用于预防或暴露后治疗感染或呼吸疾病的抗病毒组合物的制作方法

用于预防或暴露后治疗感染或呼吸疾病的抗病毒组合物
1.发明背景
技术领域
2.本发明涉及用于递送抗病毒剂的药物递送系统。本发明涉及制备所述药物递送系统的方法。本发明还涉及适用于肺部递送系统的缓释药物组合物，其具有减少的全身副作用。
3.相关技术描述
4.感染疾病可通过接触、飞沫和血源性感染等不同途径传播，通过全身性用药可降低药物在受影响身体环境中的生物利用度。药物递送系统渗透到目标组织的目标细胞，是有效治疗感染疾病的关键障碍，如通过吸入治疗肺部感染疾病。尽管药物递送系统附着到目标上皮细胞之前，药物会保留在脂质体内，但根据游离且不带电的药物跨脂质体脂膜的扩散速率，它可以从一种脂质体药物改变为另一种脂质体药物。这在很大程度上取决于存在于脂质体外部的微环境中脂质屏障的物理化学性质，以及脂质体内的水分环境。
5.由感染或其他未知原因引起的呼吸疾病是一种极其严重的、使人衰弱的肺部疾病，会造成早期死亡。特别是那些以病毒有效复制和病毒诱导的细胞溶解或免疫病理引起的细胞损伤为特征的疾病。感染的细胞系和死后的肺组织已显示出由于细胞凋亡、坏死或偶尔形成合胞体而引起的细胞病变。
6.如美国专利公开号us20110104259a1中所述，脂质体已被用作药物载体，用来掩盖通过吸入途径用于哮喘治疗的药物令人不快的味道。脂质体包囊药物可以改变药物的药代动力学特征，在局部身体环境下提供缓慢的药物释放，能够施用在较少的药物施用频率的同时获得最佳的给药剂量，和/或可减少副作用和毒性。然而，尚不清楚通过吸入途径时以脂质体递送的喹宁化合物或其他抗病毒剂整体是否能有效发挥所需的功能，例如沉积在表达合适受体作为靶位点的靶细胞系上，同时作为病毒进入细胞内靶位点，并在体内进行所需的药代动力学特性。
7.目前尚未明朗的是使用重新配制抗病毒剂的脂质体技术能够产生用于吸入的脂质体制剂，以预防剂量来预防严重急性呼吸综合征，或以治疗剂量来治疗呼吸道疾病或感染疾病，同时具有减低的副作用。目前，尚没有可行的吸入式脂质体药物制剂做为化学预防用药，以用于预防、治疗轻度病例、治疗急性呼吸窘迫综合征(ards)、急性肺损伤(ali)或严重急性呼吸综合征(sars)，前述病症是经由病毒感染引发的，例如冠状病毒、covid-19(也称为sars-cov2)。
8.仍然需要一种具有预定包囊效率的可吸入制剂，其通过减少抗病毒剂(如喹宁化合物和核苷化合物)的给药频率和/或剂量，以及针对肺递送所需的预防或治疗窗口，达到平衡。此外，适用于呼吸疾病的制剂应具有以下特性：是可可吸入的，表现出雾化后足够的包囊效率，对于由局部肺表面活性剂(surfactant)造成的破坏具有改善的稳定性或适当的抗性，并且进一步具有所希望的剂量强度以确保有潜力在肺部环境中达到所希望的药效。本发明针对此需求与其他需求。
9.发明概述
10.本发明提供一种用于治疗呼吸疾病或感染疾病的脂质体药物制剂，特别是通过吸入给药来治疗，其包含至少一种脂质(其任选地为磷脂及固醇、和/或经聚乙二醇(peg)修饰的磷脂)，以及包囊在脂质体的水性内部的抗病毒剂。
11.为了改良现存呼吸疾病或感染疾病的治疗模式，并善用缓慢、持续药物释放的益处，我们开发了一种抗病毒剂组合物，其包含脂质体态抗病毒剂以及预定量的于水性悬浮液中的游离抗病毒剂，其可被气溶胶化并吸入，而用于呼吸疾病的预防或强化治疗。特别是需要一种用于预防或治疗sars的可吸入制剂。
12.本公开提供一种用于预防或治疗呼吸疾病或感染疾病的抗病毒剂组合物，特别是针对sars，其具有以下优点：1)与吸入的游离态药物成分相比，达到更长的治疗效果， 2)将药物直接递送到疾病部位或病毒感染部位，3)较快起到作用效果，4)减少不良的药物反应和全身性作用，5)绕过在口服给药中观察到的首过代谢(first-pass metabolism)，从而提高药物成分的生物利用度(并且可能降低肝毒性、视网膜病变的眼部症状、胃肠道(gi)影响，包括恶心、呕吐、腹泻、腹部不适和肝毒性)，6)通过从脂质体药物持续释放而增加药物成分在靶组织中的停留时间，7)减少药物给药的频率，8)非侵入性吸入递送，和/或9)改善患者的治疗结果和顺应性。
13.在一特定实施方案中，根据本公开的抗病毒剂是以预定量包囊于脂质体中，以形成根据本公开的抗病毒剂组合物，以完成具有优选的释放特性与降低的毒性(特别是心脏毒性)的组合物。
14.提供一种用于预防或治疗呼吸疾病或感染疾病的抗病毒剂组合物，其是可吸入的，且包含脂质体态抗病毒剂(liposomal antiviral agent)，其中脂质体态抗病毒剂包含：
15.包含至少一种脂质的脂质体、以及包囊于所述脂质体中的抗病毒剂。
16.在一些实施方案中，脂质体包含由一或多种磷脂和固醇所组成的脂质双层，其中所述固醇为胆固醇，并且一或多种磷脂相对于固醇的摩尔比为1:1至2:1，且选择性为3:2。
17.在一些实施方案中，所述一或多种磷脂包括磷脂酰胆碱(phosphocholine，pc)，该磷脂酰胆碱可包括但不限于氢化大豆磷脂酰胆碱(hydrogenated soy phosphatidylcholine， hspc)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine， dspc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine， dppc)、或它们的混合物。在另一些实施方案中，所述一或多种磷脂包括摩尔比为1:1 或3:2的dspc和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3
‑ꢀ
phosphoethanolamine，dppe)。
18.在一些实施方案中，脂质体态抗病毒剂包含4-氨基喹啉化合物(4-amino quinoline)。
19.在一些实施方案中，4-氨基喹啉化合物选自以下组中：氯喹(chloroquine)、羟氯喹 (hydroxychloroquine)以及阿莫地喹(amodiaquine)。
20.在一些实施方案中，所述抗病毒剂为如结构式i所示的核苷化合物：
(ampicillin) 舒巴坦(sulbactam)、哌拉西林(piperacillin) 他唑巴坦(tazobactam))、大环内酯类(macrolides)、头孢菌素类(cephalosporins)、氨基糖苷类(aminoglycosides)以及糖肽类 (glycopeptides)。在一些实施方案中，抗生素选自于可利霉素(currimycin)及阿奇霉素 (azithromycin)。
33.另一方面，本发明还提供一种用于预防或治疗呼吸疾病或感染疾病的抗病毒剂组合物，或是一种包含所述抗病毒剂组合物的气溶胶化的颗粒组合物，其具有药物对脂质比例为至少0.01mol/mol，以及任选地介于0.01mol/mol至2.0mol/mol之间、介于0.05 mol/mol至2.0mol/mol之间、介于0.05mol/mol至1.5mol/mol之间、介于0.05mol/mol 至1.0mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.5mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.3 mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.2mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.15mol/mol 之间、介于0.01mol/mol至1mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.1mol/mol之间、介于0.07mol/mol至0.09mol/mol之间、或为约0.085mol/mol，。并且抗病毒剂的浓度范围介于0.1mg/ml至10mg/ml之间。
34.另一方面，本公开还提供一种根据本发明的用于预防或治疗呼吸疾病的气溶胶化的颗粒组合物，其包含脂质体态喹宁化合物，且具有药物对脂质比例为至少0.01mol/mol、任选地为至少0.05mol/mol，任选地介于0.01mol/mol至2.0mol/mol之间、介于0.05 mol/mol至2.0mol/mol之间、介于0.05mol/mol至1.5mol/mol之间、介于0.05mol/mol 至1.0mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.5mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.3 mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.2mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.15mol/mol 之间、任选地为0.5mol/mol，并且喹宁化合物的浓度为基于所述组合物的1mg/ml至 10mg/ml之间。
