一种离体培养心肌细胞的解离液及解离方法与流程

1.本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，更具体地，涉及一种用于消化离体培养心肌细胞的解离液及解离方法。


背景技术：

2.心肌细胞又称心肌纤维，属于有横纹的不随意肌，具有兴奋收缩能力，各心肌纤维分支的末端可相互连接构成肌纤维网。目前心肌细胞模型在心脏疾病、心脏发育、药物研发、药效评测、药毒测试和细胞治疗的基础研究和临床前研究等方面应用广泛。
3.现有消化心肌细胞技术中提供了多种消化途径，不同的消化途径/消化的难易程度、细胞数量和细胞活率都有不同的呈现，最大的问题是不能达到一个较高的水平，即维持较高的细胞得率和细胞活率。
4.因此，探索一种高效解离且高细胞得率、高细胞活率的解离液及解离方法至关重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种能够用于有效地消化离体培养心肌细胞的技术方案，包括解离液及解离方法，该解离液化学成分明确、无动物源性成分、批次稳定。通过采用本发明的技术方案，可以较为容易地获得高得率、高活率的心肌细胞，获得的细胞可用于后续的重新贴附培养实验或者指标检测实验。
6.为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明首先提供了一种离体培养心肌细胞的解离液，所述解离液包括tryple、dispase ii、胰蛋白酶、dnaseⅰ和blebbistatin。
8.本发明的解离液与传统的心肌细胞解离液不同，主要针对离体培养心肌细胞的消化。所述离体培养心肌细胞的来源既包括多能干细胞衍生的心肌细胞，又包括原代心肌细胞重铺培养的细胞；既包括人源，也包括鼠源。而传统的心肌细胞解离液大多消化解离心脏组织，以此来获得心肌细胞。
9.此外，本发明获得的解离后的心肌细胞仍可用于后续的重新贴附培养实验或者指标检测实验。其中，进行重新贴附实验再培养后，细胞正常贴附，肉眼观察漂浮的未贴附的死细胞较少，且贴附的心肌细胞在贴附后24-36小时即可恢复跳动，且跳动的频率和范围与解离前无异。可见，本发明获得的细胞更适合作为心肌细胞模型用于基础研究和临床前研究等。
10.在本发明的解离液中，tryple、dispase ii、胰蛋白酶和dnaseⅰ作为混合消化液，起到消化解离的作用。而blebbistatin作为消化过程中的保护剂，主要是抑制心肌细胞收缩，短暂处理可起到保护细胞作用，提高消化后的细胞活率。
11.进一步的，上述解离液中，所述dispase ii在所述解离液中的浓度为0.2-0.6u/ml；优选地，浓度为0.5u/ml。
12.上述解离液中，所述胰蛋白酶在所述解离液中的浓度为0.04-0.06％的胰蛋白酶；优选地，浓度为0.05％的胰蛋白酶。
13.上述解离液中，所述dnaseⅰ在所述解离液中的浓度为50-60u/ml；优选地，浓度为50u/ml。
14.上述解离液中，所述blebbistatin在所述解离液中的浓度为20-30μmol/l；优选地，浓度为25μmol/l。
15.上述解离液中，所述解离液的余量为tryple；优选的，所述tryple为tryple
tm express酶，无酚红。
16.本发明进一步提供了一种离体培养心肌细胞的解离方法，该方法包括：向离体培养心肌细胞中加入一定体积的解离液，解离一定的时间，显微镜下观察到80％以上的细胞处于相互分离的程度，然后加入中和液中和，收集细胞，再离心，弃上清，最后加入一定量的心肌细胞培养基，混匀。
17.在上述解离方法中，所述离体培养心肌细胞为稳定跳动的心肌细胞，其来源包括多能干细胞衍生的心肌细胞或原代心肌细胞重铺培养的细胞。
18.进一步的，加入解离液的体积为40-60μl/cm2。
19.进一步的，解离的条件和时间为co2培养箱，37℃孵育5-8分钟。
20.进一步的，所述中和液为10％的血清。
21.上述解离方法，最终解离效果的评判标准为洗脱细胞的难易程度，以及细胞得率和细胞活率。
22.本发明的有益效果如下：
23.本发明的解离液化学成分明确、无动物源性成分、批次稳定。使用本发明的解离液以及解离方法可快速高效的获得活率高于85％以上的离体培养的心肌细胞且获得较多数量的心肌活细胞。
附图说明
24.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
25.图1为实施例1-3及对比例1-3的活细胞数对比情况。
26.图2为实施例1-3及对比例1-3的活率对比情况。
具体实施方式
27.为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
28.下述实施例中的材料，如无特殊说明，均为本领域常用材料，均可从商业途径得到。
29.本发明的实施例中所使用的仪器、试剂、细胞来源如下：
30.自动细胞计数分析仪，countstar；
31.aopi活性检测荧光染料，countstar；
32.tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)；
