“负”相关。当等位基因与其连接时，以及当等位基因的存在是期望性状或性状形式将在包含该等位基因的植物中出现的指示时，等位基因与性状“正相关”。[0196]厘摩(“cm”)是重组频率的测量单位。一个cm等于由于在单一世代中交叉而使一个位点处的标记与第二个位点处的标记分离的机会的1％。[0197]如本文所用，术语“染色体区间”表示存在于单个染色体上的植物中的基因组dna的连续线性跨度。位于单个染色体区间上的遗传元件或基因是物理连接的。染色体区间的大小没有特别限制。在一些方面，位于单个染色体区间内的遗传元件是遗传连接的，通常具有例如小于或等于20cm，或可替代地小于或等于10cm的遗传重组距离。即，单个染色体区间内的两个遗传元件以小于或等于20％或10％的频率发生重组。[0198]在本技术中，术语“紧密连锁”是指两个连锁位点之间的重组以等于或小于约10％的频率发生(即，在遗传图谱上分离不超过10cm)。换句话说，紧密连锁的位点共分离至少90％的时间。当标记位点表现出与所需性状(例如，对灰叶斑病的抗性)共分离(连锁)的显著可能性时，它们对于本公开的主题特别有用。紧密连锁的位点如标记位点和第二位点可显示10％或更低、优选约9％或更低、更优选约8％或更低，更优选约7％或更低、更优选约6％或更低、更优选约5％或更低、更优选约4％或更低、更优选约3％或更低、更优选约2％或更低的位点间重组频率。在高度优选的实施方案中，相关位点显示约1％或更低，例如约0.75％或更低、更优选约0.5％或更低或还更优选约0.25％或更低的重组频率。定位于同一染色体的两个位点，并且在两个位点之间以小于10％(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更少)的频率发生重组的距离上，也被称为彼此“邻近”。在一些情况下，两种不同的标记可以具有相同的遗传图谱坐标。在这种情况下，这两个标记彼此非常接近，使得它们之间发生重组的频率很低，以致无法检测到。[0199]“连锁”是指如果等位基因的传播是独立的、更经常地分离在一起的倾向。通常，连锁是指同一染色体上的等位基因。基因重组在整个基因组中以假定的随机频率发生。通过测量性状或标记对之间的重组频率构建遗传图谱。染色体上的性状或标记彼此越接近，重组频率越低，并且连锁程度越大。如果性状或标记通常是共分离的，则认为它们在本文中是连锁的。每代重组的1/100概率被定义为1.0厘摩(1.0cm)的遗传图谱距离。术语“连锁不平衡”是指遗传位点或性状(或两者)的非随机分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关位点沿着染色体的长度在足够的物理接近度内，使得它们以大于随机(即非随机)的频率分离在一起。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连接位点共分离超过50％的时间，例如约51％至约100％的时间。换句话说，共分离的两个标记具有小于50％的重组频率(并且根据定义，在相同的连锁群上分离小于50cm)。如本文所用，连锁可以在两个标记之间，或者在标记和影响表型的位点之间。标记位点可以与性状“相关”(连接)。测量标记位点与影响表型性状的位点的连锁程度，例如作为该分子标记与表型共分离的统计概率(例如f统计或lod得分)。[0200]位于单个染色体片段上的遗传元件或基因是物理连接的。在一些实施方案中，两个位点的位置非常接近，使得同源染色体对之间的重组在具有高频率的减数分裂期间在两个位点之间不发生，例如使得连接的位点在至少约90％的时间共分离，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.75％或更多的时间。位于染色体片段内的遗传元件也是“遗传连接的”，通常在小于或等于50cm，例如约49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5、0.25cm或更小的遗传重组距离内。即，单个染色体片段内的两个遗传元件在减数分裂期间以小于或等于约50％，例如约49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更低的频率彼此发生重组。“紧密连锁的”标记显示与给定标记的交叉频率为约10％或更少，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％或更少(给定标记位点在紧密连锁的标记位点的约10cm内，例如紧密连锁的标记位点的9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5、0.25cm或更少)。换句话说，紧密连锁的标记位点共分离至少约90％的时间，例如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.75％或更多的时间。[0201]如本文所用，术语“序列同一性”是指任何给定核酸序列与靶核酸序列之间的同一性程度。通过确定比对核酸序列中匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比对核苷酸的总数，并乘以100，计算序列同一性百分比。匹配的位置是指其中相同的核苷酸出现在比对的核酸序列中的相同位置的位置。也可测定任何氨基酸序列的序列同一性百分比。为了确定序列同一性百分比，使用来自包含blastn和blastp的blastz的独立版本的blast2序列(bl2seq)程序将靶核酸或氨基酸序列与鉴定的核酸或氨基酸序列进行比较。blastz的这种独立版本可以从fish&richardson的网站(worldwidewebatfr.com/blast)或美国政府的国家生物技术信息中心网站(worldwidewebatncbi.nlm.nih.gov)获得。解释如何使用bl2seq程序的说明可以在附带blastz的自述文件中找到。bi2seq使用blastn或blastp算法在两个序列之间进行比较。[0202]blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。为了比较两种核酸序列，如下设定选项：-将i设置为含有待比较的第一核酸序列的文件(如，c:\seql.txt)；-将j设置为含有待比较的第二核酸序列的文件(如，c:\seq2.txt)；-将p设置为blastn；-o被设置为任何期望的文件名(例如，c:\output.txt)；-q设置为－1；-将r设置为2；所有其他选项保留在其默认设置下。以下命令将生成包含两个序列之间比较的输出文件：c:\b12seq-ic:\seql.txt-jc:\seq2.txt-pblastn-oc:\output.txt-q-1-r2。如果靶序列与鉴定的序列的任何部分具有同源性，则指定的输出文件将那些同源性区域作为比对序列呈现。如果靶序列不与鉴定的序列的任何部分共享同源性，则指定的输出文件将不呈现比对的序列。一旦比对，通过计数与来自鉴定序列的序列比对呈现的靶序列的连续核苷酸的数目来确定长度，所述鉴定序列以任何匹配的位置开始并以任何其它匹配的位置结束。匹配位置是在靶序列和鉴定序列中都存在相同核苷酸的任何位置。靶序列中存在的缺口不计数，因为缺口不是核苷酸。同样地，由于靶序列核苷酸被计数，而不是来自鉴定序列的核苷酸被计数，在鉴定序列中存在的缺口不被计数。通过计算该长度上匹配位置的数目并将该数目除以该长度，然后将所得值乘以100来确定特定长度上的同一性百分比。例如，如果(i)将500个碱基的核酸靶序列与主题核酸序列进行比较，(ii)bl2seq程序呈现与主题序列的区域比对的靶序列的200个碱基，其中该200个碱基区域的第一个和最后一个碱基是匹配的，和(iii)在那些200个比对的碱基上匹配的数目是180，则500个碱基的核酸靶序列包含200的长度和在该长度上90％的序列同一性(即，180/200×100＝90)。应当理解，与鉴定的序列比对的单个核酸靶序列内的不同区域可以各自具有它们自己的百分比同一性。注意，百分比同一性值四舍五入到最接近的十分之一。例如，78.11、78.12、78.13和78.14四舍五入至78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19四舍五入至78.2。还要注意，长度值将总是整数。[0203]“分离的核酸序列”或“分离的dna”指不再处于其分离的天然环境中的核酸序列，例如细菌宿主细胞或植物核或质体基因组中的核酸序列。当在本文中提及“序列”时，应理解为指具有这种序列的分子，例如核酸分子。“宿主细胞”或“重组宿主细胞”或“转化的细胞”是指由于至少一种核酸分子被引入所述细胞而产生的新的单个细胞(或生物体)。宿主细胞优选是植物细胞或细菌细胞。宿主细胞可以含有作为染色体外(附加体)复制分子的核酸，或包含整合在宿主细胞的核或质体基因组中的核酸，或作为引入的染色体，例如微型染色体。[0204]当提及与参考序列具有“基本序列同一性”或与参考序列具有至少》80％，例如至少》85％、90％、95％、98％或》99％核酸序列同一性的序列同一性的核酸序列(例如dna或基因组dna)时，在一个实施方案中，所述核苷酸序列被认为与给定的核苷酸序列基本上相同并且可以使用严格杂交条件鉴定。在另一个实施方案中，核酸序列与给定的核苷酸序列相比包含一个或多个突变，但仍可使用严格杂交条件鉴定。“严格杂交条件”可用于鉴定与给定核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下是不同的。