一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法及其应用与流程

1.本技术涉及细胞分离培养的技术领域，更具体地说，涉及一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法及其应用。


背景技术：

2.心血管疾病已经成为危胁人类健康的首要疾病。血管疾病常为始发疾病，而且缺乏有效的治疗手段。血管平滑肌细胞的生长异常与血管病的形成、发展和疾病预后密切相关。血管平滑肌细胞是血管壁的重要构成成分，许多心血管疾病的发生都与其增殖、迁移、分化有着密切关系，例如血管炎症、斑块形成、动脉粥样硬化、再狭窄和肺动脉高压等。研究表明，动脉粥样硬化斑块(心脏病发作和中风的主要原因)中的大多数病源性细胞是由血管平滑肌细胞衍生的。
3.因此，以人血管平滑肌细胞为实验研究对象，探讨心血管疾病相关的发病机制是目前研究的热点；体外培养的血管平滑肌细胞对于研究其生理功能、药物作用以及各种致病因素作用下的病理生理改变具有重要意义。
4.此外，越来越多的研究逐步开始用体外构建的类器官来替代实验动物，而血管作为皮肤的重要结构，在构建完整的皮肤类器官的过程中是必不可少的，已经有部分研究使用血管平滑肌细胞构建皮肤类器官。
5.人脐静脉平滑肌细胞分离自人体脐带组织，是脐静脉的重要结构组成细胞之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用。脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，形状如绳索，表面光滑透明，内含结缔组织、一支脐静脉和一对脐动脉。在子宫中，子宫动脉在胎盘的母体部分出的毛细血管与胎盘的子体部胎儿毛细血管靠近，在此处母体和胎儿的血液间进行co2、o2、代谢废物和营养物质的交换。脐动脉将胎儿产生的废物运送至胎盘，脐静脉将o2和营养物质从胎盘运送给胎儿。脐带是分娩过程中的废弃物，这使得体外培养的脐静脉平滑肌细胞成为了研究血管的模型细胞。
6.然而，采用目前已有的脐静脉平滑肌细胞的分离方法，培养获得的细胞往往传代次数较少、扩增时间较长且活力较差，因此，如何提供一种传代次数多、扩增时间短、细胞活力好且纯度较高的人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.为了提高分离培养的人脐静脉平滑肌细胞的活力及传代次数，本技术提供一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法及其应用，使用该方法分离培养得到的脐静脉平滑肌细胞活力好，纯度高，扩增时间短，可大规模连续传代培养20代以上，在相关的理论研究中具有重要的应用价值。
8.第一方面，本技术提供一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，采用如下技术方案：
9.一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，所述人脐静脉平滑肌细胞的分离培养
方法包括：
10.无菌分离脐带并冲洗，使用i型胶原酶溶液使血管充盈，孵育；
11.剪开血管腔，剪成体积为1～2mm3的组织块后，按3～5块/cm2的密度种植于培养瓶中；
12.将种植有组织块的瓶底向上，加入完全培养液，静置后翻转培养瓶，使组织块没入完全培养液中，培养，并定期更换完全培养液；
13.去除组织块，并进行连续传代培养。
14.本技术中，通过对人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法进行优化，显著提高了细胞的活性，增殖速度更快，缩短了细胞数量增加1倍所需的时间，在相同的培养时间内，细胞数量可达现有方法的1.5倍以上；获得的细胞可以连续传代20次以上并保证基因型的稳定，与现有的分离方法相比，传代次数显著提高的同时，细胞的生长状态也更好；分离培养后的细胞纯度高，可达98％以上，细胞存活率在99.5％以上，活性良好，可作为相关研究的模型细胞，具有重要的研究意义。
15.在一些具体的实施方案中，所述组织块的体积为1～1.5mm3或1.5～2mm3等。
16.在一个具体的实施方案中，所述组织块的体积为1mm3、1.5mm3或2mm3等。
17.在一些具体的实施方案中，所述种植的密度为3～4块/cm2或4～5块/cm2。
18.在一个具体的实施方案中，所述种植的密度为3块/cm2、4块/cm2或5块/cm2。
19.本技术中，将组织块的体积控制在1～2mm3的范围内，可以提高细胞的贴壁及爬出效率，增加获得的脐静脉平滑肌细胞的数量，提高原料的利用率。若组织块的体积较大，则不利于细胞的爬出，最终获得的细胞的数量较少，且造成了原材料的浪费；若组织块的体积较小，则组织块受外界环境的影响较大，不易贴壁，细胞容易层叠生长，不易获得单层细胞，且细胞的生理状态也较差，增殖能力较弱。
20.本技术中，将种植的密度控制在3～5块/cm2的范围内，有利于单层细胞的获得，并且可以提升细胞的活力，增加获得的细胞数量。若种植的密度较大，则组织块中爬出细胞的生长空间较小，容易产生多层细胞层叠的现象，并且也会影响细胞的继续爬出，导致最终获得的细胞数目较少；若种植的密度较小，则不利于爬出细胞之间的物质与信息交流，对细胞的活力也有一定的影响。另外，若组织块种植的密度过小，则不利于爬出的细胞形成均一的单细胞层，细胞容易聚集在组织块周围层叠生长，进而容易发生脱落及老化的现象；细胞达到传代培养所对应的融合度需要的时间也较长，不利于细胞活力的保持，同时也降低了细胞的增殖效率。
21.优选地，所述冲洗的方法包括使用36.5～37.5℃、含0.4％～0.6％肝素钠的d-hanks溶液进行清洗。
22.在一些具体的实施方案中，d-hanks溶液的温度为36.5～37℃或37～37.5℃等。
