Raffaelealauricola次级代谢产物的制备方法及其应用

raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于从菌株分离活性物质的技术领域，具体涉及raffaelea lauricola次级代谢产物（藿烷型三萜类化合物a'-neogammacer-21-en-15α-ol）的制备方法及其抑制人乳腺癌细胞株mcf-7的新用途。


背景技术：

2.raffaelea lauricola是食菌小蠹（ambrosia beetle）携带的高致病性伴生真菌，是导致树木枯萎病的病原真菌，学者们长期致力于研究其致病机理，伴随着研究的持续深入，已在该属其他物种中获得一些抑制植物生长、抗菌等活性物质。这预示该菌在生物农药或医药上潜在极大应用价值。
3.a'-neogammacer-21-en-15α-ol是藿烷型三萜类物质，而藿烷型三萜类物质多具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等活性。可以修饰a'-neogammacer-21-en-15α-ol的化学结构进而生成各种新的活性物质。到目前为止，尚未发现在raffaelea lauricola中分离到a'-neogammacer-21-en-15α-ol的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种raffaelea lauricola次级代谢产物及其抑制人乳腺癌细胞株mcf-7的新用途，所述代谢产物为：藿烷型三萜类化合物a'-neogammacer-21-en-15α-ol。
5.所述raffaelea lauricola次级代谢产物的制备方法，采取的技术方案如下：1)将raffaelea lauricola活化后，取菌块接种到pdb培养基中，在，在140～180 r/min、20~28℃条件下连续培养5~10天，按15wt%~20wt%接种量转接到改良的大米培养基中，继续在20～28℃条件下静置培养28～40天，得到菌丝体。
6.2）将步骤1）得到的菌丝体在室温下干燥后研磨粉碎，用1~2倍体积的乙酸乙酯浸泡12~24小时，超声40~60分钟，收集萃取液，残渣中再加入菌丝体1~2倍体积的乙酸乙酯，超声40~60分钟，收集萃取液，重复以上步骤，共得到三份萃取液合并浓缩得到粗提物浸膏。
7.3）将浸膏用氯仿或二氯甲烷溶解，然后用反相硅胶c
18
进行拌样，干法装柱，以甲醇：水体积比1:9-9:1梯度洗脱，收集甲醇：水体积比为9:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得组分a。
8.4）用1倍体积的氯仿溶解组分a，过200-300 目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1 开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱，收集石油醚:氯仿体积比4:1部分洗脱液，再过200-300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状a'-neogammacer-21-en-15α-ol，其结构式如下所示：
。
9.进一步地，所述步骤1）中改良的大米培养基的组成为：大米100 g,木屑10 g，加入纯水120 ml，121℃高压灭菌20 min。
10.进一步地，所述步骤1）中接种菌块的大小为0.5
×
0.5 cm，接种量为4块。
11.进一步地，所述步骤2）中超声的功率为400 w，频率为35 khz。
12.进一步地，所述步骤3）中使用的反相硅胶c
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粒径40-60 μm，孔径120
ꢀå
。
13.进一步地，所述步骤4）中梯度洗脱中石油醚：乙酸乙酯体积比依次为30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 5:1；石油醚：氯仿体积比依次为8:1, 6:1, 4:1。
14.本发明的显著优点：本发明分离纯化简单，成本低，易操作；制得的化合物纯度高，且重复性好。
附图说明
15.图1为a'-neogammacer-21-en-15α-ol的1h nmr谱（cdcl3）；图2为a'-neogammacer-21-en-15α-ol的
13
c nmr谱（cdcl3）；图3为a'-neogammacer-21-en-15α-ol的dept135谱（cdcl3）；图4为a'-neogammacer-21-en-15α-ol的cosy谱（cdcl3）；图5为a'-neogammacer-21-en-15α-olhmbc谱（cdcl3）；图6为a'-neogammacer-21-en-15α-ol的hsqc谱（cdcl3）。
具体实施方式
16.为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
17.本发明所使用的raffaelea lauricola菌株编号为hulcr7161。
18.实施例1活性次级代谢产物a'-neogammacer-21-en-15α-ol的分离1)取raffaelea lauricola（本实验室保存菌株）为材料，无菌条件下挑取大小为0.5
×
0.5 cm的菌块4 块接种到pdb培养基（马铃薯葡萄糖粉3.9 g,纯水100ml,装入250 ml 锥形瓶，在121℃高压下灭菌20min）中，在160 r/min、25℃条件下连续培养7天即初级培养，按10wt%接种量转接到改良的大米培养基（大米100 g,木屑10 g,加入纯水120 ml，121℃高压灭菌，20 min）中，继续在25℃条件下静置培养35天即次级培养。
19.2)收集培养35天菌丝体在室温下干燥之后研磨粉碎，加1倍体积的乙酸乙酯浸泡12小时，超声40分钟，过滤得萃取液，残渣中再加入菌丝体1倍体积的乙酸乙酯，超声40分钟，收集萃取液，再次重复上述步骤，共得到三份萃取液合并浓缩旋蒸得到粗提物浸膏。
20.3)将浸膏溶解于氯仿，使用40-60 μm粒径反相c
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硅胶拌样，干法装柱，以甲醇：水自1:9体积比开始梯度洗脱（甲醇：水体积比为1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1），收集甲醇：水体积比为9:1部分旋蒸得粗品。
21.4)用1倍体积的氯仿溶解粗品，上200-300目硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯体积比为30:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为30:1, 20:1, 10:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比10:1部分洗脱液，旋蒸浓缩得浸膏，再过200-300目硅胶柱，以石油醚：氯仿体积比为8:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为8:1, 6:1, 4:1），收集石油醚:氯仿体积比为4:1部分洗脱液，再过200-300目硅胶柱层析，以石油醚：乙酸乙酯体积比为20:1开始梯度洗脱（梯度洗脱比例为20:1, 10:1, 8:1, 5:1），收集石油醚：乙酸乙酯体积比为5:1部分洗脱液，旋蒸得到白色粉末状藿烷型三萜类化合物a'-neogammacer-21-en-15α-ol。
22.经计算其提取率为1.320%（提取率%=重量/菌丝体浸膏总量
×
100%）。
23.实施例2 a'-neogammacer-21-en-15α-ol对人乳腺癌细胞株mcf-7的抑制作用1）采用mtt法测定化合物的抗肿瘤活性，即mcf-7细胞使用rpmi1640培养基均在饱和湿度培养箱培养，条件设置为37℃、5% co2。上述2种培养基中均已添加10%的胎牛血清、青霉素(1
×
10
5 iu/l)和链霉素(100 mg/l)，培养至对数生长期后可用于实验。
24.2) 于96孔板中每孔180 μl含5
×
103个细胞，根据二倍稀释法设置待测化合物浓度（200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 μm）以dmso稀释，阳性对照为顺铂(cisplatin)，阴性对照为dmso溶液，在37℃培养箱内培养48 h，每孔加入20 μl的mtt溶液，再培养4 h，吸去孔内液体，加入dmso震荡充分溶解甲瓒，在570 nm波长下测定吸光值（a）。
25.3) 按公式计算细胞生长抑制率：抑制率（%）=[(a对照
–
a实验)/(a对照-a空白)]
×
100%。结果见表1。
[0026]
表1目标活性物对人乳腺癌细胞的抑制活性 通过graphpad prism 8软件计算，得出目标活性化合物ic
50
＝55.38 μg/ml，ic
50
即抑制率达到50％时的药物浓度，说明活性代谢产物a'-neogammacer-21-en-15α-ol浓度达到55.38 μg/ml时对人乳腺癌细胞株的生长抑制率为50%。
[0027]
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。