具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极及制备方法和应用

1.本发明涉及生物传感器的技术领域，具体涉及具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极及制备方法和应用。


背景技术：

2.苹果酸，又称羟基琥珀酸，是一种c4-二羧酸。广泛应用于食品、化妆品、制药、水处理、织物染色、生物可降解聚合物等领域。现有技术中，苹果酸的人工制备主要通过微生物发酵法、传统酶固定化法和集成技术(反应与分离耦合技术)等方法实现。苹果酸作为一种平台有机酸化合物，应用范围较广，具有重大经济价值。
3.当前的苹果酸发酵过程的浓度检测主要使用色谱法或电泳法来完成。然而，这些方法存在不太敏感、不能确定确切浓度、耗时长、需要进行样品预处理等问题。目前大多数报道的苹果酸生物传感器是单酶安培生物传感器，使用的是固定在反应器中的nadp

依赖的苹果酸酶。这些方法存在检测时间较长、检测范围较窄、检测效率低及抗干扰能力较弱等问题，因此亟需开发一种具有宽检测线性范围且特异检测苹果酸含量的酶传感电极。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供一种共固定nox（nadh氧化酶）和mdh（苹果酸脱氢酶）的苹果酸传感电极。采用这两种酶耦合制备的苹果酸传感电极，具有较宽的线性检测范围，可以直接应用于的高浓度苹果酸的检测，为后续开发苹果酸在线检测设备奠定了理论与应用基础。
5.为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：一种具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极，包括基底电极和利用固定化载体共固定于电极表面的nadh氧化酶和苹果酸脱氢酶。
6.作为一种优选的实施方式，所述基底电极经普鲁士蓝修饰。
7.作为一种优选的实施方式，所述固定化载体为壳聚糖。
8.本发明的另一目的在于提供上述苹果酸传感电极的制备方法，包括：将nadh氧化酶的酶液、苹果酸脱氢酶的酶液与壳聚糖溶液混合得到混合液后，将混合液滴定于基底电极上并干燥，得到所述苹果酸传感电极。
9.作为一种优选的实施方式，所述壳聚糖溶液中壳聚糖质量分数为0.5~5%；壳聚糖溶液和酶液按体积比1：0.8~1.2混合。优选的，所述壳聚糖溶液中壳聚糖质量分数为1.25%；壳聚糖溶液和酶液按体积比1：1混合。
10.作为一种优选的实施方式，所述nadh氧化酶的酶液的获取方式为：构建可表达nadh氧化酶的基因工程菌株，发酵所述基因工程菌株得到发酵得到nadh氧化酶的粗酶液，将粗酶液纯化后得到的纯酶制成所述酶液。
11.作为一种优选的实施方式，所述基因工程菌株的构建方式为：将编码nadh氧化酶的基因序列合成并构建至质粒pet-28a上，酶切位点为nde i和
xho i，获得重组质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌e. coli bl21(de3)中，得到基因工程菌株，即nadh氧化酶生产菌。
12.进一步的，将所述基因工程菌株接种于lb培养基中，加入诱导剂诱导表达nadh氧化酶；离心收集菌体后，洗涤、离心、破碎、收集上清液，即为nadh氧化酶的粗酶液；纯化所述粗酶液得到纯化的nadh氧化酶。
13.作为一种优选的实施方式，粗酶液纯化的过程为：将粗酶液与ni柱进行特异性结合，并用咪唑溶液洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的nadh氧化酶。
14.作为一种优选的实施方式，所述混合液中nadh氧化酶和苹果酸脱氢酶的酶活比例为1：1。
15.作为一种优选的实施方式，所述基底电极为普鲁士蓝修饰电极，制备方式如下：将基底电极进行表面预处理后置于气溶胶沉积箱中；将阴离子溶液和kcl溶液雾化成气溶胶后通入气溶胶沉积箱，反应若干时间；将阳离子溶液和kcl溶液雾化成气溶胶后通入气溶胶沉积箱，反应若干时间；取出电极烘干后得到所述普鲁士蓝修饰电极；所述阴离子溶液为k4fe(cn)6或k3fe(cn)6；阳离子溶液为fecl3或(nh4)2fe(so4)2。
16.作为一种优选的实施方式，将所述混合液于3～6℃下避光放置至干燥，将6 μl混合液滴定于普鲁士蓝修饰电极上，得到所述苹果酸传感电极。
17.本发明的又一目的在于提供上述苹果酸传感电极在苹果酸检测中的应用。
18.一种优选的应用方式为：以所述苹果酸传感电极作为工作电极，使用三电极系统进行检测，检测环境为pbs缓冲液，并加入黄素单核苷酸和nad ，采用计时安培法进行测试。
19.与现有技术相比，本发明提供的基于nox和mdh的苹果酸生物传感器的传感电极的方法，采用壳聚糖将nox和mdh固定在普鲁士蓝修饰后的电极表面。采用本方法制备的苹果酸生物传感电极及含有该电极的传感器线性检测上限较高，弥补了发酵生产中高浓度苹果酸无法直接检测的缺陷，也为后续开发苹果酸在线检测设备奠定了理论与应用基础。
附图说明
20.图1是nox和mdh的sds-page图。
21.图2是实施例2制备的传感电极的抗干扰性测试。
22.图3是实施例2制备的传感电极对不同浓度的苹果酸浓度—电流响应标准曲线。
23.图4是实施例2制备的传感电极对不同浓度的苹果酸浓度—电流响应标准曲线。
具体实施方式
24.本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。
