替莫唑胺中N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺的残留量测定的制作方法

替莫唑胺中n-亚硝基二甲胺和n-亚硝基二乙胺的残留量测定
技术领域：
1.本发明涉及一种化学药物中杂质成分的分析和检测方法，特别涉及一种抗肿瘤药物替莫唑胺中杂质成分n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的含量测定方法。


背景技术：

2.替莫唑胺(temozolomide，tmz)是一个1999年上市的口服抗肿瘤药物，化学名为：3，4-二氢-3-甲基-4-氧代咪唑并[5，1-d]-1，2，3，5-四嗪-8-酰胺。分子量为194.15，适应症为多形性胶质细胞瘤和退行性星型细胞瘤等神经胶质细胞瘤的二线治疗。
[0003]
替莫唑胺在合成路线如下：
[0004][0005]
反应式中，以4-氨基-5-氨基甲酰基咪唑(aic)为原料，经重氮化反应生成4-重氮基-5-氨基甲酰基咪唑内鎓盐(dic)，再与异氰酸甲酯环合生成替莫唑胺。
[0006]
在上述合成路线中，终产物替莫唑胺中可能存在的杂质为aic和dic。另外合成过程还可能产生以下结构的杂质化合物：
[0007][0008]
替莫唑胺酸(tza)和3,4-二氢-4-氧代咪唑并[5,1-d]-1,2,3,5-四嗪(ahx)，以及n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)。
[0009]
为保证替莫唑胺原料药产品质量，有必要对替莫唑胺原料药中含有的所有杂质成分进行检测，但现有技术没有对成分n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)在检测方法，本发明对此进行了开发研究。


技术实现要素：

[0010]
本发明提供了一种液相-质谱联用仪(lc-ms/ms)测定替莫唑胺中杂质n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的残留量的方法，本方法在开发过程中比较了不同梯度对替莫唑胺中杂质ndma和ndea残留量测定的影响，后续将对该分析方法进行方法学验证，确定该测定方法在指定的测定系统下可以用于替莫唑胺中ndma和ndea的测定，保证基因毒性杂质检测数据的准确性，可以用于产品的质量研究。
[0011]
本发明提供一种测定替莫唑胺中杂质n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺
(ndea)的残留量的方法，所述方法，步骤如下：
[0012]
步骤1，对照品溶液的配制：
[0013]
取ndma对照品约10-15mg，精密称定，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndma对照品储备液；
[0014]
取ndea对照品约15-20mg，精密称定，置10ml量瓶中,用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液2ml，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndea对照品储备液；
[0015]
分别精密量取ndma对照品储备液和ndea对照品储备液各1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀作为标准限度对照品溶液；
[0016]
步骤2，供试品溶液的配置：
[0017]
取替莫唑胺供试品约40-60mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水溶解，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0018]
步骤3，测定法：
[0019]
分别取标准限度对照品溶液、供试品溶液注入高效液相-质谱联用仪，记录色图谱，按外标法以峰面积计算供试品中n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的残留量。
[0020]
其中，n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的残留量(residual)的计算方法如下：
[0021][0022]
astd：6针标准限度对照品溶液中待测物峰面积均值；
[0023]
as：供试品溶液中待测物峰面积；
[0024]
cstd：标准限度对照品溶液的浓度(ng/ml)；
[0025]
cs：供试品溶液的浓度(mg/ml)。
[0026]
其中，色谱条件如下：
[0027]
液相色谱系统：thermo vanquish uhplc；色谱柱：agilent zorbax plus c18(100mm*3.0mm*1.8μm)；流速为0.4-0.6ml/min；进样量为35-45μl；柱温为30-40℃；流动相：有机相:甲醇；水相:超纯水；梯度洗脱程序见表1：
[0028]
表1：梯度洗脱表
[0029]
时间(min)水相(％)有机相(％)09553955840608.195511955
[0030]