23.在一个具体的实施方案中，d-hanks溶液的温度为36.5℃、37℃或37.5℃等。
24.在一些具体的实施方案中，d-hanks溶液中肝素钠的浓度为0.4％～0.5％或0.5％～0.6％等。
25.在一个具体的实施方案中，d-hanks溶液中肝素钠的浓度为0.4％、0.5％或0.6％等。
26.本技术中，通过向d-hanks溶液中添加肝素钠，可以延缓血液的凝固，从而将脐带
中残留的血液冲洗得更加干净。
27.优选地，所述i型胶原酶溶液中i型胶原酶的浓度为0.5～2.5mg/ml。
28.在一些具体的实施方案中，所述i型胶原酶溶液中i型胶原酶的浓度为0.5～1mg/ml、0.5～1.5mg/ml、0.5～2mg/ml、1～1.5mg/ml、1～2mg/ml、1～2.5mg/ml、1.5～2mg/ml、1.5～2.5mg/ml或2～2.5mg/ml等。
29.在一个具体的实施方案中，所述i型胶原酶溶液中i型胶原酶的浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml或2.5mg/ml等。
30.优选地，所述孵育的方法包括：
31.使用d-hanks溶液浸没充盈后的血管，孵育28～35min。
32.在一些具体的实施方案中，孵育的时间例如可以是28～30min、28～33min、30～33min、30～35min或33～35min等。
33.在一个具体的实施方案中，孵育的时间例如可以是28min、30min、33min或35min等。
34.优选地，所述孵育时，转移至36.5～37.5℃的co2培养箱中进行孵育。
35.在一些具体的实施方案中，co2培养箱的温度为36.5～37℃或37～37.5℃等。
36.在一个具体的实施方案中，co2培养箱的温度为36.5℃、37℃或37.5℃等。
37.本技术中，通过上述方法充盈并孵育脐静脉血管，可以充分消化血管内皮细胞，从而保证获得的脐静脉平滑肌细胞具有极高的纯度，无其他杂质细胞的混入。此外，消化获得的内皮细胞也可以进行培养，用于其他的用途，提升了脐血管的利用率，更加经济高效。
38.传统的去除血管内皮细胞的方法为先用刀具剪开血管，再用棉签或刀片刮除内皮细胞，这种方式可能导致内皮细胞无法完全清除，获得的脐静脉平滑肌细胞中混有其他的细胞，纯度较低；也可能因过度清除而造成原料的浪费，使获得的细胞总量减少。此外，在使用刀具刮除内皮细胞时还存在操作人员受伤的风险，具有一定的安全隐患。
39.本技术中，采用先使用i型胶原酶孵育消化内皮细胞再剪成组织块的顺序，有利于提高最终获得的脐静脉平滑肌细胞的纯度，同时也降低了操作的难度。若采用先剪成组织块再进行消化的操作顺序，则在消化时较难确定消化的程度，若消化程度较轻则会因内皮细胞未完全消化导致最终获得的脐静脉平滑肌细胞的纯度较低；若消化的程度过重则会造成造成平滑肌细胞的损失，从而导致最终获得的细胞数量较少。另外，剪成组织块后不容易区分血管的内壁和外壁，给后续的种植操作也带来了难度。
40.优选地，所述孵育后，还包括使用pbs溶液清洗静脉血管的步骤，清洗的次数可以为1～5次。
41.优选地，所述完全培养液包括胎牛血清、青链霉素混合液和dmem/f12基础培养基。
42.优选地，所述胎牛血清在所述完全培养液中的体积百分比为18％～22％。
43.在一些具体的实施方案中，所述胎牛血清在所述完全培养液中的体积百分比为18％～19％、18％～20％、18％～21％、19％～20％、19％～21％、19％～22％、20％～21％、20％～22％或21％～22％等。
44.在一个具体的实施方案中，所述胎牛血清在所述完全培养液中的体积百分比为18％、19％、20％、21％或22％等。
45.优选地，所述青链霉素混合液在所述完全培养液中的体积百分比为0.8％～
1.2％。
46.在一些具体的实施方案中，所述青链霉素混合液在所述完全培养液中的体积百分比为0.8％～0.9％、0.8％～1％、0.8％～1.1％、0.9％～1％、0.9％～1.1％、0.9％～1.2％、1％～1.1％、1％～1.2％或1.1％～1.2％等。
47.在一个具体的实施方案中，所述青链霉素混合液在所述完全培养液中的体积百分比为0.8％、0.9％、1％、1.1％或1.2％等。
48.作为优选技术方案，以体积百分比计，所述完全培养液含18％～22％胎牛血清和0.8％～1.2％青链霉素混合液，余量为dmem/f12基础培养基。
49.本技术中，对完全培养液的组分进行了优化，选择dmem/f12基础培养基，并对胎牛血清以及青链霉素混合液的添加量进行了优化，改善了细胞的增殖状态，分裂速度更快，相同的培养时间内，细胞数量更多，生理状态也更佳。
50.优选地，培养瓶中所述完全培养液的加入量为1.5～2ml。
51.在一些具体的实施方案中，培养瓶中所述完全培养液的加入量为1.5～1.7ml或1.7～2ml等。
52.在一个具体的实施方案中，培养瓶中所述完全培养液的加入量为1.5ml、1.7ml或2ml等。
53.本技术中，通过控制完全培养液的加入量为1.5～2ml，减少了培养过程中完全培养液对组织块的冲击，从而使组织块贴壁更加牢固，细胞爬出的数量更多，速度更快。
54.优选地，所述静置的时间为8～16h。
55.在一些具体的实施方案中，所述静置的时间为8～10h、8～12h、8～14h、10～12h、10～14h、10～16h、12～14h、12～16h或14～16h等。
56.在一个具体的实施方案中，所述静置的时间为8h、10h、12h、14h或16h等。
57.本技术中，控制静置的时间为8～16h，组织块贴壁更为牢固，不易脱落，与后续过程中细胞的爬出数量、爬出速度密切相关。
58.优选地，所述静置的温度为36.5～37.5℃。
59.在一些具体的实施方案中，所述静置的温度为36.5～37℃或37℃～37.5℃等。
