利用机械方式对构成活体组织的组织及细胞进行分离的方法与流程

1.本发明涉及一种利用机械方式对构成活体组织的组织及细胞进行分离的方法。


背景技术：

2.活体组织中含有可用于再生治疗和美容目的的各种组织、细胞和材料，会使用多种方法来对其进行分离。特别对于脂肪组织而言，通常会使用酶来分解组织并进行离心分离，该方法得到广泛使用，但由于没有合适的医用酶，并且所使用的酶含有毒性，因此，从利用酶分解的脂肪组织中获得的材料的安全性存在争议。因此，正在不断尝试不使用酶来从脂肪组织中获得可用于再生治疗及美容目的材料。例如，美国公开专利公布了过滤方法及装置(filtration method and apparatus)。
3.发明的内容
4.发明要解决的技术问题
5.本发明的目的在于解决上述言及的问题，提供一种利用机械方式对组织及细胞进行分离的方法，在进行活体组织的精细化工艺之前，进行如稀释等预处理工艺，由此根据稀释的物理、化学及机电效应，可以提高从活体组织，特别是从脂肪组织(adipose tissue)中分离出有用的组织、细胞及基质细胞(stromal cell)的工艺效率，即，分离出含有来自脂肪组织的干细胞的细胞的工艺效率。
6.但本发明要解决的课题不仅限于所述言及的问题，本发明所属技术领域的技术人员可以通过下面的记载内容明确理解其他未言及的课题。
7.解决问题的技术方法
8.根据本发明的一实施例，本发明涉及一种利用机械方式的组织及细胞分离方法，包括以下步骤：制备脂肪组织；用稀释液稀释所述脂肪组织，制备脂肪组织混合液；在所述脂肪组织混合液中，精细化脂肪组织和构成脂肪组织的组织及细胞；以及从精细化的脂肪组织混合液中，对脂肪组织和构成脂肪组织的组织及细胞进行分离。
9.根据本发明的一实施例，所述稀释液包括从由缓冲盐溶液、葡萄糖溶液、芽糖糊精溶液、乙醇、生理盐水、乳酸林格氏液、林格氏液、平衡电解质溶液、富血小板血浆(platelet-rich plasma，prp)、乏血小板血浆(platelet-poor plasma，ppp)、富血小板血浆和乏血小板血浆的混合液以及静脉注射溶液组成的群组中选择的至少一种。
10.根据本发明的一实施例，所述脂肪组织混合液中所述脂肪组织与所述稀释液的稀释比率是1:99至99:1(v/v)。
11.根据本发明的一实施例，所述稀释液在所述脂肪组织混合液中占25％(体积)至75％
12.(体积)。
13.根据本发明的一实施例，所述制备脂肪组织混合液的步骤是根据所述稀释液的稀释比率来调节回收的组织及细胞的每单位体积的细胞数及细胞密度。
14.根据本发明的一实施例，所述精细化脂肪组织和构成脂肪组织的组织及细胞的步
骤利用切割、撕裂、刮削、分解，及分离(separation)中的至少一种工艺。
15.根据本发明的一实施例，所述精细化脂肪组织和构成脂肪组织的组织及细胞的步骤精细化至10μm至4000μm大小。
16.根据本发明的一实施例，所述精细化脂肪组织和构成脂肪组织的组织及细胞的步骤是移动所述脂肪组织混合液，使得所述脂肪组织混合液按顺序、前后反复或以这两种方式通过多个筛查器的通孔。
17.根据本发明的一实施例，所述多个筛查器包括不同或相同大小的通孔，所述多个筛查器包括不同或相同形状的通孔。
18.根据本发明的一实施例，所述多个筛查器分别包括10μm至4000μm大小的通孔。
19.根据本发明的一实施例，所述多个筛查器根据通孔的大小按序排列，所述通孔的表面、里面，或两者中包括突出的锋利的刃(edge)。
20.根据本发明的一实施例，所述精细化脂肪组织和构成脂肪组织的组织及细胞的步骤利用装置，所述装置包括：外壳，其内部安装有具有不同大小的多个通孔的多个筛查器；以及连接口，其在所述外壳两侧连接注射器。
21.根据本发明的一实施例，所述从精细化的脂肪组织混合液中，对脂肪组织和构成脂肪组织的组织及细胞进行分离的步骤利用离心分离法、振动法，及过滤法中的至少一种方法，根据大小和比重进行分离。
22.根据本发明的一实施例，所述从精细化的脂肪组织混合液中，对脂肪组织和构成脂肪组织的组织及细胞进行分离的步骤是分离构成脂肪组织的组织和包括干细胞的基质细胞。
23.发明的效果
24.本发明在利用机械方式对构成脂肪组织的各种组织及细胞进行分离的工艺中，在进行机械精细化之前，利用生理盐水、乳酸林格氏液、林格氏液、电解质平衡溶液、富血小板血浆(platelet-rich plasma，prp)、乏血小板血浆(platelet-poor plasma，ppp)、富血小板血浆和乏血小板血浆的混合液，或可通过静脉注射方式给药的溶液等来对脂肪组织进行稀释，这种预稀释方式可根据稀释的物理、化学及机电效应，分离出更多的构成脂肪组织的各种细胞及来自脂肪组织的基质细胞，即可以分离出含有丰富干细胞的细胞，由此提高分离工艺效率。