通常，严格条件被选择为比特定序列在限定的离子强度和ph下的热熔点(tm)低约5℃。tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和ph下)。通常将选择严格条件，其中盐浓度在ph7下为约0.02摩尔，并且温度为至少60℃。降低盐浓度和/或提高温度可提高严格性。用于rna-dna杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的northern印迹)是例如包括在0.2xssc中在63℃下至少一次洗涤20min的那些，或等效条件。dna-dna杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的southern印迹)是例如包括在0.2xssc中在至少50℃，通常约55℃的温度下至少一次洗涤(通常2次)20分钟的那些，或等同条件。还参见sambrook等人(1989)，以及sambrook和russell(2001)。[0205]在一个方面，本发明涉及用于鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和/或b的染色体区间上。其中分子标记a和b是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的c和对应于位置126109267的a或分别是对应于位置125861690的t和对应于位置126109267的g，任选地其中分子标记a和/或b位于所述qtl等位基因的两侧；或筛选分子标记a和/或b的存在。[0206]在一个方面，本发明涉及用于鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和/或b的染色体区间上，其中分子标记a和b是snps，所述snps分别是相对于b73参考基因组agpv2的对应于位置125861690的c和对应于位置126109267的a。任选地其中分子标记a和/或b位于所述qtl等位基因的两侧；或筛选分子标记a和/或b的存在。[0207]在一个方面，本发明涉及用于鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和/或b的染色体区间上，其中分子标记a和b是snps，其分别是相对于b73参考基因组agpv2的对应于位置125861690的t和对应于位置126109267的g，任选地其中分子标记a和/或b位于所述qtl等位基因的两侧；或筛选分子标记a和/或b的存在。[0208]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a的染色体区间上，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a；或筛选分子标记a的存在。[0209]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记b的染色体区间上，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记b；或筛选分子标记b的存在。[0210]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和b的染色体区间上，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a和b；或筛选分子标记a和b的存在。[0211]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a的染色体区间上，其中分子标记a是参考b73参考基因组agpv2的snp，所述snp是对应于位置125861690的c或对应于位置125861690的t，任选地其中所述qtl等位基因两侧为分子标记a；或筛选分子标记a的存在。[0212]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记b的染色体区间上，其中分子标记b是相对于b73参考基因组agpv2的snp，所述snp是对应于位置126109267的a或对应于位置126109267的g。任选地其中所述qtl等位基因两侧为分子标记b；或筛选分子标记b的存在。[0213]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和b的染色体区间上。其中分子标记a和b是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的c和对应于位置126109267的a或分别是对应于位置125861690的t和对应于位置126109267的g，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a和b；或筛选分子标记a和b的存在。[0214]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，该方法包括筛选位于7号染色体上(如在来自该植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a的染色体区间上，其中分子标记a是参考b73参考基因组agpv2的snp，所述snp是对应于位置125861690的c，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a；或筛选分子标记a的存在。[0215]在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记b的染色体区间上，其中分子标记b是参考b73参考基因组agpv2的snp，所述snp是对应于位置126109267的a，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记b；或筛选分子标记b的存在。[0216]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和b的染色体区间上，其中分子标记a和b是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的c和对应于位置126109267的a。任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a和b；或筛选分子标记a和b的存在。[0217]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自该植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a的染色体区间上，其中分子标记a是参考b73参考基因组agpv2的snp，所述snp是对应于位置125861690的t，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a；或筛选分子标记a的存在。[0218]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记b的染色体区间上，其中分子标记b是参考b73参考基因组agpv2的snp，所述snp是对应于位置126109267的g，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记b；或筛选分子标记b的存在。[0219]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和b的染色体区间上，其中分子标记a和b是参考b73参考基因组agpv2snps的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的t和对应于位置126109267的g，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a和b；或筛选分子标记a和b的存在。[0220]在一个方面，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和/或f的染色体区间上。其中分子标记a和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snp分别是对应于位置125861690的c和对应于位置130881551的c或分别是对应于位置125861690的t和对应于位置130881551的t，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a和/或f；或筛选分子标记a和/或f的存在。[0221]在一个方面，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和/或f的染色体区间上，其中分子标记a和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是相对于对应于位置125861690的c和对应于位置130881551的c，任选地其中所述qtl等位基因侧接分子标记a和/或f；或筛选分子标记a和/或f的存在。