一种高亚精胺含量的大豆育种方法

1.本发明涉及大豆育种技术领域，特别是一种高亚精胺含量的大豆育种方法。


背景技术：

2.亚精胺，spermidine h2n(ch2)3nh(ch2)4nh2，一种多胺。广泛分布在生物体内，是由腐胺(丁二胺)和腺苷甲硫氨酸生物合成的。亚精胺可抑制神经元no合成酶(nnos)，结合并沉淀dna；也可用于纯化dna结合蛋白，刺激t4聚核苷酸激酶活性。研究表示，亚精胺或可阻止老年痴呆症发病。
3.大豆中亚精胺的含量水平较一般谷类、蔬菜、块根农作物、水果和畜产品高，这可能与大豆中蛋白含量高特别是多胺重要的生物合成前体精氨酸含量较高相关(kaczmarska et al.,2015；millerfleming et al.,2015)。wang(1972)最早采用5％三氯乙酸萃取对大豆多胺含量进行分析，得出大豆干粉中至少含有29.0μg/g的多胺，其中亚精胺含量在16.4μg/g左右。随着研究不断深入，后来不同研究均发现大豆种子中富含亚精胺，含量在88-389mg/kg之间(nishibori et al.,2007)。研究发现纳豆含有更高含量的亚精胺，高亚精胺含量的纳豆品种可能是由于纳豆品种与其他基因型间的遗传差异造成的(yoshikaw et al.,2014；kobayashi et al.,2017)。sagara等(2017)对奥地利维也纳附近种植的16个早熟大豆品种分别在3个季节收获的大豆进行分析，发现样品中亚精胺的含量从167-291mg/kg不等，这一结果表明作物育种对大豆中亚精胺水平有着重要影响；并在后续研究中进一步解析大豆种子中亚精胺和其他功能性植物化学物质的空间分布(sagara et al.,2020)。尽管亚精胺存在显著的遗传多样性，但是高浓度和低浓度亚精胺间基因型仍存在重叠部分，说明这是一个数量性状，受环境影响较大。gl
ó
ria等(2005)通过两年试验也得到类似的结果。目前研究表明，与其他植物或动物加工食品相比，大豆食品中含有的亚精胺含量更高，表明大豆品种亚精胺含量对大豆食品保健功能起着重要作用。除此之外，亚精胺含量相对于其他多胺和游离氨基酸更稳定，大豆食品可作为提供亚精胺的重要来源。因此，开展大豆亚精胺基因挖掘、选育高亚精胺含量大豆品种及开发大豆保健食品将成为未来大豆研究领域的热点之一。


技术实现要素：

4.本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种高亚精胺含量的大豆育种方法。
5.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
6.一种高亚精胺含量的大豆育种方法，包括以下步骤：
7.s1、利用现有构建完成的高亚精胺含量种质zyd00006和低亚精胺含量种质绥农14染色体片段代换系群体的重测序结果，结合2年3点不同环境条件下亚精胺表型数据，进行qtl分析获得稳定表达的大豆亚精胺含量qtl主效位点qspd19-2，筛选带有大豆亚精胺含量qtl主效位点qspd19-2且亚精胺含量极端高的大豆个体；
8.s2、将筛选的带有大豆亚精胺含量qtl主效位点qspd19-2且亚精胺含量极端高的大豆个体与亲本绥农14回交，南繁加代，获得目标性状次级f2群体；筛选亚精胺含量极端个体分别构建混合池，采用bsa法进行qtl分析，结合f2群体定位结果，进一步缩短qtl区间；在此基础上，筛选仅目标区间为杂合基因型的个体，自交创建针对拟窄缩目标区段的次级群体，构建目标区域局部饱和遗传图谱，完成qspd19-2的精细定位；
9.s3、基于qspd19-2的精细定位结果，结合两个亲本及代换系重测序信息，参照大豆公共数据库，将目标区间内标记对应在大豆基因组上，在亲本基因组中提取目标区间序列信息，利用生物信息学方法进行基因预测、注释及分类，筛选其中可能与亚精胺合成、代谢或调控相关的基因作为候选基因；采用qrt-pcr鉴定候选基因的表达，结合亚精胺含量数据，计算其表达量与亚精胺含量的相关性，最终确定并克隆候选基因gmqspd19-2；
10.s4、利用已经发表的大豆重测序资源，分析gmqspd19-2基因的单倍型，挖掘基因的等位变异，并对具有变异的品种进行亚精胺含量分析，鉴定亚精胺含量提高的等位变异，开发分子标记，并将高亚精胺含量的等位变异回交导入大豆主栽品种中，获得高亚精胺含量的大豆主栽品种。
11.进一步地，所述步骤s2具体包括：