附图说明
25.图1是根据本发明一实施例的本发明的分离方法的示例性工艺流程图。
26.图2是根据本发明一实施例的本发明方法用装置的示例性正截面图。
27.图3是根据本发明一实施例的图2所示的装置的部分结构的示例性截面立体图。
28.图4是根据本发明一实施例的本发明方法用装置的筛查器的示例性附图。
具体实施方式
29.下面将参照附图详细描述本发明的实施例。在说明本发明时，当认为对相关公知功能或结构进行具体说明会不必要地混淆本发明的要旨时，省略对其进行详细说明。并且，本说明书中的术语用于准确描述实施例，会根据使用者、操作者的意图或者本发明所属技
术领域的惯例有所不同。因此，对于术语的定义应以整体说明书内容为依据。每幅图中相同的附图标记表示相同的组件。
30.在整个说明书中，当说明一个构件位于另一个构件“上”时，这不仅包括一个构件与另一个构件接触的情况，还包括又一构件存在于两个构件之间的情况。
31.在整个说明书中，当说明一个部分“包括”某个构件时，意味着可以进一步包括其他构件，而不是排除其他构件。
32.下面参照实施例和附图详细说明本发明的利用机械方式对组织及细胞进行分离的方法。然而，本发明不限于这些实施例和附图。
33.本发明涉及一种利用机械方式对构成组织的各种组织及细胞进行分离的方法，根据本发明的一实施例，所述分离方法，包括：制备脂肪组织的步骤s1；稀释脂肪组织的步骤s2；精细化脂肪组织的步骤s3；及对脂肪组织及构成脂肪组织的各种组织及细胞进行分离的步骤s4。
34.根据本发明的一实施例，制备脂肪组织的步骤s1是指制备脂肪组织样本，从而从脂肪组织中分离出包括干细胞在内的构成脂肪组织的组织及细胞，可以收集来自动物(鱼类、哺乳类)等的脂肪组织来制备浓缩的脂肪组织，将其用于分离构成脂肪组织的组织及细胞。例如，采用吸脂术(liposuction)、脂肪组织切除(excision)等期望的方式收集脂肪组织，为浓缩脂肪抽吸物(lipoaspirate)或者脂肪组织，采用倾析(decanting)或者离心分离法(centrifugation)去除位于分离的脂肪组织的最上层(oil)及下层的杂质。由于脂肪组织比血液或水轻，因此所述倾析(decanting)是通过将抽吸容器静置几分钟，在脂肪组织向上漂浮后，将脂肪组织下方的水分或血液进行分离的方法。
35.根据本发明的一实施例，稀释脂肪组织的步骤s2是利用稀释液稀释所述脂肪组织，从而制备脂肪组织混合液的步骤，在脂肪组织的精细化工艺、分离工艺等加工处理，即机械处理之前，根据最终回收(或分离)浓缩的脂肪组织的组织及细胞混合液的量及密度，用各种实验方案/方法进行稀释工艺。例如，根据所述稀释液的稀释比率，调节分离工艺中利用的脂肪组织或最终回收的组织及细胞混合液的每单位体积的细胞数及细胞密度，可增加构成脂肪组织的各种组织、细胞及基质细胞(stromal cell)的分离量。
36.作为本发明的一例，所述稀释液是可以用于静脉输液途径(intravenous route)的溶液，例如，可以包括从由缓冲盐溶液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、乙醇、生理盐水(saline)、乳酸林格氏液(ringer lactate)、林格氏液(ringer)、平衡电解质溶液(balanced electrolyte)或溶液(solution)、富血小板血浆(platelet-rich plasma，prp)、乏血小板血浆(platelet-poor plasma，ppp)、富血小板血浆和乏血小板血浆的混合液、静脉注射溶液组成的群组中选择的至少一种。即，在利用机械方式从脂肪组织中分离及获得构成脂肪组织的各种组织和细胞的工艺中，通过预稀释来利用任意可通过静脉输液途径给药的生理盐水、酸林格氏液、林格氏液、平衡电解质溶液、富血小板血浆(platelet-rich plasma)、乏血小板血浆(platelet-poor plasma)、富血小板血浆和乏血小板血浆的混合液或溶液来对脂肪组织进行稀释，从而基于稀释的物理、化学及机电效应来促进脂肪组织及构成脂肪组织的各种组织及细胞的分离，由此提高分离构成脂肪组织的各种组织及细胞的工艺效率。
