一种用于基因编辑的sgRNA靶点序列、载体、编辑系统和应用的制作方法

一种用于基因编辑的sgrna靶点序列、载体、编辑系统和应用
技术领域
1.本发明涉及基因编辑领域，特别是涉及一种用于基因编辑的sgrna靶点序列、载体、编辑系统和应用。


背景技术：

2.crispr/cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/crispr
‑
associated 9)系统已被广泛用于植物基因组编辑研究，成功实现了靶点突变(zhou et al.,2019)。
3.柑橘经常遭遇生物和非生物逆境胁迫，例如病害、虫害、低温、干旱等。生产上通过一定的栽培技术措施，能在一定程度上减轻环境胁迫对柑橘生产造成的影响。但从长远来看，培育具有抗性的柑橘新品种对柑橘产业持续、稳定和健康地发展是极为重要的。然而，由于柑橘具有雄性/雌性不育、童期长、高度杂合性和多胚等生物学特性，通过常规有性杂交、芽变选种、实生选种以及诱变育种等常规方法的品种改良进程缓慢(grosser and gmitter,1990)，而且部分柑橘种类(如脐橙)因种子败育而没有种子或种子极少，严重阻碍了该类柑橘的分子生物学研究及生物工程育种进程。由此可见，寻找一种能够高效编辑柑橘基因，从而获得柑橘新品种的方法是十分重要的。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种用于基因编辑的sgrna靶点序列、载体、编辑系统和应用。利用本发明所述靶点序列能够显著提高基因编辑效率，同时为无种子柑橘类型的基因编辑提供了新的方向。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种用于基因编辑柑橘属植物的sgrna靶点序列，所述sgrna靶点序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明提供了一种包含上述sgrna靶点序列的重组载体，所述重组载体的基础质粒包括pbluescript
‑
atu6
‑
grna。
8.本发明提供了上述重组载体的构建方法，包括以下步骤：
9.(1)将基于上述sgrna靶点序列得到的sgrna互补序列退火后连接至线性化的pbluescript
‑
atu6
‑
grna载体的bsa i
‑
hf酶切位点，得初级载体；
10.(2)利用spe i和nhe i双酶切所述初级载体，将切下的sgrna cassette与经spe i酶切、回收所得pcambia1300
‑
pyao:cas9载体连接后，得重组载体。
11.本发明提供了上述sgrna靶点序列或上述重组载体在提高柑橘基属植物因编辑效率中的应用。
12.本发明提供了上述sgrna靶点序列或上述重组载体在基因编辑系统中的应用。
13.本发明提供了一种基于上述sgrna靶点序列或上述重组载体的基因编辑系统构建基因编辑柑橘属植物的方法，包括以下步骤：
14.将柑橘属植物的种子的胚珠进行诱导，得胚性愈伤组织；
15.利用上述重组载体转化农杆菌后，侵染所述胚性愈伤组织，进行培养。
16.优选的，所述种子包括败育种子。
17.优选的，侵染时，所述转化农杆菌后所得的悬浊液的浓度为od
600
＝0.4～0.5；所述侵染的时间为20～25min。
18.优选的，所述培养包括共培养、筛选培养和植物再生培养；
19.所述共培养所用共培养培养基以mt培养基为基础培养基，还包括：0.5g/l麦芽提取物和100μm乙酰丁香酮；所述筛选培养所用筛选培养基以mt培养基为基础培养基，还包括：0.5g/l麦芽提取物、100mg/l卡那霉素、400mg/l头孢霉素、50g/l麦芽糖和8g/l琼脂；所述筛选培养基的ph为5.8；所述植物再生培养所用伸长培养基eme1500以mt培养基为基础培养基，还包括：0.5g/l麦芽提取物、400mg/l头孢霉素、35g/l蔗糖和8g/l琼脂；所述伸长培养基eme1500的ph为5.8。
20.有益效果：
