一种预测污染物与生物膜之间相互作用的方法

1.本发明属于环境风险评估领域，具体涉及一种预测污染物与生物膜之间相互作用的方法。


背景技术：

2.随着人们环保意识的增强，促使人们更多地关注和重视因暴露途径多样和在环境中较高的检出频率带来的环境污染问题。污染物可直接与生物的膜受体和蛋白质结合，导致化学性损失，引发生物毒性效应。目前所采用的生物毒性测试方法包括体外试验和体内试验，用来发现毒物对有机生命体的危害程度。体内试验对受试生物需求量大、成本较高和试验周期长，根据环境伦理动物实验3r原则：减少(reduce)实验动物数量、替代(replace)实验动物和优化(refine)实验程序的规定，既要满足人们对动物的道德关切，又要保障科学的发展。
3.在当前环境下，计算机模拟程序相比于动物毒性试验具有预测能力强、非生物实验性、节省时间和准确度较高等优点。分子动力学(molecular dynamics，md)模拟是计算机软件中模拟程序的一种方法，根据实际理论的指导而进行的一种虚拟实验，并且与实验所获得的结果往往拥有非常高的一致性，目前已经得到了广泛认可和应用。磷脂双分子层(dipalmitoylphosphatidylcholine，dppc)是构成细胞膜的基本支架，由于其具有许多优良的力学和生物性能，目前已被作为模型膜利用md模拟法研究化合物与生物膜之间的相互作用。由于dppc存在结构复杂、计算周期长等问题，因此具有一定的局限性。亟需一种既遵循环境伦理道德，同时快速获得可与实验结果相比较的简化计算方法。
4.正辛醇-水分配系数(octanol-water partition coefficient，kow)是表征化合物在有机相进入生物相之间的重要环境参数，已广泛应用于农药、化工产品分离与提纯、生态毒理学等领域来预测环境中污染物的毒性。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明在避免使用生物暴露进行污染物毒性作用潜在性研究可能性的前提下，提供一种预测污染物与生物膜之间相互作用的方法，利用正辛醇作为拟有机相替代dppc提高污染物与生物膜之间相互作用预测效率，实现了污染物与生物膜间相互作用的快速计算，大大缩短了计算周期，提高运算速度，为广大研究者分析污染物跨膜和毒性作用提供简便快速的计算方法，以及可用于预测验证的非使用生物试验的替代试验方法。
6.本发明以正辛醇替代磷脂双分子层(dppc)进行分子动力学的模拟，研究污染物和正辛醇之间的相互作用。模拟采用materials studio 8.0软件，构建和优化正辛醇(c8h
18
o)与污染物的反应体系，通过md模拟作用过程计算相互作用能e，以e来判断污染物跨膜的难易程度。结合相关的毒性数据ec
50
值与相互作用能e判断污染物是直接与生物分子发生生物化学反应从而产生毒性作用完成跨膜，还是依赖正辛醇分配作用的相似相溶原理进行跨
膜。
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：一种预测污染物与生物膜之间相互作用的方法，具体实施步骤包括：
8.1.构建反应体系
9.用materials studio 8.0软件，通过modulesde的amorphous cell calculation模块建立体系。主要步骤为在setup模块下，task选择confined layer，quality选择medium，density(密度)输入正辛醇密度和污染物密度之和的平均值(单位：g/m3)。在energy模块下，forcefield(力场)选择compass，charges选择forcefield assigned，点击run，构建反应体系完成。
10.2.优化结构
11.选择modulesde的forcite geometry optimization模块，algorithm选择smart，quality设置为fine，max.iterations设置为500，external pressure设为0.0gpa，关闭对话框，单击run，关闭forcite calculation对话框，完成结构优化。
12.3.模拟作用过程
13.选择modulesde的forcite dynamics模块，本研究中压力并非关键性因素，因此在dynamics模块下具体操作步骤为ensemble采用nvt(正则系综)，initial velocities选择random，temperature(模拟系统温度)设置为298.0k。time step(步长)设为1.0fs，每隔1.0fs记录一次运动轨迹，total simulation time(模拟总时间)设置为1.0
×
104ps(输入1.0e4)，number ofsteps(总步长)为1
×
107，frame output every设为2000steps，每20000步输出一次图貌，收集数据。
14.4.计算相互作用能
