合成rig-i样受体激动剂
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月23日提交的美国临时专利申请序列号62/925,120的权益。所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
背景技术：
3.引入细胞中的外源核酸，尤其是病毒核酸，诱导先天免疫反应，导致干扰素(ifn)产生和细胞死亡等事件。在感知病毒rna后，rig-i样受体诱导i型干扰素(ifn)分泌，导致受感染和邻近细胞中抗病毒ifn诱导的蛋白质上调，从而抑制病毒复制。进一步的下游事件吸引免疫细胞并触发适应性免疫反应。另外，据报道，rig-i配体诱导许多不同类型肿瘤细胞的凋亡，但不诱导正常细胞的凋亡。
4.病毒样颗粒(vlp)是由一种或多种类型的许多蛋白质分子以对称方式构建的超分子结构。它们缺乏病毒基因组，因此是非传染性的。vlp通常可通过异源表达大量产生，并且可容易地进行纯化。
5.由于vlp的结构特性和非传染性，它们被用于疫苗学、免疫学和医学领域。已经证明vlp可有效地呈现在mhc i类分子上，因为它们可能在被微胞饮作用或其他细胞摄取途径摄取后，被有效地加工并交叉引发到mhc i类分子上。
6.仍然需要另外的并且改进的组合物和方法来调节免疫调节蛋白的活性。此类剂可用于癌症免疫疗法和其他病状(诸如慢性感染)的治疗。需要开发改进的rig-i样受体配体，包括改进的递送方法，以用于多种治疗性免疫调节应用。
技术实现要素：
7.本公开至少部分地基于充当rig-i样受体(rlr)激动剂的合成rna分子的发现。本公开还提供了用于通过将免疫刺激性核酸，特别是rlr激动剂，包装到vlp(rig-vlp)中来提高生物学活性的组合物和方法。本文所述的组合物可用于诱导强烈和持续的免疫反应，尤其可用于治疗肿瘤。
8.因此，在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
9.(a)病毒样颗粒；和
10.(b)至少一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中rlr激动剂包含长度为10-100个核苷酸的核糖核酸(rna)，其中rna的最靠5
′
的(5
′
most)核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中至少一种rlr激动剂被包装在病毒样颗粒中。
11.在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
12.(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
13.(b)至少一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中rlr激动剂包含长度为10-100个核苷酸的核糖核酸(rna)，其中rna的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中至少一种rlr激动剂被包装在病
毒样颗粒中。
14.在任何前述或相关方面，rna是单链的。在其他方面，一些或所有的rna是双链的。
15.在任何前述或相关方面，rlr激动剂的rna的长度为10-15、15-20、20-25、25-30或30-35个核苷酸。
16.在任何前述或相关方面，rlr激动剂包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一多核苷酸与第二多核苷酸充分互补以形成双链体。在一些方面，双链体包括发夹。在一些方面，双链体包含10-15、15-20、20-25、25-30或30-35个碱基对。在一些方面，双链体包含少于19个碱基对。在一些方面，第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸。
17.在任何前述或相关方面，rlr激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种由所述rlr介导的生物学活性。
18.在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
19.(a)病毒样颗粒；和
20.(b)至少一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，并且其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性。在一些方面，第一多核苷酸包含序列基序，其中至少一种rlr激动剂被包装在病毒样颗粒中。
21.在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
22.(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
23.(b)至少一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，并且其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性。在一些方面，第一多核苷酸包含序列基序，其中至少一种rlr激动剂被包装在病毒样颗粒中。
24.在任何前述或相关方面，rlr激动剂包含选自由以下组成的组的序列基序：
25.(i)gt重复基序；
26.(ii)ga重复基序；
27.(iii)aucg重复基序；
28.(iv)au重复基序；
29.(v)双嘧啶基序；
30.(vi)双嘌呤基序；
31.(vii)嘧啶三联体基序；
32.(viii)嘌呤三联体基序；
33.(ix)回文序列基序；和
34.(x)(i)-(ix)中任一项的组合。
35.在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
36.(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
37.(b)至少一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，并且其中所述激动剂包含选自以下的序列基序：
38.(i)gt重复基序；
39.(ii)ga重复基序；
40.(iii)aucg重复基序；
41.(iv)au重复基序；
42.(v)双嘧啶基序；
43.(vi)双嘌呤基序；
44.(vii)嘧啶三联体基序；
45.(viii)嘌呤三联体基序；
46.(ix)回文序列基序；和
47.(x)(i)-(ix)中任一项的组合，其中至少一种rlr激动剂被包装在病毒样颗粒中。
48.在一些方面，本公开的rlr激动剂包含序列基序的组合。在一些方面，序列基序的组合是gt重复基序和嘌呤三联体基序。在一些方面，序列基序的组合是aucg重复基序和双嘧啶基序。在一些方面，序列基序的组合是aucg重复基序和双嘌呤基序。
49.在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由rlr介导的生物学活性，其中至少一种改善的生物学活性选自：
50.(i)rlr介导的细胞因子产生增加；
51.(ii)rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；
52.(iii)rlr介导的胞内信号传导增加；
53.(iv)对rlr的结合亲和力增加；和
54.(v)(i)-(iv)中任一项的组合。
55.在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序增加rlr介导的i型干扰素(例如，ifn-α、ifn-β)产生。在一些方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序增加rlr介导的il-1β产生。在一些方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序增加rlr介导的ip-10产生。在一些方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序增加rlr介导的il-6、il-12p70、mcp-1和/或mip-1β产生。
56.在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中所述序列基序
是gt重复基序(例如，gtgtgt)，其包含＜19、约15-18、约15、约10-15、约10、约5-10、约5、约4、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含＜19个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含约15-18个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含约15个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含约10-15个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含约10个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含约5-10个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含约5个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含约4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，gt重复基序在rlr激动剂中提供改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
57.在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中所述序列基序是gt重复基序，其包含18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含18个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含16个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含14个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含12个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含10个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含8个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含6个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其包含4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中所述序列基序是gt重复基序，其中gt重复基序是[gt]n，其中n＝2至9、3-7或4-8。在一些方面，gt重复基序在rlr激动剂中提供改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0058]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0059]
(a)病毒样颗粒；和
[0060]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至(可操作地连接至)第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序
的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，其中所述第一多核苷酸包含所述序列基序，并且其中所述序列基序是包含约14个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的序列的gt重复基序，其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0061]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0062]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0063]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至(可操作地连接至)第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，其中所述第一多核苷酸包含所述序列基序，并且其中所述序列基序是包含约14个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的序列的gt重复基序，其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0064]
在一些方面，序列基序是gt重复基序，其中gt重复基序是[gt]7。在一些方面，改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0065]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0066]
(a)病毒样颗粒；和
[0067]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，其中所述第一多核苷酸包含所述序列基序，并且其中所述序列基序是包含6个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的序列的gt重复基序，其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0068]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0069]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0070]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，其中所述第一多核苷酸包含所述序列基序，并且其中所述序列基序是包含6个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的序列的gt重复基序，其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0071]
在一些方面，序列基序是gt重复基序，其中gt重复基序是[gt]3。在一些方面，序列基序是gt重复基序，其中gt重复基序是[gt]3，并且其中gt重复的后面分别是嘌呤三联体和ucg。在一些方面，嘌呤三联体是gga。在一些方面，改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子
产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0072]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中所述序列基序是ga重复基序(例如，gagaga)，其包含《19、约15-18、约15、约10-15、约10、约5-10、约5、约4、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含＜19个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含约15-18个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含约15个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含约10-15个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含约10个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含约5-10个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含约5个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含约4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，ga重复基序在rlr激动剂中提供改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0073]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，所述序列基序是ga重复基序，其包含18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含18个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含16个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含14个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含12个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含8个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含6个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是ga重复基序，其包含4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。
[0074]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中所述序列基序是ga重复基序，其中ga重复基序是[ga]n，其中n＝2至9、3至7或4至8。在一些方面，ga重复基序在rlr激动剂中提供改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0075]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0076]
(a)病毒样颗粒；和
[0077]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基
对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，其中所述第一多核苷酸包含所述序列基序，并且其中所述序列基序是包含约14个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸的序列的ga重复基序，其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0078]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0079]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0080]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，其中所述第一多核苷酸包含所述序列基序，并且其中所述序列基序是包含约14个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸的序列的ga重复基序，其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0081]
在一些方面，序列基序是ga重复基序，其中ga重复基序是[ga]7。在一些方面，ga重复基序在rlr激动剂中提供改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0082]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中所述序列基序是aucg重复基序(例如，aucgaucg)，其包含＜19、约16、约12-16、约12、约8-12、约6、16、12、8个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含＜19个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含约16个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含约12-16个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含约12个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含约8-12个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含约6个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含16个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含12个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其包含8个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，aucg重复基序在rlr激动剂中提供改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0083]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中所述序列基序
是aucg重复基序，其中aucg重复基序是[aucg]n，其中n＝2至4或2、3或4。在一些方面，aucg重复基序在rlr激动剂中提供改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0084]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0085]
(a)病毒样颗粒；和
[0086]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，其中所述第一多核苷酸包含所述序列基序，并且其中所述序列基序是包含约12个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸的序列的aucg重复基序。在一些方面，aucg重复基序是[aucg]3，其中至少一种rlr激动剂被包装在病毒样颗粒中。
[0087]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0088]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0089]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，其中所述第一多核苷酸包含所述序列基序，并且其中所述序列基序是包含约12个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸的序列的aucg重复基序。在一些方面，aucg重复基序是[aucg]3，其中至少一种rlr激动剂被包装在病毒样颗粒中。
[0090]
在一些方面，aucg重复基序在rlr激动剂中提供改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0091]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中所述基序的前面是cg或双嘧啶基序。在一些方面，aucg重复基序的前面是cg。在一些方面，aucg重复基序是[aucg]3并且前面是cg。在一些方面，aucg重复基序是[aucg]3并且前面是cc。
[0092]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中所述基序的前面是双嘌呤基序。在一些方面，双嘌呤基序是ga。在一些方面，aucg重复基序是[aucg]3并且前面是双嘌呤基序ga。在一些方面，aucg重复基序的前面是双嘌呤基序ii。
[0093]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中一个或多个尿苷核苷(u)被修饰的核苷取代。在一些方面，其中修饰的核苷是核糖胸苷(t)。在一些方面，augc重复基序是[aucg]3，其中一个或多个组成aucg重复基序的尿苷核苷(u)被修饰的核苷取代，其中修饰的核苷是核糖胸苷(t)。在一些方面，augc重复基序是[aucg]3，其中一