质谱系统：thermo tsq altis质谱仪；离子源：apci源；扫描方式：srm正离子模式；采集时间：1.5～3min：ndma，6.5～9min：ndea；放电电流：4μa；鞘气：45arb；辅助气：5arb；尾
吹气：0arb；离子源温度：275℃；接口温度：300℃；化合物母离子，碎片离子和化合物参数见表2：
[0031]
表2：离子模式、母离子、子离子、碰撞电压等参数
[0032]
化合物离子模式母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞电压(v)备注ndma正离子755810定性离子ndma正离子754413定量离子ndea正离子1034717定量离子ndea正离子1032913定性离子ndea正离子103759定性离子
[0033]
优选的，本发明的制备方法，步骤如下：
[0034]
步骤1，对照品溶液的配制：
[0035]
取ndma对照品约12.5mg，精密称定，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndma对照品储备液；
[0036]
取ndea对照品约17.5mg，精密称定，置10ml量瓶中,用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液2ml，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndea对照品储备液；
[0037]
分别精密量取ndma对照品储备液和ndea对照品储备液各1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀作为标准限度对照品溶液；
[0038]
步骤2，供试品溶液的配置：
[0039]
取替莫唑胺供试品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水溶解，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0040]
步骤3，测定法：
[0041]
分别取标准限度对照品溶液、供试品溶液注入高效液相-质谱联用仪，记录色图谱，按外标法以峰面积计算供试品中n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的残留量。
[0042]
本发明的检测方法，是经过筛选得到的，筛选过程如下：
[0043]
一、方法开发
[0044]
1溶解度
[0045]
本方法考察了替莫唑胺样品和待测物在不同溶剂中的溶解度，结果表明，替莫唑胺样品在水中溶解度较好，样品在水中的溶解度可达8mg/ml。考虑到饱和溶液中样品易析出，因此确定样品最终浓度为5mg/ml。
[0046]
2实验方法建立
[0047]
2.1初步确定实验方法为：
[0048]
2.1.1溶液配制
[0049]
空白溶液：水。
[0050]
标准限度对照品溶液：分别取ndma和ndea对照品适量，精密称定，加空白溶剂溶解并稀释制成每1ml约含ndma 1.25ng、ndea 0.35ng的溶液，该溶液为标准限度对照品溶液。
[0051]
2.1.2仪器方法
[0052]
色谱柱agilent zorbax plus c18；流速0.5ml/min；进样量40μl；柱温35℃；流动相a超纯水；流动相b乙腈；梯度洗脱程序见表3：
[0053]
表3：梯度洗脱表
[0054][0055][0056]
离子源apci，扫描方式srm正离子模式，m/z：，具体参数见表4：
[0057]
表4：离子模式、母离子、子离子、碰撞电压等参数
[0058]
化合物母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞电压(v)备注ndma755810定性离子ndma754413定量离子ndea1034717定量离子ndea1032913定性离子ndea103759定性离子
[0059]
离子源温度275℃，接口温度300℃，质谱采集时间ndma 1.5-4.0min；ndea 4.0-9.0min。
[0060]
2.1.3色谱图
[0061]
2.1.3.1空白图谱(见图1)
[0062]
2.1.3.2标准限度对照品图谱(见图2)
[0063]
2.1.4结论
[0064]
空白溶剂在待测物处无干扰，ndma的保留时间为：2.19min；ndea的保留时间为：6.96min。下一步考察主成分在该色谱条件下的出峰位置。
[0065]
2.2方法1
[0066]
2.2.1仪器方法，同2.1.2
[0067]
2.2.2溶液配制
[0068]
空白溶液：水。
[0069]
供试品溶液：取替莫唑胺样品约50mg，精密称顶，置10ml容量瓶中，用空白溶液溶解，定容至刻度，摇匀，该溶液为供试品溶液。
[0070]
2.2.3色谱图
[0071]
2.2.3.1替莫唑胺样品图谱(见图3)
[0072]
2.2.4结论
[0073]
替莫唑胺样品出峰位置与ndma和ndea出峰位置(如图2所示)不同，可通过调节质谱采集时间(0-11min)，避免来自主成分的基质干扰。下一步确定最终梯度条件。
[0074]
2.3方法2
[0075]
2.3.1仪器方法，同2.1.2，不同之处是：
[0076]
梯度洗脱程序见表5：
[0077]
表5：梯度洗脱表
