用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物的制作方法

1.本发明涉及生物成像技术领域，特别涉及一种用于质谱流式细胞术的稀 土金属配位的聚集诱导发光聚合物。


背景技术：

2.目前，国际公认的免疫分型方法流式细胞术(fcm)，是基于荧光标记技 术的高速细胞分析技术，具有灵敏、精确、特异性高等特点。fcm主要依赖 于荧光染色，由于荧光光谱的重叠性，通常无法同时进行多达数十种的荧光 标记，进而限制了检测通量的提高。传统的流式细胞仪在多参数检测时，往 往需要荧光补偿且需要分多次实验完成，消耗了大量试剂的同时也浪费了很 多临床样本。
3.质谱流式细胞技术是利用质谱信号代替传统流式细胞仪的荧光信号对单 细胞进行多参数检测的流式技术，它能够很好的解决上述问题。该技术继承 了传统流式细胞仪高速分析特点的同时，又赋予了质谱检测的高分辨能力。 其核心是利用金属元素代替荧光基团作为标签标记抗体，使检测通道增加到 上百个的同时各个通道间无干扰、背景极低。因而相比于传统流式细胞术， 质谱流式细胞术作为一个新技术已经在检测项目和可靠性等方面显示了巨大 的优越性。然而质谱流式是一种新兴的检测仪器，检测试剂种类单一，检测 灵敏度远远低于传统荧光流式，无法实现低丰度标志物的检测，并且检测过 程中会破坏细胞，不能进行其他后续测试。由此可见，传统荧光流式与质谱 流式是两种相辅相成的单细胞分析技术，能同时用于这两种检测技术的高灵 敏金属/荧光双模标签将会结合荧光流式和质谱流式两者的优点，在生物医学 检测领域具有非常广阔的应用前景，也能为单细胞的高灵敏、多指标分析提 供更多的理论依据和实用技术。
4.然而现有文献报道过的荧光/金属检测试剂无论是荧光信号还是金属信 号强度都比较弱，难以满足流式细胞术和质谱流式细胞术的检测要求。尤其 是传统的有机荧光染料在聚集状态下，荧光通常会减弱或淬灭，其严重制约 了有机发光材料的实际应用。具有聚集诱导发光(aie)性质的化合物在聚集 状态下，通过分子内部的自我调节实现荧光增强，弥补传统发光材料在该方 面的不足，在荧光传感、电致发光、固体激光与生物成像等领域展现出广阔 的应用前景。但现有技术中，未见公开将聚集诱导发光化合物应用于质谱流 式细胞术的可靠方案。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种 用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于质谱流式细 胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物，其具有如式ⅱ所示的化学结构 式：
[0007][0008]
其中，z＝1-10，m＝20-50，n＝10-30；aie荧光单体的结构式如ⅰ所示：
[0009][0010]
其中，r基团为h、n(ch3)2或n(ch2ch3)2。
[0011]
优选的是，所述aie荧光单体的制备路线为：
[0012][0013]
优选的是，所述aie荧光单体的制备方法包括以下步骤：
[0014]
将4-羟基四苯基乙烯、4-氯甲基苯乙烯、碳酸钾和碘化钾溶于丙酮中， 并加入一滴硝基苯，搅拌下回流过夜；反应溶液冷却至室温后过滤，去除溶 剂并以的二氯甲烷和石油醚为层析液，通过二氧化硅硅胶柱进行柱层析分离； 旋干溶剂后所得固体干燥即得aie荧光单体。
[0015]
优选的是，其中，4-羟基四苯基乙烯：4-氯甲基苯乙烯：碳酸钾的摩尔比 为1:2:4。
[0016]
优选的是，所述aie荧光单体的制备方法包括以下步骤：
[0017]
将2.87mmol 4-羟基四苯基乙烯、5.74mmol 4-氯甲基苯乙烯、11.48mmol 碳酸钾和碘化钾溶于50ml丙酮中，并加入一滴硝基苯，搅拌下回流过夜； 反应溶液冷却至室温后过滤，去除溶剂并以体积比为1:2的二氯甲烷和石油 醚为层析液，通过二氧化硅硅胶柱进行柱层析分离；旋干溶剂后所得固体干 燥即得aie荧光单体。
[0018]
优选的是，该用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合 物的制备路线为：
[0019][0020]
优选的是，该用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合 物的制备方法包括以下步骤：
[0021]
1)制备aie荧光单体：
[0022]
