血小板衍生生长因子受体（PDGFR）抗体、其缀合物、组合物及用途的制作方法

血小板衍生生长因子受体（pdgfr）抗体、其缀合物、组合物及用途
1.本发明涉及针对血小板衍生生长因子受体β(pdgfrβ)的抗体，及其在诊断和 /或治疗应用中的用途。其中，本发明涉及pdgfrβ靶向抗体及其缀合物，以及它们在将诊断剂、治疗剂或其组合靶向递送至受试者组织(特别是包含活化的肌成纤维细胞的纤维化组织)中的应用。
2.血小板衍生生长因子(pdgf)家族有4种类型：pdgf-a、-b、-c、和-d，以及两种受体：pdgfrα和β。这些受体对各种pdgf二聚体具有不同的结合特异性。 pdgfrα连接pdgf a、b、和c链，pdgfrβ结合pdgf b和d链。这两种pdgf 受体在结构和功能上相关，并且pdgf结合导致受体二聚化以及pdgfrαα、ββ、和αβ受体二聚体的形成。对于受体活化，pdgf aa和pdgf cc需要pdgfrαα或αβ二聚体，pdgf dd需要pdgfrββ或αβ二聚体，而pdgf ab和pdgf bb可以活化pdgfrαα、αβ或ββ二聚体。pdgf与其受体结合导致受体二聚化和酪氨酸激酶活性的活化，进而导致蛋白激酶c和细胞内钙信号传导通路的活化。
3.研究表明，肝纤维化、骨髓纤维化、肺纤维化、和肾纤维化的病因与pdgf家族和pdgfr的过表达有关。慢性肝病的三个步骤是1)肝炎、2)肝纤维化、和3)肝硬化。慢性纤维化破坏肝血窦的基本结构，损害肝脏的功能并最终导致肝硬化。如果肝纤维化不被治疗，最终将导致肝硬化。研究表明，肝纤维化由肝星形细胞(hsc)的活化引起，这些肝星形细胞在肝组织中转分化为肌成纤维细胞。pdgf-c和pdgf受体在mrna和蛋白质水平的过表达是最早的事件之一。活化的hsc和肌成纤维细胞通过旁分泌和自分泌作用产生使纤维化过程永久化的许多促纤维化细胞因子和生长因子。pdgf-bb和tgf-β1是纤维发生的两个关键因子。肝纤维化发展导致肝组织充血和肝脂肪变性形成，最终导致肝癌。因此，可以预防或疗法肝纤维化的任何药物都是肝癌的良好辅助疗法。
4.除了其参与器官纤维化外，最近还强调成纤维细胞和肌成纤维细胞在肿瘤进展、侵袭和转移中也具有关键作用。如yazdani等人(adv.drug delivery rev[先进药物递送综述]121(2017)101-116)所综述，为了抑制不可治愈的纤维化疾病的进展、或限制肌成纤维细胞诱导的肿瘤进展和转移，肌成纤维细胞靶向已获得极大的关注。人们普遍认为肌成纤维细胞在三个主要器官(肝、肾和肺)的纤维化进展中以及在癌症中起着关键作用。因此，在上述器官和肿瘤微环境的背景下，肌成纤维细胞的靶向技术正受到极大的关注，特别是设计新策略以开发针对纤维化和癌症的新颖诊断和治疗方式。
[0005]
抑制肌成纤维细胞功能的治疗靶向策略可以分为(i)小分子药/抑制剂例如，受体酪氨酸激酶抑制剂，如rhoa激酶、erk、jnk等；信号传导通路抑制剂如tgf-β、 pdgfrβ、hedgehog、notch、wnt、内皮素-1、和sirna。(ii)可以识别并与细胞表面或细胞外靶标结合的单克隆抗体。(iii)靶向递送系统，其由递送运载体或蛋白质的靶向部分组成，该递送运载体或蛋白质携带与靶向配体缀合的治疗剂。
[0006]
pdgf受体在肌成纤维细胞上的表达显示其在不同的纤维化疾病中具有组织特异性。例如，在肺部疾病中，不同的刺激可以诱导或抑制肺肌成纤维细胞上的pdgfrα表达，而他们组成性地表达pdgfrβ。相反，在肝损伤期间，肝肌成纤维细胞上的 pdgfrβ的表达是极
易诱导和上调的，并且是早期hsc活化的标志(bonner,cytokine growth factor rev.[细胞因子生长因子综述],15(2004),第255-273页)。在实验模型和人疾病中，pdgf表达也与肌成纤维细胞分化和增殖、以及随后的ecm沉积相关。 pdgf拮抗作用和pdgfrβ的药理学抑制已被证明是有前景的治疗方式，并且因此是器官纤维化以及肿瘤生长和转移的潜在靶标。肌成纤维细胞的pdgf受体已经被有效应用于化合物的靶向递送以治疗器官纤维化或肿瘤生长(bansal等人,plos one[公共科学图书馆
·
综合],9(2014),文献号e89878；poosti等人,faseb j.[美国实验生物学会联合会会志],29(2015),第1029-1042页；prakash等人,j.control.release[控制释放杂志],148(2010),文献号e116；prakash等人,j.control.release[控制释放杂志], 145(2010),第91-101页；van dijk等人,front.med.(lausanne)[前沿医学(洛桑)],2 (2015),第72页)。us2011/0282033涉及直接针对生长因子受体的氨基酸序列、包含此类序列的化合物、以及编码这些序列的核酸序列。在一个实施例中，氨基酸序列是 nanobodies
tm
，其包括针对pdgf受体的纳米抗体。
[0007]
几种用于靶向肝纤维化中pdgf受体的有前景的治疗抗体和适配子目前处于高级临床前研究或临床试验(borkham-kamphorst等人,cytokine growth factor rev.[细胞因子生长因子综述],28(2016),第53-61页)中。
[0008]
认识到靶向pdgf受体作为纤维化和癌症临床上可行的治疗和诊断方式的可能，本发明人旨在提供对pdgfrβ显示高亲和力的靶向手段。特别地，他们试图鉴定与 pdgfrβ特异性结合的抗体，例如以高亲和力在活化的肌成纤维细胞上表达的抗体。优选地，抗体对(二聚的)pdgfrβ显示出小于10nm，更优选地约1nm或更小的结合亲和力。并且，靶向抗体结合应该优选地是非信号传导抗体，即不诱导pdgfr 下游信号传导通路的活化。
[0009]
为此，他们对用重组人pdgfrβ胞外域免疫的美洲驼产生的抗体进行了筛选和选择过程，该重组人pdgfrβ胞外域已与亚等摩尔量的其配体pdgf-bb预孵育。
[0010]
这种方式导致鉴定出一组在低的纳摩尔范围内能够以非常卓越的表观结合亲和力与固定化pdgfrβ结合的抗体。抗体与结合部分相对位点上可检测标记的缀合不影响抗原结合特性。此外，(缀合的)pdgfrβ抗体不诱导akt或erk1/2(在治疗或生理条件下)浓度的活化，这表明高亲和力结合不伴随受体活化。至少在低于10-7 m浓度下，未观察到与其他受体，例如(人)pdgfrα或egfr的结合。荧光染料标记的抗体特异性聚集在小鼠的纤维化组织中以及小鼠实体瘤的纤维化间质中。抗体与脂质体的缀合允许脂质体靶向和摄取pdgfrβ表达细胞。
[0011]
因此，本发明提供了非常适合用于在诊断和/或治疗靶向策略(例如用于靶向和抑制肌成纤维细胞)中使用的pdgfrβ抗体，特别是非信号传导pdgfrβ靶向抗体。
[0012]
在一个实施例中，本发明提供了一种抗体，其以小于10nm，优选地小于5nm，更优选地小于2nm的结合亲和力与(pdgfrβ)特异性结合。
[0013]
如本文所用，术语“结合亲和力”包括结合相互作用的强度，并且因此包括实际结合亲和力以及表观结合亲和力。实际结合亲和力是缔合速率与解离速率的比率。表观结合亲和力与一对分子的缔合常数和解离常数有关，并且涉及这对分子之间的非 1:1或多价缔合。如本文所用的用来描述所述方法的分子间相互作用的表观亲和力在经验研究中观察到，其可用于比较一个分子(例如，抗体或其他特异性结合配偶体) 将结合两个其他分子(例如，肽的两个版本或变体)的相对强度。结合亲和力的概念可以描述为表观kd、表观结合
常数、ec50或结合的其他度量。表观亲和力可以包括例如，相互作用的亲合力。
[0014]
如本文所用，术语“pdgfrβ”是指血小板衍生的生长因子受体β，其是人类中由pdgfrβ基因编码的蛋白质。成熟的糖基化pdgfrβ蛋白的分子量大约是180kda。该基因被称为ensembl：ensg00000113721、entrez基因：5159和uniprotkb：p09619。
[0015]
抗体可以与单体pdgfrβ和/或pdgfr的二聚体形式(其中至少一个单元是 pdgfrβ)特异性结合。优选地，抗体与二聚体形式结合，尤其是因为二聚体pdgfr β大量存在于患病纤维化组织或恶性肿瘤的间质中。在一方面，抗体以小于10nm的结合亲和力与pdgfrβ的活化的二聚体形式结合。在另一方面，该抗体以小于10nm 的结合亲和力与pdgfrβ的非活化的二聚体形式结合。当抗体通过靶向pdgfrβ用作成像诊断时，这是特别有趣的。
[0016]
pdgfrβ蛋白是典型的受体酪氨酸激酶，其是由胞外配体结合结构域、跨膜结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域组成的跨膜蛋白。pdgfrβ蛋白存在于某些细胞类型的细胞膜上，在那里它结合其配体pdgf。这种结合打开(活化)pdgfrβ蛋白，然后通过在特定位置添加一簇氧和磷原子(磷酸基团)来活化细胞内其他蛋白质。这个过程叫做磷酸化作用，导致在多个信号传导通路中的一系列蛋白质的活化。
[0017]
由pdgfrβ蛋白刺激的信号传导通路控制细胞中的许多重要过程，例如生长和分裂(增殖)、活动、和存活。pdgfrβ蛋白质信号传导对于整个身体的很多类型的细胞的发育很重要。
[0018]
如本文所用，术语“非信号传导”意指抗体对下游pdgfrβ信号传导途径不具有可检测的作用，不管是激动还是拮抗信号传导。换句话说，抗体不受受体信号传导干扰。因此，本发明的抗体可以称为“非信号传导干扰的pdgfrβ抗体”。
[0019]
在一个实施例中，根据本发明的抗体是非激动性pdgfrβ抗体，这意指它的结合不活化pdgfrβ(下游的信号传导)，即它不会导致pdgfrβ的任何可检测的活化。 pdgfr活化的程度很容易通过本领域已知的方法确定。合适的测定典型地包括分析 (细胞内)蛋白激酶活性，例如erk1/2和akt(hua-zhong ying等人,2017(doi: 10.3892/mmr.2017.7641))。
[0020]
如本文所用，术语“抗体”是指至少包含与靶表位结合的重链可变区(vh)的抗原结合蛋白。术语抗体包括包含免疫球蛋白重链和轻链分子的单克隆抗体、单链重链可变结构域抗体及其变体和衍生物，包括scfv、串联scfv、scfab、和改进的scfab (koerber等人,2015.j mol biol[分子生物学杂志]427:576-86)、单克隆和单链重链可变结构域抗体的嵌合变体。该术语也包括抗体模拟物，例如设计的锚蛋白重复蛋白(即 darpin)、基于蛋白质a的z结构域的结合蛋白、基于iii型粘连蛋白结构域的结合蛋白(即centyrin)、工程化的脂质运载蛋白(即anticalin)、基于人igg ch2结构域的结合蛋白质(即abdurin)、基于人igg ch3结构域的结合蛋白(即fcab)、以及基于人fyn sh3结构域的结合蛋白(即fynomer)(skerra,2007.current opinionbiotechnol[现代生物技术观点]18:295-304；等人,2015.trends biotechnol[生物技术趋势]33:408-418)。
[0021]
在优选实施例中，本发明提供了包含如表1a所描述的cdr1、cdr2和cdr3 氨基酸序列的pdgfrβ抗体。
[0022]
本发明的特定方面涉及pdgfrβ抗体，其包含
[0023]-分别由id no:1、5和9定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，或与其显示至少90％，优选地至少95％同一性的变体序列；
[0024]-分别由id no:2、6和10定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，或与其显示至少90％，优选地至少95％同一性的变体序列；
[0025]-分别由id no:3、7和11定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，或与其显示至少90％，优选地至少95％同一性的变体序列；或
[0026]-分别由id no:4、8和12定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列，或与其显示至少90％，优选地至少95％同一性的变体序列。
[0027]
变体序列包括保守取代的变体，这些变体是指包含与靶标的参考配体的序列基本相同的氨基酸残基序列的抗体，其中一个或多个残基被功能相似的残基保守取代，并且该残基显示了如本文所述的靶向活性。短语“保守取代的变体”还包括这样的抗体，其中残基被化学来源的残基所替换，前提条件是所得到的肽展现如本文所披露的靶向活性。