[0078]
时间(min)a(％)b(％)09553955840608.159511595
[0079]
2.3.2溶液配制
[0080]
空白溶液：水。
[0081]
标准限度对照品溶液：分别取ndma和ndea对照品适量，精密称定，加空白溶剂溶解并稀释制成每1ml约含ndma 1.25ng、ndea 0.35ng的溶液，该溶液为标准限度对照品溶液。
[0082]
供试品溶液：取替莫唑胺样品约50mg，精密称顶，置10ml容量瓶中，用空白溶液溶解，定容至刻度，摇匀，该溶液为供试品溶液。
[0083]
标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺样品约50mg，精密称顶，置10ml容量瓶中，用标准限度对照品溶液溶解，定容至刻度，摇匀，该溶液为标准限度添加供试品溶液。
[0084]
2.3.3图谱
[0085]
2.3.3.1空白图谱(同图1)
[0086]
2.3.3.2标准限度对照品图谱(同图2)
[0087]
2.3.3.3供试品图谱(见图4，供试品图谱)
[0088]
2.3.3.4标准限度添加供试品图谱(图5)
[0089]
2.3.4结论
[0090]
空白溶液和供试品溶液在待测物处无干扰，可用于替莫唑胺中ndma和ndea的检测。该方法缩短了分析时间，但对于待测物质无影响。后续将对该方法进行方法学验证。
[0091]
二、结论
[0092]
本发明最终确定的替莫唑胺中ndma和ndea的分析方法为：
[0093]
测定法取ndma对照品约12.5mg，精密称定，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndma对照品储备液。
[0094]
取ndea对照品约17.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液2ml，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndea对照品储备液。
[0095]
分别精密量取ndma对照品储备液和ndea对照品储备液各1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀作为标准限度对照品溶液。
[0096]
取替莫唑胺供试品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水溶解，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0097]
分别取标准限度对照品溶液、供试品溶液进样，记录图谱。按外标法以峰面积计算，供试品中ndma不超过0.25ppm，ndea不超过0.07ppm。
[0098][0099]
astd：6针标准限度对照品溶液中待测物峰面积均值；
[0100]
as：供试品溶液中待测物峰面积；
[0101]
cstd：标准限度对照品溶液的浓度(ng/ml)；
[0102]
cs：供试品溶液的浓度(mg/ml)。
[0103]
色谱条件液相系统：thermo vanquish uhplc；色谱柱：agilent zorbax plus c18(100mm*3.0mm*1.8μm)；流速为0.5ml/min；进样量为40μl；柱温为35℃；流动相：有机相:甲醇；水相:超纯水；梯度洗脱程序见表6：
[0104]
表6：梯度洗脱表
[0105]
时间(min)水相(％)有机相(％)09553955840608.195511955
[0106]
质谱条件质谱仪：thermo tsq altis质谱仪；离子源：apci源；扫描方式：srm正离子模式；采集时间：1.5～3min：ndma，6.5～9min：ndea；放电电流：4μa；鞘气：45arb；辅助气：5arb；尾吹气：0arb；离子源温度：275℃；接口温度：300℃；化合物母离子，碎片离子和化合物参数如下：
[0107]
表7：离子模式、母离子、子离子、碰撞电压等参数
[0108][0109][0110]
三、方法验证
[0111]
替莫唑胺中ndma和ndea的分析方法为液质联用法(lc-ms/ms)，方法验证的内容包括：系统适用性、专属性、检测限和定量限、线性与范围、精密度(进样精密度和重复性)、中间精密度、准确度、稳定性及耐用性。
[0112]
表8，方法学验证结果总结
[0113][0114][0115]
1.分析条件
[0116]
1.1仪器
[0117]
表9，仪器设备
[0118][0119]
1.2试剂
[0120]
表10，试剂
[0121]
名称级别厂家批号水超纯水milli-q20200504甲醇色谱纯默克i1046707936
[0122]
1.3对照品和供试品
[0123]
表11，对照品和供试品
[0124][0125][0126]
1.4限度
[0127]
按外标法以峰面积计算，替莫唑胺杂质控制检测方法中供试品溶液中替莫唑胺浓度为5mg/ml，供试品中ndma不超过0.25ppm，定量限至少为0.075ppm，检测限至少为0.038ppm；供试品中ndea不超过0.07ppm，定量限至少为0.021ppm，检测限至少为0.011ppm。如果计算结果大于定量限，报告结果为其计算值；如果计算结果小于定量限，大于检测限，报告为未达定量限；如果计算结果小于检测限，报告为未检出。
