叶酸钙纳米颗粒的批量制备方法及诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法

1.本发明涉及叶酸钙纳米颗粒的批量制备方法及诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法，属于生物医学领域。


背景技术：

2.阿尔茨海默病是最常见的神经退行性疾病之一，是世界上第六大死亡原因。目前仍然没有治愈阿尔兹海默病的有效药物。阿尔兹海默病难以治愈的根本原因是胆碱能神经元的缺损及其不可再生性。神经干细胞移植被认为是一种最有希望治疗阿尔兹海默病的方法。但是，大多数移植的神经干细胞在体内会分化成其他类型的神经元或星形胶质细胞，而不是胆碱能神经元，导致治疗效果差。因此，引导植入的神经干细胞分化为功能性的胆碱能神经元，对改善神经干细胞治疗阿尔兹海默病的效果至关重要。
3.金属离子在神经发育和诱导神经干细胞分化方面发挥着重要作用。比如，钙离子可以调节神经干细胞的增殖、分化、迁移，且被证实可以提高神经干细胞的分化速率。但是使用钙离子诱导神经干细胞分化得到的神经元一般是γ－氨基丁酸能神经元，是一种与抑郁症有相关的神经元，无法用于治疗阿尔兹海默病。
4.叶酸对神经系统的正常发育至关重要，相关研究表明，叶酸可以通过调节乙酰胆碱酯酶的活性对乙酰胆碱神经元起到调节作用。但是如何利用叶酸诱导神经干细胞快速分化为功能性的胆碱能神经元依然是一个难题。
5.因此，如何实现神经干细胞向胆碱能神经元的快速高效分化是目前亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供叶酸钙纳米颗粒的批量制备方法及诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法。
7.本发明是通过如下技术方案实现的：
8.叶酸钙纳米颗粒的批量制备方法，包括步骤如下：
9.1)将naoh水溶液缓缓滴入叶酸分散液中，使ph调节到7-8，加热水浴回流反应，得到反应液；
10.2)将cacl2溶解于乙醇-水的混合溶液中，得到cacl2溶液；
11.3)在超声下，将cacl2溶液滴加至反应液中，加热搅拌反应；
12.4)反应结束后冷却，通过离心收集沉淀，洗涤，真空干燥，研磨，得到叶酸钙纳米颗粒。
13.根据本发明优选的，步骤1)中，叶酸分散液的分散体系为无菌超纯水。
14.根据本发明优选的，步骤1)中，叶酸分散液的摩尔浓度为0.1-0.4m。
15.根据本发明优选的，步骤1)中，水浴回流反应温度为45-55℃，反应时间为1-2h。
16.根据本发明优选的，步骤1)中，naoh水溶液的浓度为0.1-0.4m。
17.根据本发明优选的，步骤2)中，乙醇-水的混合溶液中，乙醇与水的体积比为1:1。
18.根据本发明优选的，步骤2)中，cacl2溶液的浓度为0.3-1.2m。
19.根据本发明优选的，步骤3)中，cacl2溶液的用量使得cacl2与叶酸的摩尔质量比为(1-2):(1-2)。
20.根据本发明优选的，步骤3)中，超声频率为40-55khz，超声时间为15-30min。
21.根据本发明优选的，步骤3)中，加热搅拌反应温度为45-55℃，反应时间为1-2h。
22.根据本发明优选的，步骤4)中，洗涤为依次用水和乙醇洗涤三次，真空干燥为在50℃的真空干燥箱内烘干。
23.本发明在超声下，将cacl2溶液滴加至反应液中，在叶酸与cacl2的反应过程中施加频率为40-55khz的超声，使叶酸与cacl2充分反应，可以使制备的产物叶酸钙呈现200-300nm左右的尺寸。反应物简单易得且溶解性好，可以通过反复洗涤提纯，在反应过程中无副产物生成并且产率高，产物溶解度低，可以通过反复离心的方法获得，因此可以实现纳米颗粒的高效大批量制备。
24.一种通过叶酸钙纳米颗粒诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法，包括步骤：