将4-羟基四苯基乙烯、4-氯甲基苯乙烯、碳酸钾和碘化钾溶于丙酮中， 并加入一滴硝基苯，搅拌下回流过夜；反应溶液冷却至室温后过滤，去除溶 剂并以的二氯甲烷和石油醚为层析液，通过二氧化硅硅胶柱进行柱层析分离； 旋干溶剂后所得固体干燥即得aie荧光单体；
[0023]
2)合成嵌段共聚物：
[0024]
2-1)将n,n-二甲基丙烯酰胺、aie荧光单体、n-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸 酯、2,2
’‑
偶氮-二(2-甲基丁腈)、2-巯基-s-硫代苯甲酰乙酸加入到干燥的无水 n,n-二甲基甲酰胺中，体系用液氮进行冷冻除氧循环三次，除氧完成后氮气 保护下加热搅拌反应；
[0025]
2-2)反应结束后冷却至室温，反应产物加入到乙醚中沉淀，所得固体溶 于n,n-二
甲基甲酰胺，并再次用乙醚沉淀，过滤后真空干燥过夜，得固体聚 合物；
[0026]
2-3)将固体聚合物溶于n,n-二甲基甲酰胺，加入三乙胺、dota，氮气 下搅拌过夜；
[0027]
2-4)除去n,n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，搅拌过夜；
[0028]
2-5)将所有溶剂在真空下除去，用水提取反应产物，用透析管透析所得 水溶液，并用水洗，将透析管中所剩溶液蒸干，真空干燥，得嵌段共聚物产 品；
[0029]
3)连接侧链马来酰胺：
[0030]
3-1)将步骤2-5)得到的嵌段共聚物产品溶于含dl-二硫苏糖醇的磷酸 缓冲液中，并在加热下搅拌反应，调节ph值至4；
[0031]
3-2)用透析管透析，并用水洗；
[0032]
3-3)向所得溶液中加入磷酸缓冲液，并加入含1,8-二(马来酰亚胺)-3,6
‑ꢀ
二氧杂辛烷的n,n-二甲基甲酰胺溶液，常温下搅拌反应；
[0033]
3-4)过滤，所得溶液用析管透析；
[0034]
3-5)将所得溶液分装冻干，即得聚集诱导发光聚合物；
[0035]
4)标记稀土金属：
[0036]
将步骤3-5)得到的聚集诱导发光聚合物溶于pbs缓冲液中，加入lncl3， 孵育,得到最终产品：稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物。
[0037]
优选的是，该用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合 物的制备方法包括以下步骤：
[0038]
1)制备aie荧光单体：
[0039]
将4-羟基四苯基乙烯、4-氯甲基苯乙烯、碳酸钾和碘化钾溶于丙酮中， 并加入一滴硝基苯，搅拌下回流过夜；反应溶液冷却至室温后过滤，去除溶 剂并以的二氯甲烷和石油醚为层析液，通过二氧化硅硅胶柱进行柱层析分离； 旋干溶剂后所得固体干燥即得aie荧光单体；
[0040]
2)合成嵌段共聚物：
[0041]
2-1)将n,n-二甲基丙烯酰胺、aie荧光单体、n-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸 酯、2,2
’‑
偶氮-二(2-甲基丁腈)、2-巯基-s-硫代苯甲酰乙酸加入到干燥的无水n,n-二甲基甲酰胺中，体系用液氮进行冷冻除氧循环三次，除氧完成后氮气 保护下90℃搅拌反应1小时；
[0042]
2-2)反应结束后冷却至室温，反应产物加入到乙醚中沉淀，所得固体溶 于n,n-二甲基甲酰胺，并再次用乙醚沉淀，过滤后真空干燥过夜，得固体聚 合物；
[0043]
2-3)将固体聚合物溶于n,n-二甲基甲酰胺，加入三乙胺、dota，氮气 下搅拌过夜；
[0044]
2-4)除去n,n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，搅拌过夜；
[0045]
2-5)将所有溶剂在真空下除去，用水提取反应产物，用透析管透析所得 水溶液，并用水洗，将透析管中所剩溶液蒸干，真空干燥，得嵌段共聚物产 品；
[0046]
3)连接侧链马来酰胺：
[0047]
3-1)将步骤2-5)得到的嵌段共聚物产品溶于含dl-二硫苏糖醇的磷酸 缓冲液中，并在50℃下搅拌反应1小时，调节ph值至4；
[0048]
3-2)用透析管透析，并用水洗；
[0049]
3-3)向所得溶液中加入磷酸缓冲液，并加入含1,8-二(马来酰亚胺)-3,6
‑ꢀ
二氧杂辛烷的n,n-二甲基甲酰胺溶液，常温下搅拌反应1小时；
[0050]
3-4)过滤，所得溶液用析管透析；
[0051]
3-5)将所得溶液分装冻干，即得聚集诱导发光聚合物；