35.另一方面，本公开还提供一种根据本发明的用于预防或治疗呼吸疾病的气溶胶化的颗粒组合物，其包含脂质体态核苷化合物，且具有药物对脂质比例为至少0.01mol/mol、任选地为至少0.05mol/mol，任选地介于0.01mol/mol至1.0mol/mol之间、介于0.03 mol/mol至0.5mol/mol之间、介于0.03mol/mol至0.15mol/mol之间、介于0.03mol/mol 至0.1mol/mol之间，任选地为约0.05mol/mol，介于0.05mol/mol至0.5mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.15mol/mol之间、介于0.05mol/mol至0.1mol/mol之间、介于 0.07mol/mol至0.1mol/mol之间，任选地为约0.085mol/mol，并且核苷化合物的浓度为基于所述组合物的0.1mg/ml至5mg/ml之间。
36.另一方面，本发明还提供一种雾化喷雾剂，其包含用于根据本发明用途的抗病毒组合物。
37.另一方面，本发明还提供一种根据本发明用于预防或治疗呼吸疾病或感染疾病的气溶胶化的颗粒组合物，该颗粒组合物包含抗病毒剂组合物，且包含根据本发明的脂质体态抗病毒剂。
38.另一方面，本发明还提供一种预防或治疗呼吸疾病或感染疾病的方法，其包括：向有此需要的个体施用有效量的根据本发明的用于预防或治疗呼吸疾病的抗病毒剂组合物。
39.另一方面，本发明还提供用于向有需要的个体施用抗病毒剂组合物的系统。此系统包括根据本发明的抗病毒剂组合物，以及肺部递送装置。所述肺部递送装置能将所述抗病毒剂组合物雾化，并且雾化后形成的包含脂质体态抗病毒剂的多个颗粒包含游离态抗病毒剂以及脂质体态抗病毒剂，所述游离态抗病毒剂的量能有效地提供即时的抗病毒活性，而所述脂质体态抗病毒剂的量能有效地提供持续的抗病毒活性。
40.另一方面，本发明还提供一种减少与治疗人类个体中呼吸疾病或感染疾病有关的并发症的方法，所述人类个体具有所述并发症，所述方法包括向有此需要的个体施用根据本公开的抗病毒剂组合物。根据本发明，所述并发症包括但不限于心脏毒性或肝毒性。根据本发明，所述并发症包括但不限于校正qt间期(qtc)的延长。
41.结合附图进行以下详细描述时，本公开的其他目的、优点和新特征将变得更加明显。
42.附图简述
43.图1为显示施用根据本公开的组合物以及游离态hcq后，大鼠肺部中hcq的药代动力学曲线。
44.图2为显示施用根据本公开的组合物以及游离态hcq后，大鼠血液中hcq的药代动力学曲线。
45.图3为显示施用根据本公开的组合物以及游离态hcq后，大鼠心脏中hcq的药代动力学曲线。
46.图4a和图4b为显示一系列描述在单次静脉注射施用sbecd配制的 gs-441524(gs-441524溶液-iv)之后、或是在气管内施用施用脂质体态gs-441524(也称为ispm21)(ispm21-it)之后，大鼠肺部(图4a)以及大鼠血浆(图4b)中gs-441524 的平均浓度-时间曲线图；lloq：定量下限。
47.优选实施方案的详述
48.定义
49.除非另有说明，如上文和整份

技术实现要素：
中使用的以下用语，应理解为具有以下含义。
50.本文所使用的单数形式“一”、“一种”、“所述”和“此”，包括复数的指代物，除非上下文另有明确说明。
51.本文中的所有数字可以理解为由“约”修饰，当提及诸如量、持续时间及此类的可测量值时，意味着包括特定值的
±
10％、优选为
±
5％、更优选为
±
1％、及甚至更优选为
±
0.1％的变量，这些变量适用于描述脂质体态药物的所希望的量，除非另有说明。
52.如本文所使用的术语“治疗(treating、treated或treatment)”包括预防性 (preventative)(例如防治性(prophylactic))、缓和性(palliative)及治愈性(curative)的用途或结果。术语“个体(subject)”包括患有呼吸疾病或其他疾病或疑似病毒感染的脊椎动物。优选地，所述个体为温血动物，包括哺乳动物，优选为人类。
53.如本文所使用的术语“药物(drug)”指的是抗病毒剂，例如根据本公开涉及期望治疗效果活性的喹宁化合物或核苷化合物。如本文所使用的术语“药物对脂质比例(drug tolipid ratio)”(d/l)指的是在根据本公开的组合物中抗病毒剂相对于至少一种脂质的比例。根据本公开的脂质体药物组合物中的游离态药物或脂质体态药物中的药物含量是经由，但不限于，紫外光-可见光(uv-vis)吸收度或高效液相色谱(hplc)法来测定的。脂质体及脂质体态药物中磷脂的含量或浓度可经由但不限于以下方法来测定：使用磷测定法 (改编自g.rouser et al.,lipids 1970,5,494-496)或hplc方法，测定脂质体和脂质体态药物样品的磷含量。
54.如本文所使用，尽管在大鼠中获得了药代动力学数据，但是在其他哺乳动物中还
可以获得与根据本公开的吸入组合物相关的药代动力学特征以产生可吸入组合物，所述哺乳动物包括但不限于猫、狗、马、小鼠、猪、非人类灵长类动物以及人类。
55.感染疾病以及呼吸疾病
56.本发明所称感染疾病和致病性感染，是指由病毒、寄生虫、细菌等生物体引起的疾病。在一个方面，感染疾病的传播途径有粪口传播、飞沫接触、性行为传播、口腔传播、直接接触、交通工具传播、垂直传播、医源性传播、病媒传播等。另一方面，感染疾病可包括但不限于尿路感染、皮肤感染、呼吸道感染、牙源性感染、阴道感染和羊膜内感染。
57.在一些实施方案中，所述感染疾病包括但不限于：急性弛缓性脊髓炎(acute flaccidmyelitis，afm)、无形体病(anaplasmosis)、炭疽病毒、巴贝虫病(babesiosis)、肉毒中毒、布鲁氏菌病、弯曲杆菌病(campylobacteriosis)、碳青霉烯耐药性感染(carbapenem-resistantinfection，cre/crpa)、软性下疳(chancroid)、基孔肯亚病毒感染(chikungunya virusinfection)、衣原体、雪卡菌(有害藻华，habs)、艰难梭菌感染(clostridium difficileinfection)、产气荚膜梭菌(epsilon毒素)、球孢子菌病真菌感染(裂谷热，valley fever)、 covid-19(冠状病毒疾病2019)、克雅病(creutzfeldt-jacob disease)、传染性海绵状脑病 (cjd)、隐孢子虫病(crypto)、环孢子虫病、登革热(1、2、3、4登革热)、白喉、大肠杆菌感染、产志贺氏毒素(shiga toxin-producing，stec)、东方马脑炎(eee)、埃博拉出血热(ebola)、埃立克体病(ehrlichiosis)、脑炎、虫媒病毒或副感染性、肠病毒感染、非小儿麻痹肠病毒(non-polio enterovirus)、肠病毒感染d68(ev-d68)、贾第虫病(giardia)、鼻疽 (glanders)、淋球菌感染(淋病)、腹股沟肉芽肿(granuloma inguinale)、b型流感嗜血杆菌病(haemophilus influenza disease，hib或h-flu))、汉他病毒肺综合征(hps)、溶血性尿毒症综合征(hus)、甲型肝炎(hep a)、乙型肝炎(hep b)、丙型肝炎(hep c)、丁型肝炎 (hep d)、戊型肝炎(hep e)、疱疹、带状疱疹、带状疱疹病毒(shingles)、组织胞浆菌病感染(histoplasmosis infection)、人类免疫缺陷病毒/艾滋病(hiv/aids)、人乳头状瘤病毒(hpv)、流行性感冒(流感)、铅中毒军团菌病(军团病)、麻风病(hansens病)、钩端螺旋体病、李斯特菌病(李斯特菌，listeria)、莱姆病、性病性淋巴肉芽肿感染(lgv)、疟疾、麻疹、类鼻疽、脑膜炎、病毒性脑膜炎、脑膜炎球菌病、细菌性脑膜炎、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、小儿多系统炎症综合征(multisystem inflammatorysyndrome in children，mis-c)、腮腺炎、诺如病毒、麻痹性贝类中毒(雪卡毒素,ciguatera)、虱病(虱子、头虱)、盆腔炎(pelvic inflammatory disease，pid)、百日咳、鼠疫、腺鼠疫、败血性鼠疫、肺炎鼠疫、肺炎球菌性疾病(肺炎)、小儿麻痹症(polio)、波瓦生脑炎 (powassan)、鹦鹉热、虱病(crabs，公众虱病(public lice infestation))、脓疱疹(小痘、猴痘、牛痘)、q热、狂犬病、蓖麻毒素中毒、立克次体病(落基山斑点热)、风疹(包括先天性(德国麻疹))、沙门氏菌病胃肠炎(沙门氏菌)、疥疮感染(疥疮)、蝇蛆病 (scombroid)、脓毒性休克(败血症)、严重急性呼吸综合征(sars)、细菌性痢疾胃肠炎 (shigellosis gastroenteritis)(志贺菌)、天花、葡萄球菌感染、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染(mrsa)、葡萄球菌食物中毒、肠毒素-b中毒(葡萄球菌食物中毒)、葡萄球菌感染万古霉素中间体(visa)、耐万古霉素葡萄球菌感染(vrsa)、a族链球菌感染(侵袭性，strep-a(侵袭性))、b族链球菌感染(strep-b)、链球菌中毒性休克综合征(streptococcaltoxic-shock syndrome,stss，中毒性休克，stss,tss)、梅毒(原发型、继发型、早期潜伏期、晚期潜伏期、
