双峰驼乳汁外泌体及其制备方法的应用与流程

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种双峰驼乳汁外泌体的制备方法及其应用。


背景技术：

2.骆驼能够在干旱、沙漠等极端恶劣的条件下能够茁壮成长。骆驼乳更是被称作沙漠中的"白金"。但是，目前研究表明：骆驼乳富含人体必需的多种氨基酸和维生素，而且含有溶菌酶、乳铁蛋白和免疫球蛋白等保护性蛋白和多种生物活性因子。显然，针对骆驼乳有效成分的开发还远远不够。


技术实现要素：

3.基于此，有必要提供一种双峰驼乳汁外泌体的提取方法及其应用，深入研究双峰驼乳汁外泌体的内在成分。表型实验结果表明，其能够促进huvecs增殖，抑制huvecs衰老，有望用于治疗心血管疾病。
4.本发明采用如下技术方案：
5.本发明提供一种双峰驼乳汁外泌体的制备方法，包括如下步骤：收集经乳酸菌喂养的双峰驼所分泌的乳汁；利用差速离心法从乳汁中分离获得除杂沉淀粗品；将沉淀粗品重悬并置于含梯度碘克沙醇溶液的离心管内的上层，超速离心分离形成12层，获得位于中间层的精提取物，即得。
6.在其中一些实施例中，所述利用差速离心法从乳汁中分离获得初步除杂后的沉淀粗品的步骤包括：利用1000g的低离心转速离心乳汁5～15min，得脱脂乳；利用10000g的中离心转速离心所述脱脂乳，得脱脂脱大囊泡的乳液；利用100000g的高离心转速将脱脂脱囊泡的乳液继续离心1.5～2.5h，获得富集沉淀；将富集沉淀采用pbs缓冲液悬浮，进一步利用2000g的离心转速对富集沉淀进行离心和重复清洗，再置于100000g的高离心转速条件下离心1.5～2.5h，收集除杂沉淀粗品。
7.在其中一些实施例中，所述梯度碘克沙醇溶液的浓度梯度为依次为40％碘克沙醇溶液、20％碘克沙醇溶液、10％碘克沙醇溶液和5％碘克沙醇溶液。
8.在其中一些实施例中，所述超速离心分离形成12层的工艺条件为：100000g的高离心转速离心2h，获得位于中间6～9层的精提取物。
9.本发明还可以提供由上述双峰驼乳汁外泌体的制备方法制备获取的双峰驼乳汁外泌体。
10.本发明还可以提供由上述双峰驼乳汁外泌体的制备方法制备获取的双峰驼乳汁外泌体在制备促进huvecs增殖的制剂产品的应用。
11.本发明还可以提供由上述双峰驼乳汁外泌体的制备方法制备获取的双峰驼乳汁外泌体在制备治疗心血管疾病的药品、食品、保健品中的应用。
12.本发明还可以一种促进huvecs增殖或者具有治疗心血管疾病功效的制剂产品，包
含由上述所述的双峰驼乳汁外泌体的制备方法制备获取的双峰驼乳汁外泌体。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
14.本发明首次提供一种从经乳酸菌喂养的双峰驼所分泌的乳汁中提取制备获得外泌体，同时验证该外泌体具有促进huvecs增殖、抑制凋亡的功效。
附图说明
15.图1为实施例1制备的双峰驼乳汁外泌(lab－cexo)体粒径分布结果图。
16.图2为实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)的透射电镜测试图。
17.图3为实施例2中针对实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)测试的small rna的长度分布柱状图。
18.图4为实施例2中针对实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)测试的各类型的ncrna的unique reads的百分比。
19.图5为实施例2中针对实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)测试的部分mirna的表达量柱状图。
20.图6为实施例2中针对实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)测试的mirna靶基因go富集结果。
21.图7为实施例2中针对实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)测试的mirna靶基因kegg富集结果。
22.图8为实施例3中针对实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)转染进入huvecs的测试图。
23.图9为实施例3中针对实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)体外处理huvecs细胞后，对细胞活性的影响统计图。
24.图10为实施例3中针对实施例1制备的双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)测试体外处理huvecs细胞后，对细胞凋亡的影响统计图。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
26.以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
27.在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
28.关键原料来源：
29.双峰驼，生长于新疆阿拉善地区。人脐静脉内皮细胞(huvecs)，购自于研域生物技术(上海)有限公司。dmem培养基，购自赛默飞世尔科技公司。
30.pbs缓冲液的配制方法：称取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l，高压蒸汽灭菌。
31.实施例1
32.本实施例提供一种双峰驼乳汁外泌体(lab－cexo)的提取方法，包括如下步骤：
33.(1)喂养双峰驼：
34.选择新疆地区平均年龄在8～12岁，3～4胎之间，产后2～3个月的母骆驼，耳孔标记。将乳酸菌混合在饲料中喂养双峰驼。连续喂养一个月后，早晚两次挤奶混匀，获取驼乳样品。
35.(2)制备外泌体：
36.将驼乳样品转移至一个新的离心管，在4℃下，先用低速(1000g)离心10min，弃去沉淀，得到脱脂乳。