60.在一个具体的实施方案中，所述静置的温度为36.5℃、37℃或37.5℃等。
61.优选地，所述静置时，在湿度为95％～100％、co2浓度为4％～6％的co2培养箱中进行静置。
62.在一些具体的实施方案中，所述co2培养箱的湿度为95％～98％或98％～100％等。
63.在一个具体的实施方案中，所述co2培养箱的湿度为95％、98％或100％等。
64.在一些具体的实施方案中，所述co2培养箱的co2浓度为4％～5％或5％～6％等。
65.在一个具体的实施方案中，所述co2培养箱的co2浓度为4％、5％或6％等。
66.优选地，所述静置的方法包括：
67.在温度为36.5～37.5℃、湿度为95％～100％、co2浓度为4％～6％的co2培养箱中，静置8～16h。
68.优选地，所述定期更换完全培养液的方法包括：
69.每3～5天，半量换液1次。
70.在一些具体的实施方案中，半量换液的间隔时间为3～4天或4～5天等。
71.在一个具体的实施方案中，半量换液的间隔时间为3天、4天或5天等。
72.本技术中，采用半量换液的方式，可以减少因培养环境骤变而使细胞产生应激反应，使细胞的生理状态维持在一个相对稳定的环境中，细胞的爬出速度更快，状态也更好。
73.优选地，所述去除组织块的条件为细胞融合度达到85％～90％。
74.在一些具体的实施方案中，所述去除组织块的条件为细胞融合度达到85％～87％或87％～90％等。
75.在一个具体的实施方案中，所述去除组织块的条件为细胞融合度达到85％、87％或90％等。
76.优选地，所述连续传代培养时，细胞的融合度不低于90％，通过tryple溶液消化的方式进行传代培养。
77.在一些具体的实施方案中，细胞的融合度为90％～92％、90％～94％、90％～96％、90％～98％、92％～94％、92％～96％、92％～98％、94％～96％、94％～98％或96％～98％等。
78.在一个具体的实施方案中，细胞的融合度为90％、92％、94％、96％或98％等。
79.本技术中，使用tryple溶液进行传代培养，与胰酶溶液相比，tryple溶液对细胞的消化更加温和，不易造成细胞凋亡，从而使细胞保持更高的活力，且细胞消化后的再贴壁比例较高，有利于后续的分裂及培养，也可以减少因传代操作引起的细胞损失。
80.优选地，所述tryple溶液消化的方法包括：
81.加入1～2ml tryple溶液，36.5～37.5℃消化1～2min，再加入等体积pbs溶液终止消化反应；
82.轻轻将细胞吹打下来，收集至离心管中，850～1000rpm离心3～5min，弃上清；
83.用5～10ml完全培养液重悬细胞，计数，根据细胞密度，按1:1或1:2接入培养瓶中，每2～3天换液1次。
84.优选地，所述人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法还包括对培养后的细胞进行鉴定的步骤。
85.第二方面，本技术提供一种通过第一方面所述的人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法分离培养得到的人脐静脉平滑肌细胞。
86.优选地，所述人脐静脉平滑肌细胞的传代次数在20次以上。
87.在一些具体的实施方案中，所述人脐静脉平滑肌细胞的传代次数为20～23次、20～25次、20～28次、20～30次、23～25次、23～28次、23～30次、25～28次、25～30次或28～30次等。
88.在一个具体的实施方案中，所述人脐静脉平滑肌细胞的传代次数为20次、23次、25次、28次或30次等。
89.优选地，将所述人脐静脉平滑肌细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202270，保藏日期为2022年4月20日。
90.本技术中，上述人脐静脉平滑肌细胞命名为人脐静脉平滑肌细胞系huvsmc。
91.本技术中，通过上述人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法分离培养得到的人脐静脉平滑肌细胞具有良好的活力，细胞增殖分裂的速度更快，存活率高，纯度好，具有重要的
研究价值。
92.综上所述，本技术具有以下有益效果：
93.1.本技术对人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法进行了优化，通过使用i型胶原酶溶液进行孵育，血管内皮细胞被充分消化，保证了制备得到的人脐静脉平滑肌细胞具有极高的纯度，且能够对脐血管进行充分利用，提高了原料的利用率；通过控制组织块的大小以及接种的密度，增加了获得的细胞的数量，并提高了细胞的活力；对完全培养液的组分进行了优化，改善了细胞的增殖状态；通过控制完全培养液的加入量以及静置的条件，提高了组织块的贴壁效率，细胞的爬出效率更高，速度更快；对传代培养的方式进行了改进，提高了细胞的活力。
94.2.本技术通过上述方法分离培养得到的人脐静脉平滑肌细胞的性能更优：增殖速度更快，在相同的培养时间内，采用本技术技术方案获得的细胞总数可达传统方法获得的细胞数量的1.5倍以上，显著缩短了增殖所需的时间；纯度高，可达98％以上，存活率高，可达99.5％以上，细胞活性更好，可连续传代20次以上并维持基因型的稳定，可应用于大规模细胞的制备中，具有重要的研究价值。
附图说明
95.图1是本技术实施例1中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
96.图2是本技术实施例1中传代培养1次的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
97.图3为本技术实施例1中的人脐静脉平滑肌细胞在tryple
tm select溶液消化后重新贴壁的形态图片(放大倍数＝40倍)。