37.作为本发明的一例，对于所述稀释液而言，所述脂肪组织混合液中所述脂肪组织
与所述稀释液的稀释比率是1:99至99:1(v/v)；20:80至80:20(v/v)；或50:50至20:80(v/v)，优选地，所述稀释液在所述脂肪组织混合液中可以是25％(体积)至75％(体积)。可以根据精细化工艺及分离工艺中用到的装置及系统的体积对其进行适当调节，还可调节回收的细胞及组织的稀释液中含有的细胞数和/或细胞密度。例如，用50％的任意静脉注射溶液等稀释液及50％的脂肪组织，在机械处理前进行稀释，然后即可进行下一项工艺。更具体地，在10cc的注射器或容器中，使用5cc的脂肪组织及5cc的稀释液；或在20cc的注射器或容器中使用10cc的脂肪组织及10cc的稀释液。
38.根据本发明的一实施例，精细化脂肪组织的步骤s3是在所述稀释的脂肪组织混合液中，精细化脂肪组织和构成脂肪组织的各种组织及细胞的步骤，可利用切割(cutting)、撕裂、刮削、分解(disintegration)及分离(separation)中的至少一种工艺进行精细化。
39.作为本发明的一例，精细化脂肪组织的步骤s3是在脂肪组织混合液中，按照10μm至4000μm的大小将脂肪组织、脂肪细胞及含有干细胞的基质细胞、活体材料等均匀地进行精细化。
40.作为本发明的一例，精细化脂肪组织的步骤s3可以利用安装有多个筛查器的系统或装置来精细化所述脂肪组织混合液。
41.例如，所述多个筛查器具有不同或相同大小的通孔，可以具有不同或相同形态的通孔。这可以精细化各种大小的脂肪细胞及基质细胞，从而提高分离工艺的效率。
42.例如，所述多个筛查器可以分别具有一个或多个通孔。
43.例如，所述多个筛查器分别具有10μm至4000μm大小的通孔，所述通孔可以是球形、椭圆形、多边形及网格形中的至少一种。所述大小可以是指通孔的直径、长度等。
44.例如，所述通孔的表面、里面或两者包括突出的锋利的刃(edge)，如图4所示，突出形成为包括锋利的刃的刀片形状。
45.例如，所述多个筛查器可以根据系统或装置中通孔的大小按序排列，可以按照通孔由大到小或由小到大的顺序排列。
46.例如，所述脂肪组织混合液投入到排列有所述多个筛查器的系统或装置中，随着从入口向出口移动，按序、前后反复或以这两种方式通过多个筛查器的通孔来实现精细化。
47.例如，在排列有所述多个筛查器的系统或装置中，移动脂肪组织使其通过通孔的重复次数约为3至30次。例如，可以从具有较大微孔的筛查器到具有相对较小孔的筛查器，或者以相反的顺序重复。
48.作为本发明的一例，安装有多个筛查器的装置，可采用如图1所示的活体组织精细化系统1，其中多个筛查器用于从稀释的脂肪组织中获得构成脂肪组织的组织及细胞的精细化工艺。活体组织精细化系统1可包括：第一注射管c1、第二注射管c2、第二盖罩160、第一盖罩150、外壳110、第二摇臂192及第一摇臂191。在活体组织精细化系统1中，圆盘120安装在外壳110两侧的接触部之间，所述圆盘120包括筛查器，所述筛查器包括具有锋利的刃的刀片形状的突出部的不同大小的通孔，该系统1还包括分别连接至外壳110两侧的接触部的第一注射管c1及第二注射管c2。第一注射管c1及第二注射管c2分别形成用于容纳稀释的脂肪组织混合物bt的第一容器及第二容器，还包括第一推杆，其向内部施加压力，使脂肪组织bt向筛查器120加压。分别对两个注射管c1、c2的柱塞加压，从而以外壳110为介导，使稀释的脂肪组织通过筛查器反复移动，即可获得不同大小的同质的精细化脂肪组织，由此，可以
机械地分离不同大小的同质的精细化脂肪组织和其他构成脂肪组织的组织及细胞。
49.例如,所述多个筛查器具有大小为10μm至4000μm的通孔，通孔具有刀片形状的刃朝向通孔的中央突出的形状，筛查器的微孔的大小按照2000μm至3000μm、1000μm至2000μm、500μm至1000μm、250μm至500μm的顺序排列。
50.例如，精细化系统1中包括多个筛查器的圆盘120还可以包括面板121及多个筛查器122a、122b、122c、122d、122e。面板121可固定在第一安装件111上。面板121可包括第一中心开口1211。即，从分别包括实现脂肪组织的精细化的多个通孔的多个筛查器122a、122b、122c、122d、122e中选择第一筛查器122a，利用选择的第一筛查器122a精细化脂肪组织后，从多个筛查器122a、122b、122c、122d、122e中选择第二筛查器122b，利用选择的第二筛查器122b精细化脂肪组织。其中，由使用者确定多个筛查器122a、122b、122c、122d、122e的选择及顺序，因此并不受限于上述说明的筛查器的选择与顺序。