[0128]
表12，限度汇总表
[0129][0130]
2.方法学验证项目及结果
[0131]
2.1系统适用性
[0132]
2.1.1溶液配制
[0133]
空白溶液：水。
[0134]
ndma对照品储备液-1：取ndma对照品约12.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为ndma对照品储备液-1。
[0135]
ndea对照品储备液-1：取ndea对照品约17.5mg，精密称定，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为ndea对照品储备液-1。
[0136]
ndea对照品储备液-2：精密量取ndea对照品储备液-1 2ml，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，作为ndea对照品储备液-2。
[0137]
混合对照品储备液-1：分别精密量取ndma对照品储备液-1和ndea对照品储备液-2各1ml，置100ml量瓶中，用空白溶液稀释，定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液-1。
[0138]
混合对照品储备液-2：精密量取混合对照品储备液-1 1ml，置100ml量瓶中，用空白溶液稀释，定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液-2。
[0139]
标准限度对照品溶液：精密量取混合对照品储备液-2 1ml，置100ml量瓶中，用空白溶液稀释，定容至刻度，摇匀，作为标准限度对照品溶液。
[0140]
2.1.2结果
[0141]
具体结果见表13。
[0142]
表13，系统适用性结果
[0143]
no.ndma峰面积ndma保留时间(min)ndea峰面积ndea保留时间(min)1175771.8965706.852170411.8970596.853194181.8966266.854180591.8971126.855184561.8967796.866177481.8767526.85rsd(％)4.550.443.280.06
[0144]
2.1.3结论
[0145]
空白溶液于待测物保留时间处无干扰，标准限度对照品溶液连续进样6针，ndma和ndea峰面积rsd不大于15％，保留时间rsd不大于2％，系统适用性良好。
[0146]
2.2专属性
[0147]
2.2.1溶液配制
[0148]
供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用“2.1.1”项下的空白溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0149]
标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中,用“2.1.1”项下的标准限度对照品溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为标准限度添加供试品溶液。
[0150]
其余溶液配制同“2.1.1”项溶液配制部分。
[0151]
2.2.2结果
[0152]
空白溶液不干扰ndma的测定，待测物ndma无相邻峰干扰；空白溶液不干扰ndea的测定，待测物ndea无相邻峰干扰。本方法专属性良好。
[0153]
2.2.3结论
[0154]
空白溶液不干扰待测物测定，ndma和ndea无相邻峰干扰，符合要求。
[0155]
2.3定量限和检测限
[0156]
2.3.1溶液配制
[0157]
取“2.1.1”项下的标准限度对照品溶液，逐级稀释后进样，以信噪比s/n≥3时的检测溶液作为检测限溶液，以信噪比s/n≥10时的检测溶液，作为定量限溶液。
[0158]
其余溶液配制同“2.1.1”项溶液配制部分。
[0159]
2.3.2结果
[0160]
具体结果见表14～表15。
[0161]
表14，检测限结果
[0162][0163]
表15，定量限结果
[0164][0165]
2.3.3结论
[0166]
ndma检测限浓度为0.1901ng/ml，其色谱峰信噪比均不小于3；定量限浓度为0.3802ng/ml,连续进样6针，峰面积rsd为8.30％，且色谱峰信噪比均不小于10；ndea检测限浓度为0.0493ng/ml，其色谱峰信噪比均不小于3；定量限浓度为0.0985ng/ml，连续进样6针，峰面积rsd为9.41％，且色谱峰信噪比均不小于10。符合要求。
[0167]
2.4线性与范围
[0168]
2.4.1溶液配制
[0169]
混合对照品储备液-3：精密量取“2.1.1”项下的混合对照品储备液-22ml，置20ml量瓶中，用“2.1.1”项下的空白溶液稀释，定容至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液-3。
[0170]
线性测试溶液：分别精密量取混合对照品储备液-3适量，置相应量瓶中，用“2.1.1”项下的空白溶剂稀释，定容至刻度，摇匀，配制六份线性测试溶液。具体过程见下表。
[0171]
表16，线性测试溶液配制方法
[0172]