37.将脱脂乳在4℃、10000g条件下离心45min，除较大的囊泡。再选择超速转子，在4℃、100000g条件下的转速离心120min，去除上清，收集沉淀。将收集到的沉淀用20μl预冷的1
×
pbs缓冲液重悬后，在4℃、2000g条件下转速离心30min，去除沉淀，重复2次。选择超速转子，将上清再次在4℃、100000g条件下离心120min，收集沉淀，重悬形成重悬液。
38.配制不同浓度(40％、20％、10％和5％)的碘克沙醇，依照浓度高至低依次将不同浓度的碘克沙醇沿管壁加入到超离管中，最后将上述步骤获得的1ml重悬液加在超离管最上层，在4℃、100000g条件下转速离心120min。离心后溶液会分成12层，取出中间6～9层的液体，在相同条件下再次离心120min。去除上清，用300μl预冷的pbs重悬，得外泌体(lab-cexo)，置于-80℃保存。
39.使用particle metrix纳米颗粒跟踪分析仪(nta)测量驼乳外泌体(lab-cexo)的颗粒大小，具体步骤为：取冻存的外泌体(lab-cexo)样本，25℃水浴解冻，冰上放置；将外泌体样本用pbs进行稀释(外泌体：pbs＝1:1)，直接用于nta检测驼乳外泌体的浓度和粒径，结果如图1所示的，平均粒径为85.20nm，浓度为1.11
×
10
12
particles/ml。
40.将驼乳外泌体颗粒沉淀物固定并使用常规程序进行透射电子显微镜检查，采用hitachi透射电子显微镜进行观察，得到的透射电子显微镜显微照片如图2所示，同时也证实了上述粒径分布的范围。
41.实施例2
42.本实施例针对实施例1制备获得的双峰驼乳汁外泌体进行测序和靶基因预测。
43.在数据质控及长度过滤完成后，统计每个样本18～31nt长度的reads数目及占比，得到small rna的长度分布情况如图3。mirna一般集中在21或22nt。图中表明长度在21nt和22nt的small rna占比最多，超过41％。
44.rna经小rna长度筛选后的序列mirbase 20.0比对，其中将小rna被注释到不同的分类中，结果由图4所示，纯净序列中的小rna种类包括mirna、rrnas、snornas、snrnas、trna和其它srnas。rrna总量作为一个样品的质控指标，驼乳外泌体中所占比例均低于40％，所以本研究样品均符合质控指标。根据测序结果，总共检测到233个mirna。表达量最高的前25个mirna如图5所示。
45.对所鉴定到表达量最高的前25个mirna进行靶基因预测，并对其做功能富集分析。go富集结果表明(图6)，大多数靶基因主要富集在一些血管生成(angiogenesis，positive regulation of angiogenesis，negative regulation of angiogenesis)、心脏发育(heart development)和一些内皮细胞分化(epithelial cell differentiation)等相关
通路中。多数靶基因主要分布在一些核内体(early endosome，endosome membrane，early endosome membrane，late endosome，recycling endosome，late endosome membrane，recycling endosome membrane)，肌动蛋白骨架(actin cytoskeleton)和细胞外基质(extracellular matrix)部分。很多靶基因具备肌动蛋白或微管结合能力(actin binding，microtubule binding)。
46.kegg富集结果(图7)表明，靶基因主要富集在一些心血管疾病相关的通路中，如lipid and atherosclerosis，fluid shear stress and atherosclerosis，dilated cardiomyopathy，hypertrophic cardiomyopathy，arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy。
47.实施例3驼乳外泌体对人脐静脉内皮细胞(huvecs)的作用探究
48.(1)吸收标记试验
49.将实施例1提取到的驼乳外泌体(lab-cexo)用pkh26红色荧光细胞连接剂试剂盒染色，用外泌体旋转柱去除未标记的染料。将染色后的外泌体(2μg/l
×
104cells)或等体积的pbs(nc)，加入半混溶的huvecs中。孵育48h后，用3.7％的pfa洗涤固定10min。再用fitc-共轭环肽标记huvecs的细胞核，用标记好的lab-cexo孵育标记好的细胞，得到两组细胞(nc和lab-cexo)。除去上清液，再用pbs洗涤三次以除去游离的外泌体。用荧光显微镜测量两组细胞的外泌体转染效果，得到的荧光显微镜照片如图8所示。
50.(2)驼乳外泌体对huvecs增殖的影响试验
51.如图9所示，用cck8法检测huvecs细胞分别转染lab-cexo和pbs(nc)后，在0、24h、48h和72h两组细胞存活率的情况。cck8结果表明，与对照组相比，lab-cexo转染组细胞存活率上升。这说明lab-cexo可以促进细胞增殖。
52.(3)驼乳外泌体对huvecs凋亡的影响
53.用流式细胞术检测huvecs细胞分别转染lab-cexo和pbs后，两组细胞凋亡的百分率。如图10所示，结果表明，与对照组相比，lab-cexo组中凋亡细胞的百分率明显降低。这说明lab-cexo能抑制细胞凋亡。
54.另外，需要说明的是，本发明采用密度梯度离心的方法从经乳酸菌喂养的双峰驼所分泌的乳汁中提取制备获得双峰驼乳汁外泌体lab-cexo。在该方法中，需要严格控制离心次数、离心时间和转速，时间过短或者转速过小，都无法充分提取外囊泡，次数过多或者转速过大，又会破坏外囊泡的结构，导致外囊泡的产率下降，从而影响获得双峰驼乳汁外泌体lab-cexo。
55.在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。