33.dispase ii，(thermo fisher scientific)；
34.trypsin(胰蛋白酶，0.25％，含edta)，(transgen)；
35.dnaseⅰ，(transgen)；
36.(-)-blebbistatin，(selleck)；
37.多能干细胞衍生的心肌细胞，(wicell)；
38.心肌细胞培养基，(stem cell)。
39.实施例1
40.一种离体培养心肌细胞的解离液，所述解离液由tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)、dispase ii、trypsin、dnaseⅰ和(-)-blebbistatin组成；
41.其中，在解离液中，dispase ii终浓度为0.2u/ml，trypsin终浓度为0.04％的trypsin，dnaseⅰ终浓度为50u/ml，(-)-blebbistatin终浓度为20μmol/l，余量为tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)。
42.解离方法为：向人诱导多功能干细胞衍生的心肌细胞中加入50μl/cm2(以12孔板为例)的上述解离液，co2培养箱、37℃解离5-8分钟，显微镜下观察到80％以上的细胞处于相互分离的程度，然后加入中和液(10％的血清)中和，轻轻吹打，收集细胞，再离心，弃上清，最后加入一定量的心肌细胞培养基，轻轻吹打混匀，随后使用自动细胞计数分析仪进行细胞计数，并获得细胞活率数据。
43.具体的实验结果见表1。活细胞数为(1.26
±
0.040)
×
106，活率为(85.32
±
0.014)％。进行重新贴附实验再培养后，细胞正常贴附，肉眼观察漂浮的未贴附的死细胞较少，且贴附的心肌细胞在贴附后24-36小时即可恢复跳动，且跳动的频率和范围与解离前无异。
44.表1实施例1中细胞的消化情况
[0045][0046]
实施例2
[0047]
一种离体培养心肌细胞的解离液，所述解离液由tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)、dispase ii、trypsin、dnaseⅰ和(-)-blebbistatin组成；
[0048]
其中，在解离液中，dispase ii终浓度为0.5u/ml，trypsin终浓度为0.05％的trypsin，dnaseⅰ终浓度为50u/ml，(-)-blebbistatin终浓度为25μmol/l，余量为tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)。
[0049]
解离方法为：向人诱导多功能干细胞衍生的心肌细胞中加入50μl/cm2(以12孔板为例)的上述解离液，co2培养箱、37℃解离5-8分钟，显微镜下观察到80％以上的细胞处于相互分离的程度，然后加入中和液(10％的血清)中和，轻轻吹打，收集细胞，再离心，弃上清，最后加入一定量的心肌细胞培养基，轻轻吹打混匀，随后使用自动细胞计数分析仪进行
细胞计数，并获得细胞活率数据。
[0050]
具体的实验结果见表2。活细胞数为(1.28
±
0.036)
×
106，活率为(89.39
±
0.015)％，进行重新贴附实验再培养后，细胞正常贴附，肉眼观察漂浮的未贴附的死细胞较少，且贴附的心肌细胞在贴附后24-36小时即可恢复跳动，且跳动的频率和范围与解离前无异。
[0051]
表2实施例2中细胞的消化情况
[0052][0053]
实施例3
[0054]
一种离体培养心肌细胞的解离液，所述解离液由tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)、dispase ii、trypsin、dnaseⅰ和(-)-blebbistatin组成；
[0055]
其中，在解离液中，dispase ii终浓度为0.6u/ml，trypsin终浓度为0.06％的trypsin，dnaseⅰ终浓度为60u/ml，(-)-blebbistatin终浓度为30μmol/l，余量为tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)。
[0056]
解离方法为：向人诱导多功能干细胞衍生的心肌细胞中加入50μl/cm2(以12孔板为例)的上述解离液，co2培养箱、37℃解离5-8分钟，显微镜下观察到80％以上的细胞处于相互分离的程度，然后加入中和液(10％的血清)中和，轻轻吹打，收集细胞，再离心，弃上清，最后加入一定量的心肌细胞培养基，轻轻吹打混匀，随后使用自动细胞计数分析仪进行细胞计数，并获得细胞活率数据。
[0057]
具体的实验结果见表3。活细胞数为(1.20
±
0.035)
×
106，活率为(85.12
±
0.008)％，进行重新贴附实验再培养后，细胞正常贴附，肉眼观察漂浮的未贴附的死细胞较少，且贴附的心肌细胞在贴附后24-36小时即可恢复跳动，且跳动的频率和范围与解离前无异。
[0058]
表3实施例3中细胞的消化情况
[0059][0060]
对比例1
[0061]