先天性)、破伤风感染、破伤风(lock jaw)、滴虫病(滴虫感染)、旋毛虫感染(旋毛虫病)、结核病(tb)、潜伏结核感染(ltbi)、土拉菌病(兔热，tularemia)、伤寒(d组)、斑疹伤寒(typhus)、细菌性阴道病(酵母菌感染)、电子烟相关肺损伤、水痘霍乱弧菌(霍乱)、弧菌病(弧菌)、病毒出血热(埃博拉病毒、拉萨病毒、马尔堡病毒)、西尼罗河病毒感染、黄热病、yersenia(耶尔森氏菌)和兹卡病毒感染(zika)。
58.根据本公开，呼吸系统疾病包括但不限于：急性呼吸窘迫综合征(ards)、急性肺损伤(ali)或严重急性呼吸综合征(sars)，其主要并发症包括：液体流入肺部导致呼吸困难或不可能。典型的症状包括发烧、咳嗽、湿性咳嗽、干性咳嗽、呼吸困难、疲劳或肌痛、胸闷、以及逐渐开始的呼吸短促。并发症包括肺动脉高压、心力衰竭、肺炎或肺栓塞。
59.在一些实施例中，根据本公开的抗病毒剂组合物适用于轻症的预防及治疗，也适用于治疗由冠状病毒或其衍生物引起的急性呼吸窘迫综合征(ards)、急性肺损伤(ali)或严重急性呼吸综合征(sars)。
60.脂质体以及脂质体态抗病毒剂
61.本文所使用的术语“脂质体(liposome)或脂质体态(liposomal)”指的是一群囊泡，每个囊泡的特征是具有一水性的内部空间，其通过一或多个双层膜形成的膜与外部介质隔离。脂质体的双层膜通常由一或多种脂质形成，即、合成或天然来源的两亲分子，其包含在空间上分离的疏水区和亲水端。
62.脂质体的内部水性空间基本上没有中性脂质，如甘油三酯、非水相(油相)、水-油乳剂、第二脂质体或其他含有非水相的混合物。脂质体的非限制性例子包括小的单层囊泡 (small unilamellar vesicle，suv)和大的单层囊泡(large unilamellar vesicles，luv)以及多层囊泡(multi-lamellar vesicles，mlv)，这些囊泡的平均直径范围介于50nm至10000nm 之间、介于50nm至500nm之间、介于50nm至450nm之间、介于50nm至400nm 之间、介于50nm至350nm之间、介于50nm至300nm之间、介于50nm至250nm 之间、介于50nm至200nm之间、介于100nm至500nm之间、介于100nm至450nm 之间、介于100nm至400nm之间、介于100nm至350nm之间、介于100nm至300nm 之间、介于100nm至250nm之间、或介于100nm至200nm之间，这些平均直径是可以通过无菌过滤膜的。例如，mlv可由选定脂质组合物的水合脂膜、喷雾干粉或冻干饼与捕获剂直接形成；而suv和luv可以通过超声、均质、微流化或挤压的方法从mlv 调整尺寸。
63.一般而言，脂质体通常包含含有至少一种脂质的脂质混合物，所述脂质选自以下组中：双脂肪链脂质，例如磷脂、二甘油酯(diglycerides)、二脂肪糖脂(dialiphatic glycolipid)；单脂质，例如鞘磷脂(sphingomyelin)、和鞘糖脂(glycosphingolipid)；固醇，例如胆固醇；以及它们的衍生物，及其组合。
64.根据本公开的磷脂的实例包括但不限于：
65.1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine，dlpc)、
66.1,2-二肉荳蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine， dmpc)、
67.1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine， dppc)、
68.1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，pspc)、
69.1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine，popc)、
70.1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，dspc)、
71.1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1,2-dioleoy1-sn-glycero-3-phosphocholine，dopc)、
72.氢化大豆磷脂酰胆碱(hydrogenatedsoyphosphatidylcholine，hspc)、
73.1,2-二肉荳蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-(1
’‑
外消旋-甘油)(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1
’‑
rac-glycerol)(sodiumsalt)，dmpg)、
74.1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1
’‑
外消旋-甘油)(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1
’‑
rac-glycerol)(sodiumsalt)，dppg)
75.1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-(1
’‑
外消旋-甘油)(钠盐)(1-palmitoyl-2-stearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1
’‑
rac-glycerol)(sodiumsalt)，pspg)
76.1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-(1
’‑
外消旋-甘油)(钠盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-(1
’‑
rac-glycerol)(sodiumsalt)，dspg)、
77.1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1
’‑
外消旋-甘油)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1
’‑
rac-glycerol)，dopg)、
78.1,2-二肉荳蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine(sodiumsalt)，dmps)、
79.1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine(sodiumsalt)，dpps)、
80.1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(钠盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine(sodiumsalt)，dsps)、
81.1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine，dops)、
82.1,2-二肉荳蔻酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)，dmpa)、
83.1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)，dppa)、
84.1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)，dspa)、
85.1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(钠盐)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodiumsalt)，dopa)、
86.1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine，dppe)、
87.1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine，pope)、
88.1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phospho
‑ꢀ
ethanolamine，dspe)、
