一类含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于铜离子快速荧光检测技术领域，具体涉及一类含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.铜离子是一种常见的环境污染物，当铜在体内蓄积到一定程度后即可对人体健康产生危害。人体吸入过量铜，表现为威尔逊(wilson)症，这是一种染色体隐性疾病，可能是由于体内重要器官如肝、肾、脑沉积过量的铜而引起的。皮肤接触铜化合物可发生皮炎和湿疹，在接触高浓度铜化合物时可发生皮肤坏死。眼接触铜盐可发生结膜炎和眼睑水肿，严重者可发生眼浑浊和溃疡。
3.铜对水生生物的毒性也很大。海水重金属离子cu
2
含量超过一定浓度便会引起文昌鱼中毒，使其身体渐成弯曲状而死亡。水环境中的cu
2
会对日本沼虾摄食率及体内碱性磷酸酶、胃蛋白酶和类胰蛋白酶造成影响。cu
2
对肝胰腺中碱性磷酸酶的影响：水环境中外加低浓度的cu
2
(2～4μg/l)时可激活消化道中胃蛋白酶和类胰蛋白酶的活性，但高浓度(8μg/l)时则有抑制作用，cu
2
可使肝脏溶酶体膜磷脂发生氧化反应，导致溶酶体膜破裂，水解酶大量释放，而引起肝组织坏死。重金属进入水体后，将对水生动物的生长发育、生理代谢过程产生一系列的影响。zn、cu、mn这些金属的积累对鱼的性别、身长等有影响。此外，重金属还将影响到水生动物的遗传表达。cu、zn、pb、cd等的混合重金属离子会对鲫鱼dna合成的抑制。
4.铜在许多受毒害的植物中均有发现必需养分的吸收、运输和积累的失调。铜中毒的植物会出现缺铁失绿。高浓度铜离子还会引起过氧化作用损伤类囊体膜，也会导致失绿。另外铜还会抑制亚硝酸还原酶的活性，从而影响氮的吸收利用。重金属胁迫对植物的光合作用都有抑制作用，并且降低效应与重金属胁迫程度是相关的。低浓度下叶绿体的基粒片层开始变稀疏，层次减少，随浓度升高，基粒片层消失，叶绿体功能受到破坏，重金属对叶片色素产生了明显的抑制效应。
5.现有检测铜离子的技术缺少灵敏度，需要设备复杂。本发明可现场检测，操作简单、检测快速、灵敏度高，同时检测条件温和，具有较好的选择性，旨在为铜离子的荧光检测技术提供更多的技术支持。


技术实现要素：

6.本发明为克服现有技术的不足，提供一类含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针及其制备方法和应用，该铜离子荧光探针可以快速响应、高灵敏度检测水体和细胞内铜离子。
7.本发明采用的技术方案为：
8.一类含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针具有如(ⅰ)所示的结构通式：
[0009][0010]
上述的一类含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：将6-甲氧基-2-萘甲醛和2-肼吡啶加入到20ml乙醇中，加热回流反应30min，再加入10ml乙醇继续加热回流反应1h，然后每隔20min加入10ml甲醇，继续加热回流反应，直至生成黄色絮状物，且反应物反应完全，结束反应，冷却至室温，旋转蒸发至剩余1ml液体，抽滤，用乙醇冲洗滤饼，干燥滤饼，得到的淡黄色固体粉末即为含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针。
[0011]
进一步的，上述的制备方法，所述的6-甲氧基-2-萘甲醛和2-肼吡啶的摩尔比为1:1。
[0012]
进一步的，上述的制备方法，所述的加热回流反应的温度为80℃。
[0013]
进一步的，上述的制备方法，所述的干燥温度为60℃。
[0014]
上述的一类含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针在检测环境水体中铜离子的应用。
[0015]
上述的一类含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针在检测活细胞中铜离子的应用。
[0016]
进一步的，上述的应用，所述的活细胞为hela细胞株、mcf-7细胞株或raw264.7细胞株。
[0017]
本发明的有益效果为：
[0018]
1、本发明的荧光探针能够快速的高灵敏的检测水体中或活细胞内的铜离子。该荧光探针表现出了较好的铜离子选择性和抗其他金属离子干扰性；在ph 7-12范围内荧光光谱不受ph影响；该荧光探针呈现出对水体中铜离子的高灵敏检测，检测限达到5nm；铜离子与探针的络合常数为3.2
×