[0028]
保守取代的实例包括：一种非极性(疏水性)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸间的相互取代；一种极性(亲水性)残基间的相互取代，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、甘氨酸与丝氨酸之间的相互取代；一种碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸间的相互取代；或一种酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸间的相互取代。
[0029]
在一个实施例中，本发明的pdgfrβ抗体包含
[0030]-分别由id no:1、5和9定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0031]-分别由id no:2、6和10定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0032]-分别由id no:3、7和11定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；或
[0033]-分别由id no:4、8和12定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0034]
表1a.根据本发明的抗pdgrβ抗体的cdr序列。
[0035][0036]
在优选实施例中，本发明提供了包含如表1b中描述的cdr1、cdr2和cdr3 氨基酸序列的组合的pdgfrβ抗体(也可参见图1)。更特定地，本发明提供了非信号传导pdgfrβ靶向抗体，其包含：
[0037]-分别由id no:13、17和21定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0038]-分别由id no:14、18和22定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；
[0039]-分别由id no:15、19和23定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列；或
[0040]-分别由id no:16、20和24定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0041][0042]
高度优选的是包含抗体“1b5”的cdr的pdgfrβ抗体，该pdgfrβ抗体包含分别由id no:13、17和21定义的重链cdr1、cdr2和cdr3序列。
[0043]
在优选方面，本发明的抗体包含重链可变区，该重链可变区包含如表1c id no: 25-32所示的序列、或其变体序列。变体序列可以显示与表1c的序列具有至少90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。例如，变体是本文披露的抗体的人重链可变结构域等价物。人源化vhh抗体可以包含一个或多个氨基酸取代。人源化骆驼的单域抗体的一般策略是本领域已知的。参见，例如vincke 等人(2009,j.biol.chem.[生物化学杂志]284,3273-3284)。用包含重链可变区的抗体可以获得非常好的结果，该重链可变区包含如seq id no:25或26定义的序列。
[0044]
具有配对id no:25/26；27/28；29/30和31/32的序列仅在n-末端氨基酸残基方面有所不同。根据seq id no:25、27、29或31的序列包含n-末端asp残基，其特别适合在酵母宿主细胞(例如酿酒酵母(s.cerevisiae))中表达。具有id no:26、28、 30或32(分别表示为1b5*、1d4*、1h4*和1e12*)的序列包含n-末端glu残基，其特别适合在细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)中表达。
[0045]
表1c优选的针对pdgfrβ的抗体的重链可变区序列
[0046]
[0047][0048]
本发明特定地涉及针对人pdgfrβ的vhh抗体。如本文所用，术语“vhh抗体”是指包含至少一个单链重链可变结构域的抗体。在特定方面，根据本发明的vhh 抗体是缺乏轻链的单链重链可变结构域抗体，在本领域也称为nanobody
tm
。优选地， vhh是可以在天然缺乏轻链的骆驼科中发现抗体类型，或是可以相应构建的合成 vhh。例如，所述vhh抗体可以包含骆驼或人源化氨基酸序列，并且可以例如，与人或人源化的fc区域偶合。
[0049]
如本文所用，术语“骆驼科”包括如美洲驼的引用，例如像原驼(lama glama)、瘦驼(vicugna vicugna)和羊驼(vicugna pacos)，以及对骆驼物种的引用，该骆驼物种包括例如，单峰驼和双峰驼。
[0050]
如本文所述，重链可变结构域(包括vhh)的氨基酸序列和结构可被认为由四个框架区或“fr”组成，该框架区或“fr”在本领域和本文中分别称为“框架区1”或“fr1”；称为“框架区2”或“fr2”；称为“框架区3”或“fr3”；以及称为“框架区4”或“fr4”；其框架区被三个互补决定区或cdr中断，该互补决定区或cdr 在本领域分别称为“互补决定区l”或“cdr1”；称为“互补决定区2”或“cdr2”；以及称为“互补决定区3”或“cdr3”。
[0051]
举例来说，本文披露的主题的vhh结构域包括在表1c中。因此，本文也提供了vhh抗体，其包含如id no:25-32中任一个所示的序列、或其变体序列。
[0052]
在一方面，本发明提供了vhh抗体，其在本文指的是根据id no:25或26的“qpd-1b5”(缩写为“1b5”)。发现这种抗体对pdgfrβ具有大概1nm的表观结合亲和力。此外，很容易提供多样的有用部分，包括生物素、荧光团、螯合剂和光学成像染料。spr分析显示对人pdgfrβ胞外域具有高亲和力和高的结合速率常数 (k-on)，但是有很低的(不可测量的)解离速率常数(k-off)。所计算的kd大约是 4-5pm。
[0053]
在另一方面，本发明提供了vhh抗体，其在本文指的是根据id no:27或28的“qpd-1d4”(缩写为“1d4”)。发现这种抗体对pdgfrβ具有小于1nm(大约0.5nm) 的表观结合亲和力。此外，很容易提供多样的有用部分，包括生物素、荧光团、螯合剂和光学成像染料。spr分
析显示高亲和力和高的结合速率常数，以及很低的解离速率常数。所计算的kd大概是20pm。
[0054]
在又一方面，本发明提供了vhh抗体，其在本文指的是根据id no:29或30的“qpd-1h4”(缩写为“1h4”)。也发现这种抗体对pdgfrβ具有小于1nm的表观结合亲和力，并且很容易提供多样的有用分子。spr分析显示高亲和力和高的结合速率常数，以及可测量的解离速率常数。所计算的kd是在低纳摩尔至高皮摩尔范围，取决于缓冲液组合物。
[0055]
更进一步，本发明提供了vhh抗体，其在本文指的是根据id no:31或32的“qpd-1e12”(缩写为“1e12”)。发现这种抗体对pdgfrβ具有大概10nm的表观结合亲和力。很容易提供多样的有用分子，包括生物素、荧光团、螯合剂和光学成像染料。spr分析显示大概100nm的计算的kd。
[0056]
本文披露的主题的抗体也包括氨基酸序列，这些氨基酸序列相对于vhh结构域的序列包含一个或更多添加和/或缺失或残基，例如本文披露的、只要保留肽的必需的靶向活性的那些序列。术语“片段”是指氨基酸残基序列，其比本文披露的主题(例如vhh结构域)的序列或野生型或全长序列短。
[0057]
为了提供“接头”，也可以将额外的残基添加至任一末端，本文披露的主题的vhh 结构域借此可以方便地附着或缀合至(可检测)标记、固体基质、或载体。氨基酸残基接头通常是至少一个残基，并且可以是40或更多个残基，更常见的是1至10个残基。用于连接的典型氨基酸残基是酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸以及门冬氨酸等。此外，肽可以通过末端nh2乙酰化(例如，乙酰化、或巯基乙酸酰胺化)或通过末端羧酰胺化(例如，用氨、甲胺等末端修饰)修饰。正如众所周知的，末端修饰对于减少蛋白酶消化的易感性是有用的，并且因此可用于延长抗体在溶液(特别是蛋白酶可以存在的生物学流体)中的半衰期。
[0058]
在一个实施例中，本发明的抗体包括n-和/或c-末端肽标签。例如，其包括允许位点特异性的抗体缀合的标签。特别感兴趣的是包括cys-残基的肽标签。其他有用的标签包括那些允许在目的器官中靶向和/或保留的标签。在特定的方面，抗体包括增强抗体在肾中保留的标签，参见huyvetter等人,theranostic[治疗诊断学]，2014年4 月25日；4(7):708-20。
[0059]
在一些实施例中，本文披露的主题的vhh结构域可以呈二聚体形式，并且在一些实施例中呈其他多聚体形式。在一些实施例中，通过二聚化增加小抗体的分子质量可以改善小抗体的肿瘤积累。除了制作同源二聚体构建体，在一些实施例中，还可以构建包含两个或更多个不同vhh结构域的异二聚体或多聚体构建体。在一些实施例中，为了赋予分子构象灵活性，两个或更多个结构域可以通过接头衔接。
[0060]
正如本领域的普通技术人员将理解的，根据本发明的抗体适合应用于体内成像、诊断和/或疗法。为此，该抗体优选地包括一个或多个能够实现或促进这种应用的部分。在一个实施例中，该抗体包括可检测标记、治疗剂、载体、修改体内药物代谢动力学特征的部分、或任何其组合。
[0061]
示例性可检测标记包括体内可检测标记，优选地是可以使用核磁共振(nmr) 成像、近红外成像、正电子发射断层扫描(pet)、闪烁成像、超声波、或荧光分析检测的可检测标记。该检测标记可以直接(通过共价附接/缀合)或间接通过本领域已知的偶合剂、接头或螯合剂偶合或结合至根据本发明的抗体。
[0062]
例如，本发明涉及一种pdgfrβ抗体，其包括nmr核素69-镓或71-镓。优选的核素是
可用于基于抗体核成像的核素，并且包括pet成像核素18-f、89-zr、68-ga、 124-i、64-cu和86-y，以及spect成像核素111-in、131-i、123-i和99m-tc。
[0063]
在特定的方面，本发明提供了一种pdgfrβ抗体、优选地是如本文所披露的vhh 抗体，其缀合至适合用于pet成像的基于18f的放射性示踪剂。参见例如alauddin (am j nucl med mol imaging.[美国核医学与分子成像杂志]2012；2(1):55-76)。
[0064]
本发明的抗体的18f标记可以通过本领域已知的方法实现、优选地使用温和的条件。例如，cu催化的叠氮化物-炔烃环加成(cuaac)和几个无铜点击反应代表这种用于放射性标记敏感分子的方法。kettenbach等人(biomed research international[国际生物医学研究],第2014卷,文章编号361329)提供了关于用于点击环加成的新颖的18f标记的辅基发展的概述，并且描述了铜催化的和无铜点击18f-环加成。
[0065]
荧光标记抗体在各种临床应用中作为用于癌症定位的强有力工具正在兴起。荧光探针很大程度上是无毒的并且已经被广泛用于临床环境中(吲哚菁绿，icg)，对人的毒性非常有限。但是，icg用途的局限，例如低量子产量和缺乏用于缀合的生物活性基团已经导致替代性染料的探索，以保证一致的药物生产和卓越的表现。这些包括 cy5/7染料、icg、荧光素(fitc)和irdye700/800。在可见光谱(例如异硫氰酸荧光素(fitc))或在近红外(nir)光谱范围(包括已知的nir荧光染料，例如 irdye800cw)可以看见抗体缀合的荧光团。
[0066]