89.1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine， dope)、
90.1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸-(1
’‑
肌醇)(铵盐)(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho
‑ꢀ
(1
’‑
myo-inositol)(ammonium salt)，dppi)、
91.1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸肌醇(铵盐)(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoinositol (ammonium salt)，dspi)、
92.1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1
’‑
肌醇)(铵盐)(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho
‑ꢀ
(1
’‑
myo-inositol)(ammonium salt)，dopi)、
93.心磷脂(cardiolipin)、
94.l-α-磷脂酰胆碱(cardiolipin,l-α-phosphatidylcholine，epc)、和
95.l-α-磷脂酰乙醇胺(l-α-phosphatidylethanolamine，epe)。
96.根据本公开的脂质体态抗病毒剂，其可任选地将大量聚乙二醇部分并入至囊泡表面，这可通过将经聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺(peg-modified phosphatidylethanolamine (pe))并入囊泡的膜中来实现，以达到更长时间、更持续的药物释放，且这是安全、有效同时还能减少给药频率。
97.根据本公开的脂质体态抗病毒剂可任选地通过将经聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺 (pe)或脂肪酸并入至囊泡的膜内而将大量经修饰的负电荷部分结合至囊泡的表面，以防止储存中溶液内脂质体互相聚集或絮凝进程。
98.经聚乙二醇修饰的脂质包含与脂质缀合的聚乙二醇部分。在一些实施方案中，聚乙二醇部分具有从约500至约20,000道尔顿的分子量。在一具体实施方案中，经聚乙二醇修饰的脂质与磷脂混合，以形成具有一或多个双层膜的脂质体。在一些实施方案中，基于磷脂和固醇的总量，经聚乙二醇修饰的脂质的量为从0.0001mol％至40mol％，任选地从0.001mol％至30mol％，仼选地从0.01mol％至20mol％，任选地从0.001mol％至10mol％，任选地从0.001mol％至5mol％，并且特别地是不超过6mol％、任选地不超过5mol％、不超过3mol％、或不超过2mol％。在一些实施方案中，经聚乙二醇修饰的脂质具有聚乙二醇部分，该聚乙二醇部分具有从1,000g/mol至5,000g/mol范围的平均分子量。在一些实施方案中，经聚乙二醇修饰的脂质是与聚乙二醇基团连接的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl-ethanolamine)(peg-pe)。在一些其他实施方案中，经聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-[methoxy(polyethylene glycol)]，或称 dspe-peg)。
[0099]
在一具体实施方案中，经聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺(pe)或脂肪酸是dspe-peg，并且dspe-peg的量为脂质体之总脂质含量的从0.0001mol％至40mol％，任选地为从 0.01mol％至20mol％，且具有平均分子量为2,000g/mol的peg部分。
[0100]
术语“脂质体态抗病毒剂”或“脂质体态药物”在本发明中可相互替换地使用。根据本公开的脂质体态抗病毒剂包含包埋有抗病毒剂的脂质体，其是如下制备的：经由跨膜ph梯度驱动的远程装载方法，将抗病毒剂包囊在脂质体的水性内部中。
[0101]
在一些实施方案中，脂质体是与诸如羟氯喹或gs-441524的药物成分一起形成的，以将所述药物成分包囊在脂质体的水性内部中，或单独形成具有跨膜梯度的空脂质体，以供后续用于药物装载制程，称为主动装载方法，也称为远程装载，以形成脂质体态药物。
[0102]
在一些实施方案中，跨膜ph梯度是经由使用捕获剂来产生的，并可用于将抗病毒剂远程装载至脂质体中，而所述捕获剂由铵化合物与阴离子反离子组成。
[0103]
术语“铵化合物”包括未经取代或经取代的铵(ammonium)，其是一表示为nr4 的阳离子，其中每一个r独立地为氢或一有机残基，且所述有机残基独立地为烷基、亚烷基、杂环烷基、环烷基、芳基、烯基、环烯基或它们经羟基取代的衍生物，任选地于其碳氢链内包含硫、氧或氮原子，形成醚、酯、硫醚、胺或酰胺键。在一具体实施方案中，所述铵化合物为铵。
[0104]
术语“阴离子反离子(anionic counterion)”指的是一阴离子或与阴离子官能基共价连接的实体。所述阴离子或阴离子官能基在生理环境中带有负电荷。
[0105]
所述阴离子或阴离子官能基可选自于以下的一或多者：硫酸根、柠檬酸根、磺酸根、磷酸根、焦磷酸根、酒石酸根、琥珀酸根、马来酸根、硼酸根、羧酸根、碳酸氢根、葡糖醛酸根、氯离子、氢氧根、硝酸根、氰酸根或溴离子。
[0106]
在一实施方案中，所述阴离子或阴离子官能基是选自于以下的一或多者：柠檬酸根、硫酸根、磺酸根、磷酸根、焦磷酸根、和羧酸根。
[0107]
在又一实施方案中，与阴离子官能基连接的实体可为天然或合成、有机或无机的化合物。所述实体的实例包括但不限于非聚合物的物质，其选自于烷基或芳基(例如苯)，核苷酸和糖类。所述烷基指的是具有指定碳原子数的饱和烃基。例如，烷基选自于以下组中：1至4个碳的烷基(c
1-4
烷基)、1至6个碳的烷基(c
1-6
烷基)、1至8个碳的烷基 (c
1-8
烷基)、1至10个碳的烷基(c
1-10
烷基)、1至12个碳的烷基(c
1-12
烷基)、1至14 个碳的烷基(c
1-14
烷基)、1至16个碳的烷基(c
1-16
烷基)、1至18个碳的烷基(c
1-18
烷基)以及1至20个碳的烷基(c
1-20
烷基)。
[0108]
在一些实施方案中，所述阴离子反离子选自以下组中：硫酸根、磷酸根、柠檬酸根及它们的组合。
[0109]
在一些实施方案中，捕获剂选自以下组中：硫酸铵、磷酸铵、柠檬酸铵、蔗糖八硫酸铵(ammonium sucrose octasulfate)、葡聚糖硫酸铵(ammonium dextran sulfate)、二甲基硫酸铵、二甲基磷酸铵、二甲基柠檬酸铵、二乙基硫酸铵、二乙基磷酸铵、二乙基柠檬酸铵、蔗糖八硫酸二乙基铵(diethylammonium sucrose octasulfate)、葡聚糖硫酸二乙基铵(diethylammonium dextran sulfate)、三甲基硫酸铵、三甲基磷酸铵、三甲基柠檬酸铵、三乙基硫酸铵、三乙基磷酸铵、三乙基柠檬酸铵、蔗糖八硫酸三乙基铵 (triethylammonium sucrose octasulfate)、葡聚糖硫酸三乙基铵(triethylammonium dextransulfate)、葡糖酸铜、葡萄糖醛酸铜及它们的组合。
[0110]
在一些实施方案中，本发明的脂质体态抗病毒剂的平均粒径介于50nm与1,000nm 之间。脂质体态抗病毒剂的非限制性实例的平均粒径范围为自50nm至20μm、50nm 至10μm、50nm至1000nm、50nm至500nm、50nm至400nm、50nm至300nm、 50nm至250nm、50nm至200nm、100nm至300nm、或150nm至250nm。
[0111]
在一些实施方案中，抗病毒剂包括但不限于抗疟疾药剂、抗反转录病毒药剂或其组合。具体来说，抗病毒剂选自以下组中：喹宁化合物、核苷化合物、及其组合。
[0112]
术语“喹宁化合物”是指衍生自从金鸡纳树的树皮中提取的具有抗疟疾活性的前
导化合物喹宁的物质。已显示喹宁化合物(例如羟氯喹)具有抑制肺炎恶化、改善影像学表现、促进病毒阴性转化和缩短病程的潜力。但是，若全身服用喹宁化合物可能会出现副作用，例如视力模糊、恶心、呕吐、腹部绞痛、头痛和腹泻。
[0113]
根据本公开的喹宁化合物包括但不限于喹宁和其他4-氨基喹啉化合物，例如喹宁、喹尼丁、辛可宁、辛可尼定、氯喹(cq)、羟氯喹(hcq)等。示例性的喹宁类化合物cq 和hcq已被提示能够防止细胞内胞器酸化并抑制病毒基因组溶酶体的释放。另外，这些药物可干扰宿主细胞上血管紧张素转化酶2(ace2)受体的糖基化，并降低所述受体与冠状病毒表面刺突蛋白之间的结合效率。
[0114]