98.图4为本技术实施例7中的人脐静脉平滑肌细胞在胰酶消化后重新贴壁的形态图片(放大倍数＝40倍)。
99.图5是本技术实施例8中传代培养1次的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
100.图6是本技术对比例1中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
101.图7是本技术对比例2中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
102.图8是本技术对比例3中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
103.图9是本技术对比例4中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
104.图10是本技术实施例1制备的的人脐静脉平滑肌细胞的α-sma染色结果图片(放大倍数＝20倍)。
105.图11是本技术实施例1制备的的人脐静脉平滑肌细胞的colponin1染色结果图片(放大倍数＝20倍)。
106.图12是本技术实施例1制备的的人脐静脉平滑肌细胞的α-sma和colponin1染色的
阳性率统计结果图片。
107.图13是本技术实施例1、对比例5和对比例6制备的人脐静脉平滑肌细胞的细胞活力测定的结果图片。
108.图14是本技术实施例1、对比例5和对比例6制备的人脐静脉平滑肌细胞的细胞生长数量测定的结果图片。
109.图15是本技术实施例1、对比例5和对比例6制备的人脐静脉平滑肌细胞的连续传代次数测定的结果图片。
110.图16是对比例5中传代培养1次的人脐静脉平滑肌细胞的的形态图片(放大倍数＝40倍)。
111.图17是对比例5中传代培养10次的人脐静脉平滑肌细胞的的形态图片(放大倍数＝40倍)。
112.图18是实施例1中传代培养1次的人脐静脉平滑肌细胞的的形态图片(放大倍数＝40倍)。
113.图19是实施例1中传代培养20次的人脐静脉平滑肌细胞的的形态图片(放大倍数＝40倍)。
具体实施方式
114.本技术提供一种人脐静脉平滑肌细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
115.1.将无菌分离的脐带用36.5～37.5℃、含0.4％～0.6％肝素钠的d-hanks溶液冲洗脐静脉血管内外的凝血块，用脐带夹夹闭血管一端，用注射器从静脉另一端注入0.5～2.5mg/ml的ⅰ型胶原酶溶液至血管充盈，用脐带夹夹闭；使用d-hanks溶液浸没充盈后的脐带，将其转移至36.5～37.5℃的co2培养箱中，孵育28～35min；去掉脐带夹，用pbs溶液冲洗静脉1～5次。
116.2.纵向剪开血管腔，剪成体积为1～2mm3的组织块后，按3～5块/cm2的密度种植于t25培养瓶中。
117.3.将种植有组织块的瓶底向上，加入1.5～2ml含18％～22％(体积百分比)胎牛血清、0.8％～1.2％(体积百分比)青链霉素混合液、余量为dmem/f12基础培养基的完全培养液，在温度为36.5～37.5℃、湿度为95％～100％、co2浓度为4％～6％的co2培养箱中静置8～16h，缓慢翻转培养瓶，使组织块缓缓没入完全培养液中，培养，以后每3～5天半量换液1次。
118.4.待组织块周围爬出的细胞的融合度达到85％～90％，去除组织块，加入1～2ml tryple溶液，36.5～37.5℃消化1～2min，再加入等体积pbs溶液终止消化反应；轻轻将细胞吹打下来，收集至离心管中，850～1000rpm离心3～5min，弃上清，用5～10ml完全培养液重悬细胞，计数，根据细胞密度，按1:1或1:2接入培养瓶中，每2～3天换液1次，待细胞的融合度不低于90％，可再次传代。
119.5.将培养的细胞在显微镜下观察，并对培养后的细胞进行鉴定。
120.上述步骤中，使用的仪器信息如表1所示。
121.表1仪器信息
[0122][0123][0124]
本技术中，使用的试剂的信息如表2所示。
[0125]
表2实验试剂信息
[0126][0127]
本技术还提供了一种通过上述方法分离培养得到的人脐静脉平滑肌细胞，所述人脐静脉平滑肌细胞的纯度可达98％以上，存活率可达99.5％以上，可连续传代20次以上并维持基因型的稳定，因此可作为细胞模型应用于相关的研究中。
[0128]
上述人脐静脉平滑肌细胞命名为人脐静脉平滑肌细胞系huvsmc，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202270，保藏日期为2022年4月20日。
[0129]
以下结合附图1～19、实施例1～9和对比例1～6对本技术作进一步详细说明。
[0130]
实施例
[0131]
实施例1
[0132]
本实施例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，方法步骤如下：
[0133]
1.将无菌分离的脐带用37℃、含0.5％肝素钠的d-hanks溶液冲洗脐静脉血管内外的凝血块，用脐带夹夹闭血管一端，用注射器从静脉另一端注入1.5mg/ml的ⅰ型胶原酶溶液至血管充盈，用脐带夹夹闭；使用d-hanks溶液浸没充盈后的脐带，将其转移至37℃的co2养箱中，孵育30min；去掉脐带夹，用pbs溶液冲洗静脉3次。
[0134]
2.纵向剪开血管腔，剪成体积为1.5mm3的组织块后，按4块/cm2的密度种植于t25培养瓶中。
[0135]
3.将种植有组织块的瓶底向上，加入1.8ml含20％(体积百分比)胎牛血清、1％(体积百分比)青链霉素混合液、余量为dmem/f12基础培养基的完全培养液，在温度为37℃、湿度为98％、co2浓度为5％的co2培养箱中静置12h，缓慢翻转培养瓶，使组织块缓缓没入完全培养液中，培养，以后每3～5天半量换液1次。