25.神经干细胞(nscs)离心后用神经分化培养基分散得细胞悬液，然后接种在细胞培养板中，并加入叶酸钙纳米颗粒分散液，进行体外培养，将神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元。
26.根据本发明优选的，叶酸钙纳米颗粒分散液的分散体系为无菌超纯水，叶酸钙纳米颗粒的浓度为10-40μg/ml。
27.根据本发明优选的，叶酸钙纳米颗粒分散前先用75％的酒精灭菌处理。
28.根据本发明优选的，神经分化培养基为含2％b27神经培养添加剂，1％胎牛血清(fbs)，1％glutamax和1％双抗的neurobasal培养基。
29.neurobasal培养基为现有技术。
30.根据本发明优选的，细胞悬液的接种体积为0.5ml，包含的细胞个数为4
×
106个。
31.根据本发明优选的，体外培养为在37℃下含5％co2的饱和湿度环境下体外培养4-10天。
32.根据本发明优选的，叶酸钙纳米颗粒分散液的接种量与细胞悬液相同。
33.本发明具有以下优点：
34.1、本发明在超声下，将cacl2溶液滴加至反应液中，在叶酸与cacl2的反应过程中施加频率为40-55khz的超声，使叶酸与cacl2充分反应，在反应过程中无副产物生成并且产率高，方法简单高效，可以批量生产，一次性可以获得十几克产物，反应物简单无毒，无其他副产物且容易清洗。
35.2、本发明制备的叶酸钙纳米颗粒粒径均匀且尺寸较小，为200-300nm，可以被细胞吞噬，有良好的生物相容性，可用于细胞实验。
36.3、本发明通过叶酸钙纳米颗粒调控神经干细胞定向分化，使用方便，可以直接加入细胞培养基或者植入材料内部使用。
37.4、本发明制备的叶酸钙纳米颗粒具有优异的促进神经干细胞分化的能力，并且可
以促进神经干细胞向成熟的胆碱能神经元分化。
38.5、本发明通过叶酸钙纳米颗粒调控神经干细胞定向分化，提供了获得胆碱能神经元的一种新途径，为研究老年痴呆提供了一种重要的思路，为研究与神经干细胞分化相关基因功能并筛选与其定向分化相关基因提供了一种有力的工具，为探索其定向分化、调控机制提供了一定的线索，并为实现神经干细胞的移植和相关神经功能奠定了基础。
附图说明
39.图1为制备的叶酸钙纳米颗粒的扫描电子显微镜照片；
40.图2为制备的叶酸钙纳米颗粒和叶酸的红外光谱；
41.图3为制备的叶酸钙纳米颗粒和叶酸的x射线衍射图谱；
42.图4为制备的叶酸钙纳米颗粒的能量色散x射线光谱元素分布；
43.图5为制备的荧光标记叶酸钙纳米颗粒与细胞溶酶体的免疫荧光染色；
44.图6为nscs用20μg/ml叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天后的tuj1和map2基因的pcr分析；
45.图7为nscs用20μg/ml叶酸钙纳米颗粒分散液培养7天后的tuj1和map2基因的pcr分析；
46.图8为nscs用20μg/ml叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天后的tuj1和map2蛋白的免疫荧光染色；
47.图9为nscs用不同浓度叶酸钙纳米颗粒分散液分别培养5天和10天后的tuj1和map2蛋白的western blot分析；
48.图10为nscs用叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天后的钙离子荧光探针分析；
49.图11为nscs用不同浓度叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天后的chat蛋白的免疫荧光染色；
50.图12为nscs用叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天后的chat蛋白的western blot分析；
51.图13为nscs用10μg/ml叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天后的tuj1和map2基因的pcr分析；