12.s21、根据步骤s1的大豆亚精胺含量qtl主效位点qspd19-2，筛选携带目标qtl且亚精胺含量极端高个体材料与亲本绥农14回交，南繁加代，获得目标性状次级f2群体并进行表型鉴定；将筛选到的亚精胺含量高、低极端个体各30株的dna等量混合，构建2个亲本池和2个极端表型混池；采用bsa法对亚精胺含量进行qtl分析，利用illunimacasava1.8进行碱基识别分析，采用双端150bp测序策略进行基因组测序；将wm82.a2.v1作为参考基因组，使用gatk软件工具实现snp的检测，通过snpeff软件进行变异注释和预测变异影响；采用ed和snp-index关联分析法进行关联分析，集中区域中的snp标记可作为候选标记进行后续验证和精细定位，对初定位区间进一步窄缩；
13.s22、筛选具有窄缩目标片段的杂合个体进行自交，获得针对窄缩目标片段的次级分离群体，在目标区间基因组中利用已有公用引物ssr标记，同时开发部分snp和indel标记，寻找并合成尽可能多的双亲差异引物；利用两个亲本重测序信息在目标区间开发并合成差异引物，对目标区间进行引物扩增，统计基因型；应用3.0软件构建目标区段局部饱和遗传图谱，用kosambi函数将重组率转化成遗传距离cm，以lod＝10.0为阈值确定标记间的顺序，应用qtlnetwork2.0的nwim法，以0.1cm为扫描步长对目标区段进行扫描，构建目标区域局部饱和遗传图谱，实现qspd19-2的精细定位。
14.进一步地，所述步骤s3具体包括：
15.s31、根据qspd19-2的精细定位区间内标记在基因组上的对应位置，在亲本基因组序列中提取qtl区间对应的序列，应用基因预测软件进行基因预测，获得基因序列；将预测的基因序列导入interproscan和uniprot数据库，滤除假基因，并在公共数据库中对预测基因进行blsat比对，对预测基因进行注释及分类，筛选其中与蛋白质、氨基酸形成相关的注释基因作为候选基因；
16.s32、根据大豆基因组信息对定位区间内的候选基因进行功能预测，获得候选基因在参考基因组williams82中的序列，利用高保真酶扩增亲本中候选基因的全长编码序列并进行比较，预测候选基因编码蛋白的差异；将栽培大豆绥农14与野生大豆zyd00006及含有
候选基因的代换系株系种于温室，按照统一标准，在r3，r5，r7期对亲本及含有候选基因株系的籽粒发育时期的胚组织、花、荚器官提取总rna，并反转录为一链cdna，以soytubulin为内参基因，利用qrt-pcr进行表达分析；通过基因序列分析结合qrt-pcr表达分析确定候选基因gmqspd19-2。
17.进一步地，所述步骤s4具体包括：
18.s41、利用基因特异引物在已发表的大豆重测序资源中进行pcr扩增并测序，测序的结果应用dnastar软件对序列进行相似性比对分析，应用dnasp软件计算单倍型数、单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数；利用mega软件统计序列的平均碱基组成、多态位点数、简约信息位点数、总体转换/颠换比率；分析克隆基因在不同大豆品种中的差异和变化规律；
19.s42、基于所克隆基因gmqspd19-2在不同材料间存在的indel和snps位点，开发indel标记或caps/dcaps标记，通过pcr产物酶切验证的方法快速鉴定大豆种质资源的基因型，结合被鉴定资源的表型数据，阐明功能标记的选择效率并筛选优异等位变异，将高亚精胺含量的等位变异回交导入大豆主栽品种中，获得高亚精胺含量的大豆主栽品种。
20.与现有技术相比，本发明利用获得稳定表达的大豆亚精胺含量qtl主效位点qspd19-2完成qspd19-2的精细定位；结合候选基因的序列和表达分析图位克隆参与调控大豆亚精胺含量的相关基因gmqspd19-2并研究其功能，揭示大豆亚精胺含量分子调控机制，并进一步挖掘大豆种质资源中的优异等位变异，选育高附加值的富含亚精胺大豆品种提供理论基础和育种材料。
附图说明
21.图1为基于重测序的cssls群体构建的bin图。
22.图2为bin的大小分布与近远着丝粒分布基本统计：a为bin的大小分布；b为近远着丝粒分布基本统计。
23.图3为染色体片段代换系群体bc4f7-f8代亚精胺含量分布。
24.图4为亚精胺含量qtl定位结果图。
具体实施方式
25.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
26.在郑宇宏，范旭红，张云峰，孟凡凡，孙星邈，王明亮，王曙明，大豆新型营养因子亚精胺的研究进展，大豆科学，2017，36(4):645-650；郑宇宏，马玲玲，邱红梅，范旭红，张云峰，孟凡凡，孙星邈，王曙明；东北大豆种质不同多胺组分含量分析.大豆科学,2019,38(6):856-861已经公开了通过对78份东北大豆种质4种多胺组分亚精胺、精胺、腐胺和尸胺含量进行的表型鉴定和初步分析，结果表明大豆种质的4种多胺组分含量存在较丰富的遗传变异，调控亚精胺和精胺的基因型和遗传变异较丰富。大豆品种间亚精胺含量存在较大差异。亚精胺含量与精胺含量呈极显著正相关，亚精胺和精胺两种成分之间遗传关系比较紧密。这些结果对将来高亚精胺含量优异种质创制及品种选育具有重要参考价值。同时筛选到高亚精胺含量种质zyd00006和低亚精胺含量种质绥农14，本实施例是在此基础上进行的。