[0136]
4.待组织块周围爬出的细胞的融合度达到85％～90％，去除组织块，加入1.5ml tryple
tm select溶液，37℃消化1～2min，再加入等体积pbs溶液终止消化反应；轻轻将细胞吹打下来，收集至离心管中，使用低速离心机在900rpm离心4min，弃上清，用8ml完全培养液重悬细胞，计数，根据细胞密度，按1:1或1:2接入培养瓶中，每2～3天换液1次，待细胞的融合度不低于90％，可再次传代。
[0137]
5.将培养的细胞在显微镜下观察。
[0138]
实施例2
[0139]
本实施例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本实施例在步骤3中，使用的dmem基础培养基替代dmem/f12基础培养基，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0140]
实施例3
[0141]
本实施例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本实施例在步骤3中，使用ham’s f-12基础培养基替代dmem/f12基础培养基，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0142]
实施例4
[0143]
本实施例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本实施例在步骤3中，完全培养液的加入量为5ml，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0144]
实施例5
[0145]
本实施例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本实施例在步骤3中，静置的时间为6h，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0146]
实施例6
[0147]
本实施例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本实施例在步骤3中，静置的时间为20h，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0148]
实施例7
[0149]
本实施例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本实施例在步骤4中，使用等体积质量分数为0.25％的胰酶进行消化，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0150]
实施例8
[0151]
本实施例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，方法步骤如下：
[0152]
1.将无菌分离的脐带用37℃、含0.5％肝素钠的d-hanks溶液冲洗脐静脉血管内外的凝血块，纵向剪开血管腔，剪成体积为1.5mm3的组织块；将组织块浸没在1.5mg/ml的ⅰ型胶原酶溶液中，将其转移至37℃的co2养箱中，孵育30min；用pbs溶液清洗组织块3次。
[0153]
2.将清洗后的组织块按4块/cm2的密度种植于t25培养瓶中。
[0154]
3～5.同实施例1。
[0155]
对比例1
[0156]
本对比例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本对比例在步骤2中，将血管剪成体积为5mm3的组织块，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0157]
对比例2
[0158]
本对比例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本对比例在步骤2中，将血管剪成体积为0.5mm3的组织块，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0159]
对比例3
[0160]
本对比例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本对比例在步骤2中，组织块的接种密度为1块/cm2，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0161]
对比例4
[0162]
本对比例从人脐静脉中分离培养获得人脐静脉平滑肌细胞，与实施例1的区别仅在于，本对比例在步骤2中，组织块的接种密度为7块/cm2，其余的操作及步骤与实施例1相同。
[0163]
对比例5
[0164]
本对比例提供一种市售人脐静脉平滑肌细胞，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，货号为cp-h084。
[0165]
对比例6
[0166]
本对比例提供一种市售人脐静脉平滑肌细胞，购自上海中乔新舟生物科技有限公司，货号为dfsc-ec-01。
[0167]
性能检测
[0168]
对实施例1～8和对比例1～6制备的人脐静脉平滑肌细胞进行鉴定与测试，具体包括形态观察、纯度鉴定、活力测定、生长数量测定和连续传代次数测定。
[0169]
细胞形态观察
[0170]
将细胞接种到培养皿中，定期在显微镜下观察细胞的形态。
[0171]
图1是本技术实施例1中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0172]
图2是本技术实施例1中传代培养1次的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0173]