用于装载或缀合抗体的合适的放射性核素在本领域是已知的。在一个实施例中，放射性核素选自由以下组成的组：111in、111at、177lu、211bi、212bi、213bi、211at、 62cu、67cu、90y、125i、131i、133i、32p、33p、47sc、111ag、67ga、68ga、153sm、 161tb、152dy、166dy、161ho、166ho、186re、188re、189re、211pb、212pb、 223ra、225ac、77as、89sr、99mo、105rh、149pm、169er、194ir、58co、80mbr、 99mtc、103mrh、109pt、119sb、189mos、192ir、219rn、215po、221fr、255fm、 11c、13n、15o、75br、198au、199au、224ac、77br、113min、95ru、97ru、103ru、 105ru、107hg、203hg、121mte、122mte、125mte、227th、165tm、167tm、168tm、 197pt、109pd、142pr、143pr、161tb、57co、58co、51cr、59fe、75se、201tl、76br 和169yb。
[0067]
用于pdgfrβ抗体的放射性核素标记以便根据披露的方法使用的方法在本领域是已知的。例如，靶向分子可以衍生化以便放射性同位素可以直接与其结合(yoo等人(1997)j nucl med[核医学杂志]38:294-300)。可替代地，可以添加接头以能够缀合。代表的接头包括二乙烯三胺五乙酸酯(dtpa)-异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺基6
‑ꢀ
肼烟酸盐盐酸盐(shnh)、和六甲基丙胺肟(hmpao)(chattopadhyay等人(2001) nucl.med.biol.[核医学和生物学]28:741-744；sagiuchi等人(2001)ann.nucl. med.[核医学年鉴]15:267-270；dewanjee等人(1994)j.nucl.med.[核医学杂志] 35:1054-1063；美国专利号6,024,938)；额外的方法可以在美国专利号6,080,384找到； hnatowich等人(1996)j.pharmacol.exp.ther.[药理学与实验治疗学杂志] 276:326-334；以及tavitian等人(1998)nat.med.[自然医学]4:467-471。
[0068]
在一个实施例中，本发明提供了具有通式m-l-q的化合物，其中m是诊断或治疗剂，l是接头，并且q是如本文披露的pdgfrβ靶向(vhh)抗体。在一个实施例中，m可以是金属螯合剂，其以与金属放射性核素偶合或不偶合的形式。可替代地， m可以是放射性卤素而不是金属螯合剂。金属螯合剂m可以是用于和医学上有用的金属离子或放射性核素偶合的本领域已知的金属螯合剂的任何一个。优选的螯合剂包括dtpa、dota、do3a、hp-d03a、edta、teta、
ehpg、hbed、nota、dotma、 tetma、pdta、ttha、licam、mecam、或肽螯合剂。金属螯合剂可以或不可以与金属放射性核素螯合，并且可以包括可选间隔子，例如单个氨基酸。用于闪烁扫描或放射疗法的优选的金属放射性核素包括99mtc、51cr、67ga、68ga、47sc、51cr、 167tm、141ce、111in、168yb、175yb、140la、90y、88y、153sm、166ho、165dy、 166dy、62cu、64cu、67cu、97ru、103ru、186re、188re、203pb、211bi、212bi、 213bi、214bi、105rh、109pd、117msn、149pm、161tb、177lu、198au、和199au。金属的选择将基于所需的治疗或诊断应用确定。例如，用于诊断目的的优选的放射性核素包括64cu、67ga、68ga、99mtc、和111in，特别优选的是99mtc和111in。对于治疗目的，优选的放射性核素包括64cu、90y、105rh和90y、111in、117msn、 149pm、153sm、161tb、166dy、166ho、175yb、177lu、186/188re、和199au，特别优选的是177lu、90y、186re和188re。
[0069]
当标记部分是放射性核素时，可以将稳定剂(例如抗坏血酸、龙胆酸、或其他恰当的抗氧化剂)添加至包括标记的靶向分子的组合物来预防或减少放射损伤。
[0070]
在m是诊断部分的情况下，优选的诊断部分包括，例如，能够通过诸如x射线、磁共振成像、超声、荧光和其他光学成像方法的技术检测化合物的试剂。特别优选的诊断部分是光标记。
[0071]
抗体可以包含治疗剂，优选地选自由以下组成的组的治疗剂：放射性核素、细胞毒素、和化疗剂。在一个实施例中，将该抗体缀合至药物、前体药物、毒素、酶、酪氨酸激酶抑制剂、鞘氨醇抑制剂、免疫调节剂、细胞因子、激素、第二抗体、第二抗体片段、免疫缀合物、放射性核素、反义寡核苷酸、rna干扰、抗血管生成剂、促凋亡剂、抗肿瘤剂、细胞毒剂、或任何其组合。
[0072]
可以缀合至本文披露的pdgfrβ抗体并且根据本文披露的主题的治疗方法使用的示例性抗肿瘤剂包括烷基化剂(例如苯丙氨酸氮芥和苯丁酸氮芥)、长春花生物碱类(例如长春地辛和长春碱)、抗代谢物(例如5-氟尿嘧啶、5-氟尿苷及其衍生物)。
[0073]
在优选方面，将本发明的抗体缀合至核素允许在靶向放射性核素疗法(trnt) 中抗体的应用。trnt是一种全身疗法，其旨在将细胞毒性的辐射递送至癌细胞，其中健康组织的暴露最小化。参见dhuyvetter等人d’expert opin drug deliv.[药物递送专家意见]2014年12月1日；11(12):1939-1954。trnt包括放射性标记的生物制剂或其他运载体的用途，其通过发射auger、β-或α-粒子靶向和递送细胞毒性量的辐射至不能操作的或弥散性疾病。用于放射疗法的示例性核素包括177-镏、镭-223和碘-131。
[0074]
该抗体可以附接到载体上、优选地是药物载体。例如，载体选自由以下组成的组：脂质体、纳米颗粒、聚合物囊泡和微囊剂。在一个实施例中，该抗体包被在包括目的物质的纳米颗粒上、优选地是包括治疗剂的纳米颗粒。
[0075]
在另一个实施例中，pdgfrβ抗体附接到脂质体来允许脂质体靶向表达pdgfrβ的组织。他们的生物相容性、生物降解性、低毒性、和将种类繁多的药包封入胶囊内的能力使脂质体作为治疗药物载体极具吸引力。自从基于磷脂的脂质体首先被描述，使用脂质体纳米载体的治疗药物和显像剂的靶向和递送已经取得重大进展。脂质体设计的进展导致用于治疗以及诊断应用的系统的改进。脂质体正在越来越多地向对比增强的、细胞的、和分子的mri诊断剂发展。更重要的是，临床研究已经证实脂质体的治疗特征，并且引入了脂质体药物配制品用于几种疾病的治疗。
[0076]
在另一个实施例中，该抗体被偶合至聚合物囊泡。聚合物囊泡在结构上类似于脂质体但是高度稳定并且和微团相比，可以将更大量的亲水性药物包封入胶囊内。这使他们对于细胞内货物的递送或药物的控释变得特别有趣。
[0077]
完善的化学反应已经被应用于将不同部分附接至脂质或预制的载体表面，例如脂质体，如胺-羧酸缀合、二硫键形成、腙键形成、和硫醇-马来酰亚胺加成反应产生硫酯键。本发明因此也提供了脂质体或聚合物囊泡，其用pdgfrβ靶向抗体修饰，优选地是如本文披露的pdgfrβ靶向vhh抗体。
[0078]
一些抗体，例如单链双抗体(scdb)、串联的scfv(tafv)分子或vhh抗体，由于其体积小而被短血清半衰期阻碍了治疗效果。因此，本发明的(vhh)抗体是适合被修饰的，例如，通过重组技术，在不损害他们的靶向结合能力和有效性下实现血清半衰期的增加和药物代谢动力学的改进。
[0079]
为了解决这个问题，长循环血清蛋白，例如人血清白蛋白(hsa)，其具有高亲和力和强稳定性，并且因此其已被广泛用于疗法和诊断研究。因此，本文还提供的是一种抗体，其中修饰体内药物动力学特征的部分包括血清蛋白结合结构，或影响肝和 /或肾的亲脂性或清除的结构。半衰期延长可以，例如，通过和抗hsa抗体融合、通过聚乙二醇化作用或通过和fc结构域的融合实现。在一方面，本发明提供了对pdgfr β显示高(低纳摩尔)结合亲和力的半衰期延长的vhh抗体，其由美洲驼衍生的vhh 抗体的两个序列优化的可变结构域组成，，一个直接针对pdgfrβ和一个直接针对 hsa，其可以通过氨基酸接头(例如ggggsgggs)进行基因融合。
[0080]
本发明还提供了一种双特异性或多特异性的结合化合物，其包括根据本发明的 pdgfrβ抗体。包括的是二价双特异性和二价双旁原位结合化合物，该化合物包括本发明的pdgfrβvhh。
[0081]
该结合化合物是例如一种多肽，其包括至少一个或两个(或更多个)如本文所披露的pdgfrβ纳米抗体。该多肽可以包含至少第一纳米抗体(与一个pdgfrβ表位结合)和第二纳米抗体(与不同的血液或血浆蛋白、肽、或任何影响血液中药物代谢动力学行为的组分结合)。其可以包括两个或更多个偶合的相同的纳米抗体，其结合不同的单体/二聚体上的pdgfrβ表位，或两个或更多个偶合的不同纳米抗体，其结合相同或不同的单体/二聚体上的不同的pdgfrβ表位。在一方面，该双特异性或多特异性的结合化合物包括两个或更多偶合的不同的纳米抗体，其中的一个至少结合 pdgfrβ表位并且至少一个结合不同的肿瘤、间质或纤维化相关的抗原或表位。
[0082]
因此，在适用的情况下，本发明的抗体可以与pdgfrβ的两个或更多个抗原决定簇、表位、部位、结构域、亚基或构象的结合也在本发明范围内。另外，例如，在 pdgfrβ以活化构象和以失活构象存在时，本发明的抗体可以结合这些构象中的任一种，或者可以结合这两种构象(即，可以以相同或不同的亲和力和/或特异性)。优选地本发明的抗体与生长因子受体结合相关配体时的生长因子受体构象结合，可以与生长因子受体未结合相关配体时的生长因子受体构象结合，或者可以与两种构象均结合(再次，可以以相同或不同的亲和力和/或特异性)。
[0083]
也期待本发明的抗体一般结合至所有天然存在的或合成的pdgfrβ的类似物、变体、突变体、等位基因、部位和片段；或至少结合至那些生长因子受体的类似物、变体、突变
体、等位基因、部位和片段，该生长因子受体包含一个或多个抗原决定簇或表位，其与本发明的抗体结合的抗原决定簇或表位在本质上是相同的，例如在野生型pdgfrβ中。在本发明的范围内也包括本发明的抗体结合至pdgfrβ的一些类似物、变体、突变体、等位基因、部位和片段，而不结合其他。
[0084]
在本发明的范围内，本发明的抗体只以其多聚体形式与pdgfrβ结合、或与其单体和多聚体形式结合。在这种情况下，该抗体可以以与本发明的抗体结合至pdgfr β的多聚体形式的亲和力和特异性相同的、或不同的、优选地高于的亲和力和/或特异性结合至pdgfrβ的单体形式。
[0085]
本发明进一步提供了一种核酸分子，其编码根据本发明的抗体，选择性地与如本文描述的肽或蛋白质中的任一个融合。术语“核酸分子”或“核酸”各自是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及他们的单链或双链形式的聚合体。除非确切地限制，该术语涵盖了包含已知的自然核苷酸类似物的核酸，他们具有与该参比自然核酸相似的特征。术语“核酸分子”或“核酸”也可以用来代替“基因”、“cdna”、或“mrna”。可以合成、或可以从包括任何有机体的任何生物来源衍生核酸。可以克隆、合成、重组改变、诱变、或其组合获得本文披露的主题的核酸。用来分离核酸的标准的重组 dna和分子克隆技术在本领域是已知的。造成碱基对改变、缺失、或小插入的位点特异性诱变在本领域也是已知的。参见，例如sambrook和russell(2001)molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆：实验室手册],第3版,cold spring harborlaboratory press[冷泉港实验室出版社]，冷泉港，纽约。
[0086]
本发明提供了包括本发明的核酸分子的载体。在一个实施例中，该载体包含编码抗pdgfrβ免疫球蛋白的重链的核酸分子。本发明还提供了载体，其包括编码融合蛋白的多核苷酸分子、修饰的抗体、抗体片段、及其探针。为了表达本发明的抗pdgfr β抗体的重链和/或轻链，将编码所述重链和/或轻链的该多核苷酸插入表达载体中，如此这些基因有效地连接至转录和翻译序列。表达载体包括质粒、yac、黏粒、反转录病毒、ebv衍生的游离基团、和所有一般技术人员将知道便于确保所述重链和/或轻链表达的其他载体。一般技术人员将意识到可以将编码重链和轻链的多核苷酸克隆到不同载体或相同载体。在优选实施例中，在相同的载体中克隆所述的多核苷酸。
[0087]