106m，表明探针与铜离子具有较强的结合能力，而且探针与铜离子的结合是可逆的。此外，该荧光探针在对水体中铜离子的检测过程中呈现出明显的颜色变化，当加入6.0
×
10-7
mol/l铜离子后，探针溶液颜色由无色变为淡黄色，随着铜离子浓度的增大，溶液颜色不断加深，最终变为浅黄色。
[0019]
2、本发明的荧光探针能够进入活细胞内，铜离子响应迅速，具有较高的灵敏度，能够对其中的铜离子进行在线实时的检测；显微成像实验还表明这类探针具有较好的细胞通透性、较好的稳定性、较好的溶解性和生物兼容性，能够对细胞内的铜离子的分布进行显微成像。
附图说明
[0020]
图1是荧光探针namp在366nm处的吸光度随ph值变化的趋势图。
[0021]
图2是荧光探针namp对不同金属离子的荧光光谱变化图。
[0022]
图3是荧光探针namp在不同浓度铜离子下的荧光光谱变化趋势图。
[0023]
图4是荧光探针namp对水体中铜离子检测的照片。
[0024]
图5是荧光探针namp对hela细胞内铜离子检测的照片。
具体实施方式
[0025]
实施例1含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针(namp)
[0026]
制备反应式如下：
[0027][0028]
称量853.15mg 6-甲氧基-2-萘甲醛(即4.5817mmol)和500mg 2-肼吡啶(即4.5817mmol)于250ml单口瓶中，加入20ml乙醇，80℃加热回流反应30min，溶解性较差，再加入10ml乙醇继续80℃加热回流反应1h，仍无颜色变化，溶解性较差，然后每隔20min加入10ml甲醇，继续80℃加热回流反应，观察其颜色和状态变化，直至生成黄色絮状物，tlc检测，反应物反应完全，结束反应，冷却至室温，旋转蒸发至剩余1ml液体，抽滤，用乙醇冲洗滤饼，将滤饼转移至小药瓶，60℃干燥后称量，得到1.3815g淡黄色固体粉末即为含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针(namp)。
[0029]
实施例2一类含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针的应用
[0030]
本应用试验采用实施例1制备的含有萘甲氧基肼吡啶结构的铜离子荧光探针(namp)进行。
[0031]
1、吸收光谱的测定。配制荧光探针namp浓度为2
×
10-5
mol/l的含有60％乙腈的探针水溶液，分别用氢氧化钠和盐酸调节该探针水溶液的ph，分别制备ph范围在2～12不同ph的探针水溶液，分别测试吸收光谱，选取最大吸收强度对ph值作图，如图1所示，图1中每个点分别代表不同ph的荧光探针namp水溶液在366nm处的吸光度，结果表明，随着ph值的降低，吸光度不断增强，荧光探针namp在ph处于7～12范围内不敏感。
[0032]
2、金属离子选择性测定。配制荧光探针namp浓度为2
×
10-5
mol/l的含有60％乙腈的探针水溶液，其ph为7。向该探针水溶液中分别加入不同种类金属盐(加入量均为荧光探针namp摩尔质量的100倍)，进行荧光光谱测定。如图2结果显示，除铜离子外，其他金属离子对荧光探针namp的荧光光谱没有影响，即此探针表现出较好的铜离子选择性。
[0033]
3、铜离子荧光滴定。荧光探针namp在ph为7的缓冲溶液中，分别加入不同量的金属铜离子，分别进行荧光光谱测定。图3表明，当加入的铜离子0.3equiv即浓度为6
×
10-7
mol/l时，该探针的荧光强度明显增强，探针表现出了较高的灵敏度。通过计算得出该探针的检测限达到5nm，探针与铜离子的络合常数为3.2
×
106m。
[0034]
4、水体中铜离子的检测。将荧光探针namp分别加入到含有不同金属离子的水溶液中，从图4可以观察到，吸收呈现出现淡黄色并且荧光呈现蓝绿色强荧光的水溶液中含有铜离子。
[0035]
5、荧光显微成像。向含有活细胞为hela细胞株的培养皿中，加入浓度为2
×
10-5
mol/l的荧光探针namp的二甲基亚砜溶液，与细胞培养液混合均匀，染色5min后，用ph＝7.4的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，再加入2
×
10-5
mol/l的铜离子溶液，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。实验结果发现，如图5所示，染有荧光探针namp的hela细胞
中呈现出明显的荧光，实验结果表明，namp具有较好的细胞通透性、较好的稳定性、较好的溶解性和生物兼容性，能够对细胞内的铜离子的分布进行显微成像。