个或多个组成aucg重复基序的尿苷核苷(u)被修饰的核苷取代，其中修饰的核苷是核糖胸苷(t)，并且其中augc重复基序的前面是gg。
[0094]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中一个或多个鸟苷核苷(g)被修饰的核苷取代。在一些方面，修饰的核苷是肌苷(i)。在一些方面，augc重复基序是[aucg]3，其中一个或多个组成aucg重复基序的鸟苷核苷(g)被修饰的核苷取代，其中修饰的核苷是核糖胸苷(t)，并且其中augc重复基序的前面是gg。
[0095]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中所述基序的前面是ig。在一些方面，aucg重复基序是[aucg]3并且前面是ig。
[0096]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含aucg重复，其中一个或多个鸟苷核苷(g)被肌苷(i)取代，其中aucg重复的前面是肌苷(i)。在一些方面，组成aucg重复的鸟苷核苷(g)被肌苷(i)取代，其中aucg重复的前面是肌苷(i)，其中第一多核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含肌苷(i)。
[0097]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中aucg重复基序是[aucg]2。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其中aucg重复基序是[aucg]2，并且其中aucg重复基序的前面是双嘌呤基序。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其中aucg重复基序是[aucg]2，其中aucg重复基序的前面是双嘌呤基序，并且其中双嘌呤基序是gg。
[0098]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中aucg重复基序是[aucg]2，并且其中aucg重复基序的前面是嘌呤三联体基序。在一些方面，嘌呤三联体基序是ggg。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其中aucg重复基序是[aucg]2，其中aucg重复基序的前面是嘌呤三联体基序，并且其中嘌呤三联体基序是ggg。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其中aucg重复基序是[aucg]2，并且其中aucg重复基序的前面是cccccg。在一些方面，序列基序是aucg重复基序，其中aucg重复基序是[aucg]2，并且其中aucg重复基序的前面是tcgucg。
[0099]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0100]
(a)病毒样颗粒；和
[0101]
(b)至少一种特异性结合至rlr的合成rlr激动剂，其中激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中第一多核苷酸与第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中双链体包含少于19个碱基对，其中第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中激动剂包含[aucg]n重复基序，其中n＝2-4；其中最靠5
′
的aucg重复基序的前面是gg、cg或ig，并且其中至少一种rlr激动剂被包装在病毒样颗粒中。在一些方面，n＝3。在一些方面，aucg基序中的每个g被肌苷取代。
[0102]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0103]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0104]
(b)至少一种特异性结合至rlr的合成rlr激动剂，其中激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中第一多核苷酸与第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中双链体包含少于19个碱基对，其中第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中激动剂包含[aucg]n重复基序，其中n＝2-4；其中最靠5
′
的aucg重复基序的前面是gg、cg或ig，并且
其中至少一种rlr激动剂被包装在病毒样颗粒中。在一些方面，n＝3。在一些方面，aucg基序中的每个g被肌苷取代。
[0105]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中所述序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的＜19、约15-18、约15、约10-15、约10、约18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的＜19个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的约15-18个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的约15个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的约10-15个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的约10个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的18个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的17个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的16个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的15个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的14个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的13个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的12个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的11个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的10个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的9个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的8个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的7个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的6个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的5个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些方面，序列基序是回文序列，其包含以产生回文的任何顺序连接的4个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。
[0106]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含接头，其中接头侧接有au。在一些方面，接头侧接有au重复基序，其中au重复基序是[au]n，其中n＝2至3。在一些方面，au重复基序是[au]2。
[0107]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0108]
(a)病毒样颗粒；和
[0109]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0110]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0111]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0112]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0113]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0114]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0115]
(v)n2与n3碱基配对；
[0116]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0117]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0118]
(viii)x1与x2互补；
[0119]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0120]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0121]
其中n1、n2、n3和n4中的至少一个是肌苷并且/或者x1和/或x2中的至少一个包含至少一个肌苷核苷，并且其中所述肌苷核苷与所述发夹rna中的胞苷碱基配对，
[0122]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0123]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0124]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0125]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0126]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0127]
(iv)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0128]
(v)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0129]
(vi)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0130]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0131]
(v)n2与n3碱基配对；
[0132]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0133]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0134]
(viii)x1与x2互补；
[0135]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0136]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0137]
其中n1、n2、n3和n4中的至少一个是肌苷并且/或者x1和/或x2中的至少一个包含至少一个肌苷核苷，并且其中所述肌苷核苷与所述发夹rna中的胞苷碱基配对，
[0138]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0139]
在一些方面，本公开的rlr激动剂具有改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0140]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0141]
(a)病毒样颗粒；和
[0142]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，并且其中所述激动剂包含下式：
[0143]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0144]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0145]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0146]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0147]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0148]
(v)n2与n3碱基配对；
[0149]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0150]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0151]
(viii)x1与x2互补；
[0152]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0153]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头，
[0154]
其中如果存在的话，肌苷与胞苷碱基配对，
[0155]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0156]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0157]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0158]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，并且其中所述激动剂包含下式：
[0159]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0160]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0161]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0162]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0163]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0164]
(v)n2与n3碱基配对；
[0165]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0166]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0167]
(viii)x1与x2互补；
[0168]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0169]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头，
[0170]
其中如果存在的话，肌苷与胞苷碱基配对，
[0171]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0172]
在一些方面，本公开的rlr激动剂具有改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内
信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0173]
在一些方面，n1包含肌苷并且n4包含胞苷。在一些方面，n1包含肌苷并且n4包含胞苷，并且x1和x2的长度各自为12个核苷酸。在一些方面，n1包含胞苷并且n4包含肌苷。在一些方面，n2包含肌苷并且n3包含胞苷。在一些方面，n2包含胞苷并且n3包含肌苷。在一些方面，n1包含鸟苷。在一些方面，n2包含鸟苷。在一些方面，n1包含胞苷。在一些方面，n2包含胞苷。在一些方面，n1和n2包含鸟苷并且n3和n4包含胞苷。在一些方面，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含鸟苷。在一些方面，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷。在一些方面，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含肌苷。
[0174]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含下式：
[0175]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0176]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0177]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0178]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0179]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0180]
(v)n2与n3碱基配对；
[0181]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0182]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0183]
(viii)x1与x2互补；
[0184]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0185]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头，
[0186]
其中如果存在的话，肌苷与胞苷碱基配对，并且其中n1包含肌苷并且n4包含胞苷，并且x1和/或x2各自包含至少一个肌苷。在一些方面，n2包含肌苷并且n3包含胞苷，并且x1和/或x2各自包含至少一个肌苷。在一些方面，n1和n2包含鸟苷，n3和n4包含胞苷，并且x1和/或x2各自包含至少一个肌苷。在一些方面，n1和n2包含鸟苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和x2各自包含至少一个肌苷。在一些方面，n1和n2包含鸟苷并且n3和n4包含胞苷，x1和x2各自包含至少一个肌苷，并且x1和x2的长度各自为12个核苷酸。在一些方面，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含鸟苷，并且x1和x2各自包含至少一个肌苷。在一些方面，n1和n2包含鸟苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和x2各自包含肌苷且不包含鸟苷核苷。在一些方面，n1和n2包含鸟苷并且n3和n4包含胞苷，x1和x2各自包含至少一个肌苷，并且x1和x2的长度各自为12个核苷酸。在一些方面，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含鸟苷，并且x1和x2各自包含肌苷且不包含鸟苷核苷。在一些方面，本公开的rlr激动剂具有改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0187]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含下式：
[0188]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0189]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0190]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0191]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0192]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0193]
(v)n2与n3碱基配对；
[0194]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0195]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0196]
(viii)x1与x2互补；
[0197]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0198]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头，
[0199]
其中如果存在的话，肌苷与胞苷碱基配对，并且其中n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和/或x2各自包含至少一个肌苷。在一些方面，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷，x1和x2各自包含至少一个肌苷，并且x1和x2的长度各自为12个核苷酸。在一些方面，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和x2各自包含至少一个肌苷。在一些方面，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷，x1和x2各自包含至少一个肌苷，并且x1和x2的长度各自为12个核苷酸。在一些方面，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含肌苷，并且x1和/x2各自包含至少一个肌苷。在一些方面，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和x2包含肌苷且不包含鸟苷核苷。在一些方面，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含肌苷，并且x1和x2包含肌苷且不包含鸟苷核苷。在一些方面，本公开的rlr激动剂具有改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0200]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含下式：
[0201]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中x1和x2各自为12个核苷酸并且包含1、2、3或4个肌苷核苷。在一些方面，x1和x2各自为13个核苷酸并且包含1、2、3、4或5个肌苷核苷。在一些方面，x1和x2各自为14个核苷酸并且包含1、2、3、4、5或6个肌苷核苷。在一些方面，x1和x2各自为15个核苷酸并且包含1、2、3、4、5、6或7个肌苷核苷。在一些方面，x1和x2各自为16个核苷酸并且各自包含1、2、3、4、5、6、7或8个肌苷核苷。在一些方面，x1和x2各自为12个核苷酸并且包含至少10％、20％、30％或40％的肌苷核苷。在一些方面，本公开的rlr激动剂具有改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0202]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0203]
(a)病毒样颗粒；和
[0204]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0205]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0206]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0207]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0208]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺
苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0209]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0210]
(v)n2与n3碱基配对；
[0211]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0212]
(vii)x1包含序列基序[aucn5]
x
，其中n5包含鸟苷或肌苷，其中x是整数，其值表示序列基序的数目，并且其中x＝2-4；
[0213]
(viii)x2包含序列基序[cn6au]y，其中n6包含鸟苷或肌苷，其中y是整数，其值表示序列基序的数目，并且其中y＝2-4；
[0214]
(ix)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0215]
任选地，其中n1、n2、n3和n4中的至少一个是肌苷，并且其中所述肌苷核苷与所述发夹rna中的胞苷碱基配对，
[0216]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0217]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0218]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0219]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0220]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0221]
(iv)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0222]
(v)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0223]
(vi)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0224]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0225]
(v)n2与n3碱基配对；
[0226]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0227]
(vii)x1包含序列基序[aucn5]
x
，其中n5包含鸟苷或肌苷，其中x是整数，其值表示序列基序的数目，并且其中x＝2-4；
[0228]
(viii)x2包含序列基序[cn6au]y，其中n6包含鸟苷或肌苷，其中y是整数，其值表示序列基序的数目，并且其中y＝2-4；
[0229]
(ix)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0230]
任选地，其中n1、n2、n3和n4中的至少一个是肌苷，并且其中所述肌苷核苷与所述发夹rna中的胞苷碱基配对，
[0231]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0232]
在一些方面，n5包含肌苷并且n6包含肌苷。在一些方面，n5包含鸟苷并且n6包含肌苷。在一些方面，n5包含肌苷并且n6包含鸟苷。在一些方面，n5包含鸟苷(g)并且n6包含鸟苷(g)。在一些方面，x＝2并且y＝2。在一些方面，x＝3并且y＝3。在一些方面，x＝4并且y＝4。在一些方面，n1包含肌苷(i)并且n4包含胞苷(c)。在一些方面，n2包含肌苷(i)并且n3包含胞苷(c)。在一些方面，n3包含肌苷(i)并且n2包含胞苷(c)。在一些方面，n4包含肌苷(i)并且n1包含胞苷(c)。在一些方面，n1包含鸟苷(g)。在一些方面，n2包含鸟苷(g)。在一些方面，n1包含胞苷(c)。在一些方面，n2包含胞苷(c)。在一些方面，n1和n2包含鸟苷(g)并且n3和n4
包含胞苷(c)。在一些方面，n1和n2包含胞苷(c)并且n3和n4包含鸟苷(g)。在一些方面，n1和n2包含肌苷(i)并且n3和n4包含胞苷(c)。在一些方面，n1和n2包含胞苷(c)并且n3和n4包含肌苷(i)。在一些方面，本公开的rlr激动剂具有改善的生物学活性，其中改善的生物学活性是rlr介导的细胞因子产生的增加；rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；rlr介导的胞内信号传导增加；对rlr的结合亲和力增加；以及上述任一项的组合。
[0233]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含接头，其中接头是核苷酸接头或非核苷酸接头。在一些方面，接头是非核苷酸接头。在一些方面，接头是核苷酸接头。在一些方面，核苷酸接头包含四环，其中四环的核苷酸序列选自由以下组成的组：
[0234]
(a)uncg，其中n＝a、c、g或u；
[0235]
(b)gnra，其中n＝a、c、g或u，并且其中r＝a或g；
[0236]
(c)anya，其中n＝a、c、g或u，并且其中y＝c或t；
[0237]
(d)cuyg，其中y＝c或t；
[0238]
(e)umac，其中m＝a或c；和
[0239]
(f)cuug。
[0240]
在一些方面，四环的序列是uucg。在一些方面，四环的序列是gauc。
[0241]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含核苷酸接头，其中核苷酸接头包含核苷酸序列uuugau或uguuu。在一些方面，核苷酸接头包含核苷酸序列uuugau。在一些方面，核苷酸接头包含核苷酸序列uguuu。
[0242]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含非核苷酸接头，其中非核苷酸接头选自由以下组成的组：
[0243]
(a)乙二醇接头；和
[0244]
(b)烷基接头。
[0245]
在一些方面，非核苷酸接头是六乙二醇接头。在一些方面，非核苷酸接头是c9烷基接头。
[0246]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含5
′
二磷酸部分或者其衍生物或类似物。在一些方面，激动剂包含5
′
三磷酸部分或者其衍生物或类似物。在一些方面，5
′
二磷酸或三磷酸部分的衍生物或类似物包含选自以下的磷酸酯生物电子等排体：膦酸酯、硫代膦酸酯、硫代磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、噻唑烷酮、羧酸酯、丙二酸酯、硼酸、苯并氧杂硼戊环、硼代磷酸酯、方酰胺(squaramide)。
[0247]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂包含修饰核苷酸、修饰核苷或修饰核碱基或其组合。在一些方面，激动剂包含对核苷酸间键联或对多核苷酸主链的修饰。
[0248]
在任何前述或相关方面，本公开的rlr激动剂表现出以下特性中的一种或多种：
[0249]
(a)特异性结合至一种或多种rlr(例如，rig-1、mda5和/或lgp2)；
[0250]
(b)增加rlr介导的细胞因子产生；
[0251]
(c)增加rlr介导的干扰素刺激基因(isg)的表达；
[0252]
(d)增加rlr依赖性胞内信号传导；
[0253]
(e)增加双链体的稳定性；
[0254]
(f)增加对rlr的结合亲和力；
[0255]
(g)减少脱靶结合；
[0256]
(h)延长生物半衰期；
[0257]
(i)增加生物分布和生物利用度；
[0258]
(j)增加并且/或者增强向细胞和/或组织中的摄取；
[0259]
(k)降低免疫原性；和
[0260]
(l)(a)-(k)中任一项的组合。
[0261]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0262]
(a)病毒样颗粒；和
[0263]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0264]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0265]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0266]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0267]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0268]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0269]
(v)n2与n3碱基配对；
[0270]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0271]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0272]
(viii)x1与x2互补；
[0273]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0274]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0275]
其中n1和n2各自包含鸟苷，其中n3和n4各自包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，其中x1和x2各自包含至少一个肌苷核苷，其中肌苷核苷与发夹rna中的胞苷碱基配对，并且其中l包含有包含四环的核苷酸接头，其中四环的核苷酸序列是uucg，
[0276]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0277]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0278]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0279]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0280]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0281]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0282]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0283]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0284]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0285]
(v)n2与n3碱基配对；
[0286]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0287]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞
苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0288]
(viii)x1与x2互补；
[0289]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0290]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0291]
其中n1和n2各自包含鸟苷，其中n3和n4各自包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，其中x1和x2各自包含至少一个肌苷核苷，其中肌苷核苷与发夹rna中的胞苷碱基配对，并且其中l包含有包含四环的核苷酸接头，其中四环的核苷酸序列是uucg，
[0292]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0293]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0294]
(a)病毒样颗粒；和
[0295]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0296]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0297]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0298]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0299]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0300]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0301]
(v)n2与n3碱基配对；
[0302]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0303]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0304]
(viii)x1与x2互补；
[0305]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0306]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0307]
其中n1包含肌苷并且n2包含鸟苷，其中n3和n4各自包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，其中x1和x2各自包含至少一个肌苷核苷，其中肌苷核苷与发夹rna中的胞苷碱基配对，并且其中l包含有包含四环的核苷酸接头，其中四环的核苷酸序列是uucg，
[0308]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0309]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0310]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0311]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0312]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0313]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0314]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0315]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0316]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0317]
(v)n2与n3碱基配对；
[0318]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0319]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0320]
(viii)x1与x2互补；
[0321]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0322]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0323]
其中n1包含肌苷并且n2包含鸟苷，其中n3和n4各自包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，其中x1和x2各自包含至少一个肌苷核苷，其中肌苷核苷与发夹rna中的胞苷碱基配对，并且其中l包含有包含四环的核苷酸接头，其中四环的核苷酸序列是uucg，
[0324]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0325]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0326]
(a)病毒样颗粒；和
[0327]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0328]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0329]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0330]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0331]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0332]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0333]
(v)n2与n3碱基配对；
[0334]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0335]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0336]
(viii)x1与x2互补；
[0337]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0338]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0339]
其中n1和n2包含肌苷，并且n3和n4包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，其中x1和x2各自包含至少一个肌苷核苷，其中肌苷核苷与发夹rna中的胞苷碱基配对，并且其中l包含有包含四环的核苷酸接头，其中四环的核苷酸序列是uucg，
[0340]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0341]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0342]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0343]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0344]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0345]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0346]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0347]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0348]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0349]
(v)n2与n3碱基配对；
[0350]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0351]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0352]
(viii)x1与x2互补；
[0353]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0354]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0355]
其中n1和n2包含肌苷，并且n3和n4包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，其中x1和x2各自包含至少一个肌苷核苷，其中肌苷核苷与发夹rna中的胞苷碱基配对，并且其中l包含有包含四环的核苷酸接头，其中四环的核苷酸序列是uucg，
[0356]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0357]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0358]
(a)病毒样颗粒；和
[0359]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，并且其中所述激动剂包含下式：
[0360]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0361]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0362]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0363]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0364]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0365]
(v)n2与n3碱基配对；
[0366]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0367]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0368]
(viii)x1与x2互补；
[0369]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0370]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头，
[0371]
其中n1和n2包含鸟苷，其中n3和n4包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，并且其中非核苷酸接头是c9烷基接头，
[0372]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0373]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0374]
(a)病毒样颗粒；和
[0375]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，并且其中所述激动剂包含下式：
[0376]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0377]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0378]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0379]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0380]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0381]
(v)n2与n3碱基配对；
[0382]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0383]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0384]
(viii)x1与x2互补；
[0385]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0386]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头，
[0387]
其中n1和n2包含鸟苷，其中n3和n4包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，并且其中非核苷酸接头是六乙二醇接头，
[0388]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0389]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0390]
(a)病毒样颗粒；和
[0391]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，并且其中激动剂包含选自由seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36组成的组的核苷酸序列，