图3为本技术实施例1中的人脐静脉平滑肌细胞在tryple
tm select溶液消化后重新贴壁的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0174]
图4为本技术实施例7中的人脐静脉平滑肌细胞在胰酶消化后重新贴壁的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0175]
图5是本技术实施例8中传代培养1次的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0176]
图6是本技术对比例1中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0177]
图7是本技术对比例2中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0178]
图8是本技术对比例3中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0179]
图9是本技术对比例4中原代培养的人脐静脉平滑肌细胞的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0180]
实施例1中的细胞原代分离培养3天后，可见从组织块爬出呈梭形、三角形或扇形的细胞，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状(参见图1)。传代后细胞生长较快，2～3天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点(参见图2)。
[0181]
与实施例1进行比较，实施例2中使用的dmem基础培养基替代dmem/f12基础培养基，实施例3中使用ham’s f-12基础培养基替代dmem/f12基础培养基，分离得到的脐静脉平滑肌细胞的形态与实施例1无明显的变化，但增殖的速度略微变慢，这说明使用dmem/f12基础培养基有助于提高细胞的生理状态，促进细胞的增殖与分裂。
[0182]
实施例4中添加的完全培养液体积偏多，静置及培养过程中培养液对组织块的冲击较多，从而使组织块容易脱落、不易贴壁，爬出的细胞数量也较少，但细胞形态相较于实施例1无明显变化；实施例5中静置的时间较短，组织块贴壁不紧，影响了后续细胞的爬出，导致爬出的细胞数量较少，但细胞形态也与实施例1无明显区别；实施例6中静置的时间较长，组织块表面干涸，组织块全部脱落，未获得脐静脉平滑肌细胞。
[0183]
此外，使用tryple溶液进行传代培养也有利于保持细胞的活力。实施例1中使用tryple溶液对细胞进行消化，消化处理后绝大多数细胞很快重新贴壁，细胞的形态未发生变化，生理状态也较好(参见图3)。与实施例1进行比较，实施例7中使用胰酶进行消化，消化处理后大部分细胞无法重新贴壁，细胞形态开始变圆，发生凋亡，表明细胞的状态较差，活力也较弱(参见图4)。上述结果说明使用tryple溶液进行消化对于维持人脐静脉平滑肌细胞的活力十分重要。
[0184]
另外，实施例8中采用先剪成组织块再使用ⅰ型胶原酶溶液消化的方式，细胞的形态较为多样(参见图5)。推测可能原因为内皮细胞未完全消化，导致获得的细胞为内皮细胞和脐静脉平滑肌细胞的混合物。此外，先剪成小块再进行接种，接种的过程中也较难区分脐静脉血管的内壁和外壁。上述因素均会导致获得的脐静脉平滑肌细胞的纯度较低。
[0185]
与实施例1进行比较，对比例1中组织块的体积较大，细胞的爬出数量较少，较难达到传代对应的细胞融合度并进行后续的传代培养(参见图6)；对比例2中组织块的体积较小，可见组织块已经脱落，爬出细胞呈层叠状，不易进行传代培养，对细胞的活力也有一定
的影响，细胞的形态也发生了一定的变化(参见图7)；对比例3中组织块的接种的密度较小，爬出的细胞数目较少，且细胞之间也无法进行信息及物质交流，对细胞的活力影响较大(参见图8)；对比例4中组织块的接种密度较大，细胞聚集在一起，形成肉眼可见的“细胞团”，且细胞在培养瓶中的分布也不够均匀，细胞的形态也发生了一定的变化，对后续传代培养的操作也造成了一定的影响(参见图9)。上述结果表明，组织块的大小以及接种的密度对于获得的人脐静脉平滑肌细胞的数量、形态及活力均有一定的影响。
[0186]
对比例5和对比例6均为市售的商品化产品，传代培养后细胞的生理状态良好，细胞形态均一，增殖速度较快。
[0187]
细胞纯度鉴定
[0188]
取对数生长期的细胞，将其接种至预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞长成单层后取出盖玻片，使用pbs清洗2次。
[0189]
使用4％组织细胞固定液固定20min，再用pbs洗涤3次。triton x-100室温通透5～10min，再用pbs洗涤3次，每次5min。
[0190]
使用1％bsa室温封闭细胞30～60min。
[0191]
一抗使用anti-α-sma antibody和anti-colponin1 antibody，稀释比分别为1:200和1:100，4℃孵育过夜，pbs漂洗3次，每次5min。二抗分别使用1μg/ml goat anti-rabbit igg(h l)highly cross-adsorbed secondary antibody,alexa fluor
tm 546和goat anti-rabbit igg(h l)highly cross-adsorbed secondary antibody,alexa fluor
tm plus488，室温避光孵育1h，pbs漂洗3次，每次5min。最后用蒸馏水再漂洗1次，用含dapi的抗荧光衰减封片剂封片，荧光倒置显微镜下观察并拍照，用image pro plus计算阳性率。