目前已报道的用于rna病毒感染的潜在疗法，是以核苷作为非结构性病毒蛋白的抑制剂，例如rna依赖性rna聚合酶(rna-dependent rna polymerase)。核苷预期会被细胞吸收，并在体内转化为三磷酸，以竞争聚合酶核苷酸结合位点，从而终止聚合酶链反应。这种向三磷酸的转化通常是由细胞激酶介导的，细胞激酶也对潜在的核苷聚合酶抑制剂产生了额外的结构要求。由核苷激酶形成的单磷酸通常被认为是三个磷酸化事件的速率限定步骤。us7,964,580公开了含有磷酰胺部分的前核苷(pronucleoside)，该前核苷被中性亲脂性基团掩盖以获得合适的分配系数，从而优化摄取和转运到细胞中，相对于单独给药母体核苷，显着提高了核苷单磷酸的细胞内浓度。然而有争议的观察结果预见到，酶介导的磷酸酯部分的水解可能会在循环后立即产生核苷本身，而不是产生目标核苷单磷酸，并且产生核苷本身后再将其靶向至所需位点。例如，通过静脉内给药， (2r,3r,4s,5r)-2-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)氧杂环戊烷-2-腈(也称为gs-441524)，已知的核苷化合物，是一种比其单磷酸形式更稳定的瑞德西韦代谢产物(humeniuk r,mathias a,cao h,et al.safety,tolerability,andpharmacokinetics of remdesivir,an antiviral for treatment of covid-19,in healthysubjects.clin transl sci.2020；13(5):896-906.doi:10.1111/cts.12840)。有效地将核苷化合物递送至富含关键的速率限制的核苷激酶的靶细胞位点，可能是一种通用的平台解决方案，可以避免不同前核苷在大范围核苷化合物中的复杂制造过程。
[0115]
在一些实施方案中，根据本公开的抗病毒剂组合物还包含抗生素、补充剂或其组合。
[0116]
在一些实施方案中，所述抗病毒剂包括一或多种如美国专利号us8,008,264及 us9,418,704所描述的1
’‑
取代的碳氢核苷化合物或2
’‑
取代的碳氢核苷化合物。
[0117]
在一些实施方案中，抗病毒剂是针对核苷化合物，包括但不限于1
’‑
取代的碳氢核苷化合物及其药学上可接受的盐类。
[0118]
在一些实施方案中，抗病毒剂包括rna依赖性rna病毒聚合酶的抑制剂，其中所述抑制剂包括结构式i所示的核苷化合物：
[0119][0120]
每个r1、r2、r3、r4或r5独立地为氢、ora、n(ra)2、n3、cn、no2、s(o)nra、卤素或甲基，其中n为0、1或2；
[0121]
r6为cn或氢；
[0122]
每个ra独立地为氢、(c
1-c8)烷基、(c
2-c8)烯基、(c
2-c8)炔基、芳基(c
1-c8)烷基、(c
4-c
8)
碳环烷基、—c(＝o)r
11
、—c(＝o)or
11
、—c(＝o)nr
11r12
、—c(＝o)sr
11
、—s(o)r
11
、—s(o)2r
11
、—s(o)(or
11
)、—s(o)2(or
11
)、或—so2nr
11r12
；以及
[0123]
r7为氢；
[0124]
每个x1或x2独立地为c-r
10
或n；
[0125]
r8为卤素、nr
11r12
、n(r
11
)(or
11
)、nr
11
nr
11r12
、n3、no、no2、cho、cn、—ch(＝nr
11
)、—ch＝nhnr
11
、—ch＝n(or
11
)、—ch(or
11
)2、—c(＝o)nr
11r12
、—c(＝s)nr
11r12
、—c(＝o)or
11
、(c
1-c8)烷基、(c
2-c8)烯基、(c
2-c8)炔基、芳基(c
1-c8) 烷基、(c
4-c8)碳环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、—c(＝o)(c
1-c8)烷基、—s(o)n(c
1-c8)烷基、芳基(c
1-c8)烷基、or
11
或sr
11
，其中每个芳基或杂芳基独立地任选地被一个或多个z基团取代；
[0126]
每个r9或r
10
独立地为氢、卤素、r
11
、or
11
、sr
11
、nr
11r12
、n(r
11
)(or
11
)、nr
11
nr
11r12
、 n3、no、no2、cho、cn、—ch(＝nr
11
)、—ch＝nhnr
11
、-ch＝n(or
11
)、—ch(or
11
)2、—c(＝o)nr
11r12
、—c(＝s)nr
11r12
、—c(＝o)or
11
；
[0127]
每个r
11
或r
12
独立地为氢、(c
1-c8)烷基、(c
2-c8)烯基、(c
2-c8)炔基、(c
4-c8)碳环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂芳基、—c(＝o)(c
1-c8)烷基、—s(o)n(c
1-c8) 烷基或芳基(c
1-c8)烷基，其中每个芳基或杂芳基独立地任选地被一个或多个z基团取代；或者
[0128]r11
或r
12
与它们两者都连接的氮一起形成3至7元的杂环，其中所述杂环中任一碳原子皆可任选地被—o—、—s—或—nra—替代；
[0129]
每个z基团独立地为卤素、—o-、＝o、—orb、—srb、—s—、—nr
b2
、—n
rb3
、＝nrb、—cn、—ocn、—scn、—n＝c＝o、—ncs、—no、—no2、＝n2、—n3、—nhc(＝o)rb、—oc(＝o)rb、—nhc(＝o)nrb2、—s(＝o)2—、—s(＝o)2oh、—s(＝o)2rb、—os(＝o)2orb、—s(＝o)2oh、—s(＝o)rb、—op(＝o)(orb)2、—p(＝o)(orb)2、—p(＝o)(o-)2、—p(o)(orb)(o-)、—c(＝o)rb、—c(＝o)x、—c(s)rb、—c(o)orb、—c(o)o-、—c(s)orb、—c(o)srb、—c(s)srb、—c(o)nr
b2
、—c(s)nr
b2
、—c(＝nrb)nr
b2
，其中每个rb独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基或杂环；其中每个所述(c
1-c8)烷基中的一个或多个非末端碳原子任选地被—o—、—s—或—nra—替代。
[0130]
在一些实施方案中，所述抗病毒剂是选自以下组中：
[0131]
[0132]
[0133]
或其药学上可接受的盐。
[0134]
在一方面，脂质体态抗病毒剂包含：脂质双层，该脂质双层包含：一种或多种磷脂、固醇以及任选的经聚乙二醇修饰的脂质，特别是经聚乙二醇修饰的磷脂酰乙醇胺 (dspe-peg)；以及水性内部，其由脂质双层包覆且包含一种或多种抗病毒剂。
[0135]
在一实施方案中，所述一种或多种磷脂为中性磷脂，而所述经聚乙二醇修饰的脂质为dspe-peg。基于总磷脂和固醇，dspe-peg的含量介于0.001mol％至5mol％之间、任选地介于0.0001mol％至40mol％之间、任选地少于6mol％、任选地介于0.001mol％至30mol％之间。
[0136]
在一实施方案中，脂质体态抗病毒剂组合物具有至少为0.01mol/mol至0.1mol/mol 的药物对脂质比例(抗病毒剂相对于至少一种脂质的比例)，并包含：脂质双层，该脂质双层包含:dppc、胆固醇；以及水性内部，其由脂质双层包覆且包含一种或多种由捕获剂捕获的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂为(2r,3r,4s,5r)-2-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)氧杂环戊烷-2-腈(也称为gs-441524)，并且所述捕获剂为硫酸铵。
[0137]
可吸入组合物及其气溶胶化的颗粒
[0138]
根据本公开的抗病毒剂组合物适用于制备可吸入的气溶胶化的颗粒组合物，其包含前述脂质体态抗病毒剂。此组合物能以雾化喷雾剂或气溶胶来吸入给药，还可经由鞘内给药。吸入给药是优选的。总体结果是，与游离药物或非肠道形式的药物相比，给药频率更低且治疗指数更高。组合物中的脂质体态抗病毒剂是特别具有优势的，因为组合物在能够保护药物的同时，还能与肺内衬或肺表面活性剂兼容。
[0139]
在一实施方案中，根据本公开的抗病毒剂组合物具有以下的药物对脂质的比例 (d/l)：至少0.01mol/mol、任选地至少0.1mol/mol、并且优选为介于0.05mol/mol至 1.0mol/mol之间、任选地介于0.01mol/mol至0.7mol/mol之间、任选地介于0.015 mol/mol至0.6mol/mol之间、以及任选地介于0.15mol/mol至0.2mol/mol之间。药物对脂质的比例是指抗病毒剂相对于至少一种脂质的摩尔比。在特定实施方案中，所述至少一种脂质包含摩尔比为1:1或3:2的中性磷脂和固醇。任选地，所述中性磷脂为dppc，而所述固醇为胆固醇。
[0140]