[0392]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0393]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0394]
(a)病毒样颗粒；和
[0395]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0396]
(i)分别为seq id no：37和68；
[0397]
(ii)分别为seq id no：38和69；
[0398]
(iii)分别为seq id no：39和70；
[0399]
(iv)分别为seq id no：40和71；
[0400]
(v)分别为seq id no：41和72；
[0401]
(vi)分别为seq id no：42和73；
[0402]
(vii)分别为seq id no：43和74；
[0403]
(viii)分别为seq id no：44和75；
[0404]
(ix)分别为seq id no：45和76；
[0405]
(x)分别为seq id no：46和77；
[0406]
(xi)分别为seq id no：47和78；
[0407]
(xii)分别为seq id no：48和79；
[0408]
(xiii)分别为seq id no：49和80；
[0409]
(xiv)分别为seq id no：50和81；
[0410]
(xv)分别为seq id no：51和82；
[0411]
(xvi)分别为seq id no：52和83；
[0412]
(xvii)分别为seq id no：53和84；
[0413]
(xviii)分别为seq id no：54和85；
[0414]
(xix)分别为seq id no：55和86；
[0415]
(xx)分别为seq id no：56和87；
[0416]
(xxi)分别为seq id no：57和88；
[0417]
(xxii)分别为seq id no：58和89；
[0418]
(xxiii)分别为seq id no：59和89；
[0419]
(xxiv)分别为seq id no：60和90；
[0420]
(xxv)分别为seq id no：61和91；
[0421]
(xxvi)分别为seq id no：62和92；
[0422]
(xxvii)分别为seq id no：63和91；
[0423]
(xxviii)分别为seq id no：64和93；
[0424]
(xxix)分别为seq id no：65和94；
[0425]
(xxx)分别为seq id no：66和95；
[0426]
(xxxi)分别为seq id no：67和96；以及
[0427]
(xxxii)分别为seq id no：63和97，
[0428]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0429]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0430]
(a)病毒样颗粒；和
[0431]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含至少一个或多个包含与胞苷碱基配对的肌苷的核苷酸的平端发夹rna，并且其中激动剂包含选自由seq id no：22、23和25组成的组的核苷酸序列，
[0432]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0433]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0434]
(a)病毒样颗粒；和
[0435]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含至少一个或多个包含与胞苷碱基配对的肌苷的核苷酸的平端发夹rna，其中所述激动剂包含式5
′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中(n
1-n
2-x1)包含第一多核苷酸并且(x
2-n
3-n4)包含第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0436]
(i)分别为seq id no：58和89；
[0437]
(ii)分别为seq id no：59和89；以及
[0438]
(iii)分别为seq id no：61和91，
[0439]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0440]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0441]
(a)病毒样颗粒；和
[0442]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，其中所述激动剂包含式5
′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中(n
1-n
2-x1)包含第一多核苷酸并且(x
2-n
3-n4)包含第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0443]
(i)分别为seq id no：37和68；
[0444]
(ii)分别为seq id no：38和69；
[0445]
(iii)分别为seq id no：39和70；
[0446]
(iv)分别为seq id no：40和71；
[0447]
(v)分别为seq id no：41和72；
[0448]
(vi)分别为seq id no：42和73；
[0449]
(vii)分别为seq id no：43和74；
[0450]
(viii)分别为seq id no：44和75；
[0451]
(ix)分别为seq id no：45和76；
[0452]
(x)分别为seq id no：46和77；
[0453]
(xi)分别为seq id no：47和78；
[0454]
(xii)分别为seq id no：48和79；
[0455]
(xiii)分别为seq id no：49和80；
[0456]
(xiv)分别为seq id no：50和81；
[0457]
(xv)分别为seq id no：51和82；
[0458]
(xvi)分别为seq id no：52和83；
[0459]
(xvii)分别为seq id no：53和84；
[0460]
(xviii)分别为seq id no：54和85；
[0461]
(xix)分别为seq id no：55和86；
[0462]
(xx)分别为seq id no：56和87；
[0463]
(xxi)分别为seq id no：57和88；
[0464]
(xxii)分别为seq id no：58和89；
[0465]
(xxiii)分别为seq id no：59和89；
[0466]
(xxiv)分别为seq id no：60和90；
[0467]
(xxv)分别为seq id no：61和91；
[0468]
(xxvi)分别为seq id no：62和92；
[0469]
(xxvii)分别为seq id no：63和91；
[0470]
(xxviii)分别为seq id no：64和93；
[0471]
(xxix)分别为seq id no：65和94；
[0472]
(xxx)分别为seq id no：66和95；
[0473]
(xxxi)分别为seq id no：67和96；以及
[0474]
(xxxii)分别为seq id no：63和97，
[0475]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0476]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0477]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0478]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，并且其中所述激动剂包含下式：
[0479]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0480]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0481]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0482]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0483]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0484]
(v)n2与n3碱基配对；
[0485]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0486]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0487]
(viii)x1与x2互补；
[0488]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0489]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头，
[0490]
其中n1和n2包含鸟苷，其中n3和n4包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，并且其中非核苷酸接头是c9烷基接头，
[0491]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0492]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0493]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0494]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，并且其中所述激动剂包含下式：
[0495]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0496]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0497]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0498]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0499]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0500]
(v)n2与n3碱基配对；
[0501]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0502]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0503]
(viii)x1与x2互补；
[0504]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0505]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头，
[0506]
其中n1和n2包含鸟苷，其中n3和n4包含胞苷，其中x1和x2的长度各自为12个核苷酸，并且其中非核苷酸接头是六乙二醇接头，
[0507]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0508]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0509]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0510]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，并且其中所述激动剂包含选自由seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36组成的组的核苷酸序列，
[0511]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0512]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0513]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0514]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一寡核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0515]
(i)分别为seq id no：37和68；
[0516]
(ii)分别为seq id no：38和69；
[0517]
(iii)分别为seq id no：39和70；
[0518]
(iv)分别为seq id no：40和71；
[0519]
(v)分别为seq id no：41和72；
[0520]
(vi)分别为seq id no：42和73；
[0521]
(vii)分别为seq id no：43和74；
[0522]
(viii)分别为seq id no：44和75；
[0523]
(ix)分别为seq id no：45和76；
[0524]
(x)分别为seq id no：46和77；
[0525]
(xi)分别为seq id no：47和78；
[0526]
(xii)分别为seq id no：48和79；
[0527]
(xiii)分别为seq id no：49和80；
[0528]
(xiv)分别为seq id no：50和81；
[0529]
(xv)分别为seq id no：51和82；
[0530]
(xvi)分别为seq id no：52和83；
[0531]
(xvii)分别为seq id no：53和84；
[0532]
(xviii)分别为seq id no：54和85；
[0533]
(xix)分别为seq id no：55和86；
[0534]
(xx)分别为seq id no：56和87；
[0535]
(xxi)分别为seq id no：57和88；
[0536]
(xxii)分别为seq id no：58和89；
[0537]
(xxiii)分别为seq id no：59和89；
[0538]
(xxiv)分别为seq id no：60和90；
[0539]
(xxv)分别为seq id no：61和91；
[0540]
(xxvi)分别为seq id no：62和92；
[0541]
(xxvii)分别为seq id no：63和91；
[0542]
(xxviii)分别为seq id no：64和93；
[0543]
(xxix)分别为seq id no：65和94；
[0544]
(xxx)分别为seq id no：66和95；
[0545]
(xxxi)分别为seq id no：67和96；以及
[0546]
(xxxii)分别为seq id no：63和97，
[0547]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0548]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0549]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0550]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含至少一个或多个包含与胞苷碱基配对的肌苷的核苷酸的平端发夹rna，并且其中所述激动剂包含选自由seq id no：22、23和25组成的组的核苷酸序列，
[0551]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0552]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0553]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0554]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含至少一个或多个包含与胞苷碱基配对的肌苷的核苷酸的平端发夹rna，其中所述激动剂包含式5
′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中(n
1-n
2-x1)包含第一多核苷酸并且(x
2-n
3-n4)包含第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0555]
(i)分别为seq id no：58和89；
[0556]
(ii)分别为seq id no：59和89；以及
[0557]
(iii)分别为seq id no：61和91，
[0558]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0559]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0560]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0561]
(b)至少一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中所述激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，其中所述激动剂包含式5
′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中(n
1-n
2-x1)包含第一多核苷酸并且(x
2-n
3-n4)包含第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0562]
(i)分别为seq id no：37和68；
[0563]
(ii)分别为seq id no：38和69；
[0564]
(iii)分别为seq id no：39和70；
[0565]
(iv)分别为seq id no：40和71；
[0566]
(v)分别为seq id no：41和72；
[0567]
(vi)分别为seq id no：42和73；
[0568]
(vii)分别为seq id no：43和74；
[0569]
(viii)分别为seq id no：44和75；
[0570]
(ix)分别为seq id no：45和76；
[0571]
(x)分别为seq id no：46和77；
[0572]
(xi)分别为seq id no：47和78；
[0573]
(xii)分别为seq id no：48和79；
[0574]
(xiii)分别为seq id no：49和80；
[0575]
(xiv)分别为seq id no：50和81；
[0576]
(xv)分别为seq id no：51和82；
[0577]
(xvi)分别为seq id no：52和83；
[0578]
(xvii)分别为seq id no：53和84；
[0579]
(xviii)分别为seq id no：54和85；
[0580]
(xix)分别为seq id no：55和86；
[0581]
(xx)分别为seq id no：56和87；
[0582]
(xxi)分别为seq id no：57和88；
[0583]
(xxii)分别为seq id no：58和89；
[0584]
(xxiii)分别为seq id no：59和89；
[0585]
(xxiv)分别为seq id no：60和90；
[0586]
(xxv)分别为seq id no：61和91；
[0587]
(xxvi)分别为seq id no：62和92；
[0588]
(xxvii)分别为seq id no：63和91；
[0589]
(xxviii)分别为seq id no：64和93；
[0590]
(xxix)分别为seq id no：65和94；
[0591]
(xxx)分别为seq id no：66和95；
[0592]
(xxxi)分别为seq id no：67和96；以及
[0593]
(xxxii)分别为seq id no：63和97，
[0594]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0595]
在任何前述或相关方面，包含rlr激动剂的核苷酸序列与基因组dna序列或mrna序列不互补，其中rlr激动剂不参与rna干扰，并且其中rlr激动剂不沉默基因表达。
[0596]
在任何前述或相关方面，本文所述的病毒样颗粒缺乏含脂蛋白的包膜。
[0597]
在任何前述或相关方面，本文所述的病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。在一些方面，重组病毒样颗粒选自由以下组成的组：
[0598]
(a)乙型肝炎病毒的重组蛋白；
[0599]
(b)麻疹病毒的重组蛋白；
[0600]
(c)辛德比斯病毒(sinbis virus)的重组蛋白；
[0601]
(d)轮状病毒的重组蛋白；
[0602]
(e)口蹄疫病毒的重组蛋白；
[0603]
(f)逆转录病毒的重组蛋白；
[0604]
(g)诺瓦克病毒(norwalk virus)的重组蛋白；
[0605]
(h)人乳头瘤病毒的重组蛋白；
[0606]
(i)bk病毒的重组蛋白；
[0607]
(j)噬菌体的重组蛋白；
[0608]
(k)rna噬菌体的重组蛋白；
[0609]
(l)qβ噬菌体的重组蛋白；
[0610]
(m)ga噬菌体的重组蛋白；
[0611]
(n)fr噬菌体的重组蛋白；
[0612]
(o)ap 205噬菌体的重组蛋白；
[0613]
(p)ty的重组蛋白；和
[0614]
(q)(a)至(p)的任何重组蛋白的片段。
[0615]
在任何前述或相关方面，本文所述的病毒样颗粒包含rna噬菌体的重组蛋白，其中所述rna噬菌体选自由以下组成的组：(a)噬菌体qβ；(b)噬菌体r17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体ga；(e)噬菌体sp；(f)噬菌体ms2；(g)噬菌体m11；(h)噬菌体mx1；(i)噬菌体nl95；(j)噬菌体f2；(k)噬菌体pp7；和(1)噬菌体ap205。
[0616]
在任何前述或相关方面，本文所述的病毒样颗粒包含噬菌体qβ的重组蛋白。在一些方面，噬菌体qβ的重组蛋白包含具有氨基酸序列seq id no：112的外壳蛋白。在一些方面，噬菌体qβ的重组蛋白包含具有与seq id no：112具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的外壳蛋白。
[0617]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0618]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒，其包含具有氨基酸序列seq id no：112的外壳蛋白；和
[0619]
(b)至少一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中所述rlr激动剂包含长度为10-100个核苷酸的核糖核酸(rna)，其中所述rna的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，
[0620]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0621]
在一些方面，本公开提供了一种组合物，其包含：
[0622]
(a)rna噬菌体qβ的病毒样颗粒；和
[0623]
(b)至少一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中所述激动剂包含核苷酸序列seq id no：23，并且其中所述激动剂的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，
[0624]
其中所述至少一种rlr激动剂被包装在所述病毒样颗粒中。
[0625]
在任何前述或相关方面，rlr激动剂与病毒颗粒非共价结合。
[0626]
在任何前述或相关方面，rlr激动剂与病毒样颗粒位点结合，所述病毒样颗粒位点选自由寡核苷酸结合位点、dna结合位点和rna结合位点组成的组。在一些方面，病毒样颗粒包含富含精氨酸的重复。
[0627]