线性水平移取混合对照品储备液-3的体积(ml)量瓶体积30％使用3.3.1项下定量限溶液—50％2.55080％0.810100％使用3.1.1项下标准限度对照品溶液—150％7.550200％210
[0173]
其余溶液配制同“2.1.1”项溶液配制部分。
[0174]
2.4.2结果
[0175]
具体结果见表17。
[0176]
表17，线性结果
[0177][0178]
2.4.3结论
[0179]
ndma在0.3802ng/ml～2.5344ng/ml浓度范围内，线性方程为y＝14595.73x 481.84，其相关系数r为0.9993，ndma线性关系良好；ndea在0.0985ng/ml～0.6570ng/ml浓度范围内，线性方程为y＝23578.93x-193.52，其相关系数r为0.9990，ndea线性关系良好。
[0180]
2.5精密度(进样精密度和重复性)
[0181]
2.5.1溶液配制
[0182]
标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用“2.1.1”项下的标准限度对照品溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为标准限度添加供试品溶液(平行配制六份)。
[0183]
其余溶液配制同“2.1.1”项溶液配制部分。
[0184]
2.5.2结果
[0185]
具体结果见表18～表19。
[0186]
表18，进样精密度结果
[0187][0188]
表19，重复性结果
[0189][0190]
2.5.3结论
[0191]
ndma标准限度对照品溶液连续进样6针，待测物峰面积的rsd为4.55％，保留时间rsd为0.43％；6针标准限度添加的供试品溶液的待测物含量rsd为6.74％；ndea标准限度对照品溶液连续进样6针,待测物峰面积的rsd为3.28％，保留时间rsd为0.06％；6针标准限度添加的供试品溶液的待测物含量rsd为3.58％，符合要求。本方法进样精密度、重复性均良好。
[0192]
2.6中间精密度
[0193]
2.6.1溶液配制
[0194]
标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中,用“2.1.1”项下的标准限度对照品溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为标准限度添加供试品溶液(平行配制六份)。
[0195]
其余溶液配制同“2.1.1”项溶液配制部分。
[0196]
2.6.2结果
[0197]
具体结果见表20～表21。
[0198]
表20，进样精密度结果
[0199][0200]
表21，中间精密度结果
[0201]
[0202][0203]
2.6.3结论
[0204]
ndma标准限度对照品溶液连续进样6针，待测物峰面积的rsd为4.94％，保留时间rsd为0.44％；6针标准限度添加供试品溶液的待测物含量rsd为4.39％，12针标准限度添加的供试品溶液的待测物含量rsd为5.49％；ndea标准限度对照品溶液连续进样6针，待测物峰面积的rsd为4.98％，保留时间rsd为0.12％；6针标准限度添加供试品溶液的待测物含量rsd为7.51％，12针标准限度添加的供试品溶液的待测物含量rsd为5.61％。本方法中间精密度良好。
[0205]
2.7准确度
[0206]
2.7.1溶液配制
[0207]
供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用“2.1.1”项下的空白溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液，平行配制两份。
[0208]
定量限添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用“2.3.1”项下的定量限溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为定量限添加供试品溶液，平行配制三份。
[0209]
50％标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用“2.4.1”项下的50％线性水平测试溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作
为50％标准限度添加供试品溶液，平行配制三份。
[0210]
100％标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用“2.1.1”项下的标准限度对照品溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为100％标准限度添加供试品溶液，平行配制三份。
[0211]
150％标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用“3.4.1”项下的150％线性水平测试溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为150％标准限度添加供试品溶液，平行配制三份。
[0212]