在一实施方案中，抗病毒剂组合物中所述至少一种脂质的浓度范围为介于1mm至 200mm之间、介于1mm至100mm之间、介于5mm至100mm之间、介于10mm 至180mm之间、介于15mm至140mm之间、介于20mm至160mm、介于30mm 至140mm之间、以及介于40mm至120mm之间。或者，抗病毒组合物中所述一种或多种磷脂的浓度范围介于1mm至100mm之间、介于5mm至100mm之间、介于5mm 至90mm之间、介于10mm至80mm之间、介于15mm至70mm之间、或者介于 20mm至60mm。
[0141]
在一实施方案中，抗病毒剂组合物中所述喹宁化合物的总浓度范围为介于0.1 mg/ml至80mg/ml之间、介于0.5mg/ml至60mg/ml之间、介于1mg/ml至30mg/ml 之间、介于2mg/ml至15mg/ml之间、介于0.5mg/ml至70mg/ml之间、介于0.5mg/ml 至60mg/ml之间、介于0.5mg/ml至50mg/ml之间、介于0.5mg/ml至40mg/ml之间、介于0.5mg/ml至30mg/ml之间、介于0.5mg/ml至20mg/ml之间、介于0.5mg/ml 至10mg/ml之间、介于0.5mg/ml至8mg/ml之间、介于0.5mg/ml至5mg/ml之间、介于1.0mg/ml至6mg/ml之间、介于1.5mg/ml至5.0mg/ml之间、介于1.5mg/ml 至4.0mg/ml之间或为约2.0mg/ml。
[0142]
在一实施方案中，抗病毒剂组合物中所述至少一种磷脂的浓度范围为介于1mm至 100mm之间、介于5mm至100mm之间、介于5mm至90mm之间、介于10mm至 80mm之间、介于15mm至70mm之间、以及介于20mm至60mm；并且药物对脂质(d/l)的比例为介于0.01mol/mol至1.0mol/mol之间、介于0.03mol/mol至0.5mol/mol 之间、介于0.03mol/mol至0.15mol/mol之间、介于0.03mol/mol至0.1mol/mol之间、为约0.005mol/mol、介于0.05mol/mol至0.1mol/mol之间、介于0.07mol/mol至0.09 mol/mol之间、或约0.085mol/mol，其中所述抗病毒剂为具有游离态5
’‑
oh基团的1
’‑ꢀ
取代的碳氢核苷化合物或2
’‑
取代的碳氢核苷化合物。
[0143]
在一些实施方案中，脂质体态抗病毒剂组合物还具有游离态抗病毒剂，并且根据本公开的组合物中所述游离态抗病毒剂的含量基于组合物中抗病毒剂总量为少于60％、 50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％，或者介于10％至40％之间、介于15％至35％之间、或介于10％至30％之间。
[0144]
在一些实施方案中，包含根据本公开的组合物的气溶胶化的颗粒组合物是经由使用雾化器使所述组合物气溶胶化来产生的，所述雾化器选自空气喷射雾化器(air-jetnebulizer)、超声雾化器、振动网孔雾化器(vibrating mesh nebulizer)、冷凝气溶胶发生器 (condensation aerosol generator)、电动流体力学雾化器(electro-hydrodynamic nebulizer)、或本领域已知的其他肺部递送装置。
[0145]
在一些实施方案中，所述气溶胶化的颗粒组合物的质量中值空气动力学直径(massmedian aerodynamic diameter)介于0.5μm和5μm之间，且任选地介于1μm和3μm之间。
[0146]
根据本公开所述的组合物气溶胶化后，抗病毒剂由脂质体态抗病毒剂的脂质体泄漏导致一部分抗病毒剂变成游离态，并且未包覆于脂质体中。气溶胶化的组合物中产生的游离态抗病毒剂的含量少于60％、50％、40％、30％、20％、10％、或5％；任选地在受控的百分比范围，该百分比范围介于0.1％至50％之间、介于0.5％至40％之间、介于0.5％至30％之间、介于0.5％至20％之间、介于0.5％至10％之间、介于0.5％至5％之间、介于10％至50％之间、介于15％至45％之间、介于20％至45％之间、介于25％至35％之间。
[0147]
在一特定实施方案中，所述气溶胶化的颗粒组合物经由肺部递送至有需要的个体，展现以施用的药物剂量为基础，每小时介于约0.5％和25％之间的释放率，且最短在约 12至24小时后完全释放所述抗病毒剂。
[0148]
参考以下具体的非限制性实施例进一步描述本公开。
实施例
[0149]
以下实施例说明本公开的某些实施方案的制备和性质。
[0150]
实施例1：脂质体态抗病毒剂的稳定性
[0151]
根据本公开的脂质体态抗病毒剂包含带有被捕获的抗病毒剂的脂质体，其是由目前已知技术的主动装载(activeloading)或被动装载(passiveloading)来制成。
[0152]
a.通过主动装载来制备脂质体态抗病毒剂
[0153]
i.空脂质体的制备
[0154]
制备用于远程装载的空脂质体的方法是以薄膜水合法或溶剂注射法进行的，所述方法可包括以下步骤：
[0155]
1.秤量预定摩尔比的磷脂和胆固醇的脂质混合物，其中可存在或不存在dspe-peg2000，然后将它们加入圆底烧瓶内的10ml氯仿中；
[0156]
2.将烧瓶置于依据所述脂质组合物合适温度下的旋转蒸发器中，搅拌烧瓶以溶解所述脂质混合物，接着在搅拌状态下将烧瓶置于真空下以蒸发氯仿，获得干燥的脂质膜；
[0157]
3.将捕获剂加入蒸馏水中并涡旋此溶液以溶解粉末，由此制备捕获剂溶液(例如硫酸铵(a.s.))；
[0158]
4.将捕获剂溶液加至所述干燥的脂质膜，并在依据所述脂质组合物合适的温度下搅拌，以形成脂质体溶液；
[0159]
5.用液态氮和依据所述脂质组合物合适温度的水浴将脂质体溶液冻融，以得到脂质体样品；
[0160]
6.将所得到的脂质体样品在依据所述脂质组合物合适的温度下挤压通过0.2μm聚碳酸酯膜、0.1μm聚碳酸酯膜，以得到所设计的粒径；
[0161]
7.透析所挤压出的脂质体样品，以除去游离的捕获剂，接着将所述样品加入透析袋(mwco：25kd)中，将袋密封，并在100倍体积的9.4％(w/v)蔗糖溶液或生理食盐水或合适的缓冲液中搅拌所述透析袋；在1小时、4小时后进一步更换蔗糖溶液或生理食盐水或合适的缓冲液，并将透析袋搅拌过夜；以及
[0162]
8.将透析过的脂质体样品经由通过0.45μm聚四氟乙烯(ptfe)膜过滤而灭菌，以获得空脂质体。
[0163]
ii.将抗病毒剂装载进脂质体内以获得脂质体态抗病毒剂
[0164]
以下方法是经由远程装载将羟氯喹或氯喹包囊于脂质体内的示例性方案，其包括以下步骤：
[0165]
1.于9.4％(w/v)蔗糖溶液或合适的介质中，制备40mg/ml或合适浓度的羟氯喹或氯喹溶液，并在合适的温度下短暂加热此溶液，以得到含有羟氯喹或氯喹的原液(stocksolution)(以下称为原液)；
[0166]
2.在锥形管中混合经由根据实施例1、第a(i)节的制程制备的空脂质体(在一典型的实施方案中，具有以下条件：dppc：胆固醇的摩尔比为3：2，300mm硫酸铵(a.s)和30mm磷脂浓度)、盐水溶液以及原液，以获得d/l比例为100g/mol或0.19mol/mol的装载溶液；
[0167]
3.在合适的温度下连续摇动所述装载溶液30分钟或预设的时间，以形成装载药物的脂质体样品；
[0168]
4.必要时以透析法或基于膜的切向流过滤(membrane-basedtangentialflow
filtration，tff)，移除游离的药物或更换缓冲液或调整药物的浓度；
[0169]
5.使用尺寸排阻柱色谱法(size-exclusion column chromatography)和hplc分析来测定最终样品的药物包囊(即装载效率)，如此得到脂质体态抗病毒剂组合物，其中基于整体组合物，药物浓度介于2mg/ml至10mg/ml之间，并且抗病毒剂相对于脂质的比例介于0.05mol/mol至1.5mol/mol之间(请参见下方制剂#1至#3)。
[0170][0171][0172]
b.通过被动装载来制备脂质体态抗病毒剂
[0173]
脂质体可以通过薄膜水合法或溶剂注射法来制备。使用溶剂注射法制备脂质体态抗病毒剂的制程具体化为包括以下步骤的方法：
[0174]
1.以秤量预定摩尔比的磷脂和胆固醇的脂质混合物，其中可存在或不存在 dspe-peg2000，然后将它们加入在圆底烧瓶中的10ml乙醇内，以形成包含所述脂质的溶剂相；
[0175]
2.于0.9％氯化钠水溶液(盐水)或合适的介质中，制备40mg/ml至60mg/ml或合适浓度的羟氯喹或氯喹溶液，以形成水相；
[0176]
3.在50℃下预加热40ml的前述水相(40mg/ml羟氯喹)至少30分钟；
[0177]
4.在搅拌下将溶解的脂质混合物(即溶剂相)通过注射器加入至预热的水相中，形成前脂质体(pro-liposome)样品，然后在50℃下持续搅拌该前脂质体样品5分钟；
[0178]
5.在依据所述脂质组合物合适的温度下，将所述前脂质体样品由0.2μm聚碳酸酯膜中挤出，得到所设计的粒径；
[0179]
