头孢菌素c的提纯方法
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域。更具体地说，本发明涉及一种头孢菌素c的提纯方法。
背景技术：
2.头孢菌素c是生产头孢菌素类抗生素的重要中间体，其工业化产品主要采用发酵法生产。现有的头孢菌素c的提纯方法，如《不同类型树脂在抗生素分离纯化中的应用》中记载的：一般是将发酵液进行酸化处理后，直接采用板框过滤或膜过滤，去除发酵液中大部分蛋白质、菌丝体、培养基等杂质，得到头孢菌素c发酵滤液，再使用大孔吸附树脂对发酵滤液进行预处理，进一步去除发酵滤液中的蛋白质和色素，再使用大孔吸附树脂对预处理后的滤液进行吸附和解析，最后使用离子交换树脂对解析液进行脱色实验，得到纯化后的头孢菌素c。上述提纯方法中，需要过3次树脂柱，树脂柱在使用前需要活化，使用一段时间后需要再生，操作复杂，且产生的废液较多。
技术实现要素：
3.本发明的目的是提供一种头孢菌素c的提纯方法，以解决上述问题。
4.为了实现本发明的目的和其它优点，提供了一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：s1、对含头孢菌素c的发酵液进行酸化、剪切和分离，得第一液体；s2、将所述第一液体用陶瓷膜过滤，得第二液体；s3、将所述第二液体加入非极性大孔树脂柱中，进行吸附、解吸，即得。
5.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s1中，将发酵液的ph值调至2.0-3.0，然后于600-800r/min，5-10℃下剪切2-3h，再抽滤后，得所述第一液体。
6.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s1中，所述第一液体包括第一液体a和第一液体b；其中，所述第一液体a是将发酵液的ph值调至2.0-3.0，然后于600-800r/min，5-10℃下剪切2-3h，再抽滤后，所得的液体；所述第一液体b是向制备所述第一液体a时所得的滤渣中加入0.6倍所述发酵液体积的水，搅拌均匀后，调节ph值至4.0-5.0，然后于50-100r/min，5-10℃下剪切10-20min，静置30min，再离心后，所得的液体。
7.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s2中，所述陶瓷膜过滤时，陶瓷膜的孔径为50nm，料液温度为10-15℃，压力为0.1-0.3mpa，膜面流速为4-5m/s。
8.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s2中，所述第一液体a在陶瓷膜过滤初期加入，所述第一液体b在陶瓷膜过滤后期加入。
9.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s3中，将所述第二液体中的头孢菌素c的浓度调节至8000ug/ml，然后以0.6-0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱中，用水以0.6-0.8bv的流速水洗2.0-3.0h，再用5％的醋酸钠溶液洗脱3.0-4.0h，收集洗脱液，即得。
10.本发明至少包括以下有益效果：
11.本发明利用头孢菌素c发酵液的流变性能，对发酵液进行高速长时剪切，以促进发酵液中的固形物沉降，提高了发酵液的分离效果，结合后续陶瓷膜过滤操作，可最大限度的
去除液体中的蛋白质和色素等杂质，后续仅需一次树脂柱纯化，即可获得高纯度的头孢菌素c，操作简单，污染少。
12.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
13.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
14.需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
15.实施例1：
16.一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：
17.s1、取2l含头孢菌素c的发酵液(发酵液中头孢菌素c的浓度约为23g/l，下同)，加入硫酸，将发酵液的ph值调至2.0，然后于700r/min，5-10℃下剪切3h，滤纸抽滤，得第一液体。