25.下面结合附图和具体实例对本发明进行详细说明，可以帮助更好地理解本发明。
实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。并对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。
26.实施例中使用的mdh为商业化酶制剂，购自上海源叶生物科技有限公司。该mdh产品的sds-page图如图1所示，1泳道的两根条带是mdh的两种聚合状态，一种为单体，一种为同源二聚体。实施例中使用的nox基因来自thermus thermophilus hb8，其genbank登录号为nc_006461.1。
27.实施例中使用的普鲁士蓝修饰电极按专利cn101532979a中公开的方法制备得到，包括：（1）将基底电极进行打磨、超声等表面预处理后置于气溶胶沉积箱中；（2）阴离子溶液0 .01～2 m k
4 fe(cn)6或k
3 fe(cn)6和0 .01～0 .5 m kcl溶液经超声雾化器雾化成气溶胶后，通入气溶胶沉积箱中，反应若干时间；（3）等浓度阳离子溶液0 .01～2 m fecl3或者(nh
4 )
2 fe(so
4 )2和0 .01～0 .5 m kcl溶液超声雾化成气溶胶后，通入气溶胶沉积箱中，反应若干时间；重复上述气溶胶 沉积若干次后，烘干即得。
28.（4）在电解液中，将步骤（3）获得的电极进行活化；（5）将步骤（4）获得的电极在室温下干燥。
29.上述的基底电极为金属电极或金属片。
30.实施例1本实施例具体说明nox酶液的制备方法。
31.本发明通过构建可表达nadh氧化酶的基因工程菌株，发酵所述基因工程菌株得到发酵得到nadh氧化酶的粗酶液，将粗酶液纯化后得到的纯酶制成所述酶液。
32.一个具体的实施方式如下：（1）nox生产菌（基因工程菌株）的构建；将编码nox的基因序列合成并构建至质粒pet-28a上，酶切位点为nde i和xho i，获得重组质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌e. coli bl21(de3)中，得到nox生产菌。
33.优选的，将100～300 ng重组质粒转化至100～300 μl大肠杆菌e. coli bl21(de3)中，将含重组质粒的大肠杆菌在冰上静置10～50 min后于 35～55℃热激60～120 s；再冰上放置1～5 min后加入500～1500 μl的lb培养基，于37℃、 200 rpm条件下培养0.5～3 h，取适量培养后的菌液涂布于有氨苄青霉素钠lb平板上过夜培养，即得到nox生产菌。
34.更优选的将200 ng重组质粒转化至200 μl大肠杆菌e. coli bl21(de3)中，将含重组质粒的大肠杆菌在冰上静置30 min后于45℃热激90 s；再冰上放置2 min后加入900 μl的lb培养基，于37℃、 200 rpm条件下培养1 h，取适量培养后的菌液涂布于有氨苄青霉素钠lb平板上过夜培养，即得到nox生产菌。
35.（2）发酵所述nox生产菌获得粗酶液；将nox生产菌接种于lb培养基中，加入0.01～0.02 mm异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，20℃低温诱导24 h，离心收集菌体用pbs缓冲液洗涤后离心、破碎、收集上清液，即为nox的粗酶液。优选加入0.01mm的异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达。
36.（3）纯化粗酶液获得纯化nox蛋白；
将粗酶液与ni柱进行特异性结合，并用50 mm、100 mm、 200 mm、250 mm咪唑溶液依次洗脱，得到含有目的蛋白的洗脱液；再将含有目的蛋白的洗脱液通过超滤管离心富集，得到纯化的nox。
37.实施例2本实施例具体说明具有宽检测线性范围的苹果酸传感电极的制备方法。
38.将实施例1中获得的纯酶、购买的mdh产品分别制成nox和mdh的酶液，取壳聚糖溶于极性溶剂制成壳聚糖质量分数0.5~5%的壳聚糖溶液。所述极性溶剂可为冰醋酸、无水乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、乙醚、醋酸丁酯中的至少一种，本实施例中选用冰醋酸配置壳聚糖质量分数1.25%的壳聚糖溶液。nox酶液酶活范围可为7.6～8.2 u，本实施例中为7.8 u，mdh为80u，混合液中nox和mdh的酶活比例配置为1:1。
39.将nadh氧化酶的酶液、苹果酸脱氢酶的酶液与壳聚糖溶液按体积比为1：1混合得到混合液后，将混合液滴定于基底电极上并干燥，得到所述苹果酸传感电极。
40.将nox和mdh的酶液与壳聚糖溶液按体积比为1：0.8～1.2混合（酶液的体积按两种酶液总体积计）得到混合液，将6 μl混合液滴定于普鲁士蓝修饰电极上并于3～6℃下避光放置至干燥。本实施例中nox和mdh的酶活比例为1:1，酶液与壳聚糖溶液按体积比为1：1混合。
41.实施例3本实施例对实施例2制备苹果酸传感电极进行了电化学检测性能评估。
42.本发明的检测体系是基于上海振华chi650e a15655型号的电化学工作站，使用三电极系统进行检测，所述苹果酸传感电极为工作电极，ag/agcl电极为参比电极，铂丝为对电极。检测环境为40ml 50mm的pbs和0.2 mm fad 和 2 mm nad