[0192]
实施例1～8以及对比例1～6中的脐静脉平滑肌细胞的纯度统计结果如表3所示。
[0193]
表3纯度统计结果
[0194]
组别纯度(％)实施例198实施例297实施例398实施例497实施例596实施例60实施例795实施例875对比例196对比例296对比例396对比例495对比例593对比例692
[0195]
由表3可以看出，实施例1～5、实施例7、对比例1～4制备得到的人脐静脉平滑肌细
胞的纯度均较高，均在95％以上，说明采用先使用ⅰ型胶原酶溶液进行消化、再剪成组织块接种的方式可以在极大程度上保证获得的人脐静脉平滑肌细胞的纯度，为保证相关研究结果的准确性创造了条件。
[0196]
其中，实施例1制备的脐静脉平滑肌细胞使用α-sma和colponin1进行免疫荧光染色鉴定并进行阳性率统计后，结果如图10、图11和图12所示。
[0197]
图10是本技术实施例1制备的人脐静脉平滑肌细胞的α-sma染色结果图片(放大倍数＝20倍)。图11是本技术实施例1制备的的人脐静脉平滑肌细胞的colponin1染色结果图片(放大倍数＝20倍)。图12是本技术实施例1制备的的人脐静脉平滑肌细胞的α-sma和colponin1染色的阳性率统计结果图片。
[0198]
由图10～图12可以看出，实施例1制备的脐静脉平滑肌细胞的α-sma阳性率＞99％，colponin1阳性率＞98％，说明细胞纯度至少可达到98％以上。
[0199]
与实施例1～5、实施例7、对比例1～4进行对比，实施例6中因静置时间过长，组织块干涸萎缩，未获得相应的细胞因此无法进行纯度的鉴定。实施例8中采用先剪成组织块再使用ⅰ型胶原酶溶液消化的方式，会因内皮细胞未完全消化、以及无法区分脐静脉血管的内壁和外壁，从而导致获得的细胞为多种细胞的混合物，因此细胞纯度较低，仅为75％。
[0200]
对比例5和对比例6均为市售的商品化产品，采用上述方法进行纯度鉴定后，细胞纯度分别为93％和92％，说明相比于市售产品，采用本技术技术方案获得的人脐静脉平滑肌细胞的纯度更高。
[0201]
细胞活力测定
[0202]
取对数生长期的细胞，用pi染色5min后，取20μl细胞滴到细胞计数板上，于荧光细胞分析仪上计数活细胞率。重复3次计算平均值。
[0203]
实施例1～8以及对比例1～6中的脐静脉平滑肌细胞的活细胞率的统计结果如表4所示。
[0204]
表4活细胞率统计结果
[0205]
组别活细胞率(％)实施例199.5实施例289.2实施例385.3实施例499.5实施例599.0实施例60实施例780.3实施例899.5对比例182.5对比例283.4对比例378.2对比例480.6对比例598.5对比例698.7
[0206]
由表4可以看出，实施例1、实施例4～5和实施例8获得的人脐静脉平滑肌细胞的活力极高，均在99.0％以上，甚至可以高达99.5％。其中，实施例4中完全培养液的添加量偏多，组织块容易脱落，实施例5中静置的时间较短，组织块贴壁不牢，虽然采用这两种方法制备得到的人脐静脉平滑肌细胞的数量较少，但细胞的生理状态良好，活力极高。实施例8制备得到的细胞虽然纯度较低，但依然具有良好的活力。
[0207]
与实施例1、实施例4～5和实施例8进行比较，实施例2和实施例3中更换了基础培养基，对细胞的活力产生了一定的影响，说明选择合适的培养基对于保持获得的人脐静脉平滑肌细胞的生理状态十分重要。实施例6未获得脐静脉平滑肌细胞，因此无法进行细胞活力的测定。实施例7中使用胰酶进行消化，对细胞的损伤较大，细胞活力下降明显。
[0208]
对比例1中组织块的体积较大，不利于细胞的爬出及生长；对比例2中组织块的体积较小，细胞层叠生长，生理状态较差；对比例3中组织块的接种密度较小，不利于细胞之间的物质及信息交流；对比例4中组织块的接种密度较大，细胞生长空间较小，从而影响了细胞的正常生长。上述因素对细胞的活力均产生了一定的影响，说明只有将组织块的大小控制在合适的范围内，配合适宜的接种密度，才可以改善细胞的生理状态，提高细胞活力。
[0209]
对比例5和对比例6均为市售的商品化产品，其细胞活力略低于实施例1，说明采用本技术中的分离培养方法获得的脐静脉平滑肌细胞的生理状态优于市面上的其他产品。
[0210]
此外，将实施例1、对比例5和对比例6的人脐静脉平滑肌细胞进行细胞活力的比对，结果如图13所示。
[0211]
图13是本技术实施例1、对比例5和对比例6的人脐静脉平滑肌细胞的细胞活力测定的结果图片。
[0212]
由图13可以看出，在相同的处理条件下，实施例1制备的人脐静脉平滑肌细胞具有更高的细胞活力，平均活率可达99.5％以上，与其他两组细胞比较，p＜0.05，差异具有统计学意义。
[0213]
细胞生长数量测定
[0214]
取对数生长期的细胞，调整细胞密度为1
×
105/ml，将细胞接种至96孔板，每孔100μl，每组设置8个复孔。待细胞贴壁后，于第72h，使用cck8试剂盒进行cck8实验，使用酶标仪测量od
450nm
值。根据细胞生长曲线，计算出不同时间点的细胞生长数量。
[0215]
实施例1～8以及对比例1～6中的脐静脉平滑肌细胞的细胞生长数量的测定结果如表5所示。
[0216]
表5细胞生长数量测定结果
[0217][0218]
由表5可以看出，实施例1中分离得到的人脐静脉平滑肌细胞的数量最多，培养72h时可达2.9
×
105个/孔；实施例4中完全培养液的添加量偏多，组织块容易脱落，实施例5中静置的时间较短，组织块贴壁不牢，虽然最初获得的细胞数量较少，原料的利用不够充分，造成了原料的浪费，但细胞的增殖效率并未受到影响，当控制接种细胞的初始数量相同时，培养相同时间所获得的细胞的总数也无明显的差异；实施例8中采用先剪成组织块再使用ⅰ型胶原酶溶液消化的方式，对细胞的增殖速率也没有明显的影响。
[0219]
