一种精油组合物在制备抑菌药物中的用途

1.本发明属于药物领域，具体涉及一种精油组合物在制备抑菌药物中的用途。


背景技术：

2.植物精油属于植物次生代谢产物，通常存在于植株的各个器官组织内，如花、芽、叶、根、种子、枝条和果实等中，是一种可随水蒸汽蒸馏析出且分子量较小的具有一定气味的挥发性油状液体的总称。精油、香精油、芳香油和挥发油均属于植物精油，只是在不同的领域叫法有所不同。精油或香精油是其在植物学上的称谓，芳香油是在商业上的称谓，挥发油则是在化学和医药学上的称谓。
3.植物精油由不同的有机化合物组成，主要含有醇类、醛类、酸类、酚类、丙酮类、萜烯类化合物。植物精油功效很多，包括抑菌、抗炎、镇静、驱虫、润肤护肤、祛风健胃、促进消化、舒缓肌肉组织、排毒等。此外，由于植物精油挥发性高，分子量小，极易渗透于皮肤，被人体吸收。因此常用于制备外用药物制剂或化妆品。如将具有抑菌功效的植物精油制备成涂抹于皮肤的外用抑菌剂，对于皮肤消毒、抑菌、伤口愈合等具有重要意义。将润肤护肤的植物精油制备成化妆品也有能够起到美容护肤的作用。
4.但是，植物精油在使用过程中存在一些问题：由于植物精油是芳香植物的高度浓缩提取物，使用时往往存在味道刺鼻、皮肤刺激性强、流动性差、涂抹时难推开等问题。而稀释后的低浓度精油功效又会大大降低。比如乳香精油和没药精油高浓度下抑菌效果好，但是有刺激性且涂抹时难推开，而低浓度下又会显著降低其抑菌功效。
5.如何制备一种低浓度下功效依然好的植物精油，既保留植物精油的功能性，又减少其皮肤刺激性，便于使用，需要进一步研究。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种精油组合物在制备抑菌药物中的用途。
7.本发明提供了一种植物精油组合物，它是由如下体积配比的组分组成：
8.松节油40～50份、乳香精油20～30份、没药精油20～30份、白芷精油20～40份、威灵仙精油20～40份、冬青油80～90份。
9.进一步地，前述的植物精油组合物是由如下体积配比的组分组成：
10.松节油48份、乳香精油24份、没药精油24份、白芷精油30份、威灵仙精油30份、冬青油84份。
11.本发明还提供了前述的植物精油组合物在制备抑菌药物中的用途。
12.进一步地，所述抑菌药物为抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和/或白色念珠菌的药物。
13.本发明还提供了一种抑菌药物，它是由前述的植物精油组合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
14.进一步地，所述制剂为外用制剂；
15.优选地，所述外用制剂为搽剂。
16.进一步地，所述搽剂是由如下体积配比的原辅料制备而成：
17.松节油40～50份、乳香精油20～30份、没药精油20～30份、白芷精油20～40份、威灵仙精油20～40份、冬青油80～90份、调香剂20～100份、橄榄油500～1000份。
18.进一步地，所述搽剂是由如下体积配比的原辅料制备而成：
19.松节油48份、乳香精油24份、没药精油24份、白芷精油30份、威灵仙精油30份、冬青油84份、调香剂60份、橄榄油700份；
20.优选地，所述调香剂为茉莉精油。
21.进一步地，所述抑菌药物为抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和/或白色念珠菌的药物。
22.本发明还提供了前述的抑菌药物的制备方法，它包括如下步骤：将前述的植物精油组合物和药学上可接受的辅料或辅助性成分混合均匀，即得。
23.现有植物精油大多需要在高浓度下才具有抑菌效果，但高浓度植物精油往往存在味道刺鼻、皮肤刺激性强、流动性差、难制备成制剂、涂抹时难推开等问题。使用时既不方便，又存在安全性问题，导致大众接受度较低。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
25.本发明提供了一种植物精油组合物，该植物精油组合物具有广谱抑菌作用，对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌均有良好的抑制效果。且本发明组合物配伍精当，可以发挥协同增效的抑菌作用，在减少有效成分的使用剂量下发挥更好的抑菌效果。此外，本发明植物精油组合物无皮肤刺激性，无皮肤变态反应，使用安全，制备得到的搽剂稳定性良好，解决了现有技术中植物精油使用时存在的问题，既保证了使用效果和安全性，又方便使用，大众接受度高，具有良好的应用前景。