18.s2、将第一液体加入陶瓷膜(孔径为50nm，下同)中过滤，过滤完成后向陶瓷膜中加入1.2l去离子水洗滤，合并两次滤液，并将滤液中头孢菌素c的浓度调节为8000ug/ml，得第二液体，其中，陶瓷膜过滤时的料液温度为10-15℃，压力为0.2mpa，膜面流速为4.5m/s。
19.s3、将第二液体以0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱(柱中树脂装量为1l，下同)中，进行吸附处理，然后将水以0.8bv的流速流过吸附处理后的x-5大孔树脂柱，水洗2h，再将5％的醋酸钠溶液以0.6bv的流速流过水洗处理后的x-5大孔树脂柱，洗脱4h，收集洗脱液，得纯化的头孢菌素c。
20.实施例2：
21.一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：
22.s1、取2l含头孢菌素c的发酵液，加入硫酸，将发酵液的ph值调至2.0，然后于700r/min，5-10℃下剪切3h，滤纸抽滤，得第一液体a；向抽滤后的残渣中加入1.2l的去离子水，搅拌均匀后，加入草酸，调节ph值至5.0，然后于50r/min，5-10℃下剪切15min，静置30min，再离心后，得第一液体b。
23.s2、将第一液体a加入陶瓷膜中过滤，过滤完成后向陶瓷膜中加入第一液体b洗滤，合并两次滤液，并将滤液中头孢菌素c的浓度调节为8000ug/ml，得第二液体，其中，陶瓷膜过滤时的料液温度为10-15℃，压力为0.2mpa，膜面流速为4.5m/s。
24.s3、将第二液体以0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱中，进行吸附处理，然后将水以0.8bv的流速流过吸附处理后的x-5大孔树脂柱，水洗2h，再将5％的醋酸钠溶液以0.6bv的流速流过水洗处理后的x-5大孔树脂柱，洗脱4h，收集洗脱液，得纯化的头孢菌素c。
25.对比例1：
26.一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：
27.s1、取2l含头孢菌素c的发酵液，加入硫酸，将发酵液的ph值调至4.0，然后于50r/min，5-10℃下剪切15min，静置30min，滤纸抽滤，得第一液体。
28.s2、将第一液体加入陶瓷膜中过滤，过滤完成后向陶瓷膜中加入1.2l去离子水洗
滤，合并两次滤液，并将滤液中头孢菌素c的浓度调节为8000ug/ml，得第二液体，其中，陶瓷膜过滤时的料液温度为10-15℃，压力为0.2mpa，膜面流速为4.5m/s。
29.s3、将第二液体以0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱中，进行吸附处理，然后将水以0.8bv的流速流过吸附处理后的x-5大孔树脂柱，水洗2h，再将5％的醋酸钠溶液以0.6bv的流速流过水洗处理后的x-5大孔树脂柱，洗脱4h，收集洗脱液，得纯化的头孢菌素c。
30.对比例2：
31.一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：
32.s1、取2l含头孢菌素c的发酵液，加入硫酸，将发酵液的ph值调至2.0，混匀后，静置30min，滤纸抽滤，并将滤液中头孢菌素c的浓度调节为8000ug/ml，得第一液体。
33.s2、将第一液体以0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱中，进行吸附处理，然后将水以0.8bv的流速流过吸附处理后的x-5大孔树脂柱，水洗2h，再将5％的醋酸钠溶液以0.6bv的流速流过水洗处理后的x-5大孔树脂柱，洗脱4h，收集洗脱液，得纯化的头孢菌素c。
34.实验例1：
35.对实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中收集的洗脱液进行透光率和浓度检测，并计算头孢菌素c的收率，结果如表1所示。其中，
36.透光率的检测步骤为：打开uv2700紫外分光光度计，将检测波长调整为420nm，再将适量纯化水倒入751型号石英比色皿中，放入紫外分光光度计仪器中进行仪器校验。之后精密吸取1.0ml洗脱液样品，加纯化水为稀释液定容至10ml容量瓶内，摇匀，倒入751型号石英比色皿中再放入紫外分光光度计仪器中进行样品透光率检测，读取显示数值则为该样品透光率数值。
