叶酸钙纳米颗粒的批量制备方法及诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法

技术特征：
1.叶酸钙纳米颗粒的批量制备方法，包括步骤如下：1)将naoh水溶液缓缓滴入叶酸分散液中，使ph调节到7-8，加热水浴回流反应，得到反应液；2)将cacl2溶解于乙醇-水的混合溶液中，得到cacl2溶液；3)在超声下，将cacl2溶液滴加至反应液中，加热搅拌反应；4)反应结束后冷却，通过离心收集沉淀，洗涤，真空干燥，研磨，得到叶酸钙纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，叶酸分散液的分散体系为无菌超纯水，叶酸分散液的摩尔浓度为0.1-0.4m。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，水浴回流反应温度为45-55℃，反应时间为1-2h，naoh水溶液的浓度为0.1-0.4m。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，乙醇-水的混合溶液中，乙醇与水的体积比为1:1，cacl2溶液的浓度为0.3-1.2m。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，cacl2溶液的用量使得cacl2与叶酸的摩尔质量比为(1-2):(1-2)，超声频率为40-55khz，超声时间为15-30min，加热搅拌反应温度为45-55℃，反应时间为1-2h；步骤4)中，洗涤为依次用水和乙醇洗涤三次，真空干燥为在50℃的真空干燥箱内烘干。6.一种通过权利要求1制得的叶酸钙纳米颗粒诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法，包括步骤：神经干细胞(nscs)离心后用神经分化培养基分散得细胞悬液，然后接种在细胞培养板中，并加入叶酸钙纳米颗粒分散液，进行体外培养，将神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，叶酸钙纳米颗粒分散液的分散体系为无菌超纯水，叶酸钙纳米颗粒的浓度为10-40μg/ml，叶酸钙纳米颗粒分散前先用75％的酒精灭菌处理。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，神经分化培养基为含2％b27神经培养添加剂，1％胎牛血清(fbs)，1％glutamax和1％双抗的neurobasal培养基。9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，细胞悬液的接种体积为0.5ml，包含的细胞个数为4
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106个，体外培养为在37℃下含5％co2的饱和湿度环境下体外培养4-10天。10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，叶酸钙纳米颗粒分散液的接种量与细胞悬液相同。

技术总结
本发明涉及叶酸钙纳米颗粒的批量制备方法及诱导神经干细胞分化为胆碱能神经元的方法。本发明在超声下，将CaCl2溶液滴加至反应液中，在叶酸与CaCl2的反应过程中施加频率为40-55kHz的超声，使叶酸与CaCl2充分反应，在反应过程中无副产物生成并且产率高，方法简单高效，可以批量生产，一次性可以获得十几克产物，反应物简单无毒，无其他副产物且容易清洗。制备的叶酸钙纳米颗粒粒径均匀且尺寸较小，可以被细胞吞噬，有良好的生物相容性，可用于细胞实验。并且通过叶酸钙纳米颗粒调控神经干细胞定向分化，使用方便，可以直接加入细胞培养基或者植入材料内部使用。可以促进神经干细胞向成熟的胆碱能神经元分化。成熟的胆碱能神经元分化。


技术研发人员：仇吉川 王良 杨鸿儒 刘峰 孔颖 王文晗 刘宏
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2022.08.19
技术公布日：2022/11/11