26.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
27.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
28.图1为本发明植物精油组合物的质量检测结果。
29.图2为本发明植物精油组合物的抑菌试验结果。
30.图3为本发明植物精油组合物的稳定性试验结果。
具体实施方式
31.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
32.本发明中使用的松节油、乳香精油、没药精油、白芷精油、威灵仙精油、冬青油、橄榄油和茉莉精油均通过购买市售产品而得。其中，松节油(cas no.8006-64-2)符合国家标准，乳香精油(cas no.8016-36-2)符合行业标准，没药精油(cas no.8016-37-3)符合行业标准，白芷精油(cas no.223747-83-9)符合行业标准，威灵仙精油购买自江西雪松天然药
用油有限公司(产品批号20201105)，冬青油(cas no.119-36-8)符合国家标准，橄榄油(cas no.8001-25-0)符合国家标准，茉莉精油(cas no.8022-96-6)符合行业标准。
33.实施例1、本发明植物精油组合物的制备
34.1、原料配方：松节油48ml、乳香精油24ml、没药精油24ml、白芷精油30ml、威灵仙精油30ml、冬青油84ml。
35.2、抑菌搽剂的制备：
36.制备抑菌搽剂除了上述原料配方，还有辅料调香剂(茉莉精油)60ml、橄榄油700ml。具体制备方法为：将原料松节油、乳香精油、没药精油、白芷精油、威灵仙精油、冬青油以及辅料茉莉精油和橄榄油混合均匀，即得。
37.实施例2、本发明植物精油组合物的制备
38.1、原料配方：松节油40ml、乳香精油20ml、没药精油20ml、白芷精油20ml、威灵仙精油20ml、冬青油80ml。
39.2、抑菌搽剂的制备：
40.制备抑菌搽剂除了上述原料配方，还有辅料调香剂(茉莉精油)100ml、橄榄油700ml。具体制备方法为：将原料松节油、乳香精油、没药精油、白芷精油、威灵仙精油、冬青油以及辅料茉莉精油和橄榄油混合均匀，即得。
41.实施例3、本发明植物精油组合物的制备
42.1、原料配方：松节油50ml、乳香精油30ml、没药精油30ml、白芷精油40ml、威灵仙精油40ml、冬青油90ml。
43.2、抑菌搽剂的制备：
44.制备抑菌搽剂除了上述原料配方，还有辅料调香剂(茉莉精油)20ml、橄榄油700ml。具体制备方法为：将原料松节油、乳香精油、没药精油、白芷精油、威灵仙精油、冬青油以及辅料茉莉精油和橄榄油混合均匀，即得。
45.以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
46.试验例1、本发明植物精油组合物的抑菌试验
47.一、试验药物分组
48.实施例1制备的搽剂中各味原料的体积占比分别为：松节油4.8％、乳香2.4％、没药2.4％、白芷3.0％、威灵仙3.0％、冬青油8.4％，为考察复方精油与单方精油抑菌作用的差异，对药物进行如下分组：
49.1、试验组：本发明实施例1制备得到的搽剂，用稀释剂将搽剂稀释至浓度为100％、50％、20％、10％和5％。
50.2、对照组：
51.(1)松节油：用稀释剂稀释至浓度为100％、50％、20％、4.8％和1％。
52.(2)乳香精油：用稀释剂稀释至浓度为100％、50％、20％、2.4％和1％。
53.(3)没药精油：用稀释剂稀释至浓度为100％、50％、20％、2.4％和1％。
54.(4)白芷精油：用稀释剂稀释至浓度为100％、50％、20％、3.0％和1％。
55.(5)威灵仙精油：用稀释剂稀释至浓度为100％、50％、20％、3.0％和1％。
56.(6)冬青油：用稀释剂稀释至浓度为100％、50％、20％、8.4％和2.0％。
57.试验组和对照组各浓度均使用橄榄油作为稀释剂稀释。各组给药量及梯度稀释如
表1～7所示。
58.表1.试验组给药量及梯度稀释表
[0059][0060]
表2.松节油对照组给药量及梯度稀释表
[0061][0062]
表3.乳香精油对照组给药量及梯度稀释表