37.浓度检测步骤为：打开高效液相色谱仪(启动泵及检测器)进行预热，检测器波长λ为254nm。将经0.45μm有机微孔滤膜滤后的甲醇水溶液(甲醇：水＝10:90)以流速1.0ml/min冲洗色谱柱约30min左右。再用流动相以流速0.5ml/min冲洗色谱柱10min后，将流速升至1.0ml/min。待基线平稳后可进空白样。精密称取头孢菌素c钠盐标准品32mg于100ml容量瓶中，加适量纯化水放入超声波仪器中进行助溶，待完全溶解后加纯化水定容至刻度，摇匀，用0.45μm过滤器过滤，即可。分别精密吸取1.0ml洗脱液样品加纯化水为稀释液定容至容量瓶内，摇匀，用0.45μm过滤器过滤即可。样品先经16折滤纸过滤，取滤液10ml，再进行稀释100倍、定容、过滤、进样操作，分别取标准品、样品20μl注入液相色谱仪。测试结束后，按下式计算洗脱液中头孢菌素c的浓度：
38.头孢菌素c的浓度＝(标准品的质量*标准品的浓度*样品的峰面积*1000)/(标准品的峰面积*100)*样品的稀释倍数
39.表1
[0040] 透光率(％)浓度(mg/ml)收率(％)实施例194.716.7387.29实施例293.218.0494.12对比例181.815.4780.71对比例236.311.6160.57
[0041]
由表1可知，实施例1和实施例2中洗脱液的透光率和浓度显著高于对比例1和对比例2，且实施例1中的洗脱液的透光率略高于实施例2，但浓度低于实施例2，这说明采用本发
明的方法可以获得高纯度和高收率的头孢菌素c，实施例1和实施例2中的透光率和浓度差异可能是由于实施例2中对抽滤后的滤渣进行了二次酸洗，酸洗过程中，在促进滤渣中残留头孢菌素c溶出的同时，也会导致微量的蛋白质等杂质复溶，又由于第一液体在过柱前，还进行了陶瓷膜过滤，陶瓷膜会对第一液体中的杂质进行进一步过滤，进而降低了二次酸洗中的杂质对洗脱液的透光率的影响，使得实施例1中的透光率仅略大于实施例2中的透光率，而二次酸洗获得的第一液体b中不仅含有头孢菌素c，第一液体b还会增加陶瓷膜过滤后期陶瓷膜的通量，进而有效提高第二液体中头孢菌素c的浓度，使得实施例1中的浓度显著小于实施例2中的浓度。
[0042]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
技术领域
1.本发明涉及生物制药领域。更具体地说，本发明涉及一种头孢菌素c的提纯方法。
背景技术：
2.头孢菌素c是生产头孢菌素类抗生素的重要中间体，其工业化产品主要采用发酵法生产。现有的头孢菌素c的提纯方法，如《不同类型树脂在抗生素分离纯化中的应用》中记载的：一般是将发酵液进行酸化处理后，直接采用板框过滤或膜过滤，去除发酵液中大部分蛋白质、菌丝体、培养基等杂质，得到头孢菌素c发酵滤液，再使用大孔吸附树脂对发酵滤液进行预处理，进一步去除发酵滤液中的蛋白质和色素，再使用大孔吸附树脂对预处理后的滤液进行吸附和解析，最后使用离子交换树脂对解析液进行脱色实验，得到纯化后的头孢菌素c。上述提纯方法中，需要过3次树脂柱，树脂柱在使用前需要活化，使用一段时间后需要再生，操作复杂，且产生的废液较多。
技术实现要素：
3.本发明的目的是提供一种头孢菌素c的提纯方法，以解决上述问题。
4.为了实现本发明的目的和其它优点，提供了一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：s1、对含头孢菌素c的发酵液进行酸化、剪切和分离，得第一液体；s2、将所述第一液体用陶瓷膜过滤，得第二液体；s3、将所述第二液体加入非极性大孔树脂柱中，进行吸附、解吸，即得。
5.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s1中，将发酵液的ph值调至2.0-3.0，然后于600-800r/min，5-10℃下剪切2-3h，再抽滤后，得所述第一液体。
6.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s1中，所述第一液体包括第一液体a和第一液体b；其中，所述第一液体a是将发酵液的ph值调至2.0-3.0，然后于600-800r/min，5-10℃下剪切2-3h，再抽滤后，所得的液体；所述第一液体b是向制备所述第一液体a时所得的滤渣中加入0.6倍所述发酵液体积的水，搅拌均匀后，调节ph值至4.0-5.0，然后于50-100r/min，5-10℃下剪切10-20min，静置30min，再离心后，所得的液体。