15.利用步骤3收集的数据直接计算稳定构型下c8h
18
o-污染物体系之间的相互作用能e(单位为：kcal/mol)，计算公式如下：
[0016][0017]
其中：e
总
为模拟后的体系总能量，e
物质
为模拟后的单独反应物质的能量，为正辛醇模拟后的能量，以上数值来自于步骤1-3。
[0018]
5.判断反应机制
[0019]
以步骤4所述e值的大小来评价污染物跨膜的难易程度。e越大，吸附越稳定，吸附行为越容易发生；e为0或负值，吸附越难发生。比较毒性ec50值与相互作用能e判断污染物是直接与生物分子发生生物化学反应从而产生毒性作用完成跨膜，还是依赖正辛醇分配作用的相似相溶原理进行跨膜。
[0020]
污染物和生物体发生作用必须先与生物体的膜结构进行接触，然后通过吸附在其表面再进行跨膜进入生物体。若呈现较弱的吸附作用则表明其跨越生物膜进入生物体内的可能性低。
[0021]
污染物从生物体跨膜后会与活性蛋白或生物分子结合发生相互作用，干扰和破坏机体的正常生理功能，最终环境污染物对生物体表现出相应的毒性效应。
[0022]
在水生生态风险评价中，研究有机污染物对水生生物的毒性作用模式十分重要。目前，有机污染物对水生生物的毒性作用模式可分为麻醉型和反应型2种类型
[1]
。反应型化
合物是指化合物本身或者其代谢产物能与普遍存在于生物大分子的某些结构发生反应的有机物。麻醉型化合物是指在整个毒性作用过程中没有与有机体的各个靶位发生生物化学反应的化合物。反应型化合物毒性显著高于麻醉型化合物。麻醉型作用是通过化合物与细胞膜之间的某种非共价作用，可逆性改变了细胞膜的结构和功能，进而对有机体产生毒性作用
[2]
。麻醉型化合物的毒性取决于其进入有机体能力，因此其毒性作用潜力完全依赖于疏水性，与正辛醇/水分配系数对数值lgkow有较好的相关性。判别有机污染物对不同水生生物的毒性作用模式不仅有利于评价有机污染物的生态风险性，而且有助于解释有机污染物的毒性作用机理。
[0023]
本发明与现有技术相比的有益效果是：通过引入拟有机相正辛醇替代dppc，采用分子动力学模拟方法分析污染物在正辛醇和dppc中的跨膜过程，快速简化地计算体系间的相互作用能，探究吸附作用机制，获得与试验结果相符合或相近的计算结果。这种超算方法符合大分子物质之间的相互吸附和通过生物膜的方式，有助于分子反应的可视化，为揭示分子间相互作用机制提供有力的技术支撑。本发明提出避免使用生物暴露进行污染物毒性作用潜在性研究的可能性，为广大研究者分析污染物跨膜和毒性作用提供简便快速的计算方法，以及可用于预测验证的非使用生物试验的替代试验方法。
附图说明
[0024]
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步说明
[0025]
图1是c8h
18
o-污染物体系的构建过程程序步骤图；
[0026]
图2是c8h
18
o-污染物体系的构建示意图；
[0027]
图3是c8h
18
o-污染物体系的优化结构具体程序步骤图；
[0028]
图4是c8h
18
o-污染物体系的优化结构示意图；
[0029]
图5是c8h
18
o-污染物体系的模拟作用具体程序步骤图；
[0030]
图6是c8h
18
o-污染物体系的模拟作用示意图。
具体实施方式
[0031]
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
[0032]
实施例1
[0033]
(1)根据参考文献3获得有机磷酸酯的名称、化学式、缩写等基础数据，整理见表1和表2；
[0034]
(2)以明亮发光杆菌t3小种为受试生物，利用dxy-2型生物毒性测试仪测得有机磷酸酯对发光杆菌的半最大效应浓度ec
50
毒性数据，方法参见文献2，具体步骤如下：
[0035]
①
固体斜面培养基和培养液的制备；
[0036]
②
发光菌冻干粉剂的复苏：使用3％nacl溶液；
[0037]
③
斜面菌种的培养：用接种棒转接至试管斜面进行传代培养，20℃下恒温培养；
[0038]
④
摇瓶菌液的培养：将发光菌第三代斜面菌种转接到50ml培养液中，于20℃振荡培养至对数生长期备用；
[0039]
⑤
工作菌液的制备：吸取一定量培养好的摇瓶菌液于3％nacl溶液中，充分搅拌，
稀释程度以控制空白发光强度在700～800mv为宜；
[0040]
⑥
毒性(15min-ec
50
)测定：将待测化合物配成7个浓度梯度，各取2.0ml加入具塞磨口比色管，以2.0ml 3％nacl溶液作空白对照(平行设3组)。将培养好的菌液磁力搅拌均匀后，取0.5ml于各比色管中混匀，暴露15min时用dxy-2型生物毒性测试仪测定发光强度，计算相对抑制率。计算公式如下：
[0041][0042]
将抑制率与待测化合物的浓度进行回归分析，建立剂量-效应曲线，根据回归方程求出相应的50％抑制时的效应浓度ec
50
，其中回归方程横坐标为浓度，纵坐标为抑制率。
[0043]