其余溶液配制同“2.1.1”项溶液配制部分。
[0213]
2.7.2回收率计算公式
[0214][0215]
2.7.3结果
[0216]
具体结果见表22。
[0217]
表22，准确度结果
[0218][0219]
[0220]
2.7.4结论
[0221]
ndma回收率范围为91.92％～112.21％，在70％～125％之间；三个水平(50％、100％、150％)回收率rsd为4.64％；ndea回收率范围为95.68％～118.04％，在70％～125％之间；三个水平(50％、100％、150％)回收率rsd为5.55％。本方法准确度良好。
[0222]
2.8稳定性
[0223]
2.8.1溶液配制
[0224]
标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称定，置10ml量瓶中,用“2.1.1”项下的标准限度对照品溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为标准限度添加供试品溶液。
[0225]
其余操作同“2.1.1”项溶液配制部分。
[0226]
2.8.2结果
[0227]
具体结果见表23。
[0228]
表23，稳定性结果
[0229][0230][0231]
2.8.3结论
[0232]
22小时内，标准限度对照品溶液中ndma峰面积相对于0h峰面积比值在100.39％～108.80％之间，标准限度添加供试品溶液中ndma峰面积相对于0h峰面积比值在91.11％～99.01％之间，ndma在标准限度对照品溶液、标准限度添加供试品溶液在22h内稳定；标准限度对照品溶液中ndea峰面积相对于0h峰面积比值在92.57％～104.00％之间，标准限度添加供试品溶液中ndea峰面积相对于0h峰面积比值在92.64％～103.12％之间，ndea在标准限度对照品溶液、标准限度添加供试品溶液在22h内稳定。
[0233]
2.9耐用性
[0234]
2.9.1溶液配制
[0235]
标准限度添加供试品溶液：取替莫唑胺供试品(批号：20191201)约50mg，精密称
定，置10ml量瓶中,用“2.1.1”项下的标准限度对照品溶液溶解，定容至刻度，摇匀，作为标准限度添加供试品溶液。
[0236]
其余操作同“2.1.1”项溶液配制部分。
[0237]
2.9.2耐用性条件
[0238]
正常条件：同“1”项中分析方法部分
[0239]
条件1：降低流速至0.48ml/min，其余同正常条件
[0240]
条件2：增加流速至0.52ml/min，其余同正常条件
[0241]
条件3：降低柱温至33℃，其余同正常条件
[0242]
条件4：升高柱温至37℃，其余同正常条件
[0243]
2.9.3结果
[0244]
具体结果见表24～表25。
[0245]
表24，不同条件下系统适用性结果
[0246][0247][0248]
表25，不同条件下耐用性结果
[0249][0250]
2.9.4结论
[0251]
不同条件下ndma系统适用性符合要求，标准限度添加供试品溶液中ndma含量的rsd为5.89％；不同条件下ndea系统适用性符合要求，标准限度添加供试品溶液中ndea含量的rsd为3.66％。本方法耐用性良好。
附图说明：
[0252]
图1：空白溶剂图，其中为上图为ndma，下图为ndea；
[0253]
图2：初步确定时的标准限度对照品图谱，其中为上图为ndma，下图为ndea；
[0254]
图3：替莫唑胺用空白溶剂溶解时得到的图谱；
[0255]
图4：方法2筛选时得到的供试品图谱；
[0256]
图5：方法2筛选时得到的准限度添加供试品图谱；
[0257]
图6：对照品标准图谱，其中为上图为ndma，下图为ndea。
具体实施方式：
[0258]
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
[0259]
实施例1
[0260]
对3个批次替莫唑胺原料药样品中ndma和ndea的残留量进行测定
[0261]
步骤1，对照品溶液的配制：
[0262]
取ndma对照品约12.5mg，精密称定，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndma对照品储备液。
[0263]
取ndea对照品约17.5mg，精密称定，置10ml量瓶中,用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液2ml，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndea对照品储备液。
[0264]
分别精密量取ndma对照品储备液和ndea对照品储备液各1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀作为标准限度对照品溶液。
[0265]
步骤2，供试品溶液的配置：
[0266]
取替莫唑胺供试品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水溶解，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0267]
步骤3，测定法：
[0268]