21.本发明提供了一种用于基因编辑柑橘属植物的sgrna靶点序列，所述sgrna靶点序列的核苷酸序列如seq id no:1所示。利用本发明所述sgrna靶点序列能够显著提高基因编辑效率，本发明提供实验证明编辑效率高达85％，同时为无种子柑橘类型的基因编辑提供了新的方向。
22.本发明还提供了一种提高柑橘属植物基因编辑效率的方法，利用柑橘属幼果中败育种子诱导出具有再生能力的胚性愈伤组织，并在液体培养基在红进行悬浮培养，随后利用包含sgrna靶点序列的重组载体侵染胚性愈伤组织，经共培养、筛选、再生和鉴定获得基因编辑柑橘属植株。本发明以柑橘属植物的愈伤组织为试材，扩展了获得基因编辑柑橘属植物，使得在无种子或少种子的柑橘属植物中进行基因编辑成为可能，同时可以提高基因转化和基因编辑的效率，具有广阔的应用前景。
附图说明
23.图1为胚性愈伤组织图，其中a为果实，b为败育的种子，c为由胚珠诱导出的愈伤，d为胚性愈伤组织；
24.图2为载体构建图，其中a为靶基因的基因结构及sgrna靶点序列，红色序列部分为外显子，b为重组载体；
25.图3为愈伤转化及芽再生图，其中a为愈伤悬浮细胞，b为农杆菌侵染悬浮液侵染愈伤悬浮细胞，c为侵染后暗处共培，d为胚状体，e为胚状体，f为胚状体的培养，g为再生植株，h为再生植株荧光观察；
26.图4为再生植株编辑效果鉴定，其中a为pcr鉴定结果(引物为egfp
‑
f/r)，其中m为marker，p为质粒，h为ddh2o，wt为野生型植株，#1为1号再生植株，#2为2号再生植株，#3为3号再生植株，#4为4号再生植株，#5为5号再生植株，b为pcr鉴定结果(引物为1300
‑
grna
‑
f/r)，其中m为marker，p为质粒，h为ddh2o，wt为野生型植株，#1为1号再生植株，#2为2号再生植株，#3为3号再生植株，#4为4号再生植株，#5为5号再生植株，c为测序结果，其中wt为野生型植株， 1(2
×
)为2棵再生植株此处多一个碱基， 1(1
×
)为1棵再生植株此处多一个碱基， 2(1
×
)为1棵再生植株此处多两个碱基，t＞a(1
×
)为1棵再生植株此处由t变为a，
‑
2(3
×
)
为2棵再生植株此处少两个碱基，
‑
2(4
×
)为4棵再生植株此处少两个碱基，
‑
4(2
×
)为2棵再生植株此处少四个碱基，
‑
7(1
×
)为1棵再生植株此处多七个碱基，
‑
4(2
×
)为2棵再生植株此处少四个碱基，snp*为可变碱基，pam为邻近基序，红色为靶点序列，绿色为碱基插入，紫色为碱基替换，
‑
为碱基缺失，d为测序结果峰图，其中wt为野生型植株， 1为增加1个碱基a(第一个)， 1为增加1个碱基t(第二个)，
‑
2为缺失2个碱基，
‑
4为缺失4个碱基，
‑
7为缺失7个碱基。
具体实施方式
27.如无特殊要求，本发明所用组分均为本领域技术人员常规购买所得。
28.本发明提供了一种用于基因编辑柑橘属植物的sgrna靶点序列，所述sgrna靶点序列的核苷酸序列如seq id no:1所示：ctctctccgccgcctatagt。
29.本发明提供了一种包含上述sgrna靶点序列的重组载体，即crispr载体，所述重组载体的基础质粒包括pbluescript
‑
atu6
‑
grna，本发明对所述基础质粒的来源并没有特殊限定，优选购自淼灵生物，货号为p1410。
30.本发明提供了上述重组载体的构建方法，包括以下步骤：
31.(1)将基于上述sgrna靶点序列得到的sgrna互补序列sgrna互补序列退火后连接至线性化的pbluescript
‑
atu6
‑
grna载体的bsa i
‑
hf酶切位点，得初级载体；
32.(2)利用spe i和nhe i双酶切所述初级载体，将切下的sgrna cassette与经spe i酶切、回收所得pcambia1300
‑
pyao:cas9载体连接后，得重组载体。
33.本发明将基于上述sgrna靶点序列得到的sgrna互补序列退火后连接至线性化的pbluescript
‑
atu6
‑
grna载体的bsa i
‑
hf酶切位点，得初级载体。在本发明中，所述sgrna互补序列优选包括sgrna1
‑
f和sgrna1
‑
r；所述sgrna1
‑