[0063][0064][0065]
表4.没药精油对照组给药量及梯度稀释表
[0066][0067]
表5.白芷精油对照组给药量及梯度稀释表
[0068][0069]
表6.威灵仙精油对照组给药量及梯度稀释表
[0070][0071]
表7.冬青油对照组给药量及梯度稀释表
[0072][0073]
二、试验方案
[0074]
因本发明组合物主要为皮肤外用消毒抑菌制剂，依据《消毒技术规范》(2002年版)和gb15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌的抑菌率需≥50％。
[0075]
因此，考察不同药物组及不同作用浓度在相同剂量及作用时间(20min)下对大肠杆菌(atcc 25922)、金黄色葡萄球菌(atcc 6538)和白色念球菌(atcc 10231)的抑菌率。
[0076]
(一)抑菌试验
[0077]
(1)菌悬液：
[0078]
按照说明书方法复苏大肠杆菌冻干粉后，涂板，37℃，倒置16h～24h。次日，挑单菌落接种于100ml营养琼脂液体培养基，37℃，培养16h～24h。按此方法，培养至大肠杆菌第4～5代进行试验。最终菌悬液浓度为：用100μl滴于5ml样品液或对照液内，回收菌数为1
×
104～9
×
104cfu/ml。
[0079]
金黄色葡萄球菌及白色念球菌菌悬液均按照同法制备。
[0080]
(2)试剂配制
[0081]
无菌pbs：购于索莱宝生物科技公司。
[0082]
营养琼脂液体培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，加水1000ml溶解即得。121℃，20min灭菌，备用。
[0083]
营养琼脂固体培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，琼脂20g，加水1000ml溶解即得。121℃，20min灭菌，备用。
[0084]
沙氏固体培养基：蛋白胨10g、琼脂20g、葡萄糖40g，加蒸馏水定容至1l，115℃20min高压蒸汽灭菌。
[0085]
(3)操作：
[0086]
①
试验组：取不同浓度的本发明实施例1制备的搽剂5ml分别置于无菌试管中，各加入大肠杆菌或金黄色葡萄球菌或白色念球菌菌悬液100μl，均匀混合，并开始计时20min。
[0087]
②
对照组：取不同种类、不同浓度的对照品(单方精油)5ml分别置于无菌试管中，各加入大肠杆菌或金黄色葡萄球菌或白色念球菌菌悬液100μl，均匀混合，并开始计时20min。
[0088]
③
空白对照组：取无菌pbs 5ml置于无菌试管中，加入大肠杆菌或金黄色葡萄球菌或白色念球菌100μl，均匀混合，并开始计时20min。
[0089]
④
菌落计数：取各组培养20min后的混悬液0.5ml加入含5ml pbs的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中3个稀释度，分别吸取100μl，置于3个平皿，用凉至40～45℃的营养琼脂培养基(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)15ml或沙氏固体培养基(白色念球菌)作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板。
[0090]
⑤
培养：37℃，倒置培养48h(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)或72h(白色念球菌)。作活菌菌落计数。
[0091]
(二)结果
[0092]
(1)大肠杆菌
[0093]
①
大肠杆菌菌悬液：
[0094]
按照说明书方法复苏大肠杆菌冻干粉，并传代3～4次，制备混悬液，梯度稀释后分别取100μl菌悬液于营养琼脂培养基15ml上培养后，作活菌菌落计数，得以下结果表8。
[0095]
表8.大肠杆菌菌悬液菌落计数
[0096][0097]
注：
“‑”
菌落数太密，无法计数。
[0098]
结论：菌落计数结果显示：1号菌悬液大肠杆菌浓度为2920cfu/ml，因0号菌悬液为稀释100后得1号菌悬液，故0号菌悬液大肠杆菌浓度为2.92
×
104cfu/ml，符合回收菌数1
×
104～9
×
104cfu/ml的要求，故最终0号菌悬液作为大肠杆菌菌悬液。
[0099]
②
不同品种的不同稀释梯度大肠杆菌活菌菌落计数结果：