在任何前述或相关方面，本文所述的组合物包含与病毒样颗粒结合的至少一个抗原或抗原决定簇。在一些方面，至少一个抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与病毒样颗粒结合。在一些方面，至少一个抗原或抗原决定簇通过非肽键与病毒样颗粒结合。在其他方面，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒融合。在一些方面，病毒样颗粒包含至少一个第一附接位点，并且其中抗原或抗原决定簇包含至少一个第二附接位点，所述第二附接位点选自由以下各项组成的组：(a)非天然存在于抗原或抗原决定簇内的附接位点；和(b)天然存在于抗原或抗原决定簇内的附接位点，并且
[0628]
其中所述抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒的结合通过所述第一附接位点与所述第二附接位点之间的缔合来实现，任选地其中所述缔合是通过至少一个非肽键。在一些方面，第一附接位点包含氨基或赖氨酸残基，并且其中第二附接位点包含巯基或半胱氨酸残基。
[0629]
在一些方面，本公开提供了一种用于刺激有需要的受试者的免疫反应、治疗其癌症或延缓其癌症的进展或者减少或抑制其肿瘤生长的药物组合物，其包含本公开提供的组合物和药学上可接受的载剂。在一些方面，组合物被配制在聚乙烯亚胺(pei)载剂中。在一些方面，pei载剂是
[0630]
在一些方面，本公开提供了一种增加细胞中rlr介导的一种或多种细胞因子的产生的方法，所述方法包括使细胞与本公开提供的组合物接触，其中组合物增加细胞中rlr介导的细胞因子产生。在一些方面，组合物增加细胞中rlr介导的i型干扰素(例如，ifn-α、ifn-β)产生。在一些方面，组合物增加细胞中rlr介导的il-1β产生。在一些方面，组合物增加细胞中rlr介导的ip-10产生。在一些方面，组合物增加细胞中rlr介导的il-6、il-12p70、mcp-1和/或mip-1β产生。
[0631]
在一些方面，本公开提供了一种增加细胞中rlr介导的一种或多种干扰素刺激基因的表达的方法，所述方法包括使细胞与本公开提供的组合物接触，其中组合物增加细胞中rlr介导的一种或多种干扰素刺激基因的表达。
[0632]
在一些方面，本公开提供了一种增加细胞中rlr依赖性胞内信号传导的方法，所述方法包括使细胞与本公开提供的组合物接触，其中组合物增加rlr依赖性胞内信号传导。
[0633]
在一些方面，本公开提供了一种刺激受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开提供的组合物。
[0634]
在一些方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症或延缓其癌症的进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开提供的组合物。
[0635]
在一些方面，本公开提供了一种减少或抑制有需要的受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开提供的组合物。
[0636]
在一些方面，本公开提供了一种用于刺激有需要的受试者的免疫反应、治疗其癌症或延缓其癌症的进展或抑制其肿瘤生长的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开提供的组合物，其中组合物增加细胞中rlr介导的一种或多种细胞因子的产生，增加细胞中rlr介导的一种或多种干扰素刺激基因的表达和/或增加细胞中rlr依赖性胞内信号传导，从而刺激免疫反应，治疗癌症或延缓癌症的进展或抑制肿瘤的生长。
[0637]
在一些方面，本公开提供的组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用，其中一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死
亡诱导剂、调理剂(例如，调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂或激动剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
[0638]
在一些方面，本公开提供的组合物在一种或多种另外的治疗剂的施用之前或之后施用，或者其中一种或多种另外的治疗剂与激动剂或药物组合物的施用同时、在其之前或之后施用。
[0639]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是pd-1/pd-l1拮抗剂、tim-3拮抗剂、vista拮抗剂、腺苷a2ar拮抗剂、b7-h3拮抗剂、b7-h4拮抗剂、btla拮抗剂、ctla-4拮抗剂、ido拮抗剂、kir拮抗剂、lag-3拮抗剂、toll样受体3(tlr3)激动剂、toll样受体7(tlr7)激动剂、toll样受体9(tlr9)激动剂。
[0640]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是包含特异性结合至cd137(4-1bb)的多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
[0641]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是包含特异性结合至cd134(ox40)的多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
[0642]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是pd-1/pd-l1拮抗剂。在一些方面，pd-1/pd-l1拮抗剂选自由以下组成的组：pdr001、(派姆单抗(pembrolizumab))、(纳武单抗(nivolumab))、匹地利珠单抗(pidilizumab)、medi0680、regn2810、tsr-042、pf-06801591和amp-224。在一些方面，pd-1/pd-l1拮抗剂选自由以下组成的组：faz053、(atezolizumab)、(avelumab)、(durvalumab)和bms-936559。
[0643]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是tim-3拮抗剂。
[0644]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是vista拮抗剂。
[0645]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是腺苷a2ar拮抗剂。
[0646]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是b7-h3拮抗剂。
[0647]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是b7-h4拮抗剂。
[0648]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是btla拮抗剂。
[0649]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是ctla-4拮抗剂。
[0650]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是ido拮抗剂。
[0651]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是kir拮抗剂。
[0652]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是lag-3拮抗剂。
[0653]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是toll样受体3(tlr3)激动剂。在一些方面，tlr3激动剂是聚肌苷：聚胞苷酸(poly i：c)。在一些方面，tlr3激动剂是(poly iclc)。在一些方面，tlr3激动剂是聚腺苷-聚尿苷酸(poly a：u)。在一些方面，tlr3激动剂是(100)。在一些方面，tlr3激动剂是(50生物缀合物)。在一些方面，tlr3激动剂是(50)。
[0654]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是toll样受体7(tlr7)激动剂。在一些方面，tlr7激动剂是gs-9620(vesatolimod)。在一些方面，tlr7激动剂是咪喹莫特
(imiquimod)(aldara
tm
)。在一些方面，tlr7激动剂是雷西莫特(resiquimod)(r-848)。
[0655]
在一些方面，一种或多种另外的治疗剂是toll样受体9(tlr9)激动剂。在一些方面，tlr9激动剂是cpg寡脱氧核苷酸(cpg odn)。在一些方面，cpg odn是a类cpg odn(cpg-a odn)。在一些方面，cpg odn是b类cpg odn(cpg-b odn)。在一些方面，cpg odn是c类cpg odn(cpg-c odn)。
[0656]
在一些方面，本公开提供了一种本公开提供的组合物用于刺激有需要的受试者的免疫反应、治疗其癌症或延缓其癌症的进展或抑制其肿瘤生长的用途，任选地与一种或多种另外的治疗剂组合使用。
[0657]
在一些方面，本公开提供了一种本公开提供的组合物在制造用于刺激有需要的受试者的免疫反应、治疗其癌症或延缓其癌症的进展或抑制其肿瘤生长的药物中的用途，任选地与一种或多种另外的治疗剂组合使用。在一些方面，组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用，其中一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如，调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。在一些方面，组合物在一种或多种另外的治疗剂的施用之前或之后施用，或者其中一种或多种另外的治疗剂与组合物的施用同时、在其之前或之后施用。
[0658]
在一些方面，本公开提供了一种药盒，其包括本公开提供的组合物和在刺激受试者的免疫反应、或治疗受试者的癌症或延缓其癌症的进展、或抑制其肿瘤生长中的使用说明，任选地有与一种或多种另外的治疗剂组合的使用说明。在一些方面，药盒包含用于与一种或多种另外的治疗剂组合施用组合物的说明书，其中一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如，调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。在一些方面，组合物在一种或多种另外的治疗剂的施用之前或之后施用，或者其中一种或多种另外的治疗剂与组合物的施用同时、在其之前或之后施用。
[0659]
在任何前述或相关方面，一种或多种另外的治疗剂是pd-1/pd-l1拮抗剂、tim-3拮抗剂、vista拮抗剂、腺苷a2ar拮抗剂、b7-h3拮抗剂、b7-h4拮抗剂、btla拮抗剂、ctla-4拮抗剂、ido拮抗剂、kir拮抗剂、lag-3拮抗剂、toll样受体3(tlr3)激动剂、toll样受体7(tlr7)激动剂、toll样受体9(tlr9)激动剂。
[0660]
在任何前述或相关方面，一种或多种另外的治疗剂是包含特异性结合至cd137(4-1bb)的多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
[0661]
在任何前述或相关方面，一种或多种另外的治疗剂是包含特异性结合至cd134(ox40)的多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
[0662]
在一些方面，本公开提供了一种产生如本文所述的组合物的方法，所述方法包括：
[0663]
(a)拆卸病毒样颗粒；
[0664]
(b)添加rlr激动剂；以及
[0665]
(c)重新组装病毒样颗粒。
[0666]
在一些方面，所述方法包括去除拆卸的病毒样颗粒的核酸。在一些方面，所述方法包括在重新组装后纯化组合物。在一些方面，所述方法包括(d)将抗原或抗原决定簇与病毒
样颗粒结合。在一些方面，在拆卸病毒样颗粒之前，将抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在其他方面，在重新组装病毒样颗粒之后，将抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。
附图说明
[0667]
图1提供了描绘细胞因子分泌的量化的条形图：来自用0.4nm、2nm和10nm包含各种修饰的rlr激动剂处理的人pbmc的ifn-α2a。
[0668]
图2提供了描绘用rig 50c(x24907)和肌苷取代的rig 27c(x24935)以0.2nm、2nm、20nm和200nm的浓度处理的人pbmc的ifn-α分泌的量化的条形图。
[0669]
图3提供了描绘用qβ-rig27(包装在带有rna噬菌体qβ外壳蛋白的vlp中的rig 27c)以2nm、20nm、200nm和600nm的浓度处理的人pbmc的ifn-α分泌的量化的条形图。
具体实施方式
[0670]
概述
[0671]
rig-i样受体(rlr)是细胞溶质模式识别受体家族，对于检测病毒rna和引发先天免疫反应至关重要。rlr家族包括三个成员：视黄酸诱导基因i(rig-i)、黑色素瘤分化相关基因5(mda5)和遗传学和生理学实验室2(laboratory of genetics and physiology2；lgp2)。这些受体在免疫和非免疫细胞类型中均表达，并调节促进i型和iii型干扰素(ifn)的irf3、irf7依赖性表达以及促炎细胞因子的nf-κb依赖性表达的信号传导通路。
[0672]
所有三种rlr家族受体都具有带有atp酶活性的dexd/h盒rna解旋酶结构域。这种结构域以及相邻的c末端结构域是rna结合所需要的。另外，rig-i和lgp2的c末端结构域已经证明可充当阻遏结构域，确保受体在与激活rna结合之前保持非活性构象。
[0673]
本公开提供包含合成rna分子的rlr激动剂，所述rna分子折叠以形成双链dsrna并且包含提供一种或多种改善的生物学活性的一种或多种序列基序。本公开还提供了一种包含包装在vlp中的至少一种rlr激动剂的组合物，并且与单独的vlp相比，展示出改善的免疫刺激效力，例如细胞因子表达的诱导。rig-vlp提供了改善的免疫刺激组合物，其用于针对例如肿瘤的预防或治疗方案。
[0674]
rig-i样受体及其配体
[0675]
本公开提供了特异性结合至rig-i样受体(rlr)并激动rlr(rlr激动剂)的合成rna配体。在一些方面，本公开提供了可用于治疗癌症的rlr激动剂。在一些方面，本公开提供了可用于治疗感染性疾病的rlr激动剂。在一些实施方案中，rlr激动剂诱导细胞因子产生。在一些实施方案中，rlr激动剂增加肿瘤微环境中cd8 t细胞的数目。在一些实施方案中，rlr激动剂诱导保护性抗肿瘤免疫。
[0676]
rig-i样受体(rlr)包含dexd/h盒rna解旋酶家族，它们充当细胞溶质模式识别受体(prr)，经由病原体相关分子模式(pamp)的识别来感知致病因子(pathogenic agent)的存在。具体地说，非自身(例如，病毒)rna的胞内存在经由rna与rlr的结合被感染细胞感知，并导致抗病毒免疫的引发和调节。与大多数病毒rna一样，内源性mrna和rna聚合酶iii转录物也是5
′‑
三磷酸化的，但真核mrna具有与在n7处甲基化的鸟苷连接的5
′
帽结构，其防止rig-i激活。病毒与自身rna之间的这些结构差异连同胞内定位的差异一起被认为能够通过优先检测病毒rna来实现rig-i作为对病毒感染的防御的有效功能。非自身rna配体与rlr的
分子识别和结合传播特定的胞内信号事件，最终激活驱动1型干扰素(ifn)产生和抗病毒基因表达的转录因子。rlr介导的ifn和炎性细胞因子产生以及抗病毒基因表达的诱导引出了控制病毒感染的免疫反应(yoneyama等人，(2015)curr opin immunol 32：48-53)。
[0677]
已鉴定出三个rlr家族成员：rig-i(视黄酸诱导基因i)——rlr家族的创始成员并且最具特色；mda5(黑色素瘤分化相关因子5)；和lgp2(遗传学和生理学实验室2以及小鼠d11lgp2的同源物)。rig-i是先天免疫系统的重要组成部分，并且在防御rna病毒感染中起关键作用。与检测一小部分免疫细胞的内体中的核酸的toll样受体tlr3、tlr7、tlr8和tlr9不同，rig-i是一种在所有细胞类型中均有表达的细胞溶质先天免疫受体(kato等人，(2006)nature 441(7089)：101-105；loo等人，(2008)j virol 82(1)：335-345)。两项早期研究独立地确定了rig-i特异性地检测病毒rna并被病毒rna激活(hornung等人，(2006)science 314(5801)：994-997；pichlmair等人，(2006)science 314(5801)：997-1001)。
[0678]
rig-i/配体复合物的高分辨率结构提供了rig-i与rna配体(特别是与激活配体双链5
′‑
三磷酸化rna(ppp-dsrna))结合的分子细节(civril等人，(2011)embo reports 12(11)：1127-1134；jiang等人，(2011)nature 479(7373)：423-427；kowalinski等人，(2011)cell 147(2)：423-435；lu等人，(2010)structure 18(8)：1032-1043；luo等人，(2011)cell 147(2)409-422；wang等人，(2010)nature structural&molecular biology 17(7)：781-787；hornung等人，(2006)science 314(5801)：994-997；pichlmair等人，(2006)science 314(5801)：997-1001；schlee等人，(2009)immunity 31(1)：25-34)。rig-i/rna复合物的晶体结构显示出蛋白质与主链而不是碱基结合，这表明rna序列可能不影响rig-i结合，或者rna序列可能表现出尚未表征的作用或活性。迄今为止，本领域未描述与rig-i样受体的序列依赖性差异相互作用或亲和力以及rig-i样受体激活的证据(schlee和hartmann(2010)molecular therapy 18(7)：1254-1262)。
[0679]
因此，本公开提供了一种包含非天然存在的、合成的和/或工程化的rlr rna配体的合成rig-i样受体(rlr)激动剂。在一些实施方案中，rlr激动剂包含长度为10-100个核苷酸的核糖核酸(rna)。在一些方面，rna的长度为10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85、85-90、90-95或95-100个核苷酸。
[0680]
在一些实施方案中，rlr激动剂可以是单链、单链(含有可形成双链体、茎环或发夹结构的自身互补序列)、双链或部分双链寡核苷酸。
[0681]
在一些实施方案中，双链寡核苷酸是完全双链的。在这种情况下，寡核苷酸由两个具有相同长度并且具有彼此100％互补的序列的单链寡核苷酸构成。
[0682]
在一些实施方案中，双链寡核苷酸是部分双链的。在这种情况下，形成寡核苷酸的两条链具有不同的长度、彼此不是100％互补的序列或两者。换句话讲，寡核苷酸的至少一个完全双链区段在一端或两端与单链结构连接。
[0683]
在一些实施方案中，双链体、发夹或茎环结构包含10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55个碱基对。
[0684]
在一些实施方案中，寡核苷酸形成包含少于19个碱基对的双链体。在一些实施方案中，双链体的互补碱基通过核苷酸或非核苷酸接头连接。
[0685]
在一些实施方案中，寡核苷酸是单链的、单链的(含有自身互补序列)或双链的，寡
核苷酸的长度是单链的长度。
[0686]
在一些方面，寡核苷酸是部分双链的，寡核苷酸的长度是较长链的长度。因此，本发明的寡核苷酸包括部分双链寡核苷酸，其中至少一条链的长度为10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85或85-90个核苷酸。
[0687]
在一些方面，寡核苷酸是双链或部分双链寡核苷酸，至少一条链包含至少一个5
′
二磷酸或三磷酸基团。当两条链都包含5
′
二磷酸或三磷酸基团时，两条链上的磷酸基团的数目可以相同或不同。在一些方面，寡核苷酸是部分双链寡核苷酸，包含至少一个5
′
二磷酸或三磷酸的在5
′
端处的至少1个核糖核苷酸可以在长链或短链上，其中至少长链的长度为10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45、45-50、50-55、55-60、60-65、65-70、70-75、75-80、80-85或85-90个核苷酸。
[0688]
在一些方面，互补程度优选为至少50％、60％、70％，更优选至少75％、80％、85％、90％，甚至更优选至少95％、96％、97％、98％、99％，最优选100％。如本领域所用，术语两个寡核苷酸/多核苷酸之间的“互补程度”是指两个寡核苷酸的重叠区域中互补碱基的百分比。如果两个碱基可经由氢键合形成碱基对，则它们彼此互补。碱基对包括沃森-克里克(watson-crick)碱基对和摆动碱基对。沃森-克里克碱基对包括a-t、c-g、a-u；摆动碱基对包括g-u、i-u、i-a、i-c。互补程度可由技术人员使用本领域中任何已知的方法通过各种引擎(诸如blast)手动或自动确定。例如，atcg与cgat和cgatgg具有100％的互补性，并且与cgtt和cgttgg具有75％的互补性。
[0689]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的rlr激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含通过接头连接至第二多核苷酸的第一多核苷酸，其中所述激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一多核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，并且其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性。
[0690]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含序列基序，其中序列基序选自由以下组成的组：
[0691]
(i)gt重复基序；
[0692]
(ii)ga重复基序；
[0693]
(iii)aucg重复基序；
[0694]
(iv)au重复基序；
[0695]
(v)双嘧啶基序；
[0696]
(vi)双嘌呤基序；
[0697]
(vii)嘧啶三联体基序；
[0698]
(viii)嘌呤三联体基序；
[0699]
(ix)回文序列基序；和
[0700]
(x)(i)-(ix)中任一项的组合。
[0701]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含至少一种改善的生物学活性，其中改
善的生物学活性选自：
[0702]
(i)rlr介导的细胞因子产生增加；
[0703]
(ii)rlr介导的干扰素刺激基因的表达增加；
[0704]
(iii)rlr介导的胞内信号传导增加；
[0705]
(iv)对rlr的结合亲和力增加；和
[0706]
(v)(i)-(iv)中任一项的组合。
[0707]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中序列基序是gt重复基序，其包含＜19、约15-18、约15、约10-15、约10、约5-10、约5、约4、约18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些实施方案中，gt重复基序是[gt]n，其中n＝2至9。在一些实施方案中，gt重复基序是[gt]7。在一些实施方案中，gt重复基序是[gt]3，并且其中gt重复基序的后面分别是嘌呤三联体和ucg。在一些实施方案中，嘌呤三联体是gga。
[0708]
在一些实施方案中，序列基序是ga重复基序，其包含＜19、约15-18、约15、约10-15、约10、约5-10、约5、约4、约18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个鸟嘌呤和腺嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。在一些实施方案中，ga重复基序是[ga]n，其中n＝2至9。在一些实施方案中，ga重复基序是[ga]7。
[0709]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含一序列基序，其中序列基序是aucg重复基序，其包含＜19、约16、约12-16、约12、约8-12、约6、约16、12、8个腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。
[0710]