本发明的多核苷酸和包括这些分子的载体可以被用于合适的哺乳类宿主细胞、或普通技术人员已知的宿主细胞的任何其他类型的转化。转化可以通过任何已知的用来将多核苷酸引入至细胞宿主的方法。这些方法是本领域的普通技术人员所熟知的并且包括葡聚糖介导的转化、磷酸钙沉淀、二甲基介导的转染、原生质体融合、电致孔、将多核苷酸封装到脂质体中、基因枪注射和直接将dna显微注射至核。
[0088]
更进一步，其涉及一种生产pdgfrβ抗体的方法，该方法包括表达编码核酸分子，典型地包括在合适的表达载体中，在相关的宿主细胞中和从细胞中回收因此生产的抗体。可以使用各种一般技术人员已知的标准技术纯化和表征分离的多肽和重组生产的多肽。参见，例如，principles of peptide synthesis[肽合成原理]，第2版修订版 springer verlag[施普林格出版公司]，柏林/纽约；ausubel(1995)short protocols inmolecular biology[分子生物学短协议],第3版,wiley[威立出版公司]，纽约。
[0089]
本文所披露的抗体，特别是当缀合至治疗和/或诊断部分时，有利地包含于治疗组合物、诊断组合物、或其组合中。在一个实施例中，本发明提供了治疗组合物、诊断组合物、
或其组合，其包含一个或多个pdgfrβ靶向配体，这些靶向配体包含根据本发明的抗体，优选地如本文披露的pdgfrβ-vhh抗体。在一方面，其被用于诊断哺乳动物的pdgf介导的疾病或医学病症的方法中。
[0090]
正如本领域一般的技术人员将理解的那样，本文披露的pdgfrβ-vhh抗体 (pdgfrβ纳米抗体)的用途在种类繁多的已知的和还未被发现的基于纳米抗体的诊断和治疗应用中。这些包括用于诊断和靶向肿瘤疗法的基于纳米抗体的递送系统。参见例如hu等人(front.immun.[免疫学前沿]2017,第8卷，专利法第1442条)。
[0091]
本文披露的主题的治疗组合物、诊断组合物、或其组合包含一些实施例中的药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体。合适的配制品包括水性和非水性无菌注射溶液，这些水性和非水性无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、杀菌性抗菌素使和配制品和预期受试者的体液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，这些水性和非水性无菌混悬液可以包括混悬剂和增稠剂。配制品可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封安瓿和小瓶，且可以在冰冻或冷冻干燥(freeze-dried) (冻干(lyophilized)状态下储存，在临用前只需要加入无菌液体载体，例如注射用水。一些示例性成分是sds，在一些实施例中其范围是0.1至10mg/ml，在一些实施例中约是2.0mg/ml；和/或是甘露醇或另一种糖，在一些实施例中其范围是10至100 mg/ml，在一些实施例中约是30mg/ml；和/或是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。考虑到所讨论的配制品类型，本领域的任何其他传统配制品都可以使用。在一些实施例中，该载体是药学上可接受的。在一些实施例中，该载体是用于人的药学上可接受的。
[0092]
本发明的抗体(或包括相同抗体的组合物)发现其作为靶向试剂、诊断试剂、治疗试剂或任何其组合的用途。例如，本发明提供了一种在免疫pet成像中使用的 pdgfrβ抗体。免疫pet是用正电子发射的放射性核素放射性标记的抗体的体内成像和定量。将这些应用匹配的放射性核素缀合至嵌合的、人源的、或完全人抗体以提供高灵敏度的实时、靶向特异性信息。供免疫pet使用的抗体适合缀合至铜-64(64cu， t1/2＝12.7hr)、钇-86(86y，t1/2＝14.7hr)、碘-124(124i，t1/2＝100.3hr)、锆-89(89zr， t1/2＝78.4hr)、镓-68(68ga，t1/2＝1.13hr)和氟-18(18f，t1/2＝1.83hr)中的一个或多个。由于89zr兼容的半衰期、用于蛋白质缀合的理想的物理化学特征、和可利用性，其可以被认为是优选的正电子发射体。
[0093]
在另一个实施例中，该抗体被用于哺乳动物的治疗pdgf介导的疾病或医学病症的方法中。例如，
[0094]
pdgf介导的疾病或医学病症是癌症、再狭窄、纤维化、血管生成、肾脏疾病或心血管疾病。在一个实施例中，该疾病是慢性炎性疾病、早期或晚期纤维化、纤维化肿瘤、nash/肝纤维化、肾纤维化、胰腺癌或结肠癌、心肌纤维化、系统性硬化病、克罗恩病、杜普伊特伦氏病(dupuytren’s disease)或关节病。
[0095]
示例性治疗用途是光动力学疗法(pdt)，特别是基于抗体的光动力学疗法，其被称为光免疫疗法(pit)。这是一种非常有创造性的新颖的方式，旨在改进肿瘤选择性。每种肿瘤具有独特的生物学特性，其包括不同细胞表面抗原的表达。通过使用本发明的抗体作为“载体”靶向pdgfrβ抗原，光敏剂的选择性递送将因此克服传统 pdt严重脱靶的毒性副作用、增加治疗效果、并且减少发病率。
[0096]
进一步治疗用途包括取决于一种或多种如上文所描述的治疗剂的那些。治疗方法
可以进一步包括施用至少一种另外的(化学)治疗剂。
[0097]
本文披露的主题的治疗组合物、诊断组合物、或其组合的合适的施用方法包括但不限于静脉内、皮下、或瘤内施用。此外，在回顾本披露时，应当理解，可以选择用于施用的任何位点和方法，至少部分取决于要施用这些组合物的受试者物种。为了将组合物递送至肺部通路，组合物可以作为气雾剂或粗喷施用。
[0098]
对于治疗应用，向受试者施用治疗有效量的本文披露的主题的组合物。“治疗有效量”是足以产生可测量的生物响应(例如，细胞毒性反应、或肿瘤消退)的治疗组合物的量。本文披露的主题的治疗组合物的活性成分的实际剂量水平可以改变，以便对于特定的受试者施用有效实现所希望治疗响应的活性化合物的量。所选择的剂量水平将取决于多种因子，其包括该治疗组合物的活性、配制品、施用途径、与其他药物或治疗的组合、肿瘤大小和寿命、以及正在治疗的受试者的健康状况和之前的病史。在一些本文披露的主题的实施例中，施用最小剂量，并且在缺乏剂量限制毒性的情况下增加剂量。确定和调整治疗有效剂量，以及评价何时和怎样做这种调整，是本领域普通技术人员已知的。
[0099]
对于诊断应用，向受试者施用可检测的量的本文披露的主题的组合物。如本文所用，“可检测的量”是指诊断组合物，指这种组合物的剂量，该组合物的存在在体内或体外可以被确定。可检测的量根据多种因素变化，包括被标记的抗体的化学特征、可检测标记、标记方法、成像方法和与其相关的参数、受试者的标记的抗体的代谢、标记的稳定性(例如，放射性核素标记的半衰期)、在施用活性剂和/或标记的抗体后和成像前所经历的时间、药物施用的途径、受试者的身体状况和既往医学史、以及肿瘤或可疑肿瘤的大小和寿命。因此，对于特定应用可检测量可以变化和修改。
附图说明
[0100]
图1：示例性抗pdgfrβvhh的氨基酸序列(适用于vhh的kabat编号，根据 riechmann和muyldermans,1999,j immunol methods[免疫学方法杂志]23:25-38)。
[0101]
图2.剂量响应elisa显示出4种代表性的vhh(克隆1b5、1d4、1e12和1h4) 对固定化人pdgfrβ的表观结合亲和力。使用兔抗vhh、darpo和opd检测结合的vhh。
[0102]
图3：在sds-page凝胶中检测hl488缀合的vhh。在15％sds-page凝胶上对总共0.1μg缀合的vhh和预染的mw梯状物进行电泳。使用d-digit荧光扫描仪 (立卡公司(licor))检测vhh结合的hl488(顶部条带)和游离hl488(底部条带)。泳道1-4：凝胶过滤批次；泳道5-8：透析批次。
[0103]
图4：使用elisa对纯化的vhh和两个批次的缀合的vhh与固定化重组pdgfr β进行的结合分析。使用兔抗vhh(批次号qe19)检测结合的vhh，然后使用驴抗兔hrp和opd作为底物。所有vhh以在纳摩尔范围的表观结合亲和力结合至pdgfr β，并且在缀合时没有观察到表观结合亲和力大幅减少。
[0104]
图5：使用elisa对纯化的vhh和irdye800cw-及nota-缀合的vhh与固定化重组pdgfrβ进行的结合分析。使用兔抗vhh(批次号qe19)检测结合的vhh，然后使用驴抗兔hrp和opd作为底物。所有vhh以在纳摩尔范围的表观结合亲和力结合至pdgfr-b，并且在缀合时没有观察到表观结合亲和力大幅减少。
[0105]
图6：vhh 1b5-生物素和与人或小鼠pdgfrβ细胞外结构域(ecd)结合的1e12
‑ꢀ
生物
素。在ecd涂覆的在maxisorp孔上捕获vhh。使用opd作为底物，使用链霉亲和素-hrp检测结合的vhh-生物素。绘制了单独测量的平均吸光度。顶部分图:与人pdgfrβ-ecd(hecd)结合。底部分图：与小鼠pdgfrβ-ecd(mecd)结合。
[0106]
图7：vhh与表达pdgfrβ的hek293细胞的结合。分图a：1b5-hl488与有或没有pdgfrβ的细胞结合。将pdgfrβ阴性的hek293或表达pdgfrβ的 hek293-pdgfrβ细胞与0.01-1000nm vhh 1b5-hl488在冰上孵育1h。n＝1，一式两份。分图b：hek293-pdgfrβ和hek293细胞中的vhh摄取。将细胞与1或10 nm vhh在37℃下孵育1h。
[0107]
图8：通过facs分析代表性的缀合抗体vhh-hl488(在37℃下，10nm 1h) 对hek293(顶部分图)或hek293-pdgfrβ细胞(底部分图)的摄取和结合。也列出了n＝1的平均荧光强度(mfi)。
[0108]
图9：vhh-hl488对hek293-pdgfrβ细胞的摄取和结合。将细胞在37℃时孵育1h并且分析hl488。分图a：具有sem的％hl488阳性细胞。分图b：显示了具有sem的三次独立实验的平均荧光强度(mfi)。
[0109]
图10.vhh-hl488对pdgfrβ表达细胞的结合与摄取。将细胞和1nm或10 vhh-hl488在37℃或4℃时孵育1h。分图a：％阳性细胞。分图b：显示了具有 sem的三次独立实验的平均荧光强度(mfi)。
[0110]
图11：用表面等离子共振(spr)评估pdgfrβ的人胞外结构域(ecd)和vhh (flag-his标记的，或和hl488、nota或800cw缀合的)的结合。将fc/his标记的 pdgfrβecd连接至和cm4传感器芯片化学缀合的蛋白质a。在0.39-50nm时测试vhh的结合。示出的是标记的或缀合的1b5 vhh的代表性的spr biacore追踪(分图a)；标记的或缀合的1d4 vhh(分图b)；标记的或缀合的1h4 vhh(分图c) 或标记的vhh 1e12(分图d)。
[0111]
图12：响应vhh的pakt和perk1/2信号传导的评估。将hhstec细胞血清饥饿24h，并且然后用5ng/ml tgf-β刺激24h。通过50ng/ml pdgf-bb诱导pakt 或perk1/2持续30min作为阳性对照。在细胞裂解之前，在37℃时将细胞和vhh 1b5、 1d4、1h4或1e12(flag-his-标记的)在1μm、100nm或10nm时孵育30min。
[0112]
图13：pakt和perk1/2条带强度的定量，相对于β-肌动蛋白归一化。将肌动蛋白一抗(西格玛奥德里奇公司(sigma-aldrich))在odyssey封闭缓冲液(立卡公司(li-cor))中稀释，并且在4℃下孵育过夜，随后是二级抗鼠和抗兔irdye 680rd 和800cw抗体(立卡公司)。在li-cor odyssey图像扫描器上扫描信号。显示了具有 sem的1-4次实验的平均值。
[0113]
图14：生物素缀合的vhh 1d4、1h4、1e12或1b5不结合人pdgfra(分图a 和b)或人egfr(分图c和d)。在直接elisa中使用pdgfra/egfr涂层和生物素-链霉亲和素-hrp检测评估vhh与人pdgfra/egfr的结合。用阳性对照抗 pdgfra/抗egfr抗体和hrp缀合的抗兔抗体确认elisa方法和pdgfra/egfr的存在。将不含一抗的孔用作阴性对照。用sem显示3-6次重复孔实验的平均值。
[0114]
图15：肾脏成纤维细胞和肌成纤维细胞中的vhh摄取。用血清饥饿和5ng/mltgfβ刺激肾脏成纤维细胞7天以将他们转化为肌成纤维细胞。将细胞与10nmvhh-hl488孵育1h(分图a)或24h(分图b)，并且使用酶标仪分析荧光含量。显示了具有sem的3次独立测量的平均值。将hek293-pdgfrb用作阳性对照(n＝1)。