[0222]在一个方面，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，该方法包括筛选位于7号染色体上(来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和/或f的染色体区间上，其中分子标记a和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的t和对应于位置130881551的t，任选地其中所述qtl等位基因两侧为分子标记a和/或f；或筛选分子标记a和/或f的存在。[0223]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记f的染色体区间上，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记f；或筛选分子标记f的存在。[0224]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和f的染色体区间上，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a和f；或筛选分子标记a和f的存在。[0225]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，该方法包括筛选位于7号染色体上(如在来自该植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记f的染色体区间上，其中分子标记f是参考b73参考基因组agpv2的snp，所述snp是对应于位置130881551的c或对应于位置130881551的t，任选地其中所述qtl等位基因两侧为分子标记f；或筛选分子标记f的存在。[0226]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和f的染色体区间上。其中分子标记a和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的c和对应于位置130881551的c或分别是对应于位置125861690的t和对应于位置130881551的t，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a和f；或筛选分子标记a和f的存在。[0227]在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记b的染色体区间上，其中分子标记b是参考b73参考基因组agpv2的对应于位置126109267的snp，所述snp是a，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记b；或筛选分子标记b的存在。[0228]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和f的染色体区间上，其中分子标记a和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的c和对应于位置130881551的c，任选地其中所述qtl等位基因两侧为分子标记a和f；或筛选分子标记a和f的存在。[0229]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，该方法包括筛选位于7号染色体上(例如在来自该植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记f的染色体区间上，其中分子标记f是参考b73参考基因组agpv2的snp，所述snp是对应于位置130881551的t，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记f；或筛选分子标记f的存在。[0230]在一个实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a和b的染色体区间上，其中分子标记a和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的t和对应于位置130881551的t，任选地其中所述qtl等位基因的两侧为分子标记a和f；或筛选分子标记a和f的存在。[0231]在一个方面，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记c、d和/或e的染色体区间上，其中分子标记c、d和e是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125976029的a、对应于位置127586792的a和对应于位置129887276的c，或其分别为对应于位置125976029的g、对应于位置127586792的g、对应于位置129887276的t；或筛选分子标记c、d和/或e的存在。[0232]在一个方面，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记c、d和/或e的染色体区间上，其中分子标记c、d和e是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125976029的a、对应于位置127586792的a和对应于位置129887276的c；或筛选分子标记c、d和/或e的存在。[0233]在一个方面，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记c、d和/或e的染色体区间上，其中分子标记c、d和e是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125976029的g、对应于位置127586792的g、对应于位置129887276的t；或筛选分子标记c、d和/或e的存在。[0234]在某些实施方案中，qtl等位基因包含分子标记a、b、c、d、e和/或f，优选全部。[0235]在某些实施方案中，qtl等位基因包含分子标记a。在某些实施方案中，qtl等位基因包含分子标记b。在某些实施方案中，qtl等位基因包含分子标记c。在某些实施方案中，qtl等位基因包含分子标记d。在某些实施方案中，qtl等位基因包含分子标记e。在某些实施方案中，qtl等位基因包含分子标记f。[0236]在某些实施方案中，分子标记等位基因a、b、c、d、e和f，如表a中所提供。[0237]表a[0238]标记idchragpv04agpv02a_识别b_识别seqidno:a7129798239125861690cytthy50b7129919413125976029adegua52c7130053680126109267adegua51d7131558094127586792adegua53e7133928553129887276cytthy54f7134903902130881551cytthy55[0239]在某些实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a、b、c、d、e和/或f，优选全部的染色体区间上；或筛选分子标记a、b、c，d、e和/或f的存在。[0240]在某些实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a、b、c、d、e和/或f，优选全部的染色体区间上；或筛选分子标记a、b、c、d、e和/或f的存在；其中分子标记a、b、c、d、e和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的c、对应于位置126109267的a、对应于位置125976029的a、对应于位置127586792的a、对应于位置129887276的c和对应于位置130881551的c，或其分别是对应于位置125861690的t、对应于位置126109267的g、对应于位置125976029的g、对应于位置127586792的g、对应于位置129887276的t和对应于位置130881551的t。[0241]在某些实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a、b、c、d、e和/或f，优选全部的染色体区间上；或筛选分子标记a、b、c、d、e和/或f的存在；其中分子标记a、b、c、d、e和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别是对应于位置125861690的c、对应于位置126109267的a、对应于位置125976029的a、对应于位置127586792的a、对应于位置129887276的c和对应于位置130881551的c。[0242]在某些实施方案中，本发明涉及鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括筛选位于7号染色体上(例如在来自植物或植物部分的分离的遗传物质中)的qtl等位基因的存在，其中所述qtl等位基因位于包含分子标记a、b、c、d、e和/或f，优选全部的染色体区间上；或筛选分子标记a、b、c、d、e和/或f的存在；其中分子标记a、b、c、d、e和f是参考b73参考基因组agpv2的snps，所述snps分别对应于位置125861690的t、对应于位置126109267的g、对应于位置125976029的g、对应于位置127586792的g、对应于位置129887276的t和对应于位置130881551的t。