7.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s2中，所述陶瓷膜过滤时，陶瓷膜的孔径为50nm，料液温度为10-15℃，压力为0.1-0.3mpa，膜面流速为4-5m/s。
8.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s2中，所述第一液体a在陶瓷膜过滤初期加入，所述第一液体b在陶瓷膜过滤后期加入。
9.优选的是，所述的头孢菌素c的提纯方法，步骤s3中，将所述第二液体中的头孢菌素c的浓度调节至8000ug/ml，然后以0.6-0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱中，用水以0.6-0.8bv的流速水洗2.0-3.0h，再用5％的醋酸钠溶液洗脱3.0-4.0h，收集洗脱液，即得。
10.本发明至少包括以下有益效果：
11.本发明利用头孢菌素c发酵液的流变性能，对发酵液进行高速长时剪切，以促进发酵液中的固形物沉降，提高了发酵液的分离效果，结合后续陶瓷膜过滤操作，可最大限度的
去除液体中的蛋白质和色素等杂质，后续仅需一次树脂柱纯化，即可获得高纯度的头孢菌素c，操作简单，污染少。
12.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
13.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
14.需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
15.实施例1：
16.一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：
17.s1、取2l含头孢菌素c的发酵液(发酵液中头孢菌素c的浓度约为23g/l，下同)，加入硫酸，将发酵液的ph值调至2.0，然后于700r/min，5-10℃下剪切3h，滤纸抽滤，得第一液体。
18.s2、将第一液体加入陶瓷膜(孔径为50nm，下同)中过滤，过滤完成后向陶瓷膜中加入1.2l去离子水洗滤，合并两次滤液，并将滤液中头孢菌素c的浓度调节为8000ug/ml，得第二液体，其中，陶瓷膜过滤时的料液温度为10-15℃，压力为0.2mpa，膜面流速为4.5m/s。
19.s3、将第二液体以0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱(柱中树脂装量为1l，下同)中，进行吸附处理，然后将水以0.8bv的流速流过吸附处理后的x-5大孔树脂柱，水洗2h，再将5％的醋酸钠溶液以0.6bv的流速流过水洗处理后的x-5大孔树脂柱，洗脱4h，收集洗脱液，得纯化的头孢菌素c。
20.实施例2：
21.一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：
22.s1、取2l含头孢菌素c的发酵液，加入硫酸，将发酵液的ph值调至2.0，然后于700r/min，5-10℃下剪切3h，滤纸抽滤，得第一液体a；向抽滤后的残渣中加入1.2l的去离子水，搅拌均匀后，加入草酸，调节ph值至5.0，然后于50r/min，5-10℃下剪切15min，静置30min，再离心后，得第一液体b。
23.s2、将第一液体a加入陶瓷膜中过滤，过滤完成后向陶瓷膜中加入第一液体b洗滤，合并两次滤液，并将滤液中头孢菌素c的浓度调节为8000ug/ml，得第二液体，其中，陶瓷膜过滤时的料液温度为10-15℃，压力为0.2mpa，膜面流速为4.5m/s。
24.s3、将第二液体以0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱中，进行吸附处理，然后将水以0.8bv的流速流过吸附处理后的x-5大孔树脂柱，水洗2h，再将5％的醋酸钠溶液以0.6bv的流速流过水洗处理后的x-5大孔树脂柱，洗脱4h，收集洗脱液，得纯化的头孢菌素c。
25.对比例1：
26.一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：