51.图4示例性地显示出根据本发明一实施例的安装有多个筛查器的装置中的所述筛查器的结构，在图4中，筛查器220可以包括面板221与通孔222。通孔222可以根据面板221的多个边缘规定。例如，筛查器220可以包括：第一线性部223a，其形成在通孔222的第一侧；第一突出部224a，其形成在通孔222的第一侧，沿着第一方向t1向通孔222的中心突出；第二线性部223b，其形成在通孔222的第二侧；及第二突出部224b，其形成在通孔222的第二侧，沿着第二方向t2向通孔222的中心突出。第一突出部224a及第二突出部224b相对于筛查器220具有一定角度，用于刮削与撕裂通过筛查器220的脂肪组织。沿着第一方向t1突出的第一突出部224a的第一延长线l1及沿着第二方向t2突出的第二突出部224b的第二延长线l2处于相互缠绕的位置。即，第一延长线l1及第二延长线l2既不平行也不相交。第一突出部224a及第二突出部224b可设定第一突出部224a的方向t1及第二突出部224b的方向t2，从而朝向第一盖罩150及第二盖罩160中任意一个盖罩。
52.根据本发明的一实施例，分离脂肪组织及构成脂肪组织的多种组织及细胞的步骤s4是从所述脂肪组织混合液中分离出精细脂肪和构成脂肪组织的各种组织及细胞的步骤，可利用离心分离法、倾析法、振动法(vibration)、过滤法等。
53.作为本发明的一例，可利用离心分离法、振动法，及过滤法中的至少一种方法，根据比重和/或大小来进行分离，从而分离出需要的脂肪组织及细胞。作为一例，在将所述经过精细化工艺的脂肪组织混合液用离心分离方法分离成四个层(甘油三酯(triglyceride)层；作为脂肪组织、脂肪组织和稀释液 体液的边界层的细胞聚集的基质细胞聚集(aggregate)层；及包括稀释液、体液及干细胞的基质细胞溶液层)后，
ⅰ
)可以用注射器回收其中位于最下层的具有干细胞的基质细胞溶液层，以及其上的细胞聚集(aggregate)层。将所述两个层混合，准备施用(治疗)。
ⅱ
)只需要溶液时，可使用被称为干细胞至基质细胞溶液(稀释液 体液 基质细胞)层的最下方的溶液层。
ⅲ
)如只需凝胶形式的最终产物，可回收从最下层(基质细胞溶液层)开始数的第二层细胞聚集(aggregate)层，该层粘度高可用作凝胶。或者，该层可与一般脂肪组织直接混合使用。或者，可以在获得该层后，利用所需的稀释液稀释后使用。
54.作为另一例，通过从最终产物中去除最上层的甘油三酯(triglyceride)层，使得上层脂肪组织与下层整个基质分化(stromal differentiation)层混合，即，与基质细胞聚集(aggregate)层、包括稀释液、体液，及基质细胞的基质细胞溶液层等脂肪组织层以下所
有层混合，该混合物可用于细胞富集(cell-enriched)脂肪组织移植(graft)。
55.下面，将通过实施例更详细地说明本发明，但以下实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
56.实施例
57.用吸脂法从人体中收集的脂肪组织中去除杂质并进行离心分离后，制备浓缩的脂肪组织。所述浓缩的脂肪组织根据表1及表2经过稀释工艺，在图2所示的装置中，利用具有大小为400μm至4000μm的通孔的多个筛查器反复精细化30次。在进行精细化工艺之前，根据稀释工艺及稀释比率来分析基质细胞(有核细胞)的数量及密度，并显示在表1及表2中。与精细化工艺之前没有进行稀释工艺的对照组比较了有核细胞比率。
58.参照表1及表2，可以发现，在精细化工艺之前利用稀释液进行稀释时，基质细胞(有核细胞(nucleated cell))的细胞数量与密度会增加，通过机械分离工艺从脂肪组织中分离出的基质细胞(有核细胞)的量得到增加。
59.表1
[0060][0061]
表2
[0062][0063][0064]
综上，通过有限的附图说明了实施例，本领域普通技术人员能够基于所述记载进行多种更改与变形。如果所说明的技术按照不同的顺序执行，和/或如果所说明的构成要素按照不同的形态进行结合或组合，或者由其他构成要素或者等同物置换或代替，也能得到适当的结果。因此，其他体现方式，其他实施例以及权利要求书及其等同内容范围都应被解释为包括在本发明中。