在一些实施方案中，aucg重复基序是[aucg]n，其中n＝2至4。在一些实施方案中，aucg重复基序是[aucg]3。
[0711]
在一些实施方案中，aucg重复基序的前面是cg或双嘧啶基序。在一些实施方案中，aucg重复基序的前面是cg。在一些实施方案中，双嘧啶基序是cc。在一些实施方案中，aucg重复基序的前面是双嘌呤基序。在一些实施方案中，双嘌呤基序是ga。在一些实施方案中，双嘌呤基序是gg。
[0712]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中一个或多个尿苷核苷(u)被修饰的核苷取代。在一些实施方案中，其中修饰的核苷是核糖胸苷(t)。在一些实施方案中，augc重复基序是[aucg]3，其中一个或多个组成aucg重复基序的尿苷核苷(u)被修饰的核苷取代，其中修饰的核苷是核糖胸苷(t)。在一些实施方案中，augc重复基序是[aucg]3，其中一个或多个组成aucg重复基序的尿苷核苷(u)被修饰的核苷取代，其中修饰的核苷是核糖胸苷(t)，并且其中augc重复基序的前面是gg。
[0713]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中一个或多个鸟苷核苷(g)被修饰的核苷取代。在一些实施方案中，修饰的核苷是肌苷(i)。在一些实施方案中，augc重复基序是[aucg]3，其中一个或多个组成aucg重复基序的鸟苷核苷(g)被修饰的核苷取代，其中修饰的核苷是核糖胸苷(t)，并且其中augc重复基序的前面是gg。
[0714]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含aucg重复基序，其中所述基序的前面是ig。在一些实施方案中，aucg重复基序是[aucg]3并且前面是ig。
[0715]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含aucg重复，其中一个或多个鸟苷核苷(g)被肌苷(i)取代，其中aucg重复的前面是肌苷(i)。在一些实施方案中，组成aucg重复的
鸟苷核苷(g)被肌苷(i)取代，其中aucg重复的前面是肌苷(i)，其中第一多核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含肌苷(i)。
[0716]
在一些实施方案中，第一多核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含肌苷(i)。
[0717]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含aucg重复序列基序，其中aucg重复基序是[aucg]2。在一些实施方案中，aucg重复基序的前面是双嘌呤基序。在一些实施方案中，双嘌呤基序是gg。在一些实施方案中，aucg重复基序的前面是嘌呤三联体。在一些实施方案中，嘌呤三联体是ggg。在一些实施方案中，aucg重复基序的前面是cccccg。在一些实施方案中，aucg重复基序的前面是tcgucg。
[0718]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含回文序列，其中回文序列包含以产生回文的任何顺序连接的＜19、约15-18、约15、约10-15、约10、约18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个核苷酸或者其衍生物或类似物的序列。
[0719]
在一些实施方案中，接头侧接有au。在一些实施方案中，接头侧接有au重复基序，其中au重复基序是[au]n，其中n＝2至3。在一些实施方案中，au重复基序是[au]2。
[0720]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含有包含至少一个或多个包含与胞苷碱基配对的肌苷的核苷酸的平端发夹rna，并且其中激动剂包含下式：
[0721]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0722]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0723]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0724]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0725]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0726]
(v)n2与n3碱基配对；
[0727]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0728]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0729]
(viii)x1与x2互补；
[0730]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0731]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头。
[0732]
在其他方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，并且其中激动剂包含下式：
[0733]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0734]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0735]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0736]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0737]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0738]
(v)n2与n3碱基配对；
[0739]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0740]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0741]
(viii)x1与x2互补；
[0742]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0743]
(x)l是共价连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的所述非核苷酸接头。
[0744]
在一些实施方案中，当存在于rlr激动剂中时，肌苷与胞苷碱基配对。
[0745]
在一些实施方案中，接头(l)是核苷酸接头或非核苷酸接头。
[0746]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rlr的rlr激动剂，其中激动剂包含有包含核苷酸或非核苷酸接头的平端发夹rna。rna发夹是最常见的rna二级结构元件之一，其中发夹的杂交部分或“茎”经常被rna四环加帽。rna四环由特征性的四环核苷酸构成，形成紧凑而稳定的结构。虽然它们可由许多不同的核苷酸序列形成，但最常见的是uncg(n＝a、c、g或u)、gnra(r＝a或g)和cuug四环。四环通常有助于引发rna折叠过程，并为rna内部或之间的三级接触和蛋白质结合提供位点，从而促进核糖核蛋白颗粒的组装。四环的进一步描述可在cheong，h.，kim，n.和cheong，c.(2015).rna structure：tetraloops.in els，john wiley&sons，ltd(编)中找到，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
[0747]
因此，在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含有包含四环的核苷酸接头。在一些实施方案中，四环的核苷酸序列选自由以下组成的组：
[0748]
(a)uncg，其中n＝a、c、g或u；
[0749]
(b)gnra，其中n＝a、c、g或u，并且其中r＝a或g；
[0750]
(c)anya，其中n＝a、c、g或u，并且其中y＝c或t；
[0751]
(d)cuyg，其中y＝c或t；
[0752]
(e)umac，其中m＝a或c；和
[0753]
(f)cuug。
[0754]
在一些实施方案中，核苷酸接头包含核苷酸序列uuugau或uguuu。在一些实施方案中，四环的序列是uucg。在一些实施方案中，四环的序列是gauc。在一些实施方案中，核苷酸接头包含核苷酸序列uuugau。在一些实施方案中，核苷酸接头包含核苷酸序列uguuu。
[0755]
在其他方面，本公开的rlr激动剂包含非核苷酸接头。如本文所述，核酸环(例如，四环)是在核酸二级结构中发现的常见元件。核苷酸环出现在链内双链体中存在的折叠结构域中。被设计成含有包含非核苷酸连接基团(例如，非核苷酸接头)的发夹环的合成核酸可替换桥联折叠双链体结构的几个核苷酸。非核苷酸基团也被用作非折叠结构中的接头。此类连接基团可以是天然核苷酸接头(例如，四环)的有用替换物。例如，它们可通过几个步骤缩短具有所需二级结构的核酸的合成，因为一个相对较长的非核苷酸连接基团替换了几个通常可构成环的个别核苷酸。此类非天然环或接头(例如，非核苷酸接头)可赋予对核酸酶降解的抗性，所述核酸酶通常作用于生物环境中(例如，在细胞中或在施用时在受试者的循环中)的天然环结构。非核苷酸连接基团也具有提供比核苷酸环和/或接头更稳定的折叠结构的潜力。非核苷酸接头的进一步描述可在rumney和kool(1995)j am chem soc 117：5635-5646中找到，所述文献以引用的方式整体并入本文。
[0756]
因此，在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含选自由以下组成的组的非核苷
酸接头：
[0757]
(a)乙二醇接头；和
[0758]
(b)烷基接头。
[0759]
在一些实施方案中，非核苷酸接头是六乙二醇接头。在一些实施方案中，非核苷酸接头是c9烷基接头。
[0760]
在一些实施方案中，rlr激动剂包含5
′
二磷酸部分或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，激动剂包含5
′
三磷酸部分或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，5
′
二磷酸或三磷酸部分的衍生物或类似物包含选自以下的磷酸酯生物电子等排体：膦酸酯、硫代膦酸酯、硫代磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、噻唑烷酮、羧酸酯、丙二酸酯、硼酸、苯并氧杂硼戊环、硼代磷酸酯、方酰胺。
[0761]
在一些实施方案中，激动剂包含修饰核苷酸、修饰核苷或修饰核碱基或其组合。在一些实施方案中，激动剂包含对核苷酸间键联或对多核苷酸主链的修饰。
[0762]
在一些方面，本公开的rlr激动剂表现出以下特性中的至少一种或多种：
[0763]
(a)特异性结合至一种或多种rlr(例如，rig-1、mda5和/或lgp2)；
[0764]
(b)增加rlr介导的细胞因子产生；
[0765]
(c)增加rlr介导的干扰素刺激基因(isg)的表达；
[0766]
(d)增加rlr依赖性胞内信号传导；
[0767]
(e)增加双链体的稳定性；
[0768]
(f)增加对rlr的结合亲和力；
[0769]
(g)减少脱靶结合；
[0770]
(h)延长生物半衰期；
[0771]
(i)增加生物分布和生物利用度；
[0772]
(j)增加并且/或者增强向细胞和/或组织中的摄取；
[0773]
(k)降低免疫原性；和
[0774]
(l)(a)-(k)中任一项的组合。
[0775]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0776]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0777]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0778]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0779]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0780]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0781]
(v)n2与n3碱基配对；
[0782]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0783]
(vii)x1和x2各自是包含选自由以下组成的组的核苷的寡核苷酸：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0784]
(viii)x1与x2互补；
[0785]
(ix)x1和x2的长度各自为12个核苷酸至16个核苷酸并且长度相同，并且；
[0786]
(x)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0787]
其中n1、n2、n3和n4中的至少一个是肌苷并且/或者x1和/或x2中的至少一个包含至少一个肌苷核苷，并且其中所述肌苷核苷与所述发夹rna中的胞苷碱基配对。
[0788]
在一些实施方案中，n1包含肌苷并且n4包含胞苷。在一些实施方案中，n1包含胞苷并且n4包含肌苷。在一些实施方案中，n2包含肌苷并且n3包含胞苷。在一些实施方案中，n2包含胞苷并且n3包含肌苷。在一些实施方案中，n1包含鸟苷。在一些实施方案中，n2包含鸟苷。在一些实施方案中，n1包含胞苷。在一些实施方案中，n2包含胞苷。在一些实施方案中，n1和n2包含鸟苷并且n3和n4包含胞苷。在一些实施方案中，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含鸟苷。在一些实施方案中，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷。在一些实施方案中，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含肌苷。在一些实施方案中，n1包含肌苷并且n4包含胞苷，并且x1和/或x2各自包含至少一个肌苷。在一些实施方案中，n2包含肌苷并且n3包含胞苷，并且x1和/或x2各自包含至少一个肌苷。在一些实施方案中，n1和n2包含鸟苷，n3和n4包含胞苷，并且x1和/或x2各自包含至少一个肌苷。在一些实施方案中，n1和n2包含鸟苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和x2各自包含至少一个肌苷。在一些实施方案中，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含鸟苷，并且x1和x2各自包含至少一个肌苷。在一些实施方案中，n1和n2包含鸟苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和x2各自包含肌苷且不包含鸟苷核苷。在一些实施方案中，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含鸟苷，并且x1和x2各自包含肌苷且不包含鸟苷核苷。在一些实施方案中，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和/或x2各自包含至少一个肌苷。在一些实施方案中，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和x2各自包含至少一个肌苷。在一些实施方案中，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含肌苷，并且x1和/x2各自包含至少一个肌苷。在一些实施方案中，n1和n2包含肌苷并且n3和n4包含胞苷，并且x1和x2包含肌苷且不包含鸟苷核苷。在一些实施方案中，n1和n2包含胞苷并且n3和n4包含肌苷，并且x1和x2包含肌苷且不包含鸟苷核苷。在一些实施方案中，x1和x2各自为12个核苷酸并且包含1、2、3或4个肌苷核苷。在一些实施方案中，x1和x2各自为13个核苷酸并且包含1、2、3、4或5个肌苷核苷。在一些实施方案中，x1和x2各自为14个核苷酸并且包含1、2、3、4、5或6个肌苷核苷。在一些实施方案中，x1和x2各自为15个核苷酸并且包含1、2、3、4、5、6或7个肌苷核苷。在一些实施方案中，x1和x2各自为16个核苷酸并且包含1、2、3、4、5、6、7或8个肌苷核苷。在一些实施方案中，x1和x2各自为12个核苷酸并且包含至少10％、20％、30％或40％的肌苷核苷。
[0789]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中激动剂包含平端发夹rna，其包含下式：
[0790]5′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中
[0791]
(i)(n
1-n
2-x1)包含有包含连接的核苷酸n1、n2和x1的第一多核苷酸；
[0792]
(ii)(x
2-n
3-n4)包含有包含连接的核苷酸x2、n3和n4的第二多核苷酸；
[0793]
(iii)n1、n2、n3和n4各自包含单一核苷酸，其包含选自由以下组成的组的核苷：腺苷、鸟苷、胞苷、5-甲基尿苷、尿苷和肌苷；
[0794]
(iv)n1与n4碱基配对；
[0795]
(v)n2与n3碱基配对；
[0796]
(vi)n1包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物；
[0797]
(vii)x1包含序列基序[aucn5]
x
，其中n5包含鸟苷或肌苷，其中x是整数，其值表示
序列基序的数目，并且其中x＝3或4；
[0798]
(viii)x2包含序列基序[cn6au]y，其中n6包含鸟苷或肌苷，其中y是整数，其值表示序列基序的数目，并且其中y＝3或4；
[0799]
(ix)l是可操作地连接所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸的接头，
[0800]
任选地，其中n1、n2、n3和n4中的至少一个是肌苷，并且其中所述肌苷核苷与所述发夹rna中的胞苷碱基配对。在一些实施方案中，n5包含肌苷并且n6包含肌苷。在一些实施方案中，n5包含鸟苷并且n6包含肌苷。在一些实施方案中，n5包含肌苷并且n6包含鸟苷。在一些实施方案中，n5包含鸟苷(g)并且n6包含鸟苷(g)。在一些实施方案中，x＝3并且y＝3。在一些实施方案中，x＝4并且y＝4。在一些实施方案中，n1包含肌苷(i)并且n4包含胞苷(c)。在一些实施方案中，n2包含肌苷(i)并且n3包含胞苷(c)。在一些实施方案中，n3包含肌苷(i)并且n2包含胞苷(c)。在一些实施方案中，n4包含肌苷(i)并且n1包含胞苷(c)。在一些实施方案中，n1包含鸟苷(g)。在一些实施方案中，n2包含鸟苷(g)。在一些实施方案中，n1包含胞苷(c)。在一些实施方案中，n2包含胞苷(c)。在一些实施方案中，n1和n2包含鸟苷(g)并且n3和n4包含胞苷(c)。在一些实施方案中，n1和n2包含胞苷(c)并且n3和n4包含鸟苷(g)。在一些实施方案中，n1和n2包含肌苷(i)并且n3和n4包含胞苷(c)。在一些实施方案中，n1和n2包含胞苷(c)并且n3和n4包含肌苷(i)。
[0801]
在一些实施方案中，接头(l)是核苷酸接头或非核苷酸接头。在一些实施方案中，接头(l)是包含四环的核苷酸接头，其中四环的核苷酸序列选自由以下组成的组：
[0802]
(a)uncg，其中n＝a、c、g或u；
[0803]
(b)gnra，其中n＝a、c、g或u，并且其中r＝a或g；
[0804]
(c)anya，其中n＝a、c、g或u，并且其中y＝c或t；
[0805]
(d)cuyg，其中y＝c或t；
[0806]
(e)umac，其中m＝a或c；和
[0807]
(f)cuug。
[0808]
在一些实施方案中，接头(l)是包含核苷酸序列uuugau或uguuu的核苷酸接头。在一些实施方案中，核苷酸接头包含核苷酸序列uuugau。在一些实施方案中，核苷酸接头包含核苷酸序列uguuu。
[0809]
在一些实施方案中，接头(l)是包含四环的核苷酸接头，其中四环的序列是uucg。在一些实施方案中，四环的序列是gauc。
[0810]
在一些实施方案中，接头(l)是选自由以下组成的组的非核苷酸接头：
[0811]
(a)乙二醇接头；和
[0812]
(b)烷基接头。
[0813]
在一些实施方案中，非核苷酸接头是六乙二醇接头。在一些实施方案中，非核苷酸接头是c9烷基接头。
[0814]
在一些实施方案中，rlr激动剂包含5
′
二磷酸部分或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，激动剂包含5
′
三磷酸部分或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，5
′
二磷酸或三磷酸部分的衍生物或类似物包含选自以下的磷酸酯生物电子等排体：膦酸酯、硫代膦酸酯、硫代磷酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、噻唑烷酮、羧酸酯、丙二酸酯、硼酸、苯并氧杂硼戊环、硼代磷酸酯、方酰胺。
[0815]
在一些实施方案中，rlr激动剂包含修饰核苷酸、修饰核苷或修饰核碱基或其组合。在一些实施方案中，激动剂包含对核苷酸间键联或对多核苷酸主链的修饰。
[0816]
在一些实施方案中，rlr激动剂表现出以下特性中的至少一种或多种：
[0817]
(a)特异性结合至一种或多种rlr(例如，rig-1、mda5和/或lgp2)；
[0818]
(b)增加rlr介导的细胞因子产生；
[0819]
(c)增加rlr介导的干扰素刺激基因(isg)的表达；
[0820]
(d)增加rlr依赖性胞内信号传导；
[0821]
(e)增加双链体的稳定性；
[0822]
(f)增加对rlr的结合亲和力；
[0823]
(g)减少脱靶结合；
[0824]
(h)延长生物半衰期；
[0825]
(i)增加生物分布和生物利用度；
[0826]
(j)增加并且/或者增强向细胞和/或组织中的摄取；
[0827]
(k)降低免疫原性；和
[0828]
(l)(a)-(k)中任一项的组合。
[0829]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸与所述第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中所述双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一多核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，并且其中所述激动剂包含选自由seq id no：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36组成的组的核苷酸序列。
[0830]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中激动剂包含有包含第一多核苷酸的平端发夹rna，所述第一多核苷酸通过接头连接至第二多核苷酸，其中第一多核苷酸与第二多核苷酸充分互补以形成双链体，其中双链体包含少于19个碱基对，其中所述第一多核苷酸的最靠5
′
的核苷酸包含5
′
二磷酸或三磷酸部分或者其衍生物或类似物，其中所述激动剂包含一序列基序，相对于不包含所述序列基序的激动剂，所述序列基序提供至少一种改善的由所述rlr介导的生物学活性，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0831]
(i)分别为seq id no：37和68；
[0832]
(ii)分别为seq id no：38和69；
[0833]
(iii)分别为seq id no：39和70；
[0834]
(iv)分别为seq id no：40和71；
[0835]
(v)分别为seq id no：41和72；
[0836]
(vi)分别为seq id no：42和73；
[0837]
(vii)分别为seq id no：43和74；
[0838]
(viii)分别为seq id no：44和75；
[0839]
(ix)分别为seq id no：45和76；
[0840]
(x)分别为seq id no：46和77；
[0841]
(xi)分别为seq id no：47和78；
[0842]
(xii)分别为seq id no：48和79；
[0843]
(xiii)分别为seq id no：49和80；
[0844]
(xiv)分别为seq id no：50和81；
[0845]
(xv)分别为seq id no：51和82；
[0846]
(xvi)分别为seq id no：52和83；
[0847]