[0243]在某些实施方案中，如本文所述的根据本发明的方法是用于鉴定具有增加的耐旱性或抗旱性的植物(或植物部分)的方法。[0244]在某些实施方案中，如本文所述的根据本发明的方法是用于鉴定具有降低的耐旱性或抗旱性的植物(或植物部分)的方法。[0245]在某些实施方案中，如本文所述的根据本发明的方法是用于鉴定具有增加的碳同位素组成(δ13c)的植物(或植物部分)的方法。[0246]在某些实施方案中，如本文所述的根据本发明的方法是用于鉴定具有降低的碳同位素组成(δ13c)的植物(或植物部分)的方法。[0247]应理解，无论何时本文提及特定分子标记(等位基因)，例如鉴定特定分子标记(等位基因)、分子标记(等位基因)同样可基于本文提供的序列(例如表a中提供的序列)以及基于互补序列(即互补dna链中的相应核苷酸)来鉴定。[0248]在某些实施方案中，本文所述的方法包括从植物或植物部分，例如从植物或植物部分的至少一个细胞分离遗传物质的步骤。[0249]在某些实施方案中，本文所述的方法包括选择其中存在qtl等位基因或分子标记(等位基因)的植物或植物部分的步骤。[0250]在某些实施方案中，本文所述的方法包括从植物或植物部分，例如从植物或植物部分的至少一个细胞分离遗传物质并选择其中存在qtl等位基因或分子标记(等位基因)的植物或植物部分的步骤。[0251]在一个方面，本发明涉及用于鉴定玉米植物或植物部分的方法，其包括(例如在来自植物或植物部分的分离的材料中)分析包含在如本文定义的根据本发明的qtl中的基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性和/或序列。在某些实施方案中，所述方法包括从植物或植物部分的至少一种细胞中分离遗传物质。[0252]在某些实施方案中，将表达水平、活性和/或序列与参考植物(部分)的表达水平、活性和/或序列进行比较。[0253]在某些实施方案中，将表达水平和/或活性与预定的阈值表达水平和/或活性进行比较。在某些实施方案中，阈值指示耐旱性/抗旱性和/或δ13c(例如，高于或低于阈值，归因于增加或降低的耐旱性/抗旱性)。[0254]在某些实施方案中，在不同条件(例如对照条件和干旱条件)之间比较表达水平和/或活性。[0255]在一个方面，本发明涉及用于产生或修饰玉米植物的方法，其包括改变包含在如本文所述的根据本发明的qtl中的一种或多种基因的表达水平和/或活性。改变基因的表达和/或活性的方法在本文别处描述(例如sirna、敲除、基因组编辑、转录或翻译控制、诱变、过表达等)，并且是本领域已知的。本领域技术人员将理解，表达水平和/或活性可以组成性地或条件性地修饰和/或可以选择性地(例如组织特异性地)或在整个植物中修饰。[0256]在某些实施方案中，基因的表达和/或活性降低，例如至少10％，优选至少20％，更优选至少50％。[0257]在某些实施方案中，基因的表达水平和/或活性增加，例如至少10％，优选至少20％，更优选至少50％。[0258]在某些实施方案中，所述基因是突变的。在某些实施方案中，突变改变野生型或天然蛋白和/或mrna的表达。在某些实施方案中，突变减少或消除(野生型或天然)蛋白和/或mrna的表达，如本文别处所述。突变可影响转录和/或翻译。突变可以发生在外显子或内含子中。突变可以发生在调控元件中，例如启动子、增强子、终止子、绝缘子等。突变可以发生在编码序列中。突变可发生在剪接信号位点，如剪接供体或剪接受体位点。突变可以是移码突变。突变可以是无义突变。突变可以是一个或多个核苷酸的插入或缺失。突变可以是非保守突变(其中一个或多个野生型氨基酸被一个或多个非野生型氨基酸替代)。突变可以影响或改变蛋白质的功能，例如酶活性。突变可以降低或(基本上)消除蛋白质的功能，例如酶活性。降低的功能，例如降低的酶活性，可以指降低约至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，例如至少20％、40％、60％、80％或更多，例如至少85％、至少90％、至少95％或更多。(基本上)消除的功能，例如(基本上)消除的酶活性，可以指至少80％，优选至少90％，更优选至少95％的降低。突变可以是显性失活突变。[0259]在某些实施方案中，突变是在编码序列中插入一个或多个核苷酸。在某些实施方案中，突变是无义突变。在某些实施方案中，突变导致基因的表达改变。在某些实施方案中，突变导致基因敲除或mrna和/或蛋白质敲除。在某些实施方案中，突变导致编码序列的移码。在某些实施方案中，突变导致基因编码的蛋白质序列改变。[0260]可以通过突变基因本身(包括编码、非编码和调节元件)降低或消除mrna和/或蛋白质表达。本文别处描述了引入突变的方法。或者，mrna和/或蛋白质表达可通过(特异性地)干扰转录和/或翻译来降低或消除，例如降低或消除mrna和/或蛋白质的转录或翻译。或者，mrna和/或蛋白质表达可通过(特异性地)干扰mrna和/或蛋白质稳定性来降低或消除，例如降低mrna和/或蛋白质稳定性。例如，可以通过rnai降低mrna(稳定性)，如本文别处所述。也可以使用mirna影响mrna(稳定性)。在某些实施方案中，通过降低mrna或蛋白质稳定性实现的降低的表达也包括在术语“突变的”中。在某些实施方案中，术语“突变的”不包括通过降低mrna或蛋白质稳定性实现的降低的表达。[0261]在某些实施方案中，基因的表达水平和/或活性通过过表达增加，例如转基因过表达或由转录和/或翻译控制引起的过表达，如本领域已知的。过表达可由拷贝数增加引起。[0262]在一个方面，本发明涉及用于产生或修饰玉米植物的方法，其包括向所述植物(的基因组)中引入如本文所述的根据本发明的qtl。引入qtl的方法在本文别处描述(例如转基因、渐渗等)，并且是本领域已知的。本领域技术人员将理解，qtl可以被引入到种系中，或者可以被引入到组织特异性。[0263]本发明涉及如此修饰或产生的玉米植物或植物部分。在某些实施方案中，植物不是植物品种。[0264]在一个方面，本发明涉及包含如本文所述的根据本发明的qtl或根据本发明的一种或多种分子标记等位基因(例如分子标记等位基因a和/或b，或a和/或f，a、b、c、d、e和/或f，优选全部)的玉米植物或植物部分。[0265]在某些实施方案中，包含在如本文所述的根据本发明的qtl中的基因选自abh4、csle1、web1、grmzm2g397260和hsftf21。[0266]在某些实施方案中，abh4选自[0267](i)包含seqidno：9或18的序列的核苷酸序列；[0268](ii)具有seqidno：11、14、17或20的cdna的核苷酸序列；[0269](iii)编码具有seqidno：12、15或21的氨基酸序列的核苷酸序列；[0270](iv)与seqidno：9、11、14、17、18或20的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的核苷酸序列；[0271](v)编码与seqidno：12、15或21的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的多肽的核苷酸序列；[0272](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0273](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质。[0274]在某些实施方案中，csle1选自[0275](i)包含seqidno：1或4的序列的核苷酸序列；[0276](ii)具有seqidno：2或5的cdna的核苷酸序列；[0277](iii)编码具有seqidno：3或6的氨基酸序列的核苷酸序列；[0278](iv)与seqidno：1、2、4或5的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的核苷酸序列；[0279](v)编码与seqidno：3或6的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的多肽的核苷酸序列；[0280](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0281](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质。[0282]在某些实施方案中，web1选自[0283](i)包含seqidno：24或27的序列的核苷酸序列；[0284](ii)具有seqidno：25或28的cdna的核苷酸序列；[0285](iii)编码具有seqidno：26或29的氨基酸序列的核苷酸序列；[0286](iv)与seqidno：24、25、27或28的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的核苷酸序列；[0287](v)编码与seqidno：26或29的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的多肽的核苷酸序列；[0288](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0289](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质。