[0115]
图16：在血清饥饿的tgfβ刺激的hhstec中的vhh-hl488的摄取与结合。在 37℃或4
℃下，vhh-hl488处理前在0.1-10nm，将细胞血清饥饿和tgfβ刺激1h。在facs上分析细胞。显示了tgfb处理的细胞中具有sem的两个独立实验的平均摄取(0.1nm vhh处理n＝1)。分图a：活细胞中hl488阳性细胞的百分比。分图b：活细胞的平均荧光强度。
[0116]
图17：脂质体的vhh介导的靶向和摄取。缀合至抗体1b5的载钙荧光素脂质体 (vhh与脂质体的比率是3、10、30和100)被表达pdgfrβ的细胞占据和结合。将hek293-pdgfrβ和hek293与脂质体1b5或j3rsc构建体在37℃孵育6h或在冰上孵育6h。使用酶标仪测量细胞内的钙荧光素的荧光信号。在37℃或在冰上孵育的脂质体-0被用来归一化荧光信号。显示了具有sem的2-5次独立实验的平均值。 ***；p 0.0001-0.001，****；p《0.0001，用双因素方差分析和邓尼特(dunnett)事后检验，与脂质体-0对照相比。所有其他差异是统计学上不显著的。
[0117]
图18：纤维化组织中的缀合的pdgfrβ-vhh的离体近红外成像。雄性c57bl/j6 小鼠气管内接受单剂量的博莱霉素(0.08mg/kg，在50ul pbs中)。在开始博莱霉素应用3周后，给小鼠(右侧分图)注射40μg vhh缀合物，并且在探针注射后2-6小时使用荧光介导的层析成像技术扫描整个动物。对照小鼠(左侧分图)接受仅与hiv 结合的vhh j3rsc。在最后一次体内扫描后，立即将动物安乐死，切除肺并进行离体扫描。
[0118]
实验部分
[0119]
实例1：pdgfrβ抗体的生产和测序。
[0120]
根据标准程序用重组pdgfrβ蛋白的胞外结构域(ecd)对美洲驼进行免疫。在免疫之前，将pdgfrβecd和pdgf-bb预孵育，其中pdgfrβecd以超过5 倍的摩尔量存在。据估计，pdgfr结合物和pdgf竞争性vhh应该能够从这个文库中分离。在免疫流程之后，从pbmc分离这个动物的rna。
[0121]
美洲驼文库构建
[0122]
cdna合成
[0123]
完整的28s和18s rrna清晰可见，表明rna适当的完整性。将沉淀的rna在无rna酶的mq中溶解并且测量rna浓度。使用逆转录酶试剂盒(英杰公司 (invitrogen))将约40μg rna(4次反应，每次10μg)转录成cdna。将cdna在马歇雷-纳格尔公司(macherey-nagel)的pcr清洗柱上纯化。使用在前导序列区域和ch2区域退火的引物扩增ig h(常规链和重链两者)片段。在1％tbe琼脂糖凝胶上上样5μl用作扩增的对照。图1显示这两个dna片段(约700bp和约900bp) 被扩增，分别代表vhh和vh。在此对照之后，在1％tae琼脂糖凝胶上上样剩余的样品，切断并且从凝胶中纯化700bp片段。大约80ng被用作嵌套pcr(终体积 800μl)的模板，以引入sfii和bsteii限制位点。在马歇雷-纳格尔公司(macherey-nagel) 的pcr清洗柱上纯化该扩增的片段并且在60μl洗脱。用sfii和bsteii消化所洗脱的 dna。作为限制性酶切消化的对照，在1.5％tbe琼脂糖凝胶上上样4μl该混合物。在限制性酶切消化后，在1.5％tae琼脂糖凝胶上上样样品。将400bp片段从凝胶上切断并且在马歇雷-纳格尔公司(macherey-nagel)凝胶提取柱上纯化。将纯化的400bp 片段(约330ng)连接到嗜菌粒pur8100载体(约1μg)并转化到tg1。使用10倍稀释液滴定转化的tg1。在补充了100μg/ml氨苄青霉素和2％葡萄糖的lb琼脂板上点样5μl稀释液以确定文库大小。从拯救的tg1培养物(总的终体积是8ml)的点样稀释液中计算转化体的数量。通过对最高稀释度下集落进行计数并使用以下公式计算总的转化体的数量，从而计算文库的大小：
[0124]
文库大小＝(集落量)*(稀释度)*8(ml)/0.005(ml；点样体积)。
[0125]
所有文库大小都很好，每个文库都超过了107个克隆。于-80℃将细菌储存于补充了20％甘油、2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xyt培养基中。
[0126]
噬菌体生产和筛选
[0127]
对于筛选，根据sop33生产噬菌体。文库的效价都》10
11
/ml。
[0128]
对于第一轮筛选，每个文库的20μl噬菌体沉淀物(对应于》1000倍的文库多样性)被预封闭和应用于包被着pdgfr的孔。对于这两个文库，从非包被孔洗脱非特异的结合的噬菌体。从包被孔洗脱结合噬菌体的出产物，在不同可见浓度之间有浓度依赖性富集(未显示数据)。
[0129]
为了进行第二轮筛选，将用在5μg/ml pdgfrβ(最高包被)上筛选的出产物感染的tg1培养物用于噬菌体生产。如预期输入噬菌体并且对照是空的。对于第二轮筛选，1μl噬菌体沉淀物被应用于包被着pdgfrβ的孔，在其中我们使用了pdgfr β的三个浓度，为此最低浓度应该引起最高的亲和力结合物。
[0130]
从包被孔洗脱出非常高的出产物，显示在所使用的不同浓度之间的浓度依赖性富集，表明选择了与pdgfrβ特异性结合的vhh。
[0131]
在第二轮噬菌体展示筛选后，通过感染大肠杆菌tg1拯救噬菌体并且从所有出产物中制备甘油原液。将这些以与在第一轮噬菌体展示筛选之后获得的出产物相同的方式在-80℃储存。随后，将在pdgfrβ的第1轮和第2轮选择的拯救出产物涂板，以挑选单个克隆。对于主板qpd-1，在96孔板中总共挑选了92个单克隆。为了筛选主板qpd-1中的pdgfrβ结合物，生产了包含单克隆vhh的周质提取物。为了通过elisa测试单克隆vhh的结合特异性，将pdgfrβ(2μg/ml pbs)在maxisorp 板上在4℃包被过夜。来自于tilly文库的大多数克隆能够特异性结合pdgfrβ。一些良好的结合vhh也选自非免疫文库(数据未显示)。
[0132]
vhh的序列分析
[0133]
为了确定所选择的vhh克隆的多样性，挑选peri elisa的结合物的亚型并且进行测序。图1显示4种不同的vhh序列qpd-1b5、qpd-1d4、qpd-1e12、和qpd-1h4 的序列比对，这些序列来源于三种不同的种系家族(kglew、kerel和keref)。
[0134]
实例2：剂量响应elisa
[0135]
示例性pdgfrβvhh的表观结合亲和力用使用96孔maxisorp板的elisa测试，该板用无菌pbs中的50μl 2μg/ml pdgfrβecd(伊普瑞斯科技公司，乌德勒支 (u-protein express,utrecht))抗原包被。将一系列稀释的vhh添加至包被孔并且从 1000nm开始在室温下孵育1小时。用兔抗vhh、darpo检测结合的vhh并且用opd80使其可见。所有vhh显示和固定化pdgfr抗原结合(参见图2)。有趣的是， qpd-1d4和qpd-1h4具有低于1nm的表观亲和力。qpd-1b5的表观亲和力是约1 nm，并且qpd-1e12的表观亲和力是大约10nm。
[0136]
在合适的表达载体上将所测试的4个克隆重新克隆，以便根据公开的方法 (heukers等人antibodies[抗体]2019,8(2),26)在细菌的或酵母宿主细胞中产生。为此，将vhh基因克隆至pmek222载体用于在大肠杆菌中生产，其提供了带有c
‑ꢀ
末端flag-his标签的vhh。vhh是使用固定化金属亲和色谱(imac，赛默飞世尔科技公司沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国(thermo fisher scientific waltham,ma,usa)) 从大肠杆菌tg1中生产和纯化的。
[0137]
对于酵母生产，在pyqvq11载体中重新克隆vhh基因用于在酵母中生产vhh，其提供
了带有c-末端c-直接标签的vhh，其含有游离硫(半胱氨酸)和epea(glu、 pro、glu、ala)纯化标签(c-标签，赛默飞世尔科技公司(thermo fisher scientific))。为了提高生产产量并且促进从上清液纯化，在几种1l的酿酒酵母培养物中生产 c-direct-标记的vhh，并且根据制造商的方案通过赛默飞世尔公司(thermo fisher) 的亲和色谱抗epea(c-标签)柱纯化。将纯化的vhh过滤除菌并且储存在pbs中。实例3：缀合抗体的制作和表征
[0138]
这个实例描述了各种vhh缀合物的制备和表征。使用本领域已知的方法 (heukers等人,antibodies[抗体]2019,8(2),26)，将vhh位点定向缀合至生物素-马来酰亚胺(pierce,赛默飞世尔科技公司(thermofisherscientific))、hilyte fluor 488
‑ꢀ
马来酰亚胺(anaspec)、irdye800cw-马来酰亚胺(立卡生物科学公司(li-corbiosciences))或nota-马来酰亚胺螯合剂(chematech)。
[0139]
首先，将vhh和2.75倍摩尔过量的tcep(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)(vwrinternational公司，拉德诺(radnor)，宾夕法尼亚州(pa),美国)孵育，以减少c
‑ꢀ
末端半胱氨酸，在37℃下vhh在其上与过量的马来酰亚胺-缀合的标记物孵育2h。
[0140]
根据制造商的方案，通过使用两个随后的zeba脱盐柱(赛默飞世尔科技公司) 的尺寸排阻色谱去除游离标记。对于荧光基团，使用multiskan go分光光度计(赛默飞世尔科技公司)确定缀合程度，并且在d-digit或odyssey扫描仪(立卡生物科学公司(li-cor biosciences))上通过sds-page(美国伯乐公司(bio-rad))进行尺寸分离后确定游离染料的量。随后，用page blue(赛默飞世尔科技公司)将sds-page 凝胶染色以显示缀合蛋白的整合。
[0141]
实例3a
[0142]
这个实例描述了vhh缀合至hilyte-488(hl488)的表征，其是一种广泛使用的荧光团，可以和fitc和alexa 488相比。
[0143]
图3显示hl488缀合的vhh的sds-page分析以确定缀合效率。在15％ sds-page凝胶上对总共0.1μg缀合的vhh(克隆1e12、1b5、1h4和1d4)和预染的mw梯状物进行电泳。使用d-digit荧光扫描仪(立卡生物科学公司(licor)) 检测vhh-结合的hl488(顶部条带)和游离hl488(底部条带)。凝胶过滤批次(泳道1-4)只包含vhh-结合的hl488，而在透析批次中(泳道5-8)仍然有一些游离染料。这些数据显示所有代表性的vhh都成功缀合至hl488。
[0144]
然后，使用上文描述的elisa测定确定4个纯化的qpd克隆和两个批次的 hl488-缀合的qpd克隆与固定化重组pdgfr-b的结合。使用兔抗vhh(批次号 qe19)检测结合的vhh，然后使用驴-抗-兔-hrp和opd作为底物。发现所有(缀合的)vhh以在纳摩尔范围的表观结合亲和力结合至pdgfr-b，并且未观察到缀合时表观结合亲和力的急剧减少。参见图4。
[0145]
实例3b
[0146]
这个实例描述了代表性vhh和nota-马来酰亚胺螯合剂或和近红外染料和 irdye-800cw的表征，其被广泛用于近ir光学成像中。
[0147]
图5显示将纯化的vhh克隆、irdye800cw-或nota-缀合的vhh克隆使用 elisa的固定化重组pdgfr-b的结合。使用兔＝抗-vhh(批次号qe19)检测结合的vhh，然后使用驴-抗-兔hrp和opd作为底物。
[0148]
发现所有vhh以在纳摩尔范围的表观结合亲和力结合至pdgfr-b，并且在缀合时没有观察到表观亲和力大幅减少。
[0149]
实例5：种间杂交反应性
[0150]
在这个实例中，使用生物素-链霉亲和素elisa评估生物素缀合的vhh 1b5和 1e12对人或者小鼠pdgfrβ细胞外结构域(ecd)的结合亲和力。将人或小鼠pdgfr βecd包被在免疫测定孔上，在其中捕获1b5-生物素或1e12-生物素。使用链霉亲和素-hrp和odp作为底物检测结合。
[0151]
elisa法
[0152]