[0100]
选取稀释倍数为104的菌板进行计数，抑菌率％＝(a-b)/a
×
100％，a为空白对照的平均菌落数，b为试验样品或对照样品的平均菌落数。
[0101]
表9.试验组、对照组及空白对照组的浓度及大肠杆菌活菌计数统计表
[0102]
[0103][0104]
结论：对比复方精油(本发明实施例1制备的搽剂)与单方精油对大肠杆菌的抑菌率，复方精油中含活性成分的总占比为24％，即当复方精油浓度为100％时，活性单方总成分为24％(各单方松节油、乳香、没药、白芷、威灵仙、冬青油精油的占比分别为4.8％、2.4％、2.4％、3.0％、3.0％和8.4％)，此时复方精油对大肠杆菌的抑菌率为100％，抑菌效果显著优于各单方精油浓度大于50％时的效果。说明本发明复方精油在显著减少各单方精油用量的情况下取得了更好的抑制大肠杆菌的效果。本发明复方精油不仅在低浓度下(≥5％)可满足皮肤外用制剂对于抑菌率的要求(≥50％)，并且抑制大肠杆菌发挥了协同增效的作用。
[0105]
(2)金黄色葡萄球菌
[0106]
①
金黄色葡萄球菌菌悬液：
[0107]
按照说明书方法复苏金黄色葡萄球菌冻干粉，并传代3～4次，制备混悬液，梯度稀
释后分别取100μl菌悬液于营养琼脂培养基15ml上培养后，作活菌菌落计数，得以下结果表10。
[0108]
表10.金黄色葡萄球菌梯度稀释表及菌落计数
[0109][0110]
注：
“‑”
菌落数太密，无法计数。
[0111]
结论：菌落计数结果显示：3号菌悬液金黄色葡萄球菌浓度为11670cfu/ml，即1.17
×
104cfu/ml，符合回收菌数1
×
104～9
×
104cfu/ml的要求，故最终选择3号菌悬液作为金黄色葡萄球菌菌悬液。
[0112]
②
不同品种的不同稀释梯度金黄色葡萄球菌活菌菌落计数结果：
[0113]
选取稀释倍数为103的菌板进行计数，抑菌率％＝(a-b)/a
×
100％，a为空白对照的平均菌落数，b为试验样品或对照样品的平均菌落数。
[0114]
表11.试验组、对照组及空白对照组的浓度及大肠杆菌活菌计数统计表
[0115]
[0116][0117][0118]
结论：对比复方精油(本发明实施例1制备的搽剂)与单方精油对金黄色葡萄球菌的抑菌率，复方精油中含活性成分的总占比为24％，即当复方精油浓度为100％时，活性单
方总成分为24％(各单方松节油、乳香、没药、白芷、威灵仙、冬青油精油的占比分别为4.8％、2.4％、2.4％、3.0％、3.0％和8.4％)，此时复方精油对大肠杆菌的抑菌率为99.19％，抑菌效果显著优于各单方精油浓度大于50％时的效果。说明本发明复方精油在显著减少各单方精油用量的情况下取得了更好的抑制金黄色葡萄球菌的效果。本发明复方精油不仅在低浓度下(≥5％)可满足皮肤外用制剂对于抑菌率的要求(≥50％)，并且抑制金黄色葡萄球菌发挥了协同增效的作用。
[0119]
(3)白色念球菌
[0120]
①
白色念珠菌菌悬液：
[0121]
按照说明书方法复苏白色念球菌冻干粉，并传代3～4次，制备混悬液，梯度稀释后分别取100μl菌悬液于营养琼脂培养基15ml上培养后，作活菌菌落计数，得以下结果表12。
[0122]
表12.白色念球菌梯度稀释表及菌落计数
[0123][0124]
结论：菌落计数结果显示：2号菌悬液白色念球菌浓度为22330cfu/ml，即2.23
×
104cfu/ml，符合回收菌数1
×
104～9
×
104cfu/ml的要求，故最终选择2号菌悬液作为白色念球菌菌悬液。
[0125]
②
不同品种的不同稀释梯度白色念球菌活菌菌落计数结果：
[0126]
选取稀释倍数为103的菌板进行计数，抑菌率％＝(a-b)/a
×
100％，a为空白对照的平均菌落数，b为试验样品或对照样品的平均菌落数。
[0127]
表13.试验组、对照组及空白对照组的浓度及白色念球菌活菌计数统计表
[0128]
[0129]
[0130][0131]
结论：对比复方精油(本发明实施例1制备的搽剂)与单方精油对白色念球菌的抑菌率，复方精油中含活性成分的总占比为24％，即当复方精油浓度为100％时，活性单方总成分为24％(各单方松节油、乳香、没药、白芷、威灵仙、冬青油精油的占比分别为4.8％、2.4％、2.4％、3.0％、3.0％和8.4％)，此时复方精油对大肠杆菌的抑菌率为89.93％，抑菌效果显著优于各单方精油浓度为50％时的效果。说明本发明复方精油在显著减少各单方精油用量的情况下取得了更好的抑制白色念球菌的效果。本发明复方精油不仅在低浓度下(≥20％)可满足皮肤外用制剂对于抑菌率的要求(≥50％)，并且抑制白色念球菌发挥了协同增效的作用。