[0290]在某些实施方案中，grmzm2g397260选自[0291](i)包含seqidno：32的序列的核苷酸序列；[0292](ii)具有seqidno：33的cdna的核苷酸序列；[0293](iii)编码具有seqidno：34的氨基酸序列的核苷酸序列；[0294](iv)与seqidno：32或33的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的核苷酸序列；[0295](v)编码与seqidno：34的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的多肽的核苷酸序列；[0296](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0297](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质。[0298]在某些实施方案中，hsftf21选自[0299](i)包含seqidno：36或39的序列的核苷酸序列；[0300](ii)具有seqidno：37或40的cdna的核苷酸序列；[0301](iii)编码具有seqidno：38或41的氨基酸序列的核苷酸序列；[0302](iv)与seqidno：36、37、39或40的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的核苷酸序列；[0303](v)编码与seqidno：38或41的序列具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，如至少98％同一性的多肽的核苷酸序列；[0304](vi)在严格杂交条件下与(i)、(ii)或(iii)中定义的核苷酸序列的反向互补序列杂交的核苷酸序列；以及[0305](vii)核苷酸序列，其编码通过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸而衍生自由(i)至(vi)的核苷酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质。[0306]在某些实施方案中，如果包含在如本文所述的本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性降低或表达(基本上)不存在或消除，则植物或植物部分具有增加的耐旱性或抗旱性。在某些实施方案中，如果与参照表达水平相比，包含在如本文所述的根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性降低或表达(基本上)不存在或消除，则植物或植物部分具有增加的耐旱性或抗旱性。在某些实施方案中，如果与参考植物或植物部分中的参照表达水平相比，如本文所述的包含在根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性降低或表达(基本上)不存在或消除，则所述植物或植物部分具有增加的耐旱性或抗旱性。[0307]在某些实施方案中，如果包含在如本文所述的根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性增加，则植物或植物部分具有增加的耐旱性或抗旱性。在某些实施方案中，如果包含在如本文所述的根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性与参考表达水平相比增加，则植物或植物部分具有增加的耐旱性或抗旱性。在某些实施方案中，如果与参考植物或植物部分中的参照表达水平相比，本文所述的本发明qtl中包含的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性增加，则所述植物或植物部分具有增加的耐旱性或抗旱性。[0308]在某些实施方案中，如果包含在如本文所述的根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性降低或表达(基本上)不存在或消除，则植物或植物部分具有增加的碳同位素组成(δ13c)。在某些实施方案中，如果与参考表达水平相比，如本文所述的包含在根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性降低或表达(基本上)不存在或消除，则植物或植物部分具有增加的碳同位素组成(δ13c)。在某些实施方案中，如果与参考植物或植物部分中的参照表达水平相比，如本文所述的包含在根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性降低或表达(基本上)不存在或消除，则所述植物或植物部分具有增加的碳同位素组成(δ13c)。[0309]在某些实施方案中，如果包含在如本文所述的根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性增加，则植物或植物部分具有增加的碳同位素组成(δ13c)。在某些实施方案中，如果包含在如本文所述的根据本发明的qtl中的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性与参考表达水平相比增加，则植物或植物部分具有增加的碳同位素组成(δ13c)。在某些实施方案中，如果与参考植物或植物部分中的参照表达水平相比，本文所述的本发明的qtl中包含的一种或多种基因的(蛋白质和/或mrna)表达水平或活性增加，则所述植物或植物部分具有增加的碳同位素组成(δ13c)。[0310]在某些实施方案中，abh4的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性增加。在某些实施方案中，abh4的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性降低。[0311]在某些实施例中，csle1的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性增加。在某些实施方案中，csle1的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性降低。[0312]在某些实施例中，web1的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性增加。在某些实施方案中，web1的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性降低。[0313]在某些实施方案中，grmzm2g397260的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性增加。在某些实施方案中，grmzm2g397260的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性降低。[0314]在某些实施方案中，hsftf21的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性增加。在某些实施方案中，hsftf21的(蛋白质和/或mrna)表达水平和/或(蛋白质)活性降低。[0315]筛选本文所述的qtl等位基因或(分子)标记等位基因的存在的方法是本领域已知的。在没有限制的情况下，筛选可以包括或包含测序，基于杂交的方法(例如(动态)等位基因特异性杂交、分子信标、snp微阵列)，基于酶的方法(例如pcr、kasp(竞争性等位基因特异性pcr)、rflp、alfp、rapd、flap内切核酸酶、引物延伸，5’‑核酸酶、寡核苷酸连接测定分析法)、基于dna扩增方法(例如单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、整个扩增子的高分辨率熔解、dna错配结合蛋白的使用、snplex、surveyor核酸酶分析)等。[0316]在某些实施方案中，qtl等位基因、标记等位基因和/或突变基因或其表达或活性如本文所述在第一种植物中改变的基因以纯合状态存在。在某些实施方案中，qtl等位基因、标记等位基因和/或突变基因或其表达或活性在第一植物中改变的基因以杂合状态存在。在某些实施方案中，qtl等位基因、标记等位基因和/或突变基因或其表达或活性如本文所述在第二种植物中改变的基因以杂合状态存在。在某些实施方案中，在第二植物中不存在qtl等位基因、标记等位基因和/或突变基因或其表达或活性如本文所述改变的基因。[0317]在某些实施方案中，选择其中qtl等位基因、标记等位基因和/或突变基因或其表达或活性如本文所述改变的基因以纯合状态存在的后代。在某些实施方案中，选择其中qtl等位基因、标记等位基因和/或突变基因或其表达或活性如本文所述改变的基因以杂合状态存在的后代。[0318]在某些实施方案中，用于获得如在此根据本发明描述的植物或植物部分的方法，如用于获得具有修饰的耐旱性或抗旱性或修饰的δ13c，如增加的或减少的耐旱性或抗旱性或增加的或减少的δ13c的植物或植物部分的方法，涉及或包括转基因和/或基因编辑，如包括crispr/cas、talen、zfn、巨核酶；(诱导)诱变，其可以是或不是随机诱变，例如tilling。