27.s1、取2l含头孢菌素c的发酵液，加入硫酸，将发酵液的ph值调至4.0，然后于50r/min，5-10℃下剪切15min，静置30min，滤纸抽滤，得第一液体。
28.s2、将第一液体加入陶瓷膜中过滤，过滤完成后向陶瓷膜中加入1.2l去离子水洗
滤，合并两次滤液，并将滤液中头孢菌素c的浓度调节为8000ug/ml，得第二液体，其中，陶瓷膜过滤时的料液温度为10-15℃，压力为0.2mpa，膜面流速为4.5m/s。
29.s3、将第二液体以0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱中，进行吸附处理，然后将水以0.8bv的流速流过吸附处理后的x-5大孔树脂柱，水洗2h，再将5％的醋酸钠溶液以0.6bv的流速流过水洗处理后的x-5大孔树脂柱，洗脱4h，收集洗脱液，得纯化的头孢菌素c。
30.对比例2：
31.一种头孢菌素c的提纯方法，包括如下步骤：
32.s1、取2l含头孢菌素c的发酵液，加入硫酸，将发酵液的ph值调至2.0，混匀后，静置30min，滤纸抽滤，并将滤液中头孢菌素c的浓度调节为8000ug/ml，得第一液体。
33.s2、将第一液体以0.8bv的流速加入x-5大孔树脂柱中，进行吸附处理，然后将水以0.8bv的流速流过吸附处理后的x-5大孔树脂柱，水洗2h，再将5％的醋酸钠溶液以0.6bv的流速流过水洗处理后的x-5大孔树脂柱，洗脱4h，收集洗脱液，得纯化的头孢菌素c。
34.实验例1：
35.对实施例1、实施例2、对比例1和对比例2中收集的洗脱液进行透光率和浓度检测，并计算头孢菌素c的收率，结果如表1所示。其中，
36.透光率的检测步骤为：打开uv2700紫外分光光度计，将检测波长调整为420nm，再将适量纯化水倒入751型号石英比色皿中，放入紫外分光光度计仪器中进行仪器校验。之后精密吸取1.0ml洗脱液样品，加纯化水为稀释液定容至10ml容量瓶内，摇匀，倒入751型号石英比色皿中再放入紫外分光光度计仪器中进行样品透光率检测，读取显示数值则为该样品透光率数值。
37.浓度检测步骤为：打开高效液相色谱仪(启动泵及检测器)进行预热，检测器波长λ为254nm。将经0.45μm有机微孔滤膜滤后的甲醇水溶液(甲醇：水＝10:90)以流速1.0ml/min冲洗色谱柱约30min左右。再用流动相以流速0.5ml/min冲洗色谱柱10min后，将流速升至1.0ml/min。待基线平稳后可进空白样。精密称取头孢菌素c钠盐标准品32mg于100ml容量瓶中，加适量纯化水放入超声波仪器中进行助溶，待完全溶解后加纯化水定容至刻度，摇匀，用0.45μm过滤器过滤，即可。分别精密吸取1.0ml洗脱液样品加纯化水为稀释液定容至容量瓶内，摇匀，用0.45μm过滤器过滤即可。样品先经16折滤纸过滤，取滤液10ml，再进行稀释100倍、定容、过滤、进样操作，分别取标准品、样品20μl注入液相色谱仪。测试结束后，按下式计算洗脱液中头孢菌素c的浓度：
38.头孢菌素c的浓度＝(标准品的质量*标准品的浓度*样品的峰面积*1000)/(标准品的峰面积*100)*样品的稀释倍数
39.表1
[0040] 透光率(％)浓度(mg/ml)收率(％)实施例194.716.7387.29实施例293.218.0494.12对比例181.815.4780.71对比例236.311.6160.57
[0041]
由表1可知，实施例1和实施例2中洗脱液的透光率和浓度显著高于对比例1和对比例2，且实施例1中的洗脱液的透光率略高于实施例2，但浓度低于实施例2，这说明采用本发
明的方法可以获得高纯度和高收率的头孢菌素c，实施例1和实施例2中的透光率和浓度差异可能是由于实施例2中对抽滤后的滤渣进行了二次酸洗，酸洗过程中，在促进滤渣中残留头孢菌素c溶出的同时，也会导致微量的蛋白质等杂质复溶，又由于第一液体在过柱前，还进行了陶瓷膜过滤，陶瓷膜会对第一液体中的杂质进行进一步过滤，进而降低了二次酸洗中的杂质对洗脱液的透光率的影响，使得实施例1中的透光率仅略大于实施例2中的透光率，而二次酸洗获得的第一液体b中不仅含有头孢菌素c，第一液体b还会增加陶瓷膜过滤后期陶瓷膜的通量，进而有效提高第二液体中头孢菌素c的浓度，使得实施例1中的浓度显著小于实施例2中的浓度。
[0042]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
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