将96孔maxisorp(nunc)免疫吸附板用pbs中的1ug/ml或2ug/ml的pdgfrβ胞外结构域(ecd；fc-和his-标记的，义翘神州科技股份有限公司(sino biological)) 或小鼠pdgfrβecd(r&d系统公司(r&d systems))4ug/ml包被，每个孔100ul，在4c下过夜。将孔在pbs中洗涤三次。在室温下将非特异性结合位点在4％bsa/pbs 中封闭1h，随后在pbs中洗涤三次。vhh 1b5-生物素或1e12-生物素(在0.01-100nm 在1％bsa/pbs中稀释)被允许在常室温下在ecd上结合1h，随后在pbs中洗涤三次。链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化酶(hrp；genetex)在1％bsa/pbs中以1:10,000 稀释，并且在室温下孵育1h。将孔在pbs中洗涤6次。邻苯二胺二盐酸盐(opd；西格玛安德里奇公司)，在0.05m磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中ph 5.0和0.03％过硼酸钠(西格玛安德里奇公司)被用作hrp底物(以0.4mg/ml)，其根据制造商的建议制备，并且以每个孔100ul的体积使用。反应被允许在室温下在黑暗中进行30min，并且通过添加50ul 1.5m hcl终止。在synergy h1微量酶标仪(伯腾仪器有限公司 (biotek))上在492nm下测量光密度。
[0153]
数据分析、统计学分析
[0154]
从存在pdgfrβecd的特异性信号中减去在缺乏pdgfrβecd的非特异结合的吸光度。使用prism 8(graphpad)软件在xy图中绘制来自独立实验(在hecd 上的1b5-生物素n＝3，在hecd上的1e12-生物素n＝1，在mecd上n＝2)的平均吸光值，具有平均值的标准差(s.e.m.)。使用非线性回归模型和对数(抑制剂)相比于响应的方程、可变斜率四参数分析数据。0nm vhh-生物素的布兰克(blanc)吸光度值为10-12。结果显示于图6中。
[0155]
vhh 1b5-生物素被捕获在人pdgfrβecd包被的(1ug/ml)maxisorp板上，以0.01-100nm。结合在1nm的1b5-生物素(log-9摩尔)到达平台期。ec50被确定为1,171x10-10 m vhh 1e12-生物素在0.01-100nm浓度时被捕获在固定化人 pdgfrβecd(2ug/ml)上。
[0156]
这些数据显示1b5-生物素有效地结合至人pdgfrβ，而1e12-生物素只适度地结合。发现1b5-生物素对小鼠的ecd的亲和力是弱的。相反地，1e12-生物素与小鼠 ecd交叉反应。1e12-生物素在10nm时达到结合平台期，并且ec50被确定为1,1x10-9 m。
[0157]
综上所述，发现1b5-生物素和人pdgfrβ强烈连接(ec50为1,171x10-10 m)，而其和小鼠pdgfrβ的亲和力差。有趣的是，相反地，1e12-生物素与小鼠pdgfrβ有强的亲和力(ec50为1,1x10-9 m)，并且与人pdgfrβ的亲和力适中。
[0158]
实例6：将抗体结合至表达人pdgfrβ的哺乳动物细胞。
[0159]
为了阐明抗体与完整细胞上表达的pdgfrβ的结合活性，确定了本发明的4个示例性缀合抗体与用pdgfrβ稳定转染的人胚肾(hek293)细胞的结合。
[0160]
细胞
[0161]
根据制造商的方案使用idimerize诱导型二聚化系统(克隆技术实验室公司，宝生物公司，日本(clontech laboratories,inc,a takara bio company,jp))生产稳定表达人
pdgfrβ(hek293-pdgfrβ)的hek293细胞。在杜氏改良eagle培养基(高葡萄糖)(dubecco’s modified eagle medium)中培养细胞，补充有10％fbs、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸、1％l-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和300ug/ml潮霉素。 hek293细胞(对照细胞)购自ecacc/西格玛奥德里奇公司并且在杜氏改良eagle 培养基(高葡萄糖)( 10％fcs 1％青霉素/链霉素 1％l-谷氨酰胺)中培养。
[0162]
抗体
[0163]
如以上描述的生产缀合的vhh-hl488抗体并且使用或者凝胶过滤或者透析进行纯化。凝胶过滤批次指的是“vhh-hl488”，并且透析批次指的是“vhh-hl488透析”。
[0164][0165][0166]
酶标仪测定
[0167]
通过胰蛋白酶分离烧瓶中生长的细胞，计数并在10％fbs/pbs中重悬，并且分装在包含200,000个细胞/处理的微量离心管中。在开始vhh处理以获得靶向温度之前，将细胞在冰上、或者在4℃或在37℃下孵育至少20min。将vhh-hl488以 0.01-1000nm添加至细胞悬液中并且将处理物在冰上、4℃或者在37℃下孵育1h。将细胞在冷的pbs中洗涤三次。将沉淀的细胞重悬于总共200ul的pbs中，并且将其上样至黑色96孔板用于在synergy h1微量酶标仪(伯腾仪器有限公司)上在488/530 nm处测量荧光，使用增益为100的顶部测量。
[0168]
facs测定
[0169]
根据如上所述，用0.01-1000nm的vhh-hl488，在4℃或者在37℃下在10％ fbs/pbs中处理细胞1h。将细胞在pbs中的2％fbs、5mm edta中洗涤两次，然后在分析前，在添加最终浓度为0.1ug/ml的pi之前，也在pbs中的2％fbs、5mmedta中洗涤。使用macsquant仪器进行facs。数据以活细胞群中hl488-阳性细胞的百分比或平均荧光强度(mfi)表示。
[0170]
数据分析、统计学分析
[0171]
3次独立实验的数据以平均值示出，除非另有说明。透析批次：n＝1-2。
[0172]
结果
[0173]
通过酶标仪分析vhh-hl488对hek293-pdgfrβ的摄取和结合
[0174]
使用稳定表达pdgfrβ的hek293细胞(hek293-pdgfrβ)评估vhh对pdgfr β的结合和摄取。缺乏pdgfrβ的hek293细胞作为阴性对照。首先，评估vhh的细胞结合。为了预防vhh摄取和为了允许结合的发生，将细胞和1b5-hl488在冰上孵育1h。通过洗涤去掉未结合的化合物，使用酶标仪测量通过细胞结合的残留的荧光。
[0175]
hek293-pdgfrβ细胞展现出1b5-hl488的剂量依赖性结合，其中1nm似乎是检测限度。在1000nm时，信号仍然未饱和。hek293对照细胞不结合1b5-hl488 (看图7a)。这些数据表明1b5-hl488与细胞结合，并且细胞结合取决于pdgfrβ。
[0176]
然后，在hek293-pdgfrβ和hek293细胞中评估更广泛筛选的vhh (1b5-hl488、1d4-hl488和1h4-hl488)的摄取。在37℃孵育允许细胞结合vhh 以及可能的内化vhh。将细胞在10nm或1nm vhh时孵育1h。在洗涤后，使用酶标仪测量细胞中残留的荧光。hek293-pdgfrβ有效地占据和结合所有测试的vhh。相反，hek293不占据任何测试的vhh(参见图7b)。这阐明hl488标记的1b5、 1d4和1h4被细胞结合和/或占据，并且该摄取取决于pdgfrβ。
[0177]
通过facs分析vhh-hl488对hek293-pdgfrβ的结合和摄取
[0178]
vhh的摄取和结合进一步用facs分析。将hek293和hek293-pdgfrβ细胞和10nm hl488-标记的1b5、1d4、1h4或1e12在37℃下孵育1h并且测量荧光含量。非转染hek293显示没有vhh摄取/结合。hek293-pdgfrβ，相反地，占据或结合所有测试的vhh。1b5-hl488、1d4-hl488和1h4-hl488通过hek293-pdgfr β有效地占据/结合，而1e12-hl488没有这么有效(如图8所示)。
[0179]
这些数据表明vhh 1b5-hl488、1d4-hl488、1h4-hl488和1e12-hl488以 pdgfrβ依赖的方式被细胞结合或占据。1b5-hl488、1d4-hl488、1h4-hl488似乎比1e12-hl488更有效地识别pdgfbr。
[0180]
在hek293-pdgfrβ细胞中的vhh-hl488的剂量响应
[0181]
然后，在hek293和hek293-pdgfrβ细胞中评估vhh检测范围。
[0182]
所有四种vhh被表达pdgfrβ的细胞结合和/或占据。当观察hl488阳性细胞的比例或者活细胞的平均荧光强度时，hl488缀合的1b5、1d4和1h4在高达0.1nm 是可检测的。1e12-hl488在更高浓度下可检测地结合或占据；观察hl488阳性群体的百分比为10nm时，观察mfi为100nm。参见图9。
[0183]
这些发现表明1b5-hl488、1d4-hl488和1h4-hl488的检测限度是0.1nm，并且1e12-hl488是100nm。
[0184]
通过facs分析vhh-hl488的摄取与结合
[0185]
为了区分细胞结合和内化，在37℃(结合和摄取)或者在4℃(结合)将 hek-pdgfrβ细胞用1-10nm vhh-hl488处理1h并且用facs分析。
[0186]
hl488阳性细胞的比例在响应冷处理时没有改变。但是，mfi显示在4℃时 1b5-hl488信号大约为37℃时的52％-58％。1d4-hl488的结合的贡献是总信号的 53％-61％，并且1h4-hl488的结合贡献为65％-66％。参见图10。因此，总的hl488 信号的大部分似乎是由于vhh细胞表面结合。
[0187]
也测试了透析-纯化的缀合的vhh。在facs中评估透析的vhh-hl488缀合物的剂量响应。1b4和1d4在1nm和1h4在10nm用facs是可检测的(数据未示出)。实例6：vhh及其缀合物的biacore spr分析
[0188]
这个实例描述了使用表面等离子共振分析(spr)对多种vhh进行的结合参数的分析。
[0189]
材料和方法
[0190]
如上文所述合成vhh 1b5-flag-his、1b5-nota、1b5-800cw、1b5-hl800、 1d4-flag-his、1d4-nota、1d4-800cw、1d4-hl488、1h4-flag-his、1h4-nota、 1h4-800cw、1h4-hl488和1e12-flag-his。
[0191]
带有fc和his标签的pdgfrβ细胞外结构域(ecd)购自义翘神州科技股份有限公司。金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)来源的蛋白质a购自西格玛公司 (sigma)(p7837)。
[0192]
表面等离子共振(spr)
[0193]
使用biacore 3000仪器(ge医疗(ge healthcare))进行spr分析。根据伯胺程序，蛋白质a化学性结合至cm4传感器芯片(ge医疗)上，大约2100个响应单元 (ru)。fc/his-标记的pdgfrβecd在0.4-2.07ng/ul时以35ul/min的流速结合至蛋白质a。电泳缓冲液hbs-ep(ge医疗；0.01m hepes ph 7.4、0.15m nacl、3mmedta、0.005％v/v表面活性剂p20)被用于vhh 1d4、1h4和1e12缀合物，在50、 25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78和0.39nm。对于1b5缀合物，hbs-ep 0.5m nascn 被用作电泳缓冲液以减少无pdgfrβecd的对照路径的非特异结合。70ul/min的流速被用于vhh注射，体积为150ul。通过三个连续注射约30s 10mm甘氨酸-hcl ph 2、10mm甘氨酸-hcl ph 1.5、和0.5m nascn/10mm naoh进行传感器cm4芯片的再生。
[0194]
数据分析
[0195]
从特异性信号减去非特异结合至对照路径的信号。使用bia软件进行数据分析，使用lammli 1:1曲线拟合模型，除非另有说明。
[0196]
代表性结果显示于图11。
[0197]
实例7：评估perk和pakt的活性对vhh结合的响应
[0198]