f的核苷酸序列优选如seq id no:2所示：attgactataggcggcggagagag，其中带有下划线部分为bsa i酶切位点的粘性末端；所述sgrna1
‑
r的核苷酸序列优选如seq id no:3所示：aaacctctctccgccgcctatagt，其中带有下划线部分为bsa i酶切位点的粘性末端。
34.在本发明中，本发明所述退火优选为在95℃下孵育5min，自然冷却至室温；所述退火的反应体系优选为sgrna1
‑
f/r(sgrna1
‑
f和sgrna1
‑
r)各5μl和te buffer 40μl；所述sgrna1
‑
f/r的浓度优选为10μm；所述te buffer的ph优选为5.8。本发明将得到的所述双链寡核苷酸连接入线性化的pbluescript
‑
atu6
‑
grna载体中，所述线性化优选为利用bsa i
‑
hf酶切pbluescript
‑
atu6
‑
grna载体后得到。在本发明中，酶切体系优选如表1所示；所述酶切的温度优选为37℃；所述酶切的时间优选为5～15min。本发明对所述bsa i
‑
hf和pbluescript
‑
atu6
‑
grna的来源没有特殊的要求，其中bsa i
‑
hf优选购自于neb，usa。本发明优选采用t4连接酶连接；本发明对所述t4连接酶的来源没有特殊限定，优选购自于neb，usa；所述t4连接酶的反应体系优选如表2所示；所述t4连接酶的反应温度优选为室温；所述t4连接酶的反应时间优选为5min。
35.表1 bsa i
‑
hf的酶切体系
36.组分用量bsa i
‑
hf1μl10
×
cutsmart buffer5μl
pbluescript
‑
atu6
‑
grna1μgddh2oto 50μl
37.表2 t4连接酶的反应体系
38.组分用量t4 dna ligase(thermo)0.5μl5
×
ligase reaction buffer4μlatu6:sgrna1
‑
grna scaffold150ngpcambia1300
‑
pyao:cas9回收载体50ngddh2oto 20μl
39.得初级载体后，本发明利用spe i和nhe i双酶切所述初级载体，将切下的sgrna cassette与经spe i酶切、回收所得pcambia1300
‑
pyao:cas9载体连接后，得重组载体。在本发明中，双酶切体系优选如表3所示；所述双酶切的温度优选为37℃；所述双酶切的时间优选为5～15min。本发明对所述spe i和nhe i的来源没有特殊的要求，优选购自于neb，usa；spe i酶切体系优选为如表4所示；所述spe i酶切的温度优选为37℃；所述spe i酶切的时间优选为5～15min。
40.表3双酶切体系
41.组分用量spe i1μlnhe i1μl10
×
cutsmart buffer5μlpbluescript
‑
atu6
‑
sgrna
‑
grna1μgddh2oto 50μl
42.表4 spe i酶切体系
[0043][0044][0045]
本发明所述基因能够显著提高基因编辑效率，同时为无种子柑橘类型的基因编辑提供了新的方向，实验结果证明编辑效率高达85％，所以，利用本发明所述基因设计得到的sgrna序列或重组载体能够用于提高柑橘基属植物因编辑效率。
[0046]
本发明提供了上述sgrna靶点序列或上述重组载体在提高柑橘基属植物因编辑效率中的应用。在本发明中，所述柑橘属植物优选包括橙，更优选为脐橙；在本发明具体实施例中优选采用纽荷尔脐橙。
[0047]
本发明提供了上述sgrna靶点序列或上述重组载体在基因编辑系统中的应用。
[0048]
本发明提供了一种基于上述sgrna靶点序列或上述重组载体的基因编辑系统构建
基因编辑柑橘属植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0049]
将柑橘属植物的种子的胚珠进行诱导，得胚性愈伤组织；
[0050]
利用上述重组载体转化农杆菌后，侵染所述胚性愈伤组织，进行培养。
[0051]
本发明将柑橘属植物的种子的胚珠进行诱导，得愈伤组织。在本发明中，所述诱导所用诱导培养基以mt培养基为基础培养基，优选还包括10mg/l 6