27.利用illuminahiseq4000测序技术平台对绥农14(
♀
)
×
zyd00006(
♂
)及其220个cssls群体后代进行重测序，亲本测序深度为30
×
，cssls群体测序深度为5
×
，父本共得到30.08gbp的cleandata，母本共得到33.38gbp的cleandata，测序原始数据经过滤和质控，获得220个cssls，总数据量为1,410.31gbp，q30均达到80％以上。
28.两亲本间共检测到580,524个适用于cssls群体的snp标记，划bin后得到3196个有效的bin并利用其构建了bin图(参照图1)。着丝粒区间及染色体臂上bin相关统计数据见表1。
29.表1
[0030][0031]
经统计，上图总snp标记523,805个，覆盖野生大豆基因组的93.35％，背景恢复率为94.13％；其中》0.3mbp的bin共有759个，可覆盖野生大豆基因组的90.69％(图2a)，近着丝粒的代换片段整体都比较大，远着丝粒的代换片段都比较小(图2b)。
[0032]
相比ssr标记构建的结果，利用测序构建的cssls更为精细、准确。采用国标法对引进群体的双亲及其部分后代材料进行了亚精胺含量测定，结果表明其差异显著。因此，该群体适合于qtl定位分析。
[0033]
基于cssls群体的大豆亚精胺含量qtl初步定位
[0034]
利用绥农14(
♀
)
×
zyd00006(
♂
)及其220个cssls群体后代材料，目前已繁衍至bc4f8代。其中bc4f7代种植于吉林省公主岭市，bc4f8代分别种植于吉林省公主岭市、敦化市和蛟河市，采用uhplc(ultra-high performance liquid chromatography)方法测定染色体片段代换系2个世代及双亲的亚精胺含量，结果如表2所示。轮回亲本绥农14亚精胺含量平均值为294.40mg/kg、供体亲本zyd00006平均值为567.56mg/kg、代换系群体后代亚精胺含量平均值为409.40mg/kg；染色体片段代换系群体后代的亚精胺含量变异范围广泛且拟合正态分布(图3)。结果表明该群体材料可以用于亚精胺含量相关基因的定位研究。
[0035]
表2
[0036][0037]
基于染色体片段代换系群体的重测序数据及群体bc4f7-f8代亚精胺表型鉴定结果(利用最佳线性无偏估计处理不同环境下表型值)，通过ici-mapping4.1软件的rstep-lrt-add方法对基因型数据结合表型鉴定结果，在p＝0.05的显著水平上，通过排列检验1000次确定检测阈值lod＝3.49，对亚精胺含量进行qtl分析，获得3个qtl区间，qspd04-1位于04号染色体连锁群上，目标片段长度为21.55kb；qspd19-1和qspd19-2位于19号染色体连锁群上，目标片段长度分别为127.62和163.37kb(见图4及表3)。其中qspd19-2为2年3个不同环境下稳定出现的qtl，且贡献率为15.39％，表明该位点极有可能与亚精胺含量相关，因此，本研究将qspd19-2作为进一步精细定位研究的候选位点。对该位点进行基因注释，获得16个候选基因。
[0038]
表3
[0039][0040]
控制大豆亚精胺含量主效位点qspd19-2的精细定位
[0041]
根据初定位结果，筛选携带目标qtl且亚精胺含量极端高个体材料与亲本绥农14回交，南繁加代，获得目标性状次级f2群体并进行表型鉴定。将筛选到的亚精胺含量高、低极端个体各30株的dna等量混合，构建2个亲本池和2个极端表型混池。采用bsa法对亚精胺含量进行qtl分析，利用illunimacasava1.8进行碱基识别分析，采用双端150bp测序策略进行基因组测序。将wm82.a2.v1作为参考基因组，使用gatk软件工具实现snp的检测，通过snpeff软件进行变异注释和预测变异影响。采用ed和snp-index关联分析法进行关联分析，集中区域中的snp标记可作为候选标记进行后续验证和精细定位，对初定位区间进一步窄
缩。
[0042]