[0052]
4)标记稀土金属：
[0053]
将步骤3-5)得到的聚集诱导发光聚合物溶于pbs缓冲液中，加入lncl3， 37℃下孵育30分钟,得到最终产品：稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物。
[0054]
优选的是，该用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合 物的制备方法包括以下步骤：
[0055]
1)制备aie荧光单体：
[0056]
将2.87mmol 4-羟基四苯基乙烯、5.74mmol 4-氯甲基苯乙烯、11.48mmol 碳酸钾和碘化钾溶于50ml丙酮中，并加入一滴硝基苯，搅拌下回流过夜； 反应溶液冷却至室温后过滤，去除溶剂并以体积比为1:2的二氯甲烷和石油 醚为层析液，通过二氧化硅硅胶柱进行柱层析分离；旋干溶剂后所得固体干 燥即得aie荧光单体；
[0057]
2)合成嵌段共聚物：
[0058]
2-1)将0.96g n,n-二甲基丙烯酰胺、0.5gaie荧光单体、2.46g n-羟基琥 珀酰亚胺丙烯酸酯、16mg 2,2
’‑
偶氮-二(2-甲基丁腈)、54mg 2-巯基-s-硫代苯 甲酰乙酸加入到45ml干燥的无水n,n-二甲基甲酰胺中，体系用液氮进行冷 冻除氧循环三次，除氧完成后氮气保护下90℃搅拌反应1小时；
[0059]
2-2)反应结束后冷却至室温，反应产物加入到400ml乙醚中沉淀，所 得固体溶于5ml n,n-二甲基甲酰胺，并再次用400ml乙醚沉淀，过滤后真 空干燥过夜，得固体聚合物3.0g；
[0060]
2-3)取100mg固体聚合物溶于3ml n,n-二甲基甲酰胺，加入1ml三乙 胺、300mg dota，氮气下搅拌过夜；
[0061]
2-4)除去n,n-二甲基甲酰胺，加入1ml三氟乙酸，搅拌过夜；
[0062]
2-5)将所有溶剂在真空下除去，用水提取反应产物，用透析管透析所得 水溶液，并用水洗，将透析管中所剩溶液蒸干，真空干燥，得嵌段共聚物产 品120mg；
[0063]
3)连接侧链马来酰胺：
[0064]
3-1)将步骤2-5)得到的嵌段共聚物产品溶于含20mm dl-二硫苏糖醇 的磷酸缓冲液中，并在50℃下搅拌反应1小时，调节ph值至4；
[0065]
3-2)用透析管透析，并用水洗；
[0066]
3-3)向所得溶液中加入磷酸缓冲液，并加入含150mg 1,8-二(马来酰亚 胺)-3,6-二氧杂辛烷的n,n-二甲基甲酰胺溶液，常温下搅拌反应1小时；
[0067]
3-4)过滤，所得溶液用析管透析；
[0068]
3-5)将所得溶液分装冻干，即得聚集诱导发光聚合物；
[0069]
4)标记稀土金属：
[0070]
将100mg步骤3-5)得到的聚集诱导发光聚合物溶于400ul pbs缓冲液 中，加入5mm lncl3，37℃下孵育30分钟,得到最终产品：稀土金属配位的 聚集诱导发光聚合物。
[0071]
优选的是，其中，ln为169tm、159tb、165ho或141pr。
[0072]
本发明的有益效果是：本发明不同于现有的传统流式荧光标签和质谱流 式聚合物金属螯合标签，通过向聚合物链中引入荧光单体的方法将两者结合 在一起，制备出了既
有荧光性能又有稀土信号的金属/荧光双模标签，能够同 时作为荧光标签和金属标签进行传统荧光流式细胞术和新型质谱流式细胞术 的检测；本发明所采用的荧光单体为聚集诱导发光(aie)单体，规避了传统 荧光材料荧光聚集淬灭的缺陷；
[0073]
目前质谱流式使用成本远远高于传统荧光流式；而本发明制备的金属/荧 光双模标签所有材料均为国产，成本极低，可有效降低质谱流式使用成本。
附图说明
[0074]
图1为本发明的实施例中制得的aie荧光单体的1h nmr表征结果
[0075]
图2为本发明的实施例中制得的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物的 荧光光谱；
[0076]
图3为本发明的实施例中制得的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物对 人外周血单核细胞分群结果。
具体实施方式
[0077]
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参 照说明书文字能够据以实施。
[0078]