52.图14为nscs用10μg/ml叶酸钙纳米颗粒分散液培养7天后的tuj1和map2基因的pcr分析；
53.图15为nscs用40μg/ml叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天后的tuj1和map2基因的pcr分析；
54.图16为nscs用40μg/ml叶酸钙纳米颗粒分散液培养7天后的tuj1和map2基因的pcr分析；
具体实施方式
55.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
56.同时下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂、材料和设备，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
57.neurobasal完全培养基为neurobasal培养基添加2％b27神经培养添加剂，1％胎牛血清(fbs)，1％glutamax和1％双抗。
58.实施例中神经干细胞(nscs)来源：无菌条件下取孕期为12-14天的c57小鼠胚胎放入增殖培养基中培养三代以后。增殖培养基为含有2％b27神经培养添加剂，1％胎牛血清(fbs)，1％glutamax，1％双抗，20ng/ml megf和20ng/ml mbfgf的neurobasal培养基。
59.实施例1
60.叶酸钙纳米颗粒的制备：
61.1)将叶酸分散于超纯水中，避光搅拌6小时，配制成浓度为0.1m的叶酸分散液；
62.2)将0.1m的naoh水溶液缓缓滴入上述叶酸分散液中，使ph调节到7，50℃水浴回流1小时，使其充分反应；
63.3)将cacl2溶解于乙醇/水(50％,v/v)溶液中，配置成0.3m的溶液，在超声环境中，将与第一步分散液等量的上述cacl2溶液滴加进第二步时得到的溶液中，并在50℃的温度下搅拌1小时；超声频率为45khz，超声时间为20min；
64.4)在冰浴中冷却反应，通过离心收集沉淀，并用水和乙醇洗涤三次，在50℃的真空干燥箱内烘干研磨；
65.该实施制得的叶酸钙纳米颗粒电子显微镜照片如图1所示，从图中可以看出，叶酸钙纳米颗粒粒径均匀且尺寸较小。
66.红外光谱如图2所示，x射线衍射图谱如图3所示，能量色散x射线光谱元素分布如图4所示，通过图2-图4可以看出，本发明在超声下，将cacl2溶液滴加至反应液中，成功制得了叶酸钙纳米颗粒。
67.实施例2
68.同实施例1所述的叶酸钙纳米颗粒的制备，不同之处在于：
69.naoh水溶液的浓度为0.3m，cacl2溶液的的浓度0.5m，其他条件和参数按实施例1进行。
70.实施例3
71.同实施例1所述的叶酸钙纳米颗粒的制备，不同之处在于：
72.naoh水溶液的浓度为0.2m，cacl2溶液的的浓度0.8m，其他条件和参数按实施例1进行。
73.实施例4
74.同实施例1所述的叶酸钙纳米颗粒的制备，不同之处在于：
75.步骤3)中，超声频率为50khz，超声时间为25min。
76.实施例5
77.通过叶酸钙纳米颗粒诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法：
78.1)将叶酸钙纳米颗粒分散于75％的酒精中，离心进行灭菌处理。然后将叶酸钙纳米颗粒分散在无菌超纯水中，配制成浓度为20μg/ml的分散液。
79.2)将神经干细胞(nscs)进行离心后用神经分化培养基分散得到细胞悬液，离心转速为700rpm，离心时间为5min。然后接种在细胞培养板中，接种的细胞悬液体积为0.5ml，包含的细胞个数为4
×
106个，并加入叶酸钙纳米颗粒分散液，叶酸钙纳米颗粒分散液的接种量与细胞悬液相同，置于37℃下含5％co2的饱和湿度环境下体外培养5-10天，将神经干细
胞诱导分化为胆碱能神经元；同时做空白对照(不添加叶酸钙纳米颗粒分散液)。
80.实施例6
81.同实施例5所述的通过叶酸钙纳米颗粒诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法，不同之处在于：