分别取标准限度对照品溶液、供试品溶液注入高效液相-质谱联用仪，记录色图谱(对照品图谱见图6，供试品溶液图谱见图3)，按外标法以峰面积计算供试品中n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的残留量。
[0269]
其中，n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的残留量的计算方法如下：
[0270][0271]
astd：6针标准限度对照品溶液中待测物峰面积均值；
[0272]
as：供试品溶液中待测物峰面积；
[0273]
cstd：标准限度对照品溶液的浓度(ng/ml)；
[0274]
cs：供试品溶液的浓度(mg/ml)。
[0275]
其中，色谱条件如下：
[0276]
液相色谱系统：thermo vanquish uhplc；色谱柱：agilent zorbax plus c18(100mm*3.0mm*1.8μm)；流速为0.5ml/min；进样量为40μl；柱温为35℃；流动相：有机相:甲醇；水相:超纯水；梯度洗脱程序如下：
[0277]
表26：梯度洗脱表
[0278]
时间(min)水相(％)有机相(％)09553955840608.195511955
[0279]
质谱系统：thermo tsq altis质谱仪；离子源：apci源；扫描方式：srm正离子模式；采集时间：1.5～3min：ndma，6.5～9min：ndea；放电电流：4μa；鞘气：45arb；辅助气：5arb；尾吹气：0arb；离子源温度：275℃；接口温度：300℃；化合物母离子，碎片离子和化合物参数如下：
[0280]
表27，离子模式、母离子、子离子、碰撞电压等参数
[0281]
化合物离子模式母离子(m/z)子离子(m/z)碰撞电压(v)备注ndma正离子755810定性离子ndma正离子754413定量离子ndea正离子1034717定量离子ndea正离子1032913定性离子ndea正离子103759定性离子
[0282]
具体结果见表28，
[0283]
表28，测样结果
[0284][0285]
实施例2
[0286]
步骤1，对照品溶液的配制：
[0287]
取ndma对照品约10mg，精密称定，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndma对照品储备液；
[0288]
取ndea对照品约15mg，精密称定，置10ml量瓶中,用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液2ml，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndea对照品储备液；
[0289]
分别精密量取ndma对照品储备液和ndea对照品储备液各1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀作为标准限度对照品溶液；
[0290]
步骤2，供试品溶液的配置：
[0291]
取替莫唑胺供试品约40mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水溶解，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0292]
步骤3，测定法：
[0293]
分别取标准限度对照品溶液、供试品溶液注入高效液相-质谱联用仪，记录色图谱，按外标法以峰面积计算供试品中n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的残留量。
[0294]
实施例3
[0295]
步骤1，对照品溶液的配制：
[0296]
取ndma对照品约15mg，精密称定，置于10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndma对照品储备液；
[0297]
取ndea对照品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中,用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液2ml，置10ml量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，摇匀作为ndea对照品储备液；
[0298]
分别精密量取ndma对照品储备液和ndea对照品储备液各1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀；再精密量取上述溶液1ml，置100ml量瓶中，用水稀释，定容至刻度，摇匀作为标准限度对照品溶液；
[0299]
步骤2，供试品溶液的配置：
[0300]
取替莫唑胺供试品约60mg，精密称定，置10ml量瓶中，用水溶解，定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
[0301]
步骤3，测定法：
[0302]
分别取标准限度对照品溶液、供试品溶液注入高效液相-质谱联用仪，记录色图
谱，按外标法以峰面积计算供试品中n-亚硝基二甲胺(ndma)和n-亚硝基二乙胺(ndea)的残留量。