在这个实例中，研究了pdgfrβ的可能活化对本发明的示例性vhh的响应。磷酸化的erk1和erk2(perk)或akt(pakt)被用作pdgfrβ活性的下游信号传导标记物。
[0199]
材料和方法
[0200]
细胞
[0201]
人肝脏星形细胞(hhstec)购自sanbio并且在2％fbs、1％青霉素/链霉素、1％生长因子的干细胞培养基中培养。
[0202]
抗体
[0203]
vhh 1b5、1d4、1h4和1e12，生产每个flag/his-标签。重组人tgfβ(100-21) 和重组人pdgf-bb(100-14b)购自peprotech公司。
[0204]
蛋白质印迹
[0205]
将hhstec细胞接种在包被了聚l-赖氨酸的12-孔板上的完全生长培养基中，并且使其粘附直到第二天。用pbs洗涤细胞并且添加饥饿培养基(0％fbs和生长因子)。24h后，用5ng/ml tgfb刺激细胞。添加tgfb后24h，将细胞用50ng/ml pdgf-bb (大约2,1nm；阳性对照)或1um、0.1um、0.01um的vhh-flag/his处理30min。将细胞放置在冰上并且用冰冷的pbs洗涤，并且在孔中使用sds样品缓冲液和10％巯基乙醇直接裂解。将裂解物超声处理并且将其在10％sds凝胶上分离并且使用标准蛋白质印迹技术将其在pvdf细胞膜上转移。兔pakt
(ser473)、兔perk1/2 (thr202/tyr204)(细胞信号传导公司(cell signaling))和小鼠β-肌动蛋白。
[0206]
数据分析、统计学分析
[0207]
使用奥德赛成像工作室(odyssey image studio)软件(立卡公司(li-cor))对条带强度进行定量。pakt或perk1/2信号用被用作上样对照的β-肌动蛋白信号进行归一化。绘制具有sem的1-4次独立实验的平均条带强度。
[0208]
结果
[0209]
评价vhh 1b4、1d4、1h4和1e12活化纤维化细胞中的pdgfrβ信号传导的潜能。将人肝脏星形细胞血清饥饿24h并且用tgfb活化24h以刺激成纤维细胞转化为肌成纤维细胞并且假定pdgfrβ表达增强。将细胞用人pdgf-bb(50ng/ml；大约2,1nm)处理30min作为阳性对照用于pakt和perk1/2的诱导。
[0210]
如图12和13所示，在任何测试浓度细胞和vhh的孵育对pakt没有影响，表明1b5、1d4、1h4和1e12不活化pdgfrβ-akt通路。perk1/2活性仍然处于对照处理在10或100nm的水平。perk1/2只有在最高浓度1μm时被活化，但其是非生理性高的vhh浓度。
[0211]
这些结果表明肌成纤维细胞暴露在vhh中对通过pi3k-akt的(激动性)pdgfr β信号传导无影响。此外，在肌成纤维细胞中，通过ras-raf-mek1/2-erk1/2信号传导的pdgfrβ信号传导不受vhh浓度的影响，该浓度被认为是生理性相关的。实例8：vhh-生物素缀合物的受体特异性。
[0212]
在这个实例中，研究了本发明的代表性的vhh和pdgf受体家族成员pdgfra 及表皮生长因子受体egfr的交叉反应的受体特异性。
[0213]
材料和方法
[0214]
化合物
[0215]
vhh 1b5-生物素批次2(50um，接受于2020年6月10日)、1d4-生物素批次1 (38.2um，接受于2020年2月19日)、1h4-生物素批次1(41.3um，2020年2月 19日)和1e12-生物素批次1(50.5um，接受于2019年5月21日)由qvq提供。
[0216]
elisa
[0217]
将96孔maxisorp(nunc)免疫吸附板用pbs中的2ug/ml人pdgfra(义翘神州科技股份有限公司；批次号：10556-hcch)或2ug/ml人egfr/her1/erbb1蛋白 (his标签，义翘神州科技股份有限公司；批次号：10001-h08h)包被，每个孔100ul，在4c下过夜。将孔在pbs中洗涤三次。在室温下将非特异性结合位点在4％bsa/pbs 中封闭1h，随后在pbs中洗涤三次。将在1％bsa/pbs中以0.01-100nm稀释的vhh
‑ꢀ
生物素缀合物在室温下孵育1h，随后在pbs中洗涤三次。链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化酶(hrp；genetex)在1％bsa/pbs中以1:40,000稀释，并且在室温下孵育1h。将pdgfra或egfr用在1％bsa/pbs中以1:5000稀释的阳性对照抗体兔抗-人 pdgfra/cd140a抗体(批次号：10556-r065)或兔抗-人egfr/her1/erbb1(批次号：10001-r021，二者均来自于义翘神州科技股份有限公司)检测，并且在室温下震荡孵育1h。第二hrp-缀合的抗-兔-抗体以1:5000在1％bsa/pbs稀释并且在室温下震荡孵育1h。将孔在pbs中洗涤6次。邻苯二胺二盐酸盐(opd；西格玛安德里奇公司)，在0.05m磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中ph 5.0和0.03％过硼酸钠(西格玛安德里奇公司)被用作hrp底物(以0.4mg/ml)，其根据制造商的建议制备，并且以每个孔100ul的体积使用。反应被允许在室温下在黑
暗中进行30min，并且通过添加50ul 1.5m hcl终止。在synergy h1微量酶标仪(伯腾仪器有限公司)上在492nm下测量光密度。
[0218]
数据分析
[0219]
计算来自重复孔的平均信号。从存在pdgfra或egfr的信号中减去缺乏 pdgfra或egfr时非特异vhh-生物素结合的吸光度。使用prism 8(graphpad)软件将来自于3-6次实验的具有sem的平均吸光值绘制在xy图上。使用非线性回归模型和对数(抑制剂)相比于响应的方程、可变斜率四参数分析数据。0nm vhh-生物素的布兰克吸光度值为10-12
。
[0220]
结果
[0221]
结合至人pdgfra
[0222]
使用elisa评估结合至人pdgfra的vhh生物素，其中孔用pdgfra包被，并且以opd作为底物使用链霉亲和素-hrp检测vhh-生物素结合。
[0223]
在0.01-100nm下孵育vhh-生物素显示对pdgfra没有亲和力(参见图14a)。相反地，将包被在孔中的pdgfra用抗pdgfra抗体和hrp缀合的抗兔抗体有效地检测到，证明了功能性pdgfra的存在(图14b)。
[0224]
结合至egfr
[0225]
在egfr包被的elisa测定板上评估生物素缀合的1b5、1d4、1h4和1e12的亲和力。在0.01-100nm测试时，没有vhh显示出对egfr的亲和力(参见图14c)。然而使用抗egfr抗体和hrp缀合的抗兔抗体，可检测到egfr，表明测定功能(图 14d)。
[0226]
这些数据显示没有vhh结合至pdgfra或egfr，表明vhh不与相似受体交叉反应。
[0227]
实例9：被人原发性成纤维细胞结合和摄取的抗体
[0228]
通过血清刺激和tgfβ处理刺激肾脏成纤维细胞用于肌成纤维细胞转化，并且研究肾脏成纤维细胞占据vhh-hl488的能力。在酶标仪上测量荧光细胞。将人肝脏星形细胞进行血清饥饿和tgfβ-刺激用于肌成纤维细胞转化，并且使用facs研究其 vhh-hl488摄取和结合。
[0229]
材料和方法
[0230]
细胞
[0231]
离体的人肝星形细胞hhstec购自sciencell/sanbio bv。在聚-l-赖氨酸包被的(2 ug/cm2；所有试剂来自sciencell)t-75组织培养瓶和12孔板上，使用sciencell推荐的细胞培养技术，在补充有2％fbs、1x星形细胞生长补充剂、100u/ml青霉素和100 ug/ml链霉素的星形细胞培养基中培养细胞。从ruud bank(umcg)获得的肾成纤维细胞在补充了10％fbs、1％青霉素/链霉素的dmem中生长。
[0232]
成纤维细胞对肌成纤维细胞的刺激和细胞治疗
[0233]
将肾脏细胞接种在12-孔板上，并且使其粘附直到第二天。在0.5％fbs 1％p/s 0.17mm抗坏血酸(vitc)中将细胞饥饿处理18h。用5ng/ml tgfb(peprotech 100-21c) 刺激细胞6天，每天更换培养基。在刺激第6天，添加vhh 24h。在刺激后7天，添加vhh 1h和0h，并且收获细胞。
[0234]
将人肝脏星形细胞涂板在聚l-赖氨酸包被的12-孔板并且允许粘附。将细胞在0％ fbs、0％生长因子、饥饿培养基中饥饿过夜。在vhh处理前用5ng/ml tgfb刺激细胞24h。在收获前在37℃或在4℃下以0.1-10nm添加vhh 1h。
[0235]
酶标仪测定
[0236]
轻柔去除培养基并且在pbs中洗涤细胞一次。用胰蛋白酶分离细胞，并且收集在10％fbs/pbs中。通过离心沉淀细胞并且重悬于200ul pbs中，并且将其上样到黑色96孔测定板。在488nm下使用顶部光学器件在synergy h1酶标仪上测量荧光。
[0237]
facs测定
[0238]
洗涤并用胰蛋白酶分离细胞。洗涤细胞两次并将其重悬于pfe中。在使用facsverse分析细胞前，以0,1ug/ml添加碘化丙锭。基于pi含量排除死细胞，并且基于活细胞的hl488含量对其进行分析。测量比例或hl488阳性细胞和活细胞的平均荧光强度。
[0239]
数据分析
[0240]
示出了在肾脏成纤维细胞实验中的3次独立测量的平均值。显示了具有sem的两次hhstecs独立实验的平均值。
[0241]
结果
[0242]
肾脏成纤维细胞中的vhh摄取
[0243]
评估肾脏成纤维细胞和肌成纤维细胞中vhh-hl488摄取。在37℃时用10nmvhh-hl488处理成纤维细胞和肌成纤维细胞1h或24h，并且在酶标仪上分析产生的细胞荧光。hek293-pdgfrb细胞被用作阳性对照。
[0244]
在孵育1h后，在肾脏成纤维细胞和肾脏肌成纤维细胞中均检测到1b4和1h4 的适度摄取；和0h对照相比，大约1.8-2x增加。hek293-pdgfrb阳性对照显示在 1h后1b5的摄取和1h4的摄取(图15a)。在孵育24h后，在肾成纤维细胞和肾肌成纤维细胞两者中1b5、1d4和1h4的摄取更显著。与对照细胞相比1b5信号增加了6x、1h4增加了3-4x并且1d4信号增加了7-8x(图15b)。在肾成纤维细胞和肌成纤维细胞间没有检测到vhh摄取的差异。
[0245]
人肝星形细胞中的vhh摄取和结合
[0246]
使用facs评估人肝星形细胞(hhstec)中vhh-hl488的摄取和结合。
[0247]
首先，评估血清饥饿和tgfb刺激的影响。将在完全生长培养基中生长的细胞或用tgfb刺激的饥饿细胞的vhh-hl488摄取进行比较。血清饥饿和tgfb刺激造成细胞形态学的改变、以及必须调整，并且细胞群的门控必须调整；因此，将完全生长培养基中的细胞和血清饥饿和tgfb刺激的细胞分别与他们各自的0nm vhh对照进行比较。和在完全生长培养基中生长的细胞相比，血清饥饿和tgfb刺激增强了vhh 的细胞摄取(数据未示出)。由于非处理细胞的vhh摄取非常低，随后的实验只在血清饥饿和tgfb刺激的细胞中进行。
[0248]
然后，进一步评估hhstec中的vhh摄取。在37℃下用0.1-10nm vhh-hl488 处理血清饥饿的tgfb-刺激的hhstec 1h。检测了在10nm和1nm时1b5、1d4和1h4摄取，然而细胞不占据1e12。参见图16。
[0249]
在vhh处理期间通过在4℃孵育细胞将细胞摄取与结合分离。在分析细胞荧光前在4℃将血清饥饿、tgfb刺激的hhstec与0.1-10nm vhh-hl488孵育1h。
[0250]
vhh 1b5结合似乎对总的细胞荧光的大部分有贡献；在37℃(摄取和结合)孵育细胞，相比于4℃(结合)不会引起更高的信号。同样地，1h4单独结合似乎对总的荧光的大部分有贡献。相反地，1d4在4℃孵育大大地减少了细胞荧光，表明发生了细胞摄取。
[0251]
这些数据表明原发性人细胞占据并结合本发明的vhh。
[0252]
实例10：通过表达pdgfrβ的细胞的vhh-缀合的脂质体的摄取和结合
[0253]
这个例子总结了抗体介导的脂质体配制品靶向表达pdgfrβ的细胞的摄取和结合实验。
[0254]