作为检测环境，并利用软件chi650e检测电流变化。采用计时安培法进行测试，检测电压为-0 .05v。
43.1. 抗干扰性测试：以纯水为溶剂分别配置1 mol/l的苹果酸、抗坏血酸、尿酸、葡萄糖、草酰乙酸、丙酮酸溶液，然后分别将实施例2所得苹果酸传感电极接入电化学工作站扫描it图，待基线平稳后，将配置好的苹果酸溶液20 μl加入反应池中，待其电流响应平稳后将其余溶液依次加入20 μl溶液至检测池中，反应 100s，观察电流变化。最后再加入20 μl苹果酸溶液验证响应效果的重复性；读取每种溶液加入后的电流值变化。
44.实施例2所得苹果酸传感电极只对苹果酸溶液有较为明显的电流响应，证明该苹果酸传感器对只对苹果酸溶液有响应，有良好的抗干扰性，如图2所示。
45.2. 响应时间测试：a .以纯水为溶剂配置1 mol/l的苹果酸溶液，然后将实施例2所得苹果酸传感电极接入电化学工作站扫描it图，待基线平稳；b .将配置好的苹果酸溶液20 μl加入反应池中，待其平稳后记录响应时间；c .重复b步骤，计算响应时间平均值；如图3所示，响应时间平均值为25 s。证明该苹果酸传感器具有响应时间短、快速高效的特点；3. 传感器准确性测试：a .在酵母发酵液中加入定量苹果酸溶液制备模拟检测液，苹果酸浓度分别为1 mm、2 mm、3 mm、4 mm；b .将实施例2所得苹果酸传感电极接入电化学工作站扫描it图；c .待基线平稳后，将上述苹果酸溶液20ul加入反应池中，待其平稳后记录响应时间；d .重复c步骤，计算响应时间平均值；计算其理论响应电流，根据响应电流平均值计算相对误差，相对误差为：模拟检测
液在1 mm时，相对误差为1.2%；模拟检测液在2 mm时，相对误差为1.0%；模拟检测液在3 mm时，相对误差为1.1%；模拟检测液在4 mm时，相对误差为0.9%；证明该苹果酸传感器具有准确性高的特点。
46.4 . 传感器线性范围测试：a .以纯水为溶剂分别配置1 mol/l的苹果酸溶液，然后将实施例所得电极接入电化学工作站扫描it图，待基线平稳；b .将配置好的苹果酸溶液20 μl加入反应池中待其平稳；c .重复b步骤数次；d .计算每次响应电流大小，找出响应值相同的最大限，计算其终浓度及线性范围，如图4所示。线性范围为2~8 mm，线性公式为y=0.157x-0.098，r2=0.993。
47.前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施 例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发 明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。