在某些实施方案中，用于获得如本文所述的根据本发明的植物或植物部分的方法，如用于获得具有经修饰的耐旱性或抗旱性或经修饰的δ13c，如增加的或降低的耐旱性或抗旱性或增加的或降低的δ13c的植物或植物部分的方法，涉及或包括rnai应用，其可以是或可以不是，包括或涉及转基因应用。例如，非转基因应用可包括将rnai组分如双链sirnas施用于植物或植物表面，例如作为喷雾。不需要稳定整合到植物基因组中。[0319]在某些实施方案中，用于获得如本文所述的根据本发明的植物或植物部分的方法，如用于获得具有经修饰的耐旱性或抗旱性或经修饰的δ13c，如增加的或降低的耐旱性或抗旱性或增加的或降低的δ13c的植物或植物部分的方法，不涉及或包括转基因、基因编辑和/或诱变。[0320]在某些实施方案中，用于获得如本文所述的根据本发明的植物或植物部分的方法，如用于获得具有修饰的耐旱性或抗旱性或改变的δ13c，如增加的或降低的耐旱性或抗旱性或增加的或降低的δ13c的植物或植物部分的方法，涉及品种选育，包括品种选育或由品种选育组成。[0321]在某些实施方案中，用于获得如本文所述的根据本发明的植物或植物部分的方法，如用于获得具有修饰的耐旱性或抗旱性或改变的δ13c，如增加的或降低的耐旱性或抗旱性或增加的或降低的δ13c的植物或植物部分的方法不涉及，包含或由品种选育组成。[0322]在一个方面，本发明涉及通过如本文所述的本发明的方法获得或可获得的植物或植物部分，如用于获得具有修饰的耐旱性或抗旱性或改变的δ13c，如增加的或降低的耐旱性或抗旱性或增加的或降低的δ13c的植物或植物部分的方法。[0323]在一个方面，本发明涉及一种或多种本文所述的(分子)标记在用于鉴定植物或植物部分中的用途，所述植物或植物部分例如具有修饰的耐旱性或耐受性或修饰的δ13c，例如增加或降低的耐旱性或抗旱性或增加或降低的δ13c的植物或植物部分。在一个方面，本发明涉及一种或多种本文所述的(分子)标记在用于鉴定植物或植物部分中的用途，所述(分子)标记能够检测至少一种诊断标记等位基因，所述植物或植物部分例如具有修饰的耐旱性或抗旱性或修饰的δ13c，例如增加或降低的耐旱性或抗旱性或增加或降低的δ13c的植物或植物部分。在一个方面，本发明涉及用于鉴定植物或植物部分的一种或多种本文所述的(分子)标记等位基因的检测，如具有修饰的耐旱性或抗旱性或修饰的δ13c，如增加的或降低的耐旱性或抗旱性或增加的或降低的δ13c的植物或植物部分。[0324]本文所述的本发明的标记等位基因可以是可用于鉴定植物或植物部分的诊断标记等位基因，所述植物或植物部分例如具有修饰的耐旱性或抗旱性或修饰的δ13c，例如增加或降低的耐旱性或抗旱性或增加或降低的δ13c的植物或植物部分。[0325]在一个方面，本发明涉及(分离的)多核酸，或互补物或反向互补物，其包含本发明的(分子)标记等位基因和/或侧翼为本发明的(分子)标记等位基因。在某些实施方案中，本发明涉及包含本发明的(分子)标记等位基因或本发明的(分子)标记等位基因的互补物或反向互补物的至少10个连续核苷酸，优选至少15个连续核苷酸或至少20个连续核苷酸的多核酸。在某些实施方案中，多核酸能够区分本发明的(分子)标记等位基因和非分子标记等位基因，例如与本发明的(分子)标记等位基因特异性杂交。应理解，独特的片段或片段优选是指包含本发明的snp或相应标记等位基因的片段或片段，或包含本发明的标记等位基因的插入片段的5’或3’接点的片段或片段，或包含在本发明的标记等位基因的插入片段内的片段或部分，或包含本发明的标记等位基因的缺损交接点的片段或片段。[0326]在一个方面，本发明涉及能够与本发明的(分子)标记等位基因或其互补物或其反向互补物特异性杂交的多核酸。[0327]在某些实施方案中，多核酸是引物。在某些实施方案中，多核酸是探针。[0328]在某些实施方案中，多核酸是等位基因特异性多核酸，如等位基因特异性引物或探针。[0329]在某些实施方案中，多核酸包含至少15个核苷酸，如16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，如至少30、35、40、45或50个核苷酸，如至少100、200、300或500个核苷酸。[0330]应理解，“特异性杂交”是指多核酸与(分子)标记等位基因杂交(例如在严格杂交条件下，如本文别处所定义)，但不(基本上)与不包含标记等位基因的多核酸杂交或(基本上)不能用作pcr引物。例如，在合适的读段中，与标记等位基因的杂交信号或标记等位基因的pcr扩增比与非标记等位基因或任何其它序列的杂交信号强至少5倍，优选强至少10倍或更多。[0331]一方面，本发明涉及包含这样的多核酸的试剂盒，例如引物(包含正向和/或反向引物)和/或探针。试剂盒可以进一步包括使用说明书。[0332]应当理解，在涉及一组正向和反向引物的实施方案中，两种引物(正向或反向)中只有一种可能需要能够区分本发明的(分子)标记等位基因和非标记等位基因，因此可能是独特的。其它引物可以能够或不能够区分本发明的(分子)标记等位基因和非标记等位基因，因此可以是独特的。[0333]通过以下非限制性实施例进一步支持本发明所述的方面和实施方案。实施例[0334]实施例1[0335]本发明描述了玉米7号染色体上的数量性状位点(qtl)的鉴定、定位和表征，其中有助于干旱下稳定碳同位素组成、气孔导度和植物性能的遗传变异。该qtl在序列水平上被表征，并且描述了其在分子、生物化学、生理学和农学水平上的表型效应。鉴定qtl内的基因，进行功能验证研究和基因表达研究以及转基因方法。分子标记数据整合和应用允许在位点和基因水平鉴定阳性和阴性单倍型、选择性状载体，并监测位点及其周围的多样性。[0336]材料和方法[0337]kasp标记的开发[0338]为产生新的衍生自nilb与rp的回交的重组体(avramovaetal.(2019).carbonisotopecomposition,wateruseefficiency,anddroughtsensitivityarecontrolledbyacommongenomicsegmentinmaize.theoreticalandappliedgenetics,132:53-63)，开发了新的分子标记。使用公众可获得的600kaxiomtm玉米基因分型芯片(unterseeretal.,2014)作为资源产生位于7号染色体上的渐渗和两个亲本系之间的多态的kasp标记。[0339]表1具有标记信息(名称、物理坐标)和相应的a(rp-轮回亲本)和b等位基因(dp-供体亲本)的600k芯片衍生的kasp标记识别[0340]标记idchragpv04agpv02a_识别b_识别seqidno:17114162912110930219adegua4427118512477115107967adecyt4537121214812117519226cytthy4647123728849119973922adegua4757125223361121316500guaade4867127837336123827128cytade497/a7129798239125861690cytthy508a/c7129919413125976029adegua518b/b7130053680126109267adegua529/d7131558094127586792adegua5310/e7133928553129887276cytthy5411/f7134903902130881551cytthy55127135221445131191105thycyt56137137626045133530779thycyt57147139623696135468905thycyt58157141161954136866388adegua59167148349595143410578guaade60177151797979146596371adegua61187155419484150177783adegua62[0341]重组nils的开发[0342]生长来自nilb和rp杂交的f2植物。在叶组织取样后，使用kasp标记进行基因分型(表1)。使在标记1(110.930.219bp)和标记18(150.177.783bp)之间的区域中显示重组的植物自交，并增加种子。这些重组体帮助鉴定靶区域内的因果qtl片段(图2)。用另外的dna标记分析重组体(图3)，并在温室实验中对iwue(内在水分利用效率)、气孔参数和农艺性状进行表型分析。[0343]rna-seq分析和候选基因提取[0344]在玻璃温室中进行rp和dp实验。对照(充分浇水)和处理条件(断水)包括在实验设置中。实验由在29℃/21℃白天/夜晚(d/n)、544μmolm-2s-1光合有效辐射(par)、47％/72％d/n相对湿度(rh)的受控条件下生长rp和dp植物组成，持续同步时间段。随后，将一半植物转移至干旱处理，其中断水11天，而另一半在对照条件下保持生长。在断水后4、7和11天采集组织样品。此外，在干旱11天后通过复水进行恢复处理。每个样品由每种处理和基因型3株植物的混合物组成。使用双末端测序在hiseq2000上使用短读段illumina测序进行测序。使用b73agpv02作为参考基因组并应用clc基因组服务器套装软件(qiagenbioinformatics,usa)的默认参数进行读段定位。[0345]使用agpv02公共参考注释(https://www.maizegdb.org/assembly)，提取定位到靶区域的基因，并且如果可用，整合功能信息(蛋白质家族[pfam]结构域和基因本体[go]术语)用于进一步表征。