6.用盐水(0.9％nacl)对挤出的脂质体样品进行透析，以去除游离药物；以及
[0180]
7.通过0.2μm聚碳酸酯膜对经过透析的脂质体样品进行过滤，由此对其进行灭菌，得到脂质体态抗病毒剂。
[0181]
根据本公开的抗病毒剂组合物可以通过以抗病毒剂的浓度为1.0mg/ml至4mg/ml 为目标的方式添加游离态抗病毒剂来配制，并且抗病毒剂与脂质的比例为至少0.05 mol/mol至0.30mol/mol之间(见以下制剂#4至#6)，以整体组合物为基础。
[0182]
制剂#4#5#6hcq(mg/ml)1.462.002.00hcq(mm)3.364.614.61dppc(mm)30.045.022.8胆固醇(mm)203015.2总脂质(mm)50.075.038.0d/l(基于总脂质)0.0670.0610.121
[0183]
c.脂质体态抗病毒剂的储存稳定性
[0184]
在4℃下保存的如上述a和b节中制备的脂质体态羟氯喹或氯喹的稳定性可监测至少2周或预设的时间。羟氯喹或氯喹通过用硫酸铵主动装载或被动装载的方式装入空脂质体，以获得脂质体态药物样品进行研究。脂质体态药物样品在4℃或合适的温度下保存2周或预设的时间后，脂质体的药效和理化性质可以随着时间的推移进行研究。
[0185]
实施例2：在动物模型中对吸入的脂质体态抗病毒剂进行临床前评估
[0186]
对实施例1b中制备的示例性脂质体态羟氯喹(hcq)组合物(还记做tlc19)在动物中的毒性进行了研究。在sprague-dawley(sd)大鼠中，概念药代动力学(conceptpharmacokinetics，pk)及组织分布研究初步证明，是经由单次静脉注射(iv)/气管内给药 (it)硫酸hcq溶液(游离态hcq)、或it给药tlc19的试验制剂(研究编号pk20021)来执行的。本研究旨在调查主要为肺的组织分布以及hcq的全身暴露量(systemicexposure)。
[0187]
将总共52只大鼠分为3个治疗组，每只大鼠通过气管内给药或单次静脉注射接受单剂量的hcq。在给药后0.25、1(仅限血液)、4、24和72小时，在预先指定的时间点采集血液和器官/组织的样品，包括肺，然后用于通过液相色谱串联质谱法测定hcq。研究设计总结如下表1。
[0188]
表1：研究设计总结(研究编号pk20021)
[0189][0190]
hcq在血液、肺部及心脏中的浓度是通过使用或masslynx软件来计算的，而药代动力学pk参数是使用测定的。在施用tlc19试验制剂及游离态hcq后，肺部、血液和心脏中hcq浓度相对于时间的曲线分别显示于图1、图 2和图3中。肺部、血液和心脏中的平均pk参数如下表2所示。
[0191]
表2:对大鼠施用tlc19试验制剂和游离态hcq后肺部、血液和心脏中的平均药代动力学参数(研究编号pk20021)
[0192][0193]
a:tmax为中位数
[0194]
b:肺部和心脏的单位为μg/g；血液的单位为μg/ml
[0195]
c:肺部和心脏的单位为hr*μg/g；血液的单位为hr*μg/ml
[0196]
d:不适用
[0197]
对于在施用游离态hcq的大鼠中的肺部分布，在施用给药后的头24小时期间， hcq浓度持续快速下降，尤其是在hcq it组中；hcq it组中，平均hcq浓度由47.8 μg/g降至2.16μg/g，而在hcq iv组中，平均hcq浓度由9.4μg/g降至3.77μg/g。相比之下，tlc19(试验制剂)组的hcq沉积在肺脏内的程度明显高于游离态hcq组，这是由于脂质体态药物的缓释特性。在给药一半游离态hcq剂量后的头24小时期间， tlc19组在肺脏内仍持续释放hcq一定时间，其中平均hcq浓度从129μg/g下降到 57.1μg/g。
[0198]
在游离态hcq iv和游离态hcq it组中，hcq在肺部中的半衰期分别为15.2小时和17.7小时，这与hcq的物理化学性质相一致，即hcq可以在生理的ph值下快速地自由穿过细胞膜。tlc19(试验制剂)组中hcq的半衰期(37.5小时)大约是游离态 hcq组的两倍。当用剂量归一化时，tlc19(试验制剂)组的auc
0-72
和c
max
肺暴露量分别是游离态hcq iv组的35倍和29倍。这些结果表明，tlc19(试验制剂)是hcq的缓释制剂，与静脉注射或气管内给药的游离态hcq相比，tlc19(试验制剂)成功延长了 hcq在肺部的停留时间。在我们的研究中，游离态hcq无论是以静脉注射还是气管内给药都不能长时间维持肺内hcq浓度。
[0199]
对于全身暴露量，在施用hcq后，hcq被迅速吸收并分配到全身中。在三个组中，血液中hcq的中值t
max
为给药后0.25小时。在游离态hcq iv组和游离态hcq it组中，总体全身暴露量，包括c
max
和auc，皆相似。对于tlc19(试验制剂)，血液中hcq 的c
max
明显低于游离态hcq。少量的hcq在给药tlc19(试验制剂)后1小时内出现初始峰值浓度。剩余的hcq留在肺部内，并允许tlc19(试验制剂)在给药后24至72小时内的长时间停留以及恒定的低平均血药浓度。随着时间观察到的较低的hcq血液浓度水平显示了hcq在局部部位被逐渐释放。一如更长的半衰期所反映的，tlc19(试验制剂)的半衰期比未配制的hcq溶液更长。
[0200]
hcq已被证明会导致心脏疾病，包括校正qt间期(qtc)的延长。为了确定tlc19 在心脏中的分布，我们测定了心脏组织中的hcq pk曲线(图3)。与hcq溶液相比， tlc19具有较低的心脏暴露量(c
max
)。当剂量归一化后，各组中都观察到相似的auc。考虑到局部(即气管
内给药)而不是全身给药(即口服或静脉给药)所需的剂量更低，这些结果表明tlc19比传统的hcq给药引起的心脏毒性更小。
[0201]
两项用于tlc19优化制剂的临床前pk研究将通过在sprague-dawley(sd)大鼠中 it给药进行，并详述如下。
[0202]
(1)sd大鼠的单剂量药代动力学研究：在tlc19单剂量it给药后，可以在sd大鼠体内进行血液药代动力学和组织浓度研究。可以在规定的采样时间点采集血液和包括肺部在内的主要器官；并且测定全血和器官的hcq浓度。如此，可以初步确定tlc19 的pk曲线，并计算tlc19在肺部内药物分布的百分比。
[0203]
(2)sd大鼠的多剂量药代动力学研究：所述研究旨在描述和评估tlc19在多剂量 it给药后的药物累积。在第一次和最后一次给药后，可以在规定的采样时间点采集血液和包括肺部的主要器官。计算tlc19在血液和肺部中的累积率。
[0204]
实施例3：脂质体态抗病毒剂的制备
[0205]
磺基丁基醚-β-环糊精(sulfobutylether-β-cyclodextrin，简称sbecd)购自中国淄博千汇生物科技有限公司。sbecd配制的gs-441524(含1.0mg/ml gs-441524)是通过将抗病毒剂gs-441524溶解在ph值约为4.4的150mg/ml sbecd溶液中而制备的，并且作为试验品(1):gs-441524溶液-iv。
[0206]
研究药物(脂质体态gs-441524，又称ispm21)是由中国台湾脂质体股份有限公司制备的。它由包囊在平均粒径约为200nm左右的脂质体中的gs-441524所组成。gs-441524是由台塑制药股份有限公司提供的一种纯的淡黄色粉末。脂质体由二棕榈酰磷脂酰胆碱 (dipalmitoylphosphatidylcholine)(nippon fine chemical co.,ltd.，日本)和胆固醇(dishman，荷兰)组成，这两者都是肺表面活性剂
23
的天然成分。用溶剂注射法制备空脂质体。简单地说，将适量的脂质混合物(二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(dppc)和胆固醇)溶于乙醇(j.t.baker，美国)，然后注射到硫酸铵溶液中，同时在50℃搅拌。使用挤出机，在 50℃下，由0.2μm聚碳酸酯膜中挤出，由此调整脂质体的尺寸至200nm左右。通过渗滤去除未被包囊的硫酸铵和乙醇，得到最终的空脂质体。
[0207]
采用主动装载法将gs-441524包囊在脂质体中。预先形成的空脂质体与gs-441524 药物溶液混合，然后在50℃下温育，以得到最终的ispm21样品(脂质体态药物悬浮液)，其ph值介于6至7之间，并作为试验品(2):ispm21-it。
[0208]
a.脂质体态核苷化合物的制备
[0209]
i.空脂质体的制备
[0210]
以薄膜水合法或溶剂注射法制备脂质体。
[0211]
使用溶剂注射法制备空脂质体的制程具体化为包括以下步骤的方法：
[0212]
1.秤量预定摩尔比的磷脂和胆固醇的脂质混合物，其中存在或不存在 dspe-peg200，接着在升高的温度下用乙醇将它们溶解；
[0213]
2.将捕获剂加入蒸馏水中，然后混合该溶液以溶解盐类，由此制备捕获剂溶液(如硫酸铵(a.s.))；
[0214]
3.在依据所述脂质组合物合适的温度下，将所述脂质混合物加入捕获剂溶液，以形成脂质体溶液；
[0215]
4.在依据所述脂质组合物合适的温度下，将所得到的脂质体溶液由聚碳酸酯膜中