一种离体培养心肌细胞的解离液，所述解离液由tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)、dispase ii、trypsin、和dnaseⅰ组成；
[0062]
其中，在解离液中，dispase ii终浓度为0.5u/ml，trypsin终浓度为0.05％的
trypsin，dnaseⅰ终浓度为50u/ml，余量为tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)。
[0063]
解离方法为：向人诱导多功能干细胞衍生的心肌细胞中加入50μl/cm2(以12孔板为例)的上述解离液，co2培养箱、37℃解离5-8分钟，显微镜下观察到80％以上的细胞处于相互分离的程度，然后加入中和液(10％的血清)中和，轻轻吹打，收集细胞，再离心，弃上清，最后加入一定量的心肌细胞培养基，轻轻吹打混匀，随后使用自动细胞计数分析仪进行细胞计数，并获得细胞活率数据。
[0064]
具体的实验结果见表4。活细胞数为(1.01
±
1.101)
×
106，活率为(74.70
±
0.059)％，进行重新贴附实验再培养后，细胞正常贴附，肉眼观察漂浮的未贴附的死细胞较多，且贴附的心肌细胞在贴附后48-72小时才可恢复跳动。
[0065]
表4对比例1中细胞的消化情况
[0066][0067]
对比例2
[0068]
一种离体培养心肌细胞的解离液，所述解离液由tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)(文献中常单独选用tryple用于心肌细胞的消化和解离)和(-)-blebbistatin组成；
[0069]
其中，在解离液中，(-)-blebbistatin终浓度为25μmol/l，余量为tryple
tm express酶(1x)-无酚红(thermo fisher scientific)。
[0070]
解离方法为：向人诱导多功能干细胞衍生的心肌细胞中加入50μl/cm2(以12孔板为例)的上述解离液，co2培养箱、37℃解离5-8分钟，显微镜下观察到80％以上的细胞处于相互分离的程度，然后加入中和液(10％的血清)中和，轻轻吹打，收集细胞，再离心，弃上清，最后加入一定量的心肌细胞培养基，轻轻吹打混匀，随后使用自动细胞计数分析仪进行细胞计数，并获得细胞活率数据。
[0071]
具体的实验结果见表5。活细胞数为(0.97
±
0.064)
×
106，活率为(78.23
±
0.013)％，进行重新贴附实验再培养后，细胞正常贴附，肉眼观察漂浮的未贴附的死细胞较多，且贴附的心肌细胞在贴附后36-48小时才可恢复跳动。
[0072]
表5对比例2中细胞的消化情况
[0073]
[0074]
对比例3
[0075]
一种离体培养心肌细胞的解离液，所述解离液由trypsin(文献中常单独选用trypsin用于心肌细胞的消化和解离)和(-)-blebbistatin组成；
[0076]
其中，在解离液中，trypsin终浓度为0.25％的trypsin，(-)-blebbistatin终浓度为25μmol/l。
[0077]
解离方法为：向人诱导多功能干细胞衍生的心肌细胞中加入50μl/cm2(以12孔板为例)的上述解离液，co2培养箱、37℃解离5-8分钟，显微镜下观察到80％以上的细胞处于相互分离的程度，然后加入中和液(10％的血清)中和，轻轻吹打，收集细胞，再离心，弃上清，最后加入一定量的心肌细胞培养基，轻轻吹打混匀，随后使用自动细胞计数分析仪进行细胞计数，并获得细胞活率数据。
[0078]
具体的实验结果见表6。活细胞数为(1.05
±
0.064)
×
106，活率为(78.23
±
0.013)％，进行重新贴附实验再培养后，细胞正常贴附，肉眼观察漂浮的未贴附的死细胞较多，且贴附的心肌细胞在贴附后36-48小时才可恢复跳动。
[0079]
表6对比例3中细胞的消化情况
[0080][0081]
此外，上述实验结果从图1和图2的对比可知：
[0082]
图1所示实施例1-3及对比例1-3的活细胞数对比情况。实施例2活细胞数均值最高，实施例3次之，继而是实施例1，对比例1-3的活细胞数低于实施例。可见，本发明各实施例的活细胞数高于各对比例的活细胞数，添加保护剂blebbistatin的活细胞数高于未加保护剂的活细胞数。
[0083]
图2所示实施例1-3及对比例1-3的活率对比情况。实施例2活率均值最高，实施例3次之，继而是实施例1，对比例1-3的活率低于实施例。可见，本发明各实施例的活率高于各对比例的活率，添加保护剂blebbistatin的活率高于未加保护剂的活率。
[0084]
综上，本发明添加保护剂blebbistatin能够显著提高分离离体培养心肌细胞的存活率，保护剂浓度范围在20-30μmol/l。另外，本发明复合解离液相较于文献中常用于心肌细胞的单一消化液——tryple或trypsin，更加具有稳定的消化和解离的能力，且能够获得较高的活率的心肌细胞。
[0085]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。