使用具有碱基功能性的统计软件r将基因分组为功能性蛋白质家族类别。对于基因本体(go)富集分析，参考序列agpv02的公开基因注释用作背景集，并与go项比较，用于基因定位到5.02mb的靶区域。使用r连同topgor包装，使用经典fisher、kolmogorov-smirnoff和kolmogorvsmirnoff消除测试统计来鉴定用于细胞组分、生物过程和分子功能的富集的gos。使用r包rgraphviz在节点/边缘go图中检索并可视化相应go类别的10个最重要的go术语(无多重检验校正)。[0346]表型评价[0347]在最佳条件下，在生长室中测定重组体d-k和亲本系在发育阶段v5的气孔导度(gs)，净co2同化率(a)和蒸腾作用(e)。内在水分利用效率(iwue)计算为a/gs的比率。使用统计软件r，通过应用杜克的真实显着性差异(tukeyhsd)确定供体片段载体和非载体之间的显著差异。[0348]结果[0349]鉴定的重组体组中的标记/表型相关性[0350]使用新产生的kasp标记，筛选约2000个f2植物并选择重组体j、h、d、k、f、e、g和i，用另外的dna标记分析并表征上述表型值。标记/表型相关性表明影响δ13c的5.02mb靶区域对气孔参数有影响，标记7(125.861.690bp)和标记11(130.881.551bp)可用作该区域两侧的标记(图4)。表2中给出了在各自基因组区间处携带供体片段(qtl )或具有rp等位基因状态(qtl-)的所选重组体的表型值。进一步表征重组体的其他性状，这些性状表现为受nilb携带的较大供体片段控制，即δ13c、叶生长对干旱的敏感性、整株植物水分利用效率(wueplant)、气孔密度、aba叶含量。[0351]已经对在qtl(qtl )处携带阳性等位基因的基因型与携带阴性等位基因(qtl-)的基因型的对比组进行了测试统计。tukeyhsd的p值突出了性状gs、a、iwue和e的qtl 和qtl-基因型之间的显著差异。未检测到a的显著差异。考虑到新产生的重组体的基因型信息，供体片段对iwue、gs、a和e的变异的影响通过因果差异定位到5.02mb的缩短间隔来证实。[0352]表2重组体和亲本系的气孔参数以及iwue值作为具有相同基因型、具有相应标准差和qtl存在状态的独立植物的平均值给出[0353]基因型gsaiwueeqtlrecd 0.133±0.01226.778±0.500191.546±5.3520.00204±0.00026-recj*0.203±0.00730.827±1.106152.195±2.1550.00281±0.00014 rece0.193±0.01031.784±0.564166.001±7.2920.00258±0.00012 recf0.139±0.00626.701±1.016193.724±4.7680.00188±8.48e-05-recg0.174±0.00628.071±0.733162.127±3.7820.00239±8.73e-05 reci0.179±0.00928.785±1.062162.714±3.8900.00247±0.00015 reck0.150±0.00827.443±0.871185.446±6.9870.00206±9.95e-05-[0354]*在所述区间中携带dp单倍型并且相应地被视为作用类似于供体基因型；[0355] recd间隔携带rp单倍型并被认为是作为轮回亲本[0356]基因鉴定[0357]在5.02mb靶区域内，可根据agpv02参考注释定位121个基因特征。考虑到pfam结构域信息，可以将121个基因模型分组为不同的功能类别。除了没有功能信息的48个基因之外，靶区间内的基因归因于dna/rna结合和转录因子活性，以及初级植物代谢(例如碳水化合物代谢)的功能。利用激素、细胞壁和光合作用相关基因，发现了影响气孔参数和碳同位素组成的途径。[0358]进行go富集分析以鉴定指向作为观察到的性状变异基础的重要途径的go术语。对于细胞组分go术语，表明叶绿体定位过程的显著富集。此外，还鉴定了与核和rna剪接相关的过程。生物过程gos的富集分析是指非生物胁迫反应，脂肪酸相关和rna加工途径。[0359]最后，分子功能gos的富集分析还产生与初级代谢，rna/dna修饰和光合作用组分相关的显著富集的术语。[0360]总之，所进行的分析强调了rna调节/调控和光合作用相关途径对性状变异的贡献。对于位于5.02mb区域内的几个基因，我们检测了响应干旱胁迫的差异基因表达，这表明了观察到的表型的作用。[0361]基因验证[0362]zmcsle1[0363](b73:基因组dna:seqidno:1；编码序列:seqidno:2；蛋白:seqidno:3；ph207:基因组dna:seqidno:4；编码序列:seqidno:5；蛋白:seqidno:6)[0364]基于rna-seq数据，该基因显示出显著不同的表达，在rp中的表达高于在dp中的表达，在对照条件下倍数变化(fc)为2.044。其在7号染色体上的定位在agpv02坐标上从130,735,393至130,740,535bp(在agpv04坐标上从134,723,714至134,728,829bp；在ph207坐标上从130,675,946到130,681,219bp)使其成为定位基因。它也是在干旱胁迫条件下与dp(fc2.5)相比在rp(fc5.05)中下调更多的基因之一。此外，其作为纤维素合酶样酶的推定功能使其成为功能基因。纤维素合酶在细胞壁合成中是重要的，其中它们递送并修饰必需的结构单元。由于细胞壁合成方法，尤其是细胞壁结构和组成对蒸腾作用和水分损失具有强烈影响，所以该基因可能有助于观察到的性状变异。在该位点由等位变异引起的表达差异可能改变气孔参数和/或源与汇之间的碳水化合物关系，从而影响wue和碳同位素鉴别。供体状态下zmcsle1的较高表达导致碳水化合物信号传导改变和/或水缺乏的水力学信号传导差异，使得气孔导度即使在水胁迫下也保持较高。为了验证zmcsle1，在ph207系的非供体群体中产生具有中断的剪接位点，早期终止密码子和氨基酸交换的tilling突变体(表3a和3b)，并测试zmcsle1的等位基因变体。[0365]表3a关于产生的zmcsle1基因模型的tilling突变体的概述[0366][0367]表3b群体ph207的选择的tilling突变体的表征。aa＝氨基酸，wt＝野生型，mut＝突变体[0368][0369]此外，根据气体交换参数对重组体的分析指向248kb的短供体片段，其范围从标记7(125.861.690bp)到标记8b(126.109.267bp)，并且在agpv02上有4个基因。我们表明，这种较小的间隔对气孔导度和iwue有特定的影响。因此，下面描述四个基因。[0370]zmabh4[0371]基于rna-seq数据的该基因(基因组dna：seqidno：9(b73)和seqidno：18(ph207))显示，在对照干旱和重复浇水条件下，携带dp等位基因的近等基因系的表达显著高于rp(图5)。对于该基因模型描述三个不同的转录本变体：t01(转录本：seqidno：10；cdna：seqidno：11)编码最长剪接变体(～1-2.5的具有fc的dp等位基因高于rp等位基因的表达；蛋白质：seqidno：12)和t02(转录本：seqidno：13；cdna：seqidno：14)和t03(转录本：seqidno：16；cdna：seqidno：17)的较短且编码相同蛋白质(dpt03等位基因的表达高于具有～1-1.2fc的rpt03等位基因；蛋白质：seqidno：15)。其在7号染色体上的定位在agpv02坐标上从125,973,529到125,976,469(在agpv04坐标上从129,916,913到129,919,853；在ph207上从126,143,580到126,147,082)使其成为定位基因。归因于具有推定的脱落酸8'-羟化酶4功能的细胞色素p450氧化酶家族，支持其作为功能基因的作用。脱落酸(aba)能够调节气孔孔径。作为参与aba分解代谢的基因(图6)，一种或所有转录本异构体之间的差异导致aba水平改变(图7)，其影响气孔孔径、导度，并且因此可能导致水分利用效率和碳同位素鉴别的差异。相应地，rp和dp之间的长转录本异构体t01的表达差异特别高。rp和dp之间aba水平的分析显示，rp与dp相比具有增加的aba水平，这导致更快速的气孔闭合和因此的早期干旱响应。为了证实zmabh4是推定的候选基因，产生tilling突变体(表4)并测试zmabh4的等位基因变体。[0372]表4a关于产生的zmabh4基因模型的tilling突变体的概述[0373][0374]表4b群体ph207的选择的tilling突变体的表征。aa＝氨基酸，wt＝野生型，mut＝突变体[0375][0376][0377]tilling品系ph207m015b(突变p377l)在由zmabh4催化的反应的产物(红花菜豆酸和二氢红花菜豆酸)与底物(aba)的比率方面与其野生型显著不同(图8)。然而，ph207m15b和ph207之间没有差异。[0378]对于品系ph207m015c(突变g453e)，abh4反应的产物与底物的比率、与其野生型的比率、与突变杂合的品系的比率和与ph207的比率没有差异。