挤出，以得到所需的粒径；
[0216]
5.使挤出的脂质体相对于蔗糖溶液或盐水或合适的缓冲液进行渗滤，由此移除游离的捕获剂和乙醇。
[0217]
ii.将抗病毒剂装载进脂质体内
[0218]
以下方法是经由远程装载将核苷化合物包囊于脂质体内的示例性方案，其包括以下步骤：
[0219]
1.制备15.4mg/ml或合适浓度的核苷化合物于合适的介质中溶液，以得到含有核苷化合物的原液(stock solution)(以下称为原液)；
[0220]
2.在锥形瓶中混合经由实施例1、第a节、第i节的制程制备的空脂质体(在一典型的具体实施方案中，具有以下条件：dppc：胆固醇的摩尔比为3：2，300mm硫酸铵(a.s)作为捕获剂，以及20-50mm的磷脂浓度)以及原液，以获得d/l比例为25g/mol 或预设d/l比例的装载溶液；
[0221]
3.在合适的温度下连续摇动所述装载溶液60分钟或预设的时间，以形成装载药物的脂质体；
[0222]
4.加入氢氧化钠溶液或缓冲溶液至所述装载药物的脂质体，以调整ph值介于6-7；以及
[0223]
5.使用尺寸排阻柱色谱法(size-exclusion column chromatography)和紫外光-可见光吸光度测量或是hplc分析来测定最终样品的药物包囊(即装载效率)。
[0224]
表a：不同药物：脂质比例下的药物装载量
[0225][0226]
*包囊效率(encapsulation efficiency，ee)由以下公式计算而得：脂质体态药物(lf) 除以全部型式的药物(tf)：ee(％)＝lf/tf*100％。
[0227]
b.脂质体态抗病毒剂的储存稳定性
[0228]
在4℃下保存的脂质体态核苷化合物的稳定性可监测至少2个月或预设的时间。是研究用300mm硫酸铵或75mm蔗糖八硫酸三乙基铵作为捕获剂将核苷化合物装载到空脂质体中，得到脂质体态药物样品(表a)。脂质体态药物样品在4℃或合适的温度下保存2个月或预设的时间后，随着时间研究脂质体的药效和理化性质。
[0229]
实施例4：脂质体态抗病毒剂的释放特性
[0230]
在模拟肺液中的体外药物释放
[0231]
执行实施例1所制备的脂质体态抗病毒剂的释放特性实验，以证明它们的缓释性质。
[0232]
体外释放(in vitro release，ivr)实验的方案如下：
[0233]
1.将0.5ml的每种脂质体态抗病毒剂样品与4.5ml的模拟肺液(在37℃预热)混合，
由此将测试样品稀释10倍，然后将稀释过的样品置于15ml离心管中；
[0234]
2.将盛装稀释过的样品的离心管置于inteli-mixer旋转器的样品孔上，以20rpm旋转，并在37℃温育；
[0235]
3.在预定的时间点取样1ml的稀释过的样品以分析包囊效率。
[0236]
测定核苷化合物包囊效率的分析方法如下：
[0237]
a.用条件溶液(condition solution)填充并洗涤2ml的g50柱；
[0238]
b.将0.1ml的样品加入柱中，然后加入0.45ml的洗脱液，并等待溶液从柱中洗脱出来；
[0239]
c.将0.8ml的洗脱液加入柱中，并收集脂质体形式的洗脱物；
[0240]
d.用合适的溶剂破坏柱前样品和柱后样品(pre and post-column samples)(脂质体形式与全部形式)；以及
[0241]
e.使用紫外光-可见光(uv-vis)或hplc方法测量样品在指定波长下的吸光度，以确定每个样品的药物浓度。
[0242]
脂质体内抗病毒剂的包囊效率(encapsulation efficiency，ee)由以下公式计算而得：脂质体形式的药物(lf)除以全部形式的药物(tf)：
[0243]
ee(％)＝lf/tf*100％。
[0244]
可以绘制释放曲线，以描述释放速率(％)相对于时间的关系。释放速率由以下公式计算：初始脂质体形式减每一时间点的脂质体形式，再除以初始脂质体形式：
[0245]
(lf
t0-tf
t
)/lf
t0
*100％。
[0246]
为了达到改良的药效以及以低给药频率进行治疗，期望能有药物成分的延长释放特性。因此，我们从所有制剂中选择具有缓慢或合适的释放特性的脂质体态抗病毒剂，并使用它们进行以下的毒性研究。
[0247]
实施例5：动物模型中吸入的脂质体态抗病毒剂的药代动力学
[0248]
研究设计
[0249]
将总共48只雌性sd大鼠分为2个治疗组:(1)gs-441524溶液-iv:24只大鼠以剂量为0.20mg/只进行单次静脉注射gs-441524；(2)ispm21-it:24只大鼠经it给药，单次施用0.20mg ispm21(含1.0mg/ml gs-441524的脂质体悬浮液)，这是一种临床模拟吸入的给药途径。采血时间点分别为给药后0.25、1、4、24、72小时，而肺部采样时间点分别为给药后0.25、4、24、72小时。所有涉及动物的手术均在tlc动物设施中进行，并符合中国台湾tlc的实验动物照护及使用委员会(iacuc)的伦理准则 (#tlc20iacuc037)。
[0250]
血液和肺部样品的采集和处理
[0251]
在规定的采样时间点从颈静脉采血，放入含有k2edta为抗凝血剂的采集管中。将每个采集管轻轻倒置，以确保样品与抗凝血剂完全混合。记录实际采样时间。收集的血液样品在2-8℃下1500xg离心10分钟以获得血浆。将上清液血浆立即转移到已标记的微管中。如果未立即处理，则将血浆转移到-80℃的冷冻装置中。血浆采集须在采血后两小时内完成。
[0252]
在规定的肺部样品采集时间内对动物实施安乐死。每只大鼠用kd注射帮浦灌注约100ml、2mm k2edta/生理盐水至少8分钟。灌注后取出肺，并用液氮冷冻。冷冻后，将肺部秤重并放在湿冰上，直到转移到-80℃的冰箱中。所有的肺部样品在-80℃冰箱中保存直到均质。
[0253]
生物分析以及药代动力学(pk)计算
[0254]
在与甲醇充分混合以沉淀蛋白质之前，向血液样品中添加内标(6,7-二甲基-2,3-二-2
‑ꢀ
吡啶基喹喔啉，6,7-dimethyl-2,3-di-2-pyridylquinoxaline)。离心后，将上清液注入与串联质谱仪(waters xevotm tq-s)(lc-ms/ms)联用的液相色谱仪(waters i-class uplc)中进行分析。对于肺部样品，将组织/器官用50％甲醇和0.1％甲酸均质化。在与甲醇充分混合以沉淀蛋白质的前，向组织/器官匀浆中添加内标(is)。离心后，将得到的样品上清液注入lc-ms/ms中进行分析。使用masslynx软件计算gs-441524的浓度。肺部和血浆分析的线性范围分别为10-10000ng/ml和0.5-500ng/ml。gs-441524的pk参数是通过非房室法(non-compartmental method)，使用(8.0或更高版本)并应用稀疏抽样计算(sparse sampling computation)来计算的。
[0255]
结果
[0256]
gs-441524在肺部中的药代动力学
[0257]
在以it给药单次施用ispm21后，与gs-441524溶液-iv(表3)相比，ispm21-it在肺中观察到较长的半衰期(22.8小时)和更高的gs-441524浓度(图4a)。由于浓度仅在第一个时间点(0.25小时)可测量，因此无法计算gs-441524溶液-iv在肺中的半衰期和 auc。值得注意的是，单剂量0.2mg ispm21-it的c
max
为74.9μg/g，以及auc
0-72
为 369h*μg/g，这显示ispm21-it与gs-441524溶液-iv相比，肺暴露量显着增加，并且 ispm21-it的c
max
为gs-441524溶液-iv的207倍(表4)。
[0258]
表3：在单次给药gs-441524溶液-iv及ispm21-it后，大鼠肺部及血浆中gs-441524 的药代动力学(pk)参数
[0259][0260]
表4：ispm21-it相对于gs-441524溶液-iv的比值，其是剂量归一化的最大浓度和浓度-时间曲线下面积
[0261][0262]
gs-441524在血浆中的药代动力学
[0263]
单次给药后，与gs-441524溶液-iv相比，ispm21-it在血浆中显示出类似的pk 特性(图4b)和auc(表3和表4)。ispm21-it的血浆半衰期(9.98小时)略高于gs-441524 溶液-iv的半衰期(7.43小时)。值得注意的是，与gs-441524溶液-iv相比，ispm21-it 在血浆中显示了更低的全身性暴露量(cmax的37％)(表4)。
[0264]
在这个大鼠pk研究中，我们研究了可吸入的ispm21对于肺部的靶向递送，并显示出gs-441524在肺部的持续释放以及显着更高的暴露量。在单次it给药ispm21后， gs-441524在给药后72小时后在肺组织中的平均浓度为1.07μg/g(3.67μm，假设肺组织样品的密度为1g/ml)，这说明ispm21可以维持相对较高的gs-441524浓度，这比针对sars-cov感染的人气道上皮(hae)细胞的体外抗病毒ec50(0.18μm)高19倍。