与实施例1、实施例4～5以及实施例8进行比较，实施例2和实施例3使用dmem/f12或ham’s f12基础培养基，会对细胞生长速率造成显著影响，细胞数量明显下降；实施例6中因静置时间过长，组织块会干涸萎缩，细胞无法生长，未获得相应的细胞因此无法进行细胞生长数量的鉴定；实施例7中使用胰酶对细胞进行消化，对细胞的伤害较大，对细胞生长速率造成显著影响，生长速率明显降低。
[0220]
比较对比例1～4的结果，可以看出，当组织块的体积较大(对比例1)或较小(对比例2)，接种密度较小(对比例3)或较大(对比例4)，均会影响细胞之间或细胞与培养环境之间的物质及信息交流，从而影响细胞的生理状态，获得的人脐静脉平滑肌细胞的增殖速率较慢。说明组织块的大小以及种植密度是细胞维持活力及增殖速率的重要影响因素。
[0221]
对比例5和对比例6均为市售的商品化产品，根据测试的结果，可以看出其增殖速率均略低于实施例1，说明采用本技术中的方法获得的脐静脉平滑肌细胞具有更快的增殖
速率。
[0222]
此外，还对实施例1、对比例5和对比例6的人脐静脉平滑肌细胞在第0、12、24、36、48、60和72h的生长数量进行对比，结果如图14所示。
[0223]
图14是本技术实施例1、对比例5和对比例6的人脐静脉平滑肌细胞的细胞生长数量测定的结果图片。
[0224]
由图14可以看出，在相同的处理条件下，实施例1制备的人脐静脉平滑肌细胞生长至相同的细胞数量，需要的时间更短；在相同的培养时间内细胞数量更多，约为其他两种细胞的1.5倍，且与其他两组细胞生长速度比较，p＜0.05，差异具有统计学意义。
[0225]
细胞连续传代次数测定
[0226]
依次将细胞连续传代培养，并进行str检测分析，观察细胞的最大可传代次。
[0227]
所有实验数据用统计学软件spss24.0进行统计分析，组间比较用f检验，α＝0.05，p＜0.05为差异有统计学意义。
[0228]
实施例1～8以及对比例1～6中的脐静脉平滑肌细胞的细胞连续传代次数的测定结果如表6所示。
[0229]
表6细胞连续传代次数测定结果
[0230][0231][0232]
由表6可以看出，实施例1制备的人脐静脉平滑肌细胞的生理状态较好，传代次数多，可达23次；实施例4中完全培养液的添加量偏多，实施例5中静置的时间较短，虽然均会因组织块贴壁不牢而导致最初获得的细胞数量较少，但对细胞的生理状态并无明显的影
响，细胞的传代次数也未受到明显影响。
[0233]
与实施例1、实施例4～5进行比较，可以看出，使用dmem/f12基础培养基(实施例2)或ham’s f12基础培养基(实施例3)，也会影响细胞的代谢水平，进而对细胞生长代数造成影响；实施例6中静置了20h，组织块干涸萎缩，细胞无法生长，也无法进行传代培养；实施例7中使用胰酶进行消化，对细胞的代谢水平造成明显影响，生长代数明显降低；实施例8中采用先剪成组织块再使用ⅰ型胶原酶溶液消化的方式，虽然之前的细胞活力以及增殖能力测定的结果显示相较于实施例1均无明显的变化，但其可以传代的次数明显减少，仅为15次，推测可能原因为获得的细胞纯度较低，混有其他类型的细胞，细胞之间的相互作用导致传代次数降低。
[0234]
对比例1中组织块的体积较大，对比例2中组织块的体积较小，对比例3中组织块的接种密度较小，对比例4中组织块的接种密度较大，细胞的生理状态均较差，传代次数也十分有限，这说明组织块的大小以及接种的密度对于细胞生理状态的影响十分明显，只有控制在合适的范围内，才可以提高细胞活力，增加传代次数。
[0235]
对比例5和对比例6均为市售的商品化产品，传代次数也略低于实施例1，仅为15次和18次，说明采用本技术中的方法分离培养的人脐静脉平滑肌细胞比从其他公司采购的细胞传代次数更多。
[0236]
将实施例1、对比例5和对比例6的人脐静脉平滑肌细胞的连续传代次数进行对比，结果如图15所示。
[0237]
图15是本技术实施例1、对比例5和对比例6的人脐静脉平滑肌细胞的连续传代次数测定的结果图片。
[0238]
由图15可以看出，实施例1培养出的人脐静脉平滑肌细胞可传代至23代，保持基因型不变，而对比例5和对比例6的细胞分别传代至15代和18代时，细胞开始出现老化、增殖缓慢等现象，难以继续传代。
[0239]
图16是对比例5中传代培养1次的人脐静脉平滑肌细胞的的形态图片(放大倍数＝40倍)。图17是对比例5中传代培养10次的人脐静脉平滑肌细胞的的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0240]
图18是实施例1中传代培养1次的人脐静脉平滑肌细胞的的形态图片(放大倍数＝40倍)。图19是实施例1中传代培养20次的人脐静脉平滑肌细胞的的形态图片(放大倍数＝40倍)。
[0241]
对比图16和图17，可以看出对比例5中人脐静脉平滑肌细胞在传代培养10次后，细胞的形态发生了明显的变化，表明细胞发生了衰老及凋亡，活力变弱；与此进行对比，实施例1制备得到的人脐静脉平滑肌细胞在传代20次后的形态仍未发生明显的变化(对比图18和图19)，证明细胞的生理状态良好，可继续进行分裂及增殖。另外，经过str检测，对比例5中人脐静脉平滑肌细胞传代至10代后，大部分细胞已出现基因突变，而实施例1中的细胞在传代20次后的突变仍较少，因此，实施例1分离培养出的细胞更适用于大规模的传代培养。
[0242]
实施例9
[0243]
本实施例对实施例1分离培养获得的人脐静脉平滑肌细胞进行保藏，命名为人脐静脉平滑肌细胞系huvsmc，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编为430072，保藏编号为cctcc no：c202270，保藏日期为2022年4月20日。
[0244]
本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。