(3)应用materials studio 8.0软件进行分子动力学模拟正辛醇和磷脂双分子层的体系总能量、单独物质能以及相互作用能。
[0044]
以磷酸三(2-氯乙基)酯(tcep)和磷酸三乙酯(tep)为目标污染物，利用分子动力学模型分别对c8h
18
o-tcep、dppc-tcep、c8h
18
o-tep和dppc-tep四种体系进行模型构建与优化、模拟作用过程和计算相互作用能，相互作用能的大小则反映了吸附过程的自发性及吸附后的稳定性。采用dxy-2型生物毒性测试仪测得tcep和tep的发光菌ec
50
值，利用毒性数据(发光菌ec
50
)验证替代结果的合理性，详细数据见表1。
[0045]
表1tcep和tep的有关参数
[0046][0047]
根据发光菌ec
50
越小，毒性越大结论得出tcep毒性大于tep毒性。对tcep和tep毒性作用模式进行判断，根据反应型化合物的毒性显著高于麻醉型化合物，表明tcep为典型的反应型化合物，tcep本身或者其代谢产物与生物体中存在的生物大分子发生生物化学反应，对发光菌产生毒性作用。反之，tep为麻醉型化合物，通过分配作用产生毒性。表1四种体系的相互作用能数据表明：tcep和tep的相互作用能e均呈负值且e
dppc-tcep
《e
dppc-tep
。无论生物膜是正辛醇还是dppc，tcep体系的相互作用能总小于tep体系。结果表明tcep与正辛醇和dppc分子间吸附能力不稳定，跨膜行为难以发生，tcep直接与生物分子发生生物化学反应产生毒性进而跨膜。而tep更容易跨膜，直接通过正辛醇的分配作用进入生物体。
[0048]
结合毒性机制判断与相互作用能e进行对比分析得到以下结论：tcep毒性越大，相互作用能e越小，分子是以反应作用为主导产生毒性效应完成跨膜，表现为反应型化合物，毒性与相互作用能呈负相关性。tep是以分配作用为主导产生毒性效应完成跨膜，表现为麻醉型化合物。因此计算所得的实验结果获得与实验室试验结果相符合的结论，可以利用正辛醇替代dppc研究污染物与生物膜间的相互作用。
[0049]
以磷酸三(1，3-二氯-2-丙基)酯(tdcp)和磷酸三(丁氧基乙基)酯(tbep)为目标污染物，采用materials studio 8.0软件，利用分子动力学对污染物与c8h
18
o和dppc构建反应模型体系并计算相互作用能，采用毒性测试仪测得tdcp和tbep的发光菌ec
50
值，详细污染物参数见表2。
[0050]
表2tdcp和tbep的有关参数
[0051][0052]
表2中发光菌ec
50
数据看出tdcp毒性》tbep毒性，因此tdcp表现为反应型化合物，直接与生物分子发生反应产生毒性；tbep表现为麻醉型化合物，整个毒性作用过程中没有与有机体的各个靶位发生生物化学反应，而是通过化合物与细胞膜之间的某种非共价作用，改变了细胞膜的结构和功能，进而对有机体产生毒性作用。
[0053]
对正辛醇和dppc两种膜的四个复合物体系中相互作用能e对比显示：tdcp和tbep的相互作用能均呈负值，和e
dppc-tdcp
》e
dppc-tbep
。结果表明，tbep跨膜难以发生，是通过正辛醇的分配作用进行跨膜；tdcp跨膜更容易，它是与生物分子发生生物化学反应产生毒性作用完成跨膜。
[0054]
从毒性与相互作用能两者综合分析可以得到一致的结论。tdcp毒性大时，相互作用能e也增大。tdcp与tbep相比，其吸附能力稳定，更容易跨过生物膜与生物体发生反应后产生毒性效应，表现为反应型化合物，毒性与相互作用能呈正相关性。因此正辛醇可以成为替代dppc的拟有机相，为随后研究污染物与生物膜间的跨膜作用和毒性机制提供快速简便的方法。
[0055]
本发明在避免使用生物暴露进行污染物毒性作用潜在性研究的可能性基础上，提出了一种提高污染物与生物膜之间相互作用预测效率的替代方法，通过引入拟有机相正辛醇，采用分子动力学模拟算法计算相互作用能，分析污染物与正辛醇之间的吸附跨膜行为。相较于结构复杂的模型膜dppc，可以有效降低体系算法的复杂性，实现了短时间内快速计算出污染物与生物膜间相互作用的预测效果。本发明为广大研究者分析污染物跨膜和毒性作用提供简便快速的计算方法，以及可用于预测验证的非使用生物试验的替代试验方法。
[0056]
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
[0057]
参考文献
[0058]
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[0059]
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[0060]
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[0061]
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