[0132]
(三)总结
[0133]
本发明配方中调香剂(茉莉精油)和橄榄油没有抑菌效果，它们的使用不会对各组抑菌效果产生影响。因此，根据抑菌试验结果显示；与单方精油相比，复方精油(本发明实施例1制备的搽剂)对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌具有优异的抑菌效果，均满足皮肤外用制剂对于抑菌率的要求(≥50％)。且与单方精油相比，本发明复方精油的抑菌效果发挥了协同增效作用。
[0134]
试验例2、本发明组合物抑菌效率试验
[0135]
根据《消毒技术规范》(2002年版)、gb15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》对本发明实施例1制备的组合物(搽剂)的ph值(1:10水溶液)、细菌菌落总数、真菌菌落总数、大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌进行检测以及对其抑菌效果进行检测。
[0136]
该项目均委托具有资质的第三方机构进行检测。根据《消毒技术规范》(2002年版)、gb15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》等标准对本发明实施例1制备的组合物(搽剂)的ph值(1:10水溶液)、细菌菌落总数、真菌菌落总数、大肠菌群、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌进行检测以及对其抑菌效果进行检测。报告如图1和图2所示。
[0137]
结论：以上试验证明，本发明制备得到的搽剂质量符合要求。且该供试品原液，作用2min、5min、10min、20min，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌率均大于99.9％，对白色念球菌抑菌率分别为68％、82％、88％、95％，该样品对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑菌作用，对白色念球菌作用20min有较强抑菌作用。
[0138]
试验例3、本发明组合物的稳定性试验
[0139]
该项委托具有资质的第三方机构进行检验。根据《消毒技术规范》(2002年版)、gb15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》等标准对本发明实施例1制备的组合物(搽
剂)的稳定性进行考察，因本品为皮肤外用制剂，以白色念球菌为检测指标进行检测。报告如图3所示。
[0140]
结论：研究加速稳定性试验(54℃，14d)前后的样品原液对白色念球菌的抑菌作用，作用时间为2min、5min、10min、20min。研究发现加速稳定性试验前后的样品原液对白色念球菌均有抑菌作用，说明样品稳定性(贮存有效期一年)符合标准。本发明组合物(搽剂)的贮存有效期为一年，常温贮存。
[0141]
试验例4、本发明组合物的安全性试验
[0142]
安全性研究均委托具有资质的第三方机构进行检验。根据《消毒技术规范》(2002年版)标准对本发明实施例1制备的组合物(搽剂)的安全性进行考察，因本品为皮肤外用制剂，主要对多次皮肤刺激性试验、皮肤变态反应试验进行检测。
[0143]
一、皮肤变态反应试验
[0144]
1、材料和动物
[0145]
(1)受试样品：本发明实施例1制备的组合物(搽剂)，常温保存。
[0146]
(2)试验动物：皮肤完好的健康白色豚鼠32只，雌雄各半，体重200-300g，由仪征安立卯生物科技有限公司提供，生产许可证号scxk(苏)2016-0005，合格证编号no.202119529。实验动物在温度为20～26℃、相对湿度为40％～70％的普通环境中饲养，实验动物使用许可证号：syxk(苏)2020-0005。co60辐照实验鼠维持饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证：苏饲证(2019)01008。
[0147]
2、方法
[0148]
(1)检测依据：《消毒技术规范》(2002年版)第二部分“消毒产品检验技术规范”2.3.6皮肤变态反应试验。