‑
ba；所述柑橘属植物优选包括橙，更优选为脐橙；在本发明具体实施例中优选采用纽荷尔脐橙；所述种子优选包括败育种子，更优选为花后90d的败育种子；所述愈伤组织优选为胚性愈伤组织；胚性愈伤组织的细胞正处于分生细胞状态，易于接受外源基因，转化率较高，繁殖量很大，可以提供大量外植体资源以及获得较多转化植株，而且转化后的胚性愈伤组织通过离体培养途径可以再生植物，经过器官再生途径在一定程度上避免了嵌合体的产生。
[0052]
本发明所述诱导前，优选还包括对柑橘属植物的败育种子进行消毒和剖开；所述消毒优选采用酒精消毒；所述酒精的体积百分含量优选为75％；所述剖开的方式优选为横向剖开。
[0053]
本发明所述诱导后，优选还包括对所得愈伤组织进行扩大培养；所述扩大培养所用eme培养基以mt培养基为基础培养基，优选还包括0.5g/l麦芽糖。
[0054]
得愈伤组织后，本发明利用上述重组载体转化农杆菌后，侵染所述愈伤组织，进行培养。本发明侵染时，所述转化农杆菌后所得的悬浊液的浓度优选为od
600
＝0.4～0.5，更优选为0.45；所述侵染的时间优选为20～25min，更优选为20min；所述侵染的方式优选为农杆菌侵染法。
[0055]
在本发明中，所述培养优选包括共培养、筛选培养和植物再生培养；所述再生培养优选包括胚状体诱导、生芽和芽伸长；所述共培养所用共培养培养基以mt培养基为基础培养基，优选还包括：0.5g/l麦芽提取物和100μm乙酰丁香酮；所述筛选培养所用筛选培养基以mt培养基为基础培养基，优选还包括：0.5g/l麦芽提取物、100mg/l卡那霉素、400mg/l头孢霉素、50g/l麦芽糖和8g/l琼脂；所述筛选培养基的ph优选为5.8；所述植物再生培养用伸长培养基eme1500以mt培养基为基础培养基，优选还包括0.5g/l麦芽提取物、400mg/l头孢霉素、35g/l蔗糖和、8g/l琼脂；所述伸长培养基eme1500的ph为5.8。
[0056]
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种用于基因编辑的sgrna靶点序列、载体、编辑系统和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0057]
实施例1
[0058]
纽荷尔脐橙胚性愈伤组织诱导
[0059]
取花后90d纽荷尔脐橙的果实，用75％酒精外表消毒20min后横向剖开，从败育的种子中取出胚珠置于愈伤诱导培养基(mt 10mg/l 6
‑
ba)上进行愈伤诱导，3个月后诱导出疏松的胚性愈伤组织(图1)，之后在eme培养基(mt 0.5g麦芽提取物)上进行扩繁。
[0060]
实施例2
[0061]
基因编辑载体构建
[0062]
本发明以柑橘溃疡病感病基因cslob1(cs7g27640)为靶基因(其中基因cslob1的全序列如seq id no:10所示：ttaacctttttttttttggttcaaacgaagaaatgtttccgtcattcaattaaaattaatgacatcatctagtggctcggtgacatacgctttagatacaattgtcattcttgccttttcctttctc
tatataaaccccttttgccttgaactttgtttcaactaaagcagctcctcctcatcccttactgtctttgctttctcactaactactacaacccaacagttttcttctctcaaaaatggaatgcaaacacaaaattaatgtagcaatcccaatcactaatatgaagaacactcaattctcatctccatctactttctctacttctcctccttctcaatcttctccacgcttcccttctcctaatcatcaacaattgtcttctccagaatcttctccaagctttaaagcttctccttcacaatcctctccaaatcttgcagctcccctctctccgccgcctatagttcttagcccttgtgctgcttgcaaaatcctccgccgcagatgcgtcgagaaatgtgttttagctccatattttccaccaaccgaaccatacaagttcaccattgctcatagagtcttcggtgctagcaatatcatcaagttcttgcaggtatgcacttcttttgtatgtgataaattcaaactaattaaatgtccaaccattttttttctaattgggagaaaaaaaaaacttgttaattgttttattttcatcaattagttgtgtgattagactttggagtggttgattgttccactcttttttggaaacttacggacttctctaatcaaaagaaaagagagtgtgacatttcaactgatttcatgcaactttaatgtttgttttcaattcactttctttaatttaaatagagtagattattcaaatggatcctttttatttctccttataaaggaatcatcatcactcttccttgacggggcactggcgcagggtcaatctgcctcgtatacaagttttacaaagcttaaattttgcccctttctagaaaatattgtgaattttacaaagtcaaacaatgagtatgaacttagcacatgggtccacattagaaaccaattccatgccccagcagcttaatatcataaagttagcacatggcccgttaagacttaagctttgacagaatccagcgctcagagaacggtttaaaatgtttctcatttagactagacttgcaaattaaaattaaaatatttcagtcattttattttattaaaatgtaagggagggtaaatcccaaattaatttttcgcctcccatcttctcaagattcaaattctggtggtcagacaataaaattgtttgaaaacgatttgaagcagccttggggctgaaaatttcagtcatccatatttgcacacaaacaatgtctcatgccattaaaaattttccaggaactgccagaatctcaacgagcagatgcagtgagcagcatggtctatgaagcaagtgccagaatccgggatcctgtttacggctgcgccggggctatttgccatctccagaaacaagtcagtgagcttcaggctcagttagccaaggcacaggctgagcttgtcaccatggaaagccagcaacgcaatttaataactctaatttgcatggaaatggcacaatctcaagaacaagtcttgcagcagcagcagcagcagcagcaacagttcatggatactagctgttttttggatgacaatggtattggatcagcttgggagcctctgtggacatgatcaagagaaattaaagcaagattgttgaaattttaaccttttaagagattatttacataaagctaaacatacttaattataaaagtttctgatcaataattaaagttatttgctgcgcggtagatgggagtgattattatgtgctttaattttcattagtcttgttgacaaaaaggaatctttgaaccatc)，于在线软件crispr
‑
p(http://crispr.hzau.edu.cn/crispr2/)设计sgrna。选取seq id no:1(5
’‑
ctctctccgccgcctatagt
‑3’
)为sgrna靶点序列(图2中a)，合成带接头的互补sgrna互补序列seq id no:2(sgrna1
‑
f：5
’‑
attgactataggcggcggagagag
‑3’
)及seq id no:3(sgrna1
‑
r：5
’‑
aaacctctctccgccgcctatagt
‑3’
)，其中下划线为bsa i酶切位点的粘性末端。随后经退火(98℃，5min，自然冷却至室温)形成双链靶点。