(xvii)分别为seq id no：53和84；
[0848]
(xviii)分别为seq id no：54和85；
[0849]
(xix)分别为seq id no：55和86；
[0850]
(xx)分别为seq id no：56和87；
[0851]
(xxi)分别为seq id no：57和88；
[0852]
(xxii)分别为seq id no：58和89；
[0853]
(xxiii)分别为seq id no：59和89；
[0854]
(xxiv)分别为seq id no：60和90；
[0855]
(xxv)分别为seq id no：61和91；
[0856]
(xxvi)分别为seq id no：62和92；
[0857]
(xxvii)分别为seq id no：63和91；
[0858]
(xxviii)分别为seq id no：64和93；
[0859]
(xxix)分别为seq id no：65和94；
[0860]
(xxx)分别为seq id no：66和95；
[0861]
(xxxi)分别为seq id no：67和96；以及
[0862]
(xxxii)分别为seq id no：63和97。
[0863]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中激动剂包含有包含至少一个或多个包含与胞苷碱基配对的肌苷的核苷酸的平端发夹rna，并且其中激动剂包含选自由seq id no：22、23和25组成的组的核苷酸序列。
[0864]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中所述激动剂包含有包含至少一个或多个包含与胞苷碱基配对的肌苷的核苷酸的平端发夹rna，其中所述激动剂包含式5
′‑
(n
1-n
2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中(n
1-n
2-x1)包含第一多核苷酸并且(x
2-n
3-n4)包含第二多核苷酸，并且其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0865]
(i)分别为seq id no：58和89；
[0866]
(ii)分别为seq id no：59和89；以及
[0867]
(iii)分别为seq id no：61和91，
[0868]
在一些方面，本公开提供了一种特异性结合至rig-i样受体(rlr)的合成rig-i样受体(rlr)激动剂，其中激动剂包含有包含非核苷酸接头的平端发夹rna，其中激动剂包含
式5
′‑
(n
1-n2-x1)-l-(x
2-n
3-n4)-3
′
，其中(n
1-n
2-x1)包含第一多核苷酸并且(x
2-n
3-n4)包含第二多核苷酸，并且其中第一多核苷酸和第二多核苷酸包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：
[0869]
(i)分别为seq id no：37和68；
[0870]
(ii)分别为seq id no：38和69；
[0871]
(iii)分别为seq id no：39和70；
[0872]
(iv)分别为seq id no：40和71；
[0873]
(v)分别为seq id no：41和72；
[0874]
(vi)分别为seq id no：42和73；
[0875]
(vii)分别为seq id no：43和74；
[0876]
(viii)分别为seq id no：44和75；
[0877]
(ix)分别为seq id no：45和76；
[0878]
(x)分别为seq id no：46和77；
[0879]
(xi)分别为seq id no：47和78；
[0880]
(xii)分别为seq id no：48和79；
[0881]
(xiii)分别为seq id no：49和80；
[0882]
(xiv)分别为seq id no：50和81；
[0883]
(xv)分别为seq id no：51和82；
[0884]
(xvi)分别为seq id no：52和83；
[0885]
(xvii)分别为seq id no：53和84；
[0886]
(xviii)分别为seq id no：54和85；
[0887]
(xix)分别为seq id no：55和86；
[0888]
(xx)分别为seq id no：56和87；
[0889]
(xxi)分别为seq id no：57和88；
[0890]
(xxii)分别为seq id no：58和89；
[0891]
(xxiii)分别为seq id no：59和89；
[0892]
(xxiv)分别为seq id no：60和90；
[0893]
(xxv)分别为seq id no：61和91；
[0894]
(xxvi)分别为seq id no：62和92；
[0895]
(xxvii)分别为seq id no：63和91；
[0896]
(xxviii)分别为seq id no：64和93；
[0897]
(xxix)分别为seq id no：65和94；
[0898]
(xxx)分别为seq id no：66和95；
[0899]
(xxxi)分别为seq id no：67和96；以及
[0900]
(xxxii)分别为seq id no：63和97。
[0901]
在一些方面，本公开提供了一种rlr激动剂，其中包含所述激动剂的所述核苷酸序列与基因组dna序列或mrna序列不互补，其中所述rlr激动剂不参与rna干扰，并且其中所述rlr激动剂不沉默基因表达。
[0902]
包含修饰的核碱基、核苷或核苷酸的rlr激动剂
[0903]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包含一种或多种修饰核碱基、核苷或核苷酸。在一些实施方案中，与参考未修饰的rlr激动剂相比，修饰rlr激动剂可具有有用的特性，包括增强的稳定性、胞内保留、增强的靶标结合和/或对引入了rlr激动剂的细胞的先天免疫反应的诱导的增加。因此，使用修饰rlr激动剂可提高靶标结合的效率、核酸的胞内保留，以及具有降低的免疫原性。在一个实施方案中，本公开提供的激动剂由一种或多种寡核苷酸构成，所述寡核苷酸包含至少一个被修饰以增加靶标结合亲和力的区域。寡核苷酸对其靶多肽(例如，rlr受体)的亲和力可通过例如测量荧光标记的寡核苷酸与其靶标结合时的荧光偏振(fp)来确定(moerke(2009)curr protoc chem biol 1(1)：1-15)。
[0904]
在另一个实施方案中，本公开提供的rlr激动剂由至少一种寡核苷酸组成，所述寡核苷酸包含至少一个区域，所述区域包含至少一个增加双链体稳定性的修饰的核碱基、核苷或核苷酸。双链体的稳定性可通过测量双链体的tm来常规确定，tm是构成双链体的两条寡核苷酸链解离的温度；解离是通过分光光度法检测的。tm越高，双链体的稳定性越高。
[0905]
在一个实施方案中，经过修饰以增加双链体稳定性的寡核苷酸区域包含至少一个在糖的2
′
位置处被修饰的核苷酸，最优选地2
′‑
o-烷基、2
′‑
o-烷基-o-烷基或2
′‑
氟修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，包含rlr激动剂的寡核苷酸也经过修饰以增强核酸酶抗性。细胞含有多种可降解核酸的核酸外切酶和核酸内切酶。已经证明许多核苷酸和核苷修饰使其所掺入的寡核苷酸对核酸酶消化的抗性比未修饰的寡核苷酸强。核酸酶抗性常规通过将寡核苷酸与细胞提取物或分离的核酸酶溶液一起孵育并且通常利用凝胶电泳测量随时间保留的完整寡核苷酸的程度进行测量。已经过修饰以增强核酸酶抗性的寡核苷酸保持完整的时间比未修饰的寡核苷酸长。多种寡核苷酸修饰已证明增强或赋予核酸酶抗性。在一个实施方案中，使用含有至少一种硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸。在一些情况下，增强靶标结合亲和力的寡核苷酸修饰也能够独立地增强核酸酶抗性(de mesmaeker等人，1995，acc.chem.res.28：366-374)。
[0906]
本发明所设想的一些寡核苷酸的特定实例包括含有修饰的主链的那些寡核苷酸，修饰的主链例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、膦酸甲酯、短链烷基或环烷基糖间键联或短链杂原子或杂环糖间键联。在一些实施方案中，使用具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸(包括以立体特异性方式合成的那些寡核苷酸)和具有杂原子主链(特别是ch2-nh-o-ch2、ch2-n(ch3)-o-ch2[称为亚甲基(甲基亚氨基)或mmi主链]、ch2-o-n(ch3)-ch2、ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2和o-n(ch3)-ch2-ch2主链，其中天然磷酸二酯主链表示为o-p-o-ch2)的那些寡核苷酸。de mesmaeker等人(1995，acc.chem.res.28：366-374)公开的酰胺主链也用于一些实施方案中。寡核苷酸还可含有一个或多个取代的糖部分。在一些实施方案中，寡核苷酸在2
′
位置处包含以下之一：oh、sh、sch3、f、ocn、och3och3、och3o(ch2)nch3、o(ch2)nnh2或o(ch2)nch3，其中n是1至约10；c1至c10低级烷基、烷氧基烷氧基(在本领域中也称为o-烷基-o-烷基)、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；cl；br；cn；cf3；ocf3；o-烷基、s-烷基或n-烷基；o-烯基、s-烯基或n-烯基；soch3；so2ch3；ono2；no2；n3；nh2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；rna裂解基团；报告基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药物动力学特性的基团；或用于改善寡核苷酸和具有类似特性的其他取代基的药效学特性的基团。在一个实施方案中，修饰包括2
′‑
甲氧基乙氧基[2
′‑
o-ch2ch2och3，也称为2
′‑
o-(2-甲氧基乙基)或2
′‑
moe](martin等人，helv.chim.acta，1995，78，486)。在一些实施方案中，修
饰包括2
′‑
甲氧基(2
′‑
o-ch3)、2
′‑
丙氧基(2
′‑
och2ch2ch3)和2
′‑
氟(2
′‑
f)。类似修饰还可在寡核苷酸上的其他位置处进行，特别是3
′
末端核苷酸上的糖的3
′
位置处和5
′
末端核苷酸的5
′
位置处。寡核苷酸还可具有糖模拟物(诸如环丁基)以代替戊呋喃糖基。
[0907]
寡核苷酸还可另外或替代地包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修饰的核碱基包括仅在天然核酸中偶尔或短暂发现的核碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-me嘧啶，特别是5-甲基胞嘧啶(也称为5-甲基-2
′
脱氧胞嘧啶并且在本领域中通常称为5-me-c)、5-羟基甲基胞嘧啶(hmc)、糖基hmc和龙胆二糖基hmc；以及合成核碱基，例如2-氨基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、n6(6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤。kornberg，a.，dna replication，w.h.freeman&co.，san francisco，1980，第75-77页；gebeyehu，g.，等人，1987，nucl.acids res.15：4513)。可包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。5-me-c取代已经证明将核酸双链体稳定性提高0.6℃-1.2℃。(sanghvi，y.s.，crooke，s.t.和lebleu，b.，编，antisense research and applications，crc press，boca raton，1993，第276-278页)并且目前在一些实施方案中用作碱基取代。
[0908]
本发明寡核苷酸的另一种修饰涉及使寡核苷酸化学连接至一个或多个增强寡核苷酸的活性或细胞摄取的部分或缀合物。此类部分包括但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分、胆甾醇基部分(letsinger等人，proc.natl.acad.sci.usa，1989，86，6553)、胆酸(manoharan等人，bioorg.med.chem.let.，1994，4，1053)、硫醚(例如己基-s-三苯基甲硫醇)(manoharan等人，ann.n.y acad.sci.，1992，660，306；manoharan等人，bioorg.med.chem.let.，1993，3，2765)、巯基胆固醇(oberhauser等人，nucl.acids res.，1992，20，533)、脂肪链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)(saison-behmoaras等人，embo j.，1991，10，111；kabanov等人，febs lett.，1990，259，327；svinarchuk等人，biochimie，1993，75，49)、磷脂、聚胺或聚乙二醇链(manoharan等人，nucleosides&nucleotides，1995，14，969)或金刚烷乙酸(manoharan等人，tetrahedron lett.，1995，36，3651)。包含亲脂性部分的寡核苷酸和用于制备此类寡核苷酸的方法在本领域中是已知的，例如美国专利号5,138,045、5,218,105和5,459,255。
[0909]
本发明的寡核苷酸可作为前药提供，其包含一个或多个通常在体内被裂解以产生活性寡核苷酸的部分。imbach等人在wo公布号94/26764中描述了前药方法的一个实例。
[0910]
不必在给定寡核苷酸中的所有位置上均一修饰，并且实际上可将多于一种上述修饰掺入单一寡核苷酸中或者甚至掺入寡核苷酸内的单一核苷中。
[0911]
根据本发明的寡核苷酸的长度优选为约8至约50个核苷酸。在本发明的上下文中，应理解这涵盖如上文所述的具有8至50个单体的非天然存在的低聚物。
[0912]
根据本发明使用的寡核苷酸可通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于此类合成的设备由包括applied biosystems在内的若干家供应商销售。还可采用任何其他用于此类合成的方法；寡核苷酸的实际合成完全在本领域普通技术人员的知识和能力范围内。使用类似技术制备其他寡核苷酸诸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物也是众所周知的。同样众所周知的是，使用类似技术和可商购获得的修饰酰胺酸酯和可控孔径玻璃(cpg)产品诸如生物素、荧光素、吖啶或补骨脂素修饰的酰胺酸酯和/或cpg(可从glen research，
胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、赖西丁(k2c)、α-硫代-胞苷、2
′‑
o-甲基-胞苷(cm)、5，2
′‑
o-二甲基-胞苷(m5cm)、n4-乙酰基-2
′‑
o-甲基-胞苷(ac4cm)、n4，2
′‑
o-二甲基-胞苷(m4cm)、5-甲酰基-2
′‑
o-甲基-胞苷(f5cm)、n4，n4，2
′‑
o-三甲基-胞苷(m
42
cm)、1-硫代-胞苷、2
′‑
f-ara-胞苷、2
′‑
f-胞苷以及2
′‑
oh-ara-胞苷。
[0916]
在一些实施方案中，修饰核碱基是修饰腺嘌呤。具有修饰腺嘌呤的示例性核碱基和核苷包括α-硫代-腺苷、2-氨基-嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤代-嘌呤(例如，2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤代-嘌呤(例如，6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1a)、2-甲基-腺嘌呤(m2a)、n6-甲基-腺苷(m6a)、2-甲硫基-n6-甲基-腺苷(ms2m6a)、n6-异戊烯基-腺苷(i6a)、2-甲硫基-n6-异戊烯基-腺苷(ms2i6a)、n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(io6a)、2-甲硫基-n6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷(ms2io6a)、n6-甘氨酰基氨基甲酰基-腺苷(g6a)、n6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(t6a)、n6-甲基-n6-苏氨酰基氨基甲酰基-腺苷(m6t6a)、2-甲硫基-n6-苏氨酰基氨甲酰基-腺苷(ms2g6a)、n6，n6-二甲基-腺苷(m
62
a)、n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(hn6a)、2-甲硫基-n6-羟基正缬氨酰基氨基甲酰基-腺苷(ms2hn6a)、n6-乙酰基-腺苷(ac6a)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、α-硫代-腺苷、2
′‑
o-甲基-腺苷(am)、n6，2
′‑
o-二甲基-腺苷(m6am)、n6，n6，2
′‑
o-三甲基-腺苷(m
62
am)、1，2
′‑
o-二甲基-腺苷(m1am)、2
′‑
o-核糖基腺苷(磷酸酯)(ar(p))、2-氨基-n6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、2
′‑
f-ara-腺苷、2
′‑
f-腺苷、2
′‑
oh-ara-腺苷以及n6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺苷。
[0917]
在一些实施方案中，修饰核碱基是修饰鸟嘌呤。具有修饰鸟嘌呤的示例性核碱基和核苷包括α-硫代鸟苷、肌苷(i)、1-甲基-肌苷(m1i)、怀俄苷(wyosine)(img)、甲基怀俄苷(mimg)、4-脱甲基-怀俄苷(img-14)、异怀俄苷(img2)、怀丁苷(yw)、过氧怀丁苷(wybutosine)(o2yw)、羟基怀丁苷(ohyw)、修饰不足的羟基怀丁苷(ohyw*)、7-脱氮-鸟苷、辫苷(queuosine)(q)、环氧辫苷(oq)、半乳糖基-辫苷(galq)、甘露糖基-辫苷(manq)、7-氰基-7-脱氮-鸟苷(preq0)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟苷(preq1)、古嘌苷(archaeosine)(g
)、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷(m7g)、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基-鸟苷(m1g)、n2-甲基-鸟苷(m2g)、n2，n2-二甲基-鸟苷(m
22
g)、n2，7-二甲基-鸟苷(m
2，7
g)、n2，n2，7-二甲基-鸟苷(m
2，2，7
g)、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、n2-甲基-6-硫代-鸟苷、n2，n2-二甲基-6-硫代-鸟苷、α-硫代-鸟苷、2
′‑
o-甲基-鸟苷(gm)、n2-甲基-2
′‑
o-甲基-鸟苷(m2gm)、n2，n2-二甲基-2
′‑
o-甲基-鸟苷(m
22
gm)、1-甲基-2
′‑
o-甲基-鸟苷(m1gm)、n2，7-二甲基-2
′‑
o-甲基-鸟苷(m
2，7
gm)、2
′‑
o-甲基-肌苷(im)、1，2
′‑
o-二甲基-肌苷(m1im)、2
′‑
o-核糖基鸟苷(磷酸酯)(gr(p))、1-硫代-鸟苷、o6-甲基-鸟苷、2
′‑
f-ara-鸟苷以及2
′‑
f-鸟苷。
[0918]
在一些实施方案中，本公开的rlr激动剂包括上述修饰核碱基中的一个或多个的组合(例如，上述修饰核碱基中的2、3或4个的组合)。
[0919]
在某些实施方案中，本公开的rlr激动剂被均一修饰(即，完全修饰，在整个序列中
修饰)以用于特定修饰。例如，rlr激动剂可用5-甲基-胞苷(m5c)均一修饰，这意味着mrna序列中的所有胞嘧啶残基都被5-甲基-胞苷(m5c)替换。类似地，本公开的rlr激动剂可通过用修饰残基(诸如上文所述的那些)替换来针对序列中存在的任何类型的核苷残基进行均一修饰。
[0920]
可存在于本公开的rlr激动剂中的核苷修饰及其组合的实例包括但不限于以下pct专利申请公布中描述的那些：wo2012045075、wo2014081507、wo2014093924、wo2014164253和wo2014159813。
[0921]
本公开的rlr激动剂可包含对糖、核碱基和/或核苷间键联的修饰的组合。这些组合可包含本文所描述的任何一个或多个修饰。
[0922]
修饰核苷和修饰核苷组合的实例在以下表1和表2中提供。这些修饰核苷酸的组合可用于形成本公开的rlr激动剂。在某些实施方案中，修饰核苷可部分地或完全地取代本公开的rlr激动剂的天然核苷酸。作为非限制性实例，天然核苷酸尿苷可被本文所述的修饰核苷取代。在另一个非限制性实例中，天然核苷尿苷可被本文所公开的至少一种修饰核苷部分地取代(例如，约0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％的天然尿苷)。
[0923]
表1.核苷修饰的组合
[0924]
[0925][0926]
表2.修饰核苷及其组合
[0927]
[0928]
[0929]
[0930]
j pharm biopharm 107：321-40；menzi等人，(2015)future med chem 7(13)：1733-49；winkler j.，(2013)ther deliv.(7)：791-809；singh等人，(2010)chem soc rev 39(6)：2054-70；和lu等人，(2010)bioconjug chem 21(2)：187-202中进一步描述了寡核苷酸、多核苷酸的合成以及其缀合和连接。
[0939]
病毒样颗粒(vlp)
[0940]
在一些实施方案中，本公开提供了包含至少一种所述rlr激动剂和病毒样颗粒(vlp)的组合物。在一些实施方案中，rlr激动剂与vlp结合。在一些实施方案中，rlr激动剂包装在vlp中。
[0941]
本技术上下文中的病毒样颗粒是指类似于病毒颗粒但不是致病性的结构。一般来说，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，并且因此是非感染性的。此外，病毒样颗粒可通过异源表达大量产生，并且可以很容易地纯化。
[0942]
适用于本文所述组合物的示例性病毒样颗粒在pct公开号wo 2003/024481和wo 2004/084940中提供，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
[0943]
在一些实施方案中，病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。技术人员可使用重组dna技术和公众容易获得并在本文中描述的病毒编码序列来产生vlp。例如，病毒包膜或核心蛋白的编码序列可使用可商购获得的杆状病毒载体在病毒启动子的调节控制下进行工程改造以在杆状病毒表达载体中表达，对序列进行适当的修饰以允许编码序列与调节序列的功能性连接。例如，病毒包膜或核心蛋白的编码序列还可进行工程改造以在细菌表达载体中表达。
[0944]
vlp的实例包括但不限于乙型肝炎病毒的衣壳蛋白(ulrich，等人，virus res.50：141-182(1998))、麻疹病毒(warnes，等人，gene 160：173-178(1995))、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、轮状病毒(美国专利号5,071,651和5,374,426)、口蹄疫病毒(twomey，等人，vaccine 13：1603-1610，(1995))、诺瓦克病毒(jiang，x.，等人，science 250：1580-1583(1990)；matsui，s.m，等人，j.clin.invest.87：1456-1461(1991))、逆转录病毒gag蛋白(pct专利申请号wo 96/30523)、逆转录转座子ty蛋白p1、乙型肝炎病毒的表面蛋白(wo 92/11291)、人乳头瘤病毒(wo 98/15631)、人多瘤病毒(sasnauskas k.，等人，biol.chem.380(3)：381-386(1999)；sasnauskas k.，等人，generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast 3