[0149]
(2)试验方法：豚鼠检疫3d后，按体重随机分为试验组和阴性对照组，每组16只。于试验前24h将豚鼠背部左侧3cm
×
3cm范围去毛，取受试物0.5ml，直接敷在2cm
×
2cm左侧去毛皮肤上，用一层称量纸覆盖，再以无刺激胶布固定，持续6h。阴性对照组以生理盐水同法操作。第7d和第14d以同样方法重复一次。在末次诱导后14d，将受试物0.5ml直接敷在2cm
×
2cm右侧去毛皮肤上，用一层称量纸覆盖，再以无刺激胶布固定，6h后洗受试物。24h和48h后观察皮肤反应，按照“《消毒技术规范》表2-18皮肤反应的评分标准”评分。
[0150]
3、试验结果
[0151]
试验期间，动物体重增重未见异常，结果见表14。除去搽剂后24h和48h，试验组和阴性对照组动物未见异常体征，供试品敷贴区域皮肤无明显改变，反应评分均为0，结果见表15。
[0152]
每6个月进行一次阳性对照试验，近1年，2，4-二硝基氯代苯阳性致敏率为50％(报告编号：bg-20nyzk-wt002)与62.5％(报告编号：bg-21nyzk-wt002)。
[0153]
根据“《消毒技术规范》表2-19致敏强度分级标准”判定，本发明搽剂未见皮肤变态反应。
[0154]
表14.本发明组合物(搽剂)皮肤变态反应试验动物体重
[0155]
组别初始体重(g)终末体重(g)试验组
♀
276.5
±
9.7474.5
±
6.5
阴性对照组
♂
274.1
±
9.1479.4
±
6.9试验组
♀
279.0
±
8.6478.4
±
10.6阴性对照组
♂
277.5
±
8.8477.0
±
6.7
[0156]
表15.本发明组合物(搽剂)皮肤变态反应试验结果
[0157][0158]
二、多次完整皮肤刺激试验
[0159]
1、材料和动物
[0160]
(1)受试样品：本发明实施例1制备的组合物(搽剂)，常温保存。
[0161]
(2)实验动物：普通级新西兰兔，3只，雄性，体重2.5～3.0kg，由仪征安立卯生物科技有限公司提供，生产许可证号scxk(苏)2016-0005，合格证编号no.202119529。实验动物在温度为16～26℃、相对湿度为40％～70％的普通环境中饲养，实验动物使用许可证号：
syxk(苏)2020-0005。所有动物试验前检疫与适应环境3d，自由饮水、摄食。实验兔维持饲料由江苏省协同医药生物工程有限责任公司提供，生产许可证：苏饲证(2019)01008。
[0162]
2、方法
[0163]
(1)检测依据：《消毒技术规范》(2002年版)第二部分“消毒产品检验技术规范”2.3.3.3.3多次完整皮肤刺激试验。
[0164]
(2)试验方法：在试验前24h，将兔背部脊柱两侧的毛去除，不得损伤皮肤。去毛范围，左、右各约3cm
×
3cm。次日将样品原液0.5ml直接涂在一侧皮肤上，另一侧涂无菌水作为对照，在涂抹4h后，用温水清洗，除去残留物。每天涂抹一次，连续涂抹14d。在每次涂抹后24h观察皮肤局部反应，按“《消毒技术规范》表2-11皮肤刺激反应的评分标准”评分。
[0165]
3、试验结果
[0166]
染毒后未观察到动物染毒区皮肤出现异常体征，兔皮肤刺激指数为0，见表16。
[0167]
根据“《消毒技术规范》表2-12皮肤刺激强度分级”判定，受试物对兔多次完整皮肤刺激强度级别为：无刺激性。
[0168]
表16.受试物对兔多次皮肤刺激性试验结果
[0169][0170]
结论：上述试验结果显示，本发明组合物无皮肤刺激性；无皮肤变态反应。
[0171]
试验例5、调香剂和稀释剂精油的抑菌效力
[0172]
为了证明本发明使用的调香剂(茉莉精油)和稀释剂(橄榄油)没有抑菌效果，本发明提供了茉莉精油和橄榄油的抑菌效力实验。
[0173]
一、试验依据：
[0174]
《消毒技术规范》(2002年版)、gb15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》。
[0175]
二、分组及分组依据：
[0176]
为考察复方精油中调香剂和稀释剂的抑菌作用，现进行以下试验：
[0177]
试验组1：茉莉精油浓度为100％；
[0178]
试验组2：橄榄油浓度为100％；
[0179]
空白对照组：pbs。
[0180]
三、试验方案：
[0181]