82.叶酸钙纳米颗粒分散液的浓度为10μg/ml，其他条件和参数按实施例5进行。
83.实施例7
84.同实施例5所述的通过叶酸钙纳米颗粒诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法，不同之处在于：
85.叶酸钙纳米颗粒分散液的浓度为40μg/ml，其他条件和参数按实施例5进行。
86.试验例1
87.将加入浓度为20μg/ml的加荧光进行标记的叶酸钙纳米颗粒分散液培养3天后的神经细胞进行溶酶体染色，进行纳米颗粒与溶酶体的定位分析，检测结果如图5。通过图5可以看出，叶酸钙纳米颗粒可以被细胞吞噬并进入溶酶体，说明本发明制备的叶酸钙纳米颗粒有良好的生物相容性。
88.试验例2
89.1、将实施例5加入20μg/ml的叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天和7天的神经细胞进行基因和蛋白检测，检测神经元标记物β-微管蛋白(tuj1)和微管结合蛋白(map2)的表达水平，检测结果见图6、图7、图8。
90.检测结果发现：加入叶酸钙纳米颗粒培养后的nscs的神经元标记物tuj1和map2表达水平与对照组相比均有提高。发现培养5天后，加入叶酸钙纳米颗粒培养的nscs的tuj1表达相比对照组提升了6.9倍，map2表达提升了6.5倍。培养7天后，加入叶酸钙纳米颗粒培养的nscs的tuj1表达相比对照组提升了7倍，map2表达提升了10倍。
91.2、将上述不同培养条件下培养5天和10天的神经细胞进行蛋白检测，检测神经元标记物tuj1和map2的表达水平，检测结果见图9。
92.检测结果发现：加入叶酸钙纳米颗粒培养5天后的nscs的神经元标记物tuj1和map2的表达水平与未加入叶酸钙纳米颗粒培养10天后的nscs的神经元标志物蛋白表达水平相近。可以说明叶酸钙纳米颗粒提高神经干细胞分化速度5天以上。
93.3、将上述不同培养条件下培养5天的nscs进行钙离子荧光探针实验，实验结果见图10，通过图10可以看出，叶酸钙纳米颗粒诱导分化的nscs只在乙酰胆碱的刺激下做出响应，证明所诱导分化的nscs向胆碱能神经元定向分化。
94.4、将上述不同培养条件下培养5天的nscs进行胆碱能神经元标记物乙酰胆碱转移酶(chat)的蛋白水平检测，实验结果见图11、图12，通过图11、12可以看粗，加入叶酸钙纳米颗粒培养的nscs的胆碱能神经元标记物chat的表达水平明显提高。
95.试验例3
96.将实施例6加入10μg/ml的叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天和7天的神经细胞进行基因检测，检测神经元标记物β-微管蛋白(tuj1)和微管结合蛋白(map2)的表达水平，检测结果见图13、图14，可以发现加入叶酸钙纳米颗粒培养后的nscs的神经元标记物tuj1和map2表达水平与对照组相比均有提高。培养5天后，加入叶酸钙纳米颗粒培养的nscs的tuj1表达相比对照组提升了3倍，map2表达提升了2.1倍。培养7天后，加入叶酸钙纳米颗粒培养
的nscs的tuj1表达相比对照组提升了3.4倍，map2表达提升了4.7倍。
97.试验例4
98.将实施例7加入40μg/ml的叶酸钙纳米颗粒分散液培养5天和7天的神经细胞进行基因检测，检测神经元标记物β-微管蛋白(tuj1)和微管结合蛋白(map2)的表达水平，检测结果见图15、图16，可以发现加入叶酸钙纳米颗粒培养后的nscs的神经元标记物tuj1和map2表达水平与对照组相比均有提高。培养5天后，加入叶酸钙纳米颗粒培养的nscs的tuj1表达相比对照组提升了2.8倍，map2表达提升了6.5倍。培养7天后，加入叶酸钙纳米颗粒培养的nscs的tuj1表达相比对照组提升了2.65倍，map2表达提升了2.5倍。
99.综上试验例2-4，可以看出，浓度为40μg/ml的叶酸钙纳米颗粒分散液在调控神经干细胞定向分化为胆碱能神经元的效果最佳。