五味子药材的质量双标可视化质量控制技术

1.本发明属于中药质量控制技术领域，具体涉及以五味子对照药材为基准物质，建立一套不依赖于对照品，较为全面控制药材质量的方法，该方法稳定性、精密度良好，可以弥补目前五味子药材质量控制的不足，能够为五味子药材质量提升提供新思路。


背景技术：

2.五味子药材为木兰科植物五味子schisandra chinen-sis (turcz.) baill的干燥成熟果实，主产于东北三省。曾有南五味子在市场中出现鉴别混乱以及临床用药混乱的现象，在质量评价以及质量控制方面存在一定的混淆，影响中药五味子的临床合理使用。
3.随着现代中药分析手段的进步，五味子药材质量控制方法主要包括单指标含量测定法、多指标含量测定法和指纹图谱与含量测定结合法，以上方法具有灵敏度高、重复性好的优点，能够为控制五味子药材提供量化数据，但存在着单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供一种五味子药材质-量双标控制方法。以五味子对照药材为定性、定量的基准物质，采用高效液相色谱结合q-tof-ms技术，建立一套不依赖于对照品，较为全面科学地控制药材质量的方法。
5.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
6.本发明提供了一种五味子药材质量控制标准的建立方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1 基于对照药材的五味子药材定性研究；步骤2 基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究；步骤3 方法学考察。
7.进一步地，所述步骤1的具体步骤包括：（1）溶液的制备：取五味子对照药材及供试药材粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50倍量的70%甲醇，称定重量，超声（功率250 w，频率20 k hz）处理15 min，放冷，补足失重，摇匀，滤过；续滤液挥干，70%甲醇定容，摇匀，过0.22 μl滤膜，即得；（2）色谱条件与系统适用性试验：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的agilent poroshell 120 sb-c18色谱柱，色谱柱规格为4.6
×
100mm，2.7-micron；以水为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱；流速0.6 ml/min；柱温30℃；dad检测器在波长230 nm下进行检测；进样量5 μl；（3）特征图谱的建立：每份样品平行2次，按色谱条件依次进样检测，将230 nm波长下的图谱数据由分析检测仪器中导出获得10批供试药材的hplc叠加图谱；10批供试药材使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对；
（4）相似度评价：以特征峰的相似度明确五味子药材真伪。供试药材与对照药材的相似度均大于0.97；（5）特征峰化学成分解析：采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，共鉴定出10个化学成分；（6）中药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制方法程序：利用visual basic编程语言设计包含1个oel控件和4个command控件的适用于五味子药材（饮片）可视化的质-量双标质量控制程序。
8.更进一步地，所述（5）中鉴定出10个化学成分分别为：3号峰为原儿茶酸，5号峰为五味子醇甲，8号峰为五味子醇乙，9号峰为肉豆蔻酸，11号峰为五味子酯甲，12号峰为五味子酯乙，13号峰为五味子酯丙，14号峰为五味子甲素，18号峰为五味子乙素，19号峰为五味子丙素。
9.进一步地，所述步骤2的具体步骤包括：以步骤1中确定的14号峰“五味子甲素”作为内标物质，通过内标物质化学成分准确定量，计算10批供试药材特征峰化学成分的相对含量；取“中位数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限。
10.进一步地，所述步骤2的特征峰均为五味子发挥其功效及药理作用的特征活性化学成分。
11.进一步地，所述步骤3的具体步骤包括：（1）精密度实验：精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.58%，表明仪器精密度良好；（2）稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.49 %，表明供试品溶液在24 h内稳定；（3）重复性实验：按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差；各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.69 %，表明方法重复性良好；（4）线性关系考察：配制“五味子甲素”的6个质量浓度溶液，按“2.1.2”项下色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y=2465.2x-2.4903）、相关系数（r=0.999 7）。结果表明“五味子甲素”在0.3350 ～4.1875 μg范围内线性关系良好。
12.进一步地，所述方法通过五味子药材特征图谱中的特征峰作为五味子药材的定性标准，能够明确鉴定药材的真伪。
13.进一步地，所述方法通过建立的特征峰相对含量的计算方法确定的各特征峰相对含量的下限，能够区分五味子的优劣。
14.进一步地，所述方法通过visual basic编程语言设计的可视化的质-量双标质量控制程序适用于五味子药材（饮片）。
15.与现有技术相比本发明的有益效果。
16.（1）本发明首次公开五味子药材质-量双标控制方法，可以弥补目前五味子药材质量控制方法中单一指标不能反映药材整体特征、多指标含量测定依赖于多种对照品且某些指标成分不能反映药效、指纹图谱只能模糊地评价药材相似性不能清晰地判断供试品真伪优劣的不足。