疾病-靶向脂质体是有吸引力的治疗化合物载体，由于他们具有将高的药物载量特异性递送至靶向细胞的潜力，同时是生物可降解的并显示出低毒性。vhh 1b5是一种根据本发明的示例性pdgfrβ-特异性纳米抗体，其有效识别pdgfrβ并且被人表达pdgfrβ的细胞内化。为了阐明1b5可以作为脂质体药物载体的pdgfrβ靶向分子，制造了一系列荧光标记的1b5脂质体，以及hiv靶向的j3rsc纳米抗体-脂质体作为阴性对照。在用人pdgfrβ稳定转染的人胚肾细胞hek293(hek293-pdgfrβ) 中研究1b5脂质体和j3rsc脂质体的细胞识别和内化。不表达pdgfrβ的hek293 细胞被用作阴性对照。用酶标仪测量的细胞荧光被用作结合和/或摄取的读值。
[0255]
材料和方法
[0256]
化合物
[0257]
脂质体由二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇和聚(乙二醇)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺组成，并且含有20mm钙荧光素和0.1mol％罗丹明磷脂酰乙醇胺(pe)。
[0258]
使用传统的程序获得脂质体缀合物(批次12.3.2020，所有脂质10mm)。简而言之，通过后插入技术转移选择的纳米抗体，其中胶束包括马来酰亚胺-peg-dspe，并且将peg-dspe和脂质体在升高的温度下孵育(allen tm等人,use of thepost-insertion method for the formation of ligand-coupled liposomes[使用插入后方法用于形成配体偶合脂质体]，cellular&molecular biology letters[细胞与分子生物学快报] 2002,7(3):889-94)。将vhh 1b5或vhh j3rsc(源自qvq)以0、1、3、10、30或 100纳米抗体/脂质体的比率缀合至脂质体。没有纳米抗体的非靶向脂质体被用作阴性对照。
[0259]
细胞系
[0260]
hek293细胞购自ecacc/西格玛安德里奇公司并且在补充了10％fcs和1％青霉素/链霉素的dmem(高葡萄糖)中培养。由新西兰制药公司(zealand pharma)构建和获得稳定表达pdgfrβ的hek293细胞(hek293-pdgfrβ)。使用idimerize
tm
可诱导的异源二聚体系统(目录号635067，宝生物公司(takara bio))创建该细胞系。在杜氏改良eagle培养基(dmem，高葡萄糖)中培养hek293-pdgfrβ，该培养基补充了10％fbs、1％丙酮酸钠、1％非必需氨基酸、1％l-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和300ug/ml潮霉素。
[0261]
酶标仪
[0262]
将在培养瓶中生长的细胞用胰蛋白酶消化并计数。将细胞以2百万个细胞/ml的密度在完全生长培养基中重悬，并且将其等分至微量离心管中，100ul体积中包含 200.000个细胞。其中使用冷孵育，细胞在冰上孵育20min以在添加vhh之前达到靶向温度。将脂质体-vhh缀合物涡旋，添加至细胞悬液并且轻轻混合轻轻。将细胞在37℃或在冰上孵育指定的时间直到在1ml冷的pbs中洗涤三次。在pbs中重悬细胞沉淀，最终体积为200ul，并且将其上样至黑的96孔板，用于在synergy h1微量酶标仪(伯腾仪器有限公司)上在485/528nm(钙荧光素)和560/601nm(罗丹明 pe)测量荧光，使用增益为100的顶部光学器件。
[0263]
数据分析、统计学分析
[0264]
将没有vhh(脂质体-0)的非靶向对照脂质体用作用于归一化原始荧光值的参比样品。来自多个独立实验的平均归一化荧光用平均值的标准误(sem)示出。重复的次数如图例
所指示。
[0265]
使用prism 8软件(graphpad)和双因素方差分析和邓尼特多重比较检验(dunnett’smultiple comparison test)分析数据，其中非靶向的脂质体0作为对照样品。图例；ns. 统计学上无显著差异；p≥0.05，*；p＝0.01-0.05，**；p＝0.001-0.01，***；p＝0.0001-0.001， ****；p《0.0001。
[0266]
结果
[0267]
由hek293-pdgfrβ细胞占据1b5-脂质体
[0268]
产生了有不同纳米抗体-对-脂质体比率(范围是1、3、10、30和100)的pdgfrβ靶向的脂质体。j3rsc是一种识别hiv和在人细胞中没有表位的vhh纳米抗体，并且被用来产生作为阴性对照的j3rsc脂质体。脂质体装载有钙荧光素，其在脂质体制备中的高浓度下自淬灭，并且细胞溶质内脂质体释放和钙荧光素的稀释引起荧光增加。该脂质双分子层被罗丹明pe标记，其使质膜在细胞膜融合时产生荧光。
[0269]
在37℃孵育hek293-pdgfrβ细胞和500um 1b5-脂质体-100，该允许细胞结合和占据化合物的温度引起3.4倍的钙荧光素荧光增加。在冰上孵育hek293-pdgfrβ，其阻断了活性摄取过程，导致更低的钙荧光素信号，比非靶向的对照低1.8倍。在37℃时在hek293-pdgfrβ中1b5-脂质体-100的罗丹明pe信号增加了2.4倍，并且冰上孵育减少了信号(数据未示出)。
[0270]
这些发现表明1b5-脂质体-100既被细胞结合也被其占据。该内化是特异的并且是pdgfrβ依赖性的，因为hek293占据非脂质体构建体，并且hiv-靶向的j3rsc
‑ꢀ
脂质体-100没有被任何一个细胞系占据(数据未示出)。
[0271]
为了研究就细胞摄取而言，什么比率的纳米抗体和脂质体缀合物是最有效的，测试了比率为1、3、10、30和100的1b5纳米抗体和脂质体构建体。将hek293-pdgfrβ和hek293细胞与500um脂质体构建体在37℃或在冰上孵育6h。钙荧光素荧光显示以3、10、30和100的比率的1b5-脂质体缀合物在37℃都能有效地被 hek293-pdgfrβ吸收，但不能被hek293吸收，并且其信号在冰上孵育后很大程度被抑制(图17)。罗丹明信号同样显示在3、10、30和100的比率的纳米抗体/脂质体中有效的1b5-脂质体摄取(数据未示出)。在冰上孵育阻止了1b5-脂质体10、30和 100的摄取，但未阻止比率为3的脂质体的摄取。j3rsc-脂质体构建体不能被 hek293-pdgfrβ或者hek293细胞结合或占据。
[0272]
这些数据显示1b5-脂质体构建体被细胞的活性过程占据，并且该摄取和结合通过pdgfrβ发生。每个脂质体3、10、30和100个纳米抗体的缀合比例是合适的比率，而每个脂质体1个纳米抗体不能有效结合或摄取。
[0273]
脂质体-1b5的摄取是时间依赖性的
[0274]
然后，进行了1b5-脂质体摄取的时间过程实验。将hek293-pdgfrβ细胞与1b5
‑ꢀ
脂质体-100或与阴性对照非靶向的脂质体-0或hiv-靶向的j3rsc-脂质体-100孵育0h、 1h、3h或6h。发现来自于非靶向的脂质体-0对照的背景钙荧光素荧光随着时间增加，因此1b5-脂质体和j3rsc-脂质体每个时间点的值用其自己的脂质体-0对照进行归一化。非特异的罗丹明荧光不随着时间而变化(数据未示出)。
[0275]
hek293-pdgfrβ显示时间依赖性的1b5-脂质体摄取。在孵育0h和1h后，基于钙荧光素荧光观察到2.2和2.8倍的1b5-脂质体-100结合和/或摄取，然而这没有统计学差异。在3h
和6h后，检测到4.7和5.1倍的基于钙荧光素的1b5-脂质体摄取。在孵育6h后，发现基于罗丹明pe的检测的1b5-脂质体摄取显著(图3)。
[0276]
与图17中的发现一致，这些数据表明1b5-脂质体-100摄取通过pdgfrβ特异性发生，因为缺乏pdgfrβ的hek293细胞不显示摄取，并且hiv-靶向的j3rsc-脂质体-100不结合任何一个细胞系。与活性细胞转运例如内吞作用的时间一致，更长的孵育时间产生更高的1b5-脂质体摄取。
[0277]
剂量响应测定
[0278]
然后，进行剂量响应实验以寻找1b5-脂质体构建体的最小有效剂量。在37℃下，将hek293-pdgfrβ和hek293细胞用500、250、125、62.5.31.3、15.6、7.8u、3.9、 2.0、1.0或0.5um非靶向的脂质体-0、1b5-脂质体-100或j3rsc-脂质体-100处理4h。
[0279]
125、62.5、31.3、15.7和7.8um的脂质体-vhh稀释液在非特异性脂质体-0或 j3rsc-脂质体-100和特异性1b5-脂质体-100钙荧光素摄取之间展现出最宽的窗口，其中31.3um显示出最高的信号。罗丹明pe信号显示在对照和1b5-脂质体-100摄取之间，250、125、62.5和31.3um稀释度的脂质体显示几乎相等的差异(数据未示出)。
[0280]
因此，在hek293-pdgfrβ摄取实验中在31.3-125um脂质体浓度的脂质体-1b5 是非常有效的。
[0281]
结论
[0282]
pdgfrβ-靶向的脂质体特异性结合pdgfrβ并且被hek293-pdgfrβ细胞使用活性转运机制占据。vhh-脂质体缀合物以每个脂质体3、10、30和100个纳米抗体的比率有效地被pdgfrβ占据，而具有每个脂质体1个纳米抗体的缀合物不和表达 pdgfrβ的细胞连接。vhh-脂质体摄取是时间依赖性的并且在31.3-125um脂质体浓度下有效地发生。
[0283]
实例11：缀合的非激动性pdgfrβ抗体的稳定性
[0284]
在这个实例中，在体外和离体时研究根据本发明的缀合的vhh的稳定性。
[0285]
冻融实验
[0286]
研究了vhh 1b5、1d4、1h4和1e12的生物素缀合物在3次冻融循环后的稳定性，并通过与人pdgfrβ的结合能力来评价其稳定性。
[0287]
冻存的等分试样经受3次冻融循环(＝4次冻存，4次融化)。为了进行冻融循环，从-20℃取出等分试样并且于室温下将其放置在台上1小时，然后将其放回-20℃至少直到第二天。将煮沸的样品在加热块上在80℃下加热8h，然后关闭该加热块并且使其冷却过夜，将样品放置在其上。在第二天将煮沸的样品冷冻储存。
[0288]
基于保留的与人pdgfrβ胞外结构域结合的能力评估vhh整合，并且通过链霉亲和素-hrp或通过抗vhh抗体和hrp-缀合的抗兔抗体检测结合的vhh。冻融似乎对vhh 1b5和1d4无影响。vhh 1h4和1e12似乎以轻微减少的亲和力结合pdgfrβ。
[0289]
体内稳定性
[0290]
这个实例总结了在小鼠血浆和血细胞中vhh-800cw缀合物浓度的测量。将纳米抗体缀合物1b5-800cw、1d45-800cw、1h4-800cw和1e12-800cw以400ug/ml 的浓度溶解于pbs中，并以每只小鼠100ul的体积40ug施用。成年雄性c57bi/6小鼠(n＝9，体重大概25-30g)通过静脉途径注射一次。在时间点5min、20min、和 60min时(每只动物3个时间点)从颌下静脉采血。
[0291]
在血浆或elisa中使用直接荧光测量进行测量。直接荧光测量显示血浆中 1b5-800cw的半衰期是5.675min，血浆中1d4-800cw的半衰期是4.223min，1h4-800cw是5.106min，并且1e12-800cw是4.828min。基于elisa的检测表明 1b5-800cw的半衰期是3.59min，1d4-800cw是3.89min，1h4-800cw是4.318min，并且1e12-800cw是6.064min。
[0292]
实例12：缀合的vhh的离体近红外成像
[0293]
这个实例描述了用博来霉素诱导的肺部纤维化的小鼠中小鼠特异性vhh的离体近红外成像。
[0294]
材料和方法
[0295]
如上文所描述合成抗pgrfrβvhh 1e12-800cw。阴性对照抗hiv vhhj3rsc-800cw从qvq，乌得勒支(utrecht)，荷兰获得。
[0296]
雄性c57bl/j6小鼠(10至12周龄)气管内接受单剂量的博莱霉素(0.08mg/kg 在50ul pbs中)以诱导肺部纤维化。对照小鼠只接受相等体积的运载体。在开始应用博来霉素的三周后，给小鼠注射在40μl pbs中的40μg vhh-缀合物，并且在探针注射后2-6小时使用荧光介导的层析成像技术(ivis，珀金埃尔默公司(perkinelmer))扫描整个动物。在最后一次体内扫描后，立即将动物安乐死并且切断肺，并在ivis中进行离体扫描。
[0297]
结果
[0298]
如图18所示，vhh 1e12-800cw特异性富集在纤维化肺中，正如组织中的颜色密度所显示的，其包含表达pdgfβ受体的细胞。相反地，只结合hiv受体的阴性对照vhh j3rsc不展现任何纤维化组织的积累。