因本品主要为皮肤外用消毒抑菌制剂，依据《消毒技术规范》(2002年版)和gb15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》，考察不同试验组在相同作用时间下对大肠杆菌(atcc 25922)、金黄色葡萄球菌(atcc 6538)和白色念球菌(atcc 10231)的抑菌率。
[0182]
(1)菌悬液：
[0183]
按照说明书方法复苏大肠杆菌冻干粉后，涂板，37℃，倒置16h～24h。次日，挑单菌落接种于100ml营养琼脂液体培养基，37℃，培养16h～24h。按此方法，培养至大肠杆菌第4～5代进行试验。最终菌悬液浓度为：用100μl滴于5ml样品液内，回收菌数为1
×
104～9
×
104cfu/ml。
[0184]
金黄色葡萄球菌及白色念球菌菌悬液均按照同法制备。
[0185]
(2)试剂试液：
[0186]
无菌pbs：购于索莱宝生物科技公司。
[0187]
营养琼脂液体培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，加水1000ml溶解即得。121℃，20min灭菌，备用。
[0188]
营养琼脂固体培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏5g，琼脂20g，加水1000ml溶解即得。121℃，20min灭菌，备用。
[0189]
沙氏固体培养基：蛋白胨10g、琼脂20g、葡萄糖40g，加蒸馏水定容至1l，115℃20min高压蒸汽灭菌。
[0190]
(3)操作：
[0191]
①
试验组：取试验组1和试验组2样品5ml分别置于无菌试管中，各加入大肠杆菌或金黄色葡萄球菌或白色念球菌菌悬液100μl，均匀混合，并开始计时20min。
[0192]
②
空白对照组：取无菌pbs 5ml置于无菌试管中，加入大肠杆菌或金黄色葡萄球菌或白色念球菌100μl，均匀混合，并开始计时20min。
[0193]
③
菌落计数：取各组培养20min后的混悬液0.5ml加入含5ml pbs的试管内，充分混匀，作适当稀释，然后取其中3个稀释度，分别吸取100μl，置于3个平皿，用凉至40～45℃的营养琼脂培养基(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)15ml或沙氏固体培养基(白色念球菌)作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板。
[0194]
④
培养：37℃，倒置培养48h(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)或72h(白色念球菌)。作活菌菌落计数。
[0195]
(4)结果：
[0196]
①
菌悬液：同试验例1选择大肠杆菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和白色念珠菌菌悬液。
[0197]
②
试验组1和试验组2抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的菌落计数结果见表17～19：
[0198]
抑菌率％＝(a-b)/a
×
100％，a为空白对照的平均菌落数，b为试验样品的平均菌落数
[0199]
表17.各试验组给药浓度及大肠杆菌菌落计数结果
[0200][0201]
表18.各试验组给药浓度及金黄色葡萄球菌菌落计数结果
[0202][0203]
表19.各试验组给药浓度及白色念珠菌菌落计数结果
[0204][0205][0206]
结论：与空白对照组相比，100％茉莉精油和橄榄油对大肠杆菌、金葡菌和白色念球菌的的抑菌率几乎为0.00％，说明复方精油中作为调香剂(茉莉精油)和橄榄油没有抑菌效果，它们的使用不会对各组抑菌效果产生影响。
[0207]
综上，本发明提供了一种植物精油组合物，该植物精油组合物具有广谱抑菌作用，对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念球菌均有良好的抑制效果。且本发明组合物配伍精当，可以发挥协同增效的抑菌作用，在减少有效成分的使用剂量下发挥更好的抑菌效果。此外，本发明植物精油组合物无皮肤刺激性，无皮肤变态反应，使用安全，制备得到的搽剂稳定性良好，解决了现有技术中植物精油使用时存在的问题，既保证了使用效果和安全性，又方便使用，大众接受度高，具有良好的应用前景。