[0063]
用bsa i
‑
hf(neb，usa)对pbluescript
‑
atu6
‑
grna(淼灵生物，p1410)进行37℃酶切15min(酶切体系见表1)、回收，并在室温用t4连接酶(neb，usa，反应体系见表2)将其与退火形成的双链靶点进行连接，反应时间为5min。随后在37℃条件下用spe i和nhe i(neb，usa)进行双酶切(双酶切体系见表3)反应15min，将sgrna cassette(atu6:sgrna1
‑
grna scaffold)切下，连接至经在37℃条件下spe i酶切15min(酶切体系见表4)、回收的pcambia1300
‑
pyao:cas9载体(淼灵生物，p1639)。构建好的重组载体如图2中b所示，并转化至农杆菌gv3101备用。
[0064]
实施例3
[0065]
农杆菌介导的柑橘愈伤转化、培养及植株再生
[0066]
取“实施例1”中的胚性愈伤组织用液体h h培养基(h h培养基采用的试剂和含量
如表5所示)制备愈伤悬浮细胞(120rpm，25℃)，每隔2～4周继代1次(图3中a)。培养农杆菌至其od
600
＝0.6～0.8之间时，将农杆菌侵染悬浮液的浓度为od
600
＝0.45，侵染20min(图3中b)。随后在共培培养基eme(mt 0.5g/l麦芽提取物 100μm乙酰丁香酮)上培养5d(暗培养，25℃，图3中c)，转入筛选培养基eme
‑
m(mt 0.5g麦芽提取物 100mg/l卡那霉素 400mg/l头孢霉素 50g/l麦芽糖 8g/l琼脂，ph为5.8)上培养。约2个月后长出具有抗性的胚状体(图3中d、图3中e)，再将胚状体放入伸长培养基eme1500(mt 0.5g/l麦芽提取物 400mg/l头孢霉素 35g/l蔗糖 8g/l琼脂，ph为5.8)中进行培养(图3中f)。获得的再生植株如图3中g、图3中h所示。
[0067]
表5 h h培养基的组分及含量
[0068]
试剂含量(mg/l)nh4no3825kno3950kh2po4150k2hpo420mgso4
·
7h2o370cacl2·
2h2o440na2edta37.3feso4
·
7h2o27.8mnso4·
h2o16.8znso4·
7h2o8.6h3bo36.2kcl750ki0.83na2moo4·
2h2o0.25cuso4·
5h2o0.025cocl2·
5h2o0.025thiamine hci10pyridoxine hci10nicotinic acid5myo
‑
inositol100glycine2
[0069]
应用例1
[0070]
再生植株编辑效果鉴定
[0071]
随机挑选5株具有绿色荧光发光的再生植株，利用sp plant dna kit(omega，usa)进行dna提取，用两对引物(egfp
‑
f/r，1300
‑
grna
‑
f/r，见表9)分别进行pcr鉴定，pcr扩增体系和程序如表6和表7所示；结果如图4中a、图4中b所述，这些再生植株都是阳性植株。
[0072]
表6 pcr扩增体系
[0073][0074]
表7 pcr程序
[0075][0076]
在靶点前后设计扩增引物(cslob1
‑
id
‑
f/r，见表9)对靶点区域进行扩增(pcr扩增体系和程序如表6和表7所示)，模板为提取的dna(为节约测序成本，将5株阳性植株的dna混样)。对扩增片段进行回收，并连接(室温(25～37℃)反应5min，连接体系见表8)至ptopo
‑
blunt载体(艾德莱，中国)，随机挑选20个阳性克隆送至测序公司测序。
[0077]
表8 ptopo
‑
blunt载体连接体系
[0078][0079]
对测序结果进行序列比对分析发现，结果如图4中c、图4中d所示，靶点区域被有效编辑，出现了碱基插入、缺失、替换等。编辑效率高达85.0％(17/20)，高于以上胚轴为转化材料的编辑效率。
[0080]
表9引物列表
[0081][0082][0083]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。