筛选具有窄缩目标片段的杂合个体进行自交，获得针对窄缩目标片段的次级分离群体，在目标区间基因组中利用已有公用引物ssr标记，同时开发部分snp和indel标记，寻找并合成尽可能多的双亲差异引物。利用两个亲本重测序信息在目标区间开发并合成差异引物，对目标区间进行引物扩增，统计基因型。应用3.0软件构建目标区段局部饱和遗传图谱，用kosambi函数将重组率转化成遗传距离(cm)，以lod＝10.0为阈值确定标记间的顺序，应用qtlnetwork2.0的nwim法，以0.1cm为扫描步长对目标区段进行扫描，从而应用经典遗传学方法实现qtl精细定位。
[0043]
候选基因筛选
[0044]
根据精细定位qtl区间内标记在基因组上的对应位置，在亲本基因组序列中提取qtl区间对应的序列，应用基因预测软件genscan等进行基因预测，获得基因序列。将预测的基因序列导入本地安装的软件interproscan和uniprot数据库(http//www.expasy.org/sprot)，滤除假基因，并在公共数据库geneontology(go)(http://www.geneontology.org/)和kyoto encyclopedia of genesand genomes pathway(kegg)(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)中对预测基因进行blsat比对，对预测基因进行注释及分类，筛选其中与蛋白质、氨基酸等品质性状形成相关的注释基因作为候选基因。
[0045]
根据大豆基因组信息(http://phytozome.jgi.doe.gov/)，对定位区间内的候选基因进行功能预测，获得候选基因在参考基因组williams82中的序列，利用高保真酶扩增亲本中候选基因的全长编码序列并进行比较，预测候选基因编码蛋白的差异。将栽培大豆绥农14与野生大豆zyd00006及含有候选基因的代换系株系种于温室，按照统一标准，在r3，r5，r7期(取样时期参照soybase ontology各时期特点)对亲本及含有候选基因株系的籽粒发育时期的胚组织、花、荚器官提取总rna，并反转录为一链cdna，以soytubulin为内参基因，利用qrt-pcr进行表达分析；通过基因序列分析结合qrt-pcr表达分析确定候选基因。
[0046]
候选基因功能验证
[0047]
根据两个亲本基因组重测序信息，在大豆基因组中调出目标基因，应用primer5.0软件在该基因的上下游设计引物，提取rna反转录成cdna，pcr扩增基因全长。进行目标基因target sequences的设计和选择(尽量保证选取序列的特异性)，合成相应的target adaptors，通过酶切和连接构建到sgrna载体中，成功得到adaptor-sgrna表达盒。再将adaptor-sgrna表达盒通过酶切和连接构建到crispr/cas9的表达载体上，得到最终的crispr/cas9表达质粒。进行载体的遗传转化，采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法构建大豆转基因材料，进行外植体(亲本及含有目标基因的片段代换系材料子叶节)农杆菌侵染与共培养，继芽伸长、生根培养后进行炼苗及移栽。移栽获得转基因植株，进而分析目标基因突变后对大豆亚精胺含量的影响。
[0048]
以亲本及含有目标基因的目标片段代换系为对照，进行突变个体鉴定，pcr产物测序，对植株进一步单克隆测序，根据测序结果筛选突变个体。每个遗传转化受体至少获得阳性转基因植株10-15株；与遗传转化受体相比，对比分析候选基因的表达情况及亚精胺表型的差异，完成基因功能验证，获得目的基因gmqspd19-2。
[0049]
候选基因的等位变异筛选及育种价值评价
[0050]
利用基因特异引物在已发表的大豆重测序资源中进行pcr扩增并测序，测序的结
果应用dnastar等软件对序列进行相似性比对分析，应用dnasp软件计算单倍型数、单倍型多样性、核苷酸多样性、平均核苷酸差异数等。利用mega软件统计序列的平均碱基组成、多态位点数、简约信息位点数、总体转换/颠换比率等；分析克隆基因在不同大豆品种中的差异和变化规律。
[0051]
基于所克隆基因gmqspd19-2在不同材料间存在的indel和snps位点，开发indel标记或caps/dcaps标记，通过pcr产物酶切验证的方法可快速鉴定大豆种质资源的基因型，结合被鉴定资源的表型数据，阐明功能标记的选择效率并筛选优异等位变异，将高亚精胺含量的等位变异回交导入大豆主栽品种中，改良主栽品种的亚精胺含量，评价gmqspd19-2基因的育种价值，同时为分子标记辅助高亚精胺含量大豆育种提供参考。
[0052]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。