[0379]来自品系ph207m015b和ph207m015c的叶片的碳同位素鉴别(δ13c)与来自它们的野生型或ph207的叶子的鉴别没有区别(图9)。[0380]在这两种tilling品系中观察到的表型缺乏的可能原因可以是所研究的突变太温和而对表型没有影响，背景突变掩盖了表型，或这些品系中的激素稳态通过其它因子的调节得以维持。[0381]tilling系的其余部分将进一步表征。[0382]除了tilling方法，zmabh4的功能验证通过遗传修饰的生物体(gmos)进行。[0383]在这方面，通过将处于单子叶泛素启动子控制下的密码子优化的zmabh4基因整合到a188基因组中并选择对于该异源核苷酸的整合而言纯合的植物，将马齿型基因型a188用作转化背景以实现zmabh4基因的强组成型过表达。表5给出了来自t1代转化株的种子数的概述，其对于整合仍然是杂合的。[0384]预期zmabh4的过表达会降低植物中的aba水平，并由此诱导更高的气孔导度，从而诱导更高的气孔导度。[0385]包括zmabh4的所有zmabh家族成员的沉默通过在a188中表达异源发夹构建体来进行。产生t2纯合种子并且11个事件处于t1阶段。zmabh4的沉默预期增加aba水平并导致具有低气孔导度和较低碳同位素组成的早期干旱响应。[0386]表5关于zmabh4生成的gmo资源状态的概述[0387][0388]产生使用crispr/cas9敲除zmabh基因家族的构建体。其中一种构建体编码4个向导rnas、2个靶向zmabh4、2个靶向zmabh1(缺失将分别改变67％和84％的氨基酸序列)，用于转化玉米自交系b104。转化由vib研究所植物系统生物学中心(vibcenterforplantsystemsbiology,ghent,belgium)进行。恢复了在zmabh4中具有突变的6个独立事件。其中3个事件显示zmabh1中的额外突变。来源于五个事件的植物是基因型和表型的。t1代表型的初步结果显示，与携带两个野生型等位基因的植物(n＝4，图12)相比，携带两个zmabh4突变等位基因的植物(n＝3)的叶片中aba含量增加2.5倍。突变体中aba葡糖苷的增加和aba8'-羟基化产物的未改变水平(pa、dpa、图12)表明，植物使用葡糖苷灭活aba而不是羟基化，这可能在突变体中受损。然而，这与nilb与rp的比较相反，其中检测到红花菜豆酸和二氢红花菜豆酸水平的差异(图7)。此外，在该初步表型分析中突变体的气体交换测量结果仅在zmabh4zmabh1双突变体中显示出与野生型的差异，而在zmabh4单突变体中没有差异。然而，许多单突变体对于突变是杂合的，仍然携带野生型等位基因，而在双突变体中纯合突变植物的比例更高。该观察结果还表明zmabh4突变可被b104背景中的zmabh1补偿。[0389]近等基因系的zmabh4等位基因来源于近交系b73和mo17的杂交(eichtenetal.(2011)b73-mo17near-isogeniclinesdemonstratedispersedstructuralvariationinmaize.in:plantphysiol.156(4),s.1679–1690.doi:10.1104/pp.111.174748.)在mo17(图10)的背景下而不是在b73(图11b、c)下对气孔导度(gs)和瞬时水分利用效率(iwue)具有影响。这表明abh4或至少abh4周围的区域是mo17背景中表型差异的原因。在b73的背景中，nils中维持的aba分解代谢速率(图11a)解释了气体交换数据中表型的缺乏。[0390]zmweb1[0391]基因(b73：基因组dna：seqidno：24；cdna：seqidno：25；蛋白质：seqidno：26；ph207：基因组dna：seqidno：27；cdna：seqidno：28；蛋白质：seqidno：29)显示在dp中的表达高于fc为4.92的对照条件中的rp。其在7号染色体上的定位在agpv02坐标上从126,142,402到126,145,382(在agpv04坐标上从130,051,739到130,054,355；在ph207上从126,226,508到126,229,120)使其成为定位基因。其在拟南芥中的最接近的同源物(at2g26570)被称为weakchloroplastmovementunderbluelight-like蛋白质(web1)。该蛋白编码卷曲螺旋蛋白，其与另一种卷曲螺旋蛋白web2/pmi2(at1g66840)一起维持叶绿体光重定位运动速度(kodamaetal.,2010pnas)。叶绿体移向弱光(累积反应)和远离强光(回避反应)。叶绿体响应环境光条件的快速和精确移动对于叶绿体中有效的光合作用和光损伤预防是必要的。该基因中的等位基因差异影响光合反应，从而也影响光合和气孔参数，这又导致改变的碳同位素鉴别。此外，其在花药中的显著表达也可能在开花过程和随后的籽粒形成和籽粒灌浆中起作用。[0392]grmzm2g397260[0393]对于该基因(b73：基因组dna：seqidno：32；cdna：seqidno：33；蛋白质：seqidno：34)。然而，该基因显示在b73的成熟叶片中高度表达(sekhonetal.,2011)。其在7号染色体上agpv02坐标上从126,103,570到126,104,295(agpv04坐标上从130047983到130048708)的定位使其成为位置基因。没有功能注释可用于该基因。然而，它似乎是玉米特异性基因，因为不能检测到与其它基因模型的显著同源性。[0394]zmhsftf21[0395]对于该基因(b73：基因组dna：seqidno：36；cdna：seqidno：37；蛋白质：seqidno：38；ph207：基因组dna：seqidno：39；cdna：seqidno：40；蛋白质：seqidno：41)。其在7号染色体上的定位在agpv02坐标上从125.861.349至125.865.050(在agpv04坐标上从129,797,898至129,801,599；在ph207坐标上从126,047,960到126,052,077)使其成为定位基因。它编码热休克蛋白转录因子21，其功能与对缺水的响应有关，并且它在b73的成熟叶中表达(sekhonetal.,2011)，这使得它也是功能性基因。[0396]分析重组体的δ13c、叶生长对干旱的敏感性、整株植物水分利用效率(wueplant)、气孔密度，aba叶含量。[0397]鉴定的重组体组中的其它标记/表型相关性[0398]为了在遗传上剖析几种干旱相关性状与7号染色体上的基因组片段的关联，进行两个连续的温室和一个田间实验。将携带覆盖靶区域的小的重叠渐渗的nilb和9个重组nil(d-l)与其轮回亲本(rp)一起进行表型分析。在两个温室实验的每一个中使用每种基因型10株植物。监测气候条件(25-33℃/19-20℃d/n，400μmolm-2s-1par，40％rh)并在实验期间使用补充光。将两周龄的单个幼苗(发育阶段v3)种植在10l盆中，所述盆含有相同量的筛分的均质土壤和以随机完全区组设计组织的相同土壤水含量(swc)。[0399]在第一实验中，评价整株植物水分利用效率(wueplant)。通过停水6周使玉米植物经受进行性干旱胁迫。起始swc(vol/vol)为约85％。用塑料袋覆盖盆的表面以避免土壤水分蒸发，直到实验结束才进行进一步的浇水。当所有植物停止生长(发育阶段v9-v10)，开始衰老并消耗所有可利用的水时，实验结束。通过称量盆的重量来测定swc，并且将每个植物消耗的水量计算为与实验开始时的初始盆重量的差值。在实验结束时，在将材料在60℃下干燥1周以实现恒重之后，收获地上材料用于生物质测定。由于实验是破坏性的，测定另外2周龄植物的初始平均干生物量并从每种基因型的最终生物量中减去。wueplant计算为实验结束时的干生物质/消耗水的比率(参见图14)。[0400]在第二个温室实验中，使用li-6800(li-corbiosciencesgmbh,usa)对叶5进行叶气体交换测量充分发展(v5发展阶段)，以评估co2同化(a)和气孔导度(gs)(图16)，并计算作为它们之间的比率的内在wue(iwue)(图15)。之后，从叶片5中取出叶片样品用于气孔密度测定(图17)。在叶中部的远轴侧的三个不同位置处获取指甲油印记，并用透明玻璃纸带将其固定在显微镜载玻片的表面上。在显微镜下拍摄叶表皮的照片。计数气孔并计算其每叶面积的数目。将整叶5进一步立即在液氮中冷冻并进一步研磨以制备用于通过lc-ms/ms进行激素测量的样品(脱落酸(aba)(图18)及其分解代谢物、红花菜豆酸(pa)(图19)和二氢红花菜豆酸(dpa)(图20))。从相同的植物获得种子并将每株植物5-10粒谷粒一起研磨并用于碳同位素组成(δ13c)测量(图21)。[0401]田间试验在德国弗莱辛进行。使植物在有规律的灌溉水田(48°24′12.2″n，11°43′22.3″e)和防雨棚(48°24′40.9″n，11°43′22.4″e)中生长，并减少灌溉以实现温和的干旱胁迫。rp和nil是较大试验的一部分，这些试验被设计为随机完全区组设计，对于野外和防雨棚，每个入口重复6次。每个入口种植在单个1.2m行，行间距离为0.75m，行内区间为0.12m，目的是植物密度为11株m-2。除草剂和肥料的施用遵循良好的农业实践。手工收获每行的所有穗轴并在去壳前在30℃下干燥2周。将颗粒研磨并用于δ13c分析(图22和23)。当前第1页12当前第1页12