17.（2）本发明采用现代分析检测技术指认出10个化学成分，其中有8种均为木脂素类成分。五味子醇甲、五味子醇乙可增强小鼠肝细胞抵抗ccl4毒性的能力，从而对肝脏起到保护作用；五味子酯甲和五味子酯乙对缺氧复氧心肌细胞具有保护作用，同时通过调节nrf2/are抗氧化通路能够改善小鼠的疲劳作用；五味子酯丙通过抑制a549人肺癌细胞的g0/g1细胞周期，发挥明显的抗增殖作用；五味子甲素对逆转录酶活性有一定的抑制作用；五味子乙素作为一种强效的抗自由基活性剂，有助于提高大鼠皮肤的谷胱甘肽；五味子丙素在研究中具有显著的抗炎、抗病毒作用。上述化学成分与五味子的保肝养心功效相关，从而全面科学地反映中药五味子的内在质量。
附图说明
18.图1是10批五味子供试药材的叠加图谱。
19.图2是对照药材特征图谱及供试药材共有模式。
20.图3是辽宁抚顺五味子样品质-量双标质量控制方法可视化结果。
具体实施方式
21.以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
22.实施例1。
23.五味子对照药材（批号：120922-201610，中国药品生物制品检定所）。五味子药材供试品（辽宁抚顺、长白山、黑龙江伊春、吉林白山、辽宁恒仁、吉林延吉、吉林北大湖镇、黑龙江小兴安岭、辽宁丹东、辽宁凤城）经经辽宁中医药大学许亮教授鉴定，均为木兰科植物五味子schisandra chinensis(turcz.)baill.的干燥成熟果实。根据2020版《中华人民共和国药典》“含量测定”项下方法检测，10批产地供试品均符合药典规定（含五味子醇甲不得少于0.4%）。
24.1.基于对照药材的五味子药材定性研究。
25.1.1溶液的制备。
26.取对照药材粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 ml，称定重量，超声（功率250 w，频率20 k hz）处理15 min，放冷，补足失重，摇匀，滤过，续滤液挥干，70%甲醇定容至5 ml容量瓶，摇匀，过0.22 μm滤膜，作为参照物溶液；取供试药材粉末（过4号筛）0.5 g，按上述方法制成供试品溶液。
27.1.2色谱条件。
28.色谱柱：agilent poroshell 120 sb-c
18
色谱柱（4.6 mm
×
100 mm，2.7-micron）；流动相：水（a）-乙腈（b），进行梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～3 min，5%
ꢀ→
23% b；3～5 min，23%
ꢀ→
50%b；5～17 min，50%
ꢀ→
60% b；17～22 min，60%
ꢀ→
65% b；22～25 min，65%
ꢀ→
95% b；25～30 min，95%
ꢀ→
100% b；流速：0.6 ml/min；柱温：30℃；dad检测器波长：230 nm；进样
量：5 μl。
29.1.3 特征图谱的建立。
30.将参照物溶液和供试品溶液，每份样品平行2次，按色谱条件依次进样检测，将230 nm波长下的图谱数据由分析检测仪器中导出。10批供试药材的hplc叠加图谱，见图1；10批供试药材使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成共有模式r，与对照药材特征图谱进行比对，见图2。
31.1.4 相似度评价。
32.供试药材与对照药材的相似度均大于0.97。
33.1.5 特征峰化学成分解析。
34.采用q-tof-ms技术，通过分析化合物的保留时间、一级离子质荷比以及二级离子碎片信息，并与相关文献报道信息进行匹配，共鉴定出10个特征峰。
35.本发明所述的五味子药材质量控制方法，得到的五味子药材特征图谱可以用于判断五味子药材的真伪。
36.2.基于内标物质的特征峰化学成分相对定量研究。
37.14号峰“五味子甲素”分离效果好、峰面积和保留时间稳定居中，故以其作为内标物质，开展基于内标物质的特征峰相对定量研究。根据2020版《中华人民共和国药典》五味子“含量测定”项下方法检测，10批产地供试品中，所有供试品均符合药典规定。通过内标物质化学成分准确定量，计算10批供试药材特征峰化学成分的相对含量。取“中位数-标准差”作为特征峰化学成分相对于内标物质化学成分的相对含量下限，见表1。
38.表1 基于内标物质的特征峰相对定量结果。3.方法学考察。
39.3.1 精密度试验。
40.精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件测定，连续进样6次，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.58%，表明仪器精密度良好。
41.3.2 稳定性试验。
42.精密吸取同一供试品溶液，按色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样6次检测，测定各色谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于2.49 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。
43.3.3 重复性实验。
44.按供试品溶液制备方法制备6份供试样品，按色谱条件，分别进样检测，测定各色
谱峰相对保留时间、相对峰面积，计算相对标准偏差。各色谱峰相对保留时间、相对峰面积rsd值均小于1.69 %，表明方法重复性良好。
45.3.4 线性关系考察。
46.配制“五味子甲素”的6个质量浓度溶液，按“2.1.2”项下色谱条件，分别进样检测，以质量（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到线性回归方程（y=2465.2x-2.4903）、相关系数（r=0.999 7）。结果表明“五味子甲素”在0.3350 ～4.1875 μg范围内线性关系良好。
47.实施例2辽宁抚顺五味子供试品的鉴别。
48.辽宁抚顺五味子样品与对照药材的相似度为0.976。通过本发明所设计的中药材（饮片）可视化的“质-量”双标质量控制方法程序（01版），可以直观的判定辽宁抚顺五味子样品为“真”，质量为“中”，见图3。