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一 个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0079]
本发明提供了一种用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光 聚合物，其具有如式ⅱ所示的化学结构式：
[0080][0081]
其中，z＝1-10，m＝20-50，n＝10-30；aie荧光单体的结构式如ⅰ所示：
[0082][0083]
其中，r基团为h、n(ch3)2或n(ch2ch3)2。
[0084]
其中，所述aie荧光单体的制备路线为：
[0085][0086]
所述aie荧光单体的制备方法包括以下步骤：
[0087]
将4-羟基四苯基乙烯、4-氯甲基苯乙烯、碳酸钾和碘化钾溶于丙酮中， 并加入一滴硝基苯，搅拌下回流过夜；反应溶液冷却至室温后过滤，去除溶 剂并以的二氯甲烷和石油醚为层析液，通过二氧化硅硅胶柱进行柱层析分离； 旋干溶剂后所得固体干燥即得aie荧光单体。在优选的实施例中，4-羟基四 苯基乙烯：4-氯甲基苯乙烯：碳酸钾的摩尔比为1:2:4。
[0088]
其中，该用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物的 制备路线为：
[0089][0090]
该用于质谱流式细胞术的稀土金属配位的聚集诱导发光聚合物的制备方 法包括以下步骤：
[0091]
1)制备aie荧光单体：
[0092]
将4-羟基四苯基乙烯、4-氯甲基苯乙烯、碳酸钾和碘化钾溶于丙酮中， 并加入一滴硝基苯，搅拌下回流过夜；反应溶液冷却至室温后过滤，去除溶 剂并以的二氯甲烷和石油醚为层析液，通过二氧化硅硅胶柱进行柱层析分离； 旋干溶剂后所得固体干燥即得aie荧光单体；
[0093]
2)合成嵌段共聚物：
[0094]
2-1)将n,n-二甲基丙烯酰胺、aie荧光单体、n-羟基琥珀酰亚胺丙烯酸 酯、2,2
’‑
偶氮-二(2-甲基丁腈)、2-巯基-s-硫代苯甲酰乙酸加入到干燥的无水n,n-二甲基甲酰胺中，体系用液氮进行冷冻除氧循环三次，除氧完成后氮气 保护下加热搅拌反应；
[0095]
2-2)反应结束后冷却至室温，反应产物加入到乙醚中沉淀，所得固体溶 于n,n-二甲基甲酰胺，并再次用乙醚沉淀，过滤后真空干燥过夜，得固体聚 合物；
[0096]
2-3)将固体聚合物溶于n,n-二甲基甲酰胺，加入三乙胺、dota(1,4,7,10
‑ꢀ
四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸)，氮气下搅拌过夜；
[0097]
2-4)除去n,n-二甲基甲酰胺，加入三氟乙酸，搅拌过夜；
[0098]
2-5)将所有溶剂在真空下除去，用水提取反应产物，用透析管透析所得 水溶液，并用水洗，将透析管中所剩溶液蒸干，真空干燥，得嵌段共聚物产 品；
二(马来酰亚胺)-3,6-二氧杂辛烷的n,n-二甲基甲酰胺溶液，常 温下搅拌反应1小时；
[0128]
3-4)过滤，所得溶液用5k mw c.o.析管透析(5x 5ml水)；
[0129]
3-5)将所得溶液分装冻干，即得聚集诱导发光聚合物，-20℃避光保存；
[0130]
4)标记抗体、稀土金属及细胞染色：
[0131]
4-1)取100ug单克隆抗体cd-3加入到含400ulpbs缓冲液的50k超滤 管中，室温离心，12,000g，10min；
[0132]
4-2)离心结束后向抗体中加入100ul含4mm三(2-羧乙基)膦的pbs缓 冲液，吹打混匀，并在37℃下孵育30分钟；
[0133]
4-3)与此同时，将100mg步骤3-5)得到的聚集诱导发光聚合物溶于 400ulpbs缓冲液，加入5mm 169tmcl3，并在37℃下孵育30分钟。
[0134]
4-4)孵育结束后取出超滤管，用300ul 20mm tris-buffered saline缓冲液 分别清洗抗体和标记了稀土金属的聚合物。
[0135]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方 式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领 域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范 围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。