rd international workshop“virus-like particles as vaccines.”berlin，2001年9月26日-29日)、rna噬菌体、ty、fr噬菌体、ga噬菌体、ap205噬菌体以及特别地，qβ噬菌体。
[0945]
如本领域技术人员显而易见的，本公开的vlp不限于任何特定形式。颗粒可化学合成或通过生物过程合成，其可以是天然的或非天然的。例如，这种类型的实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。在一些实施方案中，vlp包含轮状病毒的重组多肽；诺瓦克病毒的重组多肽；甲病毒的重组多肽；形成细菌菌毛或菌毛样结构的重组蛋白；口蹄疫病毒的重组多肽；麻疹病毒的重组多肽、辛德毕斯病毒的重组多肽、逆转录病毒的重组多肽；乙型肝炎病毒的重组多肽(例如，hbcag)；烟草花叶病毒的重组多肽；羊含病毒(flock house virus)的重组多肽；人乳头瘤病毒的重组多肽；多瘤病毒的重组多肽，和特别地，人多瘤病毒的重组多肽，和特别地，bk病毒的重组多肽；噬菌体的重组多肽、rna噬菌体的重组多肽；ty的重组多肽；fr噬菌体的重组多肽、ga噬菌体的重组多肽、ap 205噬菌体的重组多肽，和特别地，qβ噬菌体的重组多肽。病毒样颗粒可还包含此类多肽的一个或多个片段以及此类多肽的变
体，或者替代地由其组成。多肽的变体可与其野生型对应物在氨基酸水平上共享例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％的同一性。
[0946]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含rna噬菌体的重组蛋白或其片段。在一些实施方案中，rna噬菌体选自由以下组成的组：a)噬菌体qβ；b)噬菌体r17；c)噬菌体fr；d)噬菌体ga；e)噬菌体sp；f)噬菌体ms2；g)噬菌体m11；h)噬菌体mx1；i)噬菌体nl95；k)噬菌体f2；和1)噬菌体pp7。
[0947]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含rna噬菌体qβ或rna噬菌体fr的重组蛋白或其片段。在一些实施方案中，病毒样颗粒包含rna噬菌体qβ的重组蛋白或其片段。
[0948]
在一些实施方案中，重组蛋白包含rna噬菌体的外壳蛋白。
[0949]
因此，形成衣壳或vlp的rna噬菌体外壳蛋白，或与自组装成衣壳或vlp相容的噬菌体外壳蛋白的片段，是本公开的其他实施方案。例如，噬菌体qβ外壳蛋白可在大肠杆菌(e.coli)中重组表达。此外，在此类表达后，这些蛋白质自发形成衣壳。另外，这些衣壳形成具有固有重复组织的结构。
[0950]
可用于制备本公开的组合物的噬菌体外壳蛋白的实例包括rna噬菌体的外壳蛋白，所述rna噬菌体诸如噬菌体qβ(seq id no：112；pir数据库，登录号vcbpqb，指代qβ cp以及seq id no：113；登录号aaa16663，指代qβ al蛋白)、噬菌体r17(seq id no：114；pir登录号vcbpr7)、噬菌体fr(seq id no：115；pir登录号vcbpfr)、噬菌体ga(seq id no：116；genbank登录号np-040754)、噬菌体sp(seq id no：117；genbank登录号caa30374，指代sp cp以及seq id no：118；登录号，指代sp a1蛋白)、噬菌体ms2(seq id no：119；pir登录号vcbpm2)、噬菌体m11(seq id no：120；genbank登录号aac06250)、噬菌体mx1(seq id no：121；genbank登录号aac14699)、噬菌体nl95(seq id no：122；genbank登录号aac14704)、噬菌体f2(seq id no：123；genbank登录号p03611)、噬菌体pp7(seq id no：124)。此外，噬菌体qβ的a1蛋白或从其c末端缺失多达100、150或180个氨基酸的c末端截短形式可掺入qβ外壳蛋白的衣壳组装中。通常，衣壳组装中qβ a1蛋白相对于qβ cp的百分比将受到限制，以确保衣壳形成。
[0951]
还发现qβ外壳蛋白在大肠杆菌中表达时自组装成衣壳(kozlovska t m.等人，gene 137：133-137(1993))。所得衣壳或病毒样颗粒显示出二十面体噬菌体样衣壳结构，直径为25nm并且t＝3准对称。此外，已经解决了噬菌体qβ的晶体结构。衣壳含有180个外壳蛋白拷贝，其通过二硫键以共价五聚体和六聚体连接(golmohammadi，r.等人，structure 4：543-5554(1996))，导致qβ外壳蛋白的衣壳具有杰出的稳定性。然而，由重组qβ外壳蛋白制成的衣壳或vlp可能含有未经由二硫键与衣壳内的其他亚基连接或不完全连接的亚基。因此，在非还原性sds-page上加载重组qβ衣壳后，可以看到对应于单体qβ外壳蛋白的谱带以及对应于qβ外壳蛋白的六聚体或五聚体的谱带。不完全二硫键连接的亚基在非还原性sds-page中可能表现为二聚体、三聚体甚至四聚体谱带。qβ衣壳蛋白还显示出对有机溶剂和变性剂的不寻常的耐受性。据观察，高达30％的dmso和乙腈浓度以及高达1m的胍鎓浓度不影响衣壳的稳定性。qβ外壳蛋白衣壳的高稳定性是有利的特征，特别是对于其在根据本发明的哺乳动物和人的免疫接种和疫苗接种中的用途。
[0952]
在大肠杆菌中表达后，qβ外壳蛋白的n末端蛋氨酸通常被去除，如通过在stoll，e.等人j.biol.chem.252：990-993(1977)中描述的n末端edman测序所观察到的。由未去除n末
端蛋氨酸的qβ外壳蛋白构成的vlp或者包含其中n末端蛋氨酸被裂解或存在的qβ外壳蛋白的混合物的vlp也在本公开的范围内。
[0953]
其他rna噬菌体外壳蛋白也已经证明在细菌宿主中表达后自组装(kastelein，ra.等人，gene 23：245-254(1983)；kozlovskaya，t m.等人，dokl.akad.nauk sssr 287：452-455(1986)；adhin，mr.等人，virology 170：238-242(1989)；ni，c z.，等人，protein sci.5：2485-2493(1996)；priano，c.等人，j.mol.biol.249：283-297(1995))。除了外壳蛋白外，qβ噬菌体衣壳还含有所谓的通读蛋白a1和成熟蛋白a2。a1由uga终止密码子处的遏制产生，并且长度为329aa。在一些实施方案中，用于本公开的噬菌体qβ重组外壳蛋白的衣壳不含a2裂解蛋白，并且含有来自宿主的rna。rna噬菌体的外壳蛋白是rna结合蛋白，并且在病毒的生命周期中与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用，充当翻译阻遏物。相互作用的序列和结构元件是已知的(witherell，g w.&uhlenbeck，o c.biochemistry 28：71-76(1989)；lim f.等人，j.biol.chem.271：31839-31845(1996))。通常已知茎环和rna参与病毒组装(golmohammadi，r.等人，structure 4：543-5554(1996))。
[0954]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含rna噬菌体的重组蛋白或其片段，其中重组蛋白包含rna噬菌体的突变体外壳蛋白，优选上述rna噬菌体的突变体外壳蛋白。在一些实施方案中，rna噬菌体的突变体外壳蛋白已通过取代去除至少一个赖氨酸残基，或通过取代添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰；替代地，rna噬菌体的突变体外壳蛋白已通过缺失至少一个赖氨酸残基或，通过插入添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰。
[0955]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含rna噬菌体qβ的重组蛋白或其片段，其中重组蛋白包含具有氨基酸序列seq id no：112的外壳蛋白或者具有氨基酸序列seq id no：112和seq id no：113或seq id no：113的突变体的外壳蛋白的混合物，并且其中n末端蛋氨酸优选被裂解。
[0956]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含qβ的重组蛋白或其片段，其中重组蛋白包含突变体qβ外壳蛋白。在一些实施方案中，这些突变体外壳蛋白已通过取代去除至少一个赖氨酸残基，或通过取代添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰。替代地，这些突变体外壳蛋白已通过缺失至少一个赖氨酸残基，或通过插入添加至少一个赖氨酸残基来进行修饰。
[0957]
四个赖氨酸残基暴露在qβ外壳蛋白的衣壳表面上。暴露的赖氨酸残基被精氨酸替换的qβ突变体也可用于本发明。因此，以下qβ外壳蛋白突变体和突变体qβ vlp可用于本发明的实践中：“qβ240”(lys13-arg；seq id no：125)、“qβ-243”(asn 10-lys；seq id no：126)、“qβ-250”(lys 2-arg、lysl3-arg；seq id no：127)、“qβ-251”(seq id no：128)和“qβ-259”(lys 2-arg、lys16-arg；seq id no：129)。因此，在一些实施方案中，病毒样颗粒包含突变体qβ外壳蛋白的重组蛋白，其包含具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的蛋白质：a)氨基酸序列seq id no：125；b)氨基酸序列seq id no：126；c)氨基酸序列seq id no：127；d)氨基酸序列seq id no：128；和e)氨基酸序列seq id no：129。上文指示的qβ外壳蛋白、突变体qβ外壳蛋白vlp和衣壳的构建、表达和纯化分别在美国公布号us 2003-0175290中公开，所述专利以引用的方式整体并入本文。在此特别参考上述申请的实施例18。
[0958]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含qβ的重组蛋白或其片段，其中重组蛋白包含前述qβ突变体中的任一种与对应a1蛋白的混合物。
[0959]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含rna噬菌体ap205的重组蛋白或其片段。
[0960]
ap205基因组由成熟蛋白、外壳蛋白、复制酶和相关噬菌体中不存在的两个开放阅读框组成；裂解基因和开放阅读框在成熟基因的翻译中起作用(klovins，j.，等人，j.gen.virol.83：1523-33(2002))。ap205外壳蛋白可由质粒pap283-58(seq id no：79)表达，所述质粒是pqb10的衍生物(kozlovska，t.m.等人，gene 137：133-37(1993))，并且其含有ap205核糖体结合位点。替代地，可将ap205外壳蛋白克隆到pqbl85中，位于载体中存在的核糖体结合位点的下游。两种方法都引起蛋白质的表达和衣壳的形成，如美国专利号7,138,252中所描述，所述专利以引用的方式整体并入。载体pqb10和pqb185是来源于pgem载体的载体，这些载体中克隆基因的表达受trp启动子控制(kozlovska，t.m.等人，gene 137：133-37(1993))。质粒pap283-58(seq id no：130)在以下序列中包含推定的ap205核糖体结合位点，所述位点位于xbai位点的下游，并且紧邻ap205外壳蛋白的atg起始密码子的上游：tctagaattttctgcgcacccatcccgggtggcgcccaaagtgaggaaaatcac atg(seq id no：131)。载体pqb185包含xbai位点下游和起始密码子上游的夏因-达尔加诺序列(shine delagarno sequence)(tctagattaacccaacgcgtaggagtcaggccatg，夏因-达尔加诺序列加下划线，seq id no：132)。
[0961]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含rna噬菌体ap205的重组外壳蛋白或其片段。
[0962]
在一些实施方案中，ap205外壳蛋白形成衣壳。此类蛋白质是重组表达的，或由天然来源制备的。如电子显微镜(em)和免疫扩散所证明，细菌中产生的ap205外壳蛋白自发形成衣壳。由ap205外壳蛋白(seq id no：133)形成的衣壳和由ap205 rna噬菌体的外壳蛋白形成的衣壳的结构特性在em时几乎无法区分。ap205 vlp具有高度免疫原性，并且可与抗原和/或抗原决定簇连接以产生展示出以重复方式取向的抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体。针对如此展示的抗原引出高滴度，表明结合的抗原和/或抗原决定簇易于与抗体分子相互作用并且具有免疫原性。
[0963]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含rna噬菌体ap205的重组突变体外壳蛋白或其片段。
[0964]
在一些实施方案中，ap205 vlp的组装能力突变体形式，包括在氨基酸5处脯氨酸被取代为苏氨酸的ap205外壳蛋白(seq id no：134)，用于本公开的实践中。这些vlp、来源于天然来源的ap205 vlp或ap205病毒颗粒可与抗原结合以产生根据本发明的抗原的有序重复阵列。
[0965]
ap205 p5-t突变体外壳蛋白可由质粒pap281-32(seq id no.135)表达，所述质粒直接来源于pqb185，并且含有突变体ap205外壳蛋白基因而不是qβ外壳蛋白基因。将用于表达ap205外壳蛋白的载体转染到大肠杆菌中以表达ap205外壳蛋白。
[0966]
在一些实施方案中，本公开提供了包含具有与形成有序阵列并具有固有重复结构的野生型蛋白质具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的蛋白质的组合物。
[0967]
在一些实施方案中，本公开提供了编码用于制备本发明组合物的蛋白质的核酸分子。
[0968]
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含蛋白质，其包含与seq id no：112-129中所示出的氨基酸序列中的任一个具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
[0969]
适用于本公开的蛋白质还包括形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的c末端截短突变体或vlp。此类截短突变体的特定实例包括具有seq id no：112-129中任一个所示的氨基酸序列的蛋白质，其中1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸已从c末端去除。通常，这些c末端截短突变体将保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
[0970]
适用于本公开的其他蛋白质还包括形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的n末端截短突变体。此类截短突变体的特定实例包括具有seq id no：112-129中任一个所示的氨基酸序列的蛋白质，其中1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸已从n末端去除。通常，这些n末端截短突变体将保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
[0971]
适用于本公开的另外的蛋白质包括形成衣壳或衣壳样结构的n和c末端截短突变体。合适的截短突变体包括具有seq id no：112-129中任一个所示的氨基酸序列的蛋白质，其中1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸已从n末端去除，并且1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸已从c末端去除。通常，这些n末端和c末端截短突变体将保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
[0972]
保留诱导免疫反应的能力的vlp片段可包含以下多肽或者替代地由其组成，所述多肽的长度为约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450或500个氨基酸，但显然将取决于构成vlp的亚基的序列长度。此类片段的实例包括本文讨论的适用于制备免疫反应增强组合物的蛋白质片段。
[0973]
在一些实施方案中，vlp不含脂蛋白包膜或不含含脂蛋白的包膜。在一些实施方案中，vlp完全不含包膜。
[0974]
缺少脂蛋白包膜或含脂蛋白的包膜，以及特别是完全缺少包膜，导致其结构和组成中病毒样颗粒更加明确。因此，此类更明确的病毒样颗粒可使副作用减至最小。此外，缺少含脂蛋白的包膜，或特别是完全缺少包膜，避免在病毒样颗粒内掺入潜在有毒的分子和热原或使其减至最小。
[0975]
在一些实施方案中，本公开的组合物中使用的颗粒由乙型肝炎衣壳(核心)蛋白(hbcag)或hbcag的片段组成，所述片段已经过修饰以消除或减少游离半胱氨酸残基的数目。zhou等人(j.virol.66：5393-5398(1992))证明经过修饰以去除天然存在的半胱氨酸残基的hbcag保留了缔合和形成多聚体结构的能力。因此，适用于本公开的组合物的核心颗粒包括那些包含修饰hbcag或其片段的核心颗粒，其中天然存在的半胱氨酸残基中的一个或多个已被缺失或被另一个氨基酸残基(例如，丝氨酸残基)取代。
[0976]
hbcag是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的蛋白质。已鉴定出hbcag的许多同种型并且它们的氨基酸序列对于本领域技术人员来说是容易获得的。例如，具有seq id no：136所示的氨基酸序列的hbcag蛋白的长度为185个氨基酸，并且是通过加工212个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的。这种加工导致从乙型肝炎核心抗原前体蛋白的n末端去除29个氨基酸。类似地，长度为185个氨基酸的hbcag蛋白是通过加工214个氨基酸的乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的。
[0977]
在一些实施方案中，本公开的组合物将使用hbcag的加工形式(即，已去除乙型肝炎核心抗原前体蛋白的n末端前导序列的hbcag)制备。
[0978]
此外，当hbcag在不会发生加工的条件下产生时，hbcag通常会以“加工”形式表达。
例如，细菌系统，诸如大肠杆菌，一般不去除通常在真核细胞中表达的蛋白质的前导序列，也称为“信号肽”。因此，当使用将蛋白质的表达引导至细胞质的大肠杆菌表达系统来产生本公开的hbcag时，这些蛋白质的表达通常使得乙型肝炎核心抗原前体蛋白的n末端前导序列不存在。
[0979]
可用于本公开的乙型肝炎病毒样颗粒的制备公开于例如wo 00/32227中，并且在此特别是实施例17至19和21至24中，以及wo 01/85208中，并且在此特别是实施例17至19、21至24、31和41中，以及待审的美国公布号us 2003-0175290中。对于后一种应用，具体参考实施例23、24、31和51。所有三份文件都以引用的方式明确并入本文。
[0980]
本公开还包括hbcag变体，其已经过修饰以缺失或取代一个或多个另外的半胱氨酸残基。因此，本发明的疫苗组合物包括包含hbcag的组合物，其中seq id no：136所示的氨基酸序列中不存在的半胱氨酸残基已缺失。
[0981]
本领域众所周知，游离半胱氨酸残基可参与许多化学副反应。这些副反应包括二硫键交换、与化学物质或代谢物(例如在与其他物质的组合疗法中注射或形成的化学物质或代谢物)反应或暴露于紫外线时直接氧化和与核苷酸反应。因此可能会产生有毒的加合物，特别是考虑到hbcag具有与核酸结合的强烈倾向这一事实。因此，有毒的加合物将分布在多个物种之间，所述物种可独立地各自以低浓度存在，但在一起时达到毒性水平。
[0982]
鉴于上述情况，在已经过修饰以去除天然存在的半胱氨酸残基的组合物中使用hbcag的一个优点是当抗原或抗原决定簇附接时有毒物种可结合的位点的数量将减少或完全消除。
[0983]
已经鉴定出许多适用于本公开的实践的天然存在的hbcag变体。例如，yuan等人(j.virol.73：10122-10128(1999))描述了其中对应于seq id no：137中位置97的位置处的异亮氨酸残基被亮氨酸残基或苯丙氨酸残基替换的变体。许多hbcag变体以及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列公开于以下genbank报告中：aaf121240(seq id no：138)、af121239(seq id no：139)、x85297(seq id no：140)、x02496(seq id no：141)、x85305(seq id no：142)、x85303(seq id no：143)、af151735(seq id no：144)、x85259(seq id no：145)、x85286(seq id no：146)、x85260(seq id no：147)、x85317(seq id no：148)、x85298(seq id no：149)、af043593(seq id no：150)、m20706(seq id no：151)、x85295(seq id no：152)、x80925(seq id no：153)、x85284(seq id no：154)、x85275(seq id no：155)、x72702(seq id no：156)、x85291(seq id no：157)、x65258(seq id no：158)、x85302(seq id no：159)、m32138(seq id no：160)、x85293(seq id no：161)、x85315(seq id no：162)、u95551(seq id no：163)、x85256(seq id no：164)、x85316(seq id no：165)、x85296(seq id no：166)、ab033559(seq id no：167)、x59795(seq id no：168)、x85299(seq id no：169)、x85307(seq id no：170)、x65257(seq id no：171)、x85311(seq id no：172)、x85301(seq id no：173)、x85314(seq id no：174)、x85287(seq id no：175)、x85272(seq id no：176)、x85319(seq id no：177)、ab010289(seq id no：178)、x85285(seq id no：179)、ab010289(seq id no：180)、af121242(seq id no：181)、m90520(seq id no：182)、p03153(seq id no：183)、af110999(seq id no：184)和m95589(seq id no：185)，所述报告各自的公开内容以引用的方式并入本文。这些hbcag变体在多个位置的氨基酸序列不同，包括对应于位于seq id no：77中以下位置处的氨基酸残基的氨基酸残基：12、13、21、
22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183。适用于本发明组合物并且可根据本说明书的公开内容进一步修饰的其他hbcag变体描述于wo 00/198333、wo 00/177158和wo 00/214478中。
[0984]
适用于本公开的hbcag可以来源于任何生物体，只要它们能够包封或偶联或以其他方式附接(特别是只要它们能够包装)rlr激动剂并诱导免疫反应即可。
[0985]
在一些实施方案中，组合物包含能够缔合以形成二聚体或多聚体结构的hbcag变体。在一些实施方案中，组合物包含有包含与任何野生型氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的hbcag多肽，以及这些蛋白质在适当的情况下被加工以去除n末端前导序列的形式。
[0986]
多肽的氨基酸序列是否具有与野生型氨基酸序列之一或其亚部分具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列，可常规地使用已知的计算机程序(诸如bestfit程序)来确定。当使用bestfit或任何其他序列比对程序确定特定序列是否与参考氨基酸序列具有例如95％同一性时，设定参数，使得在参考氨基酸序列的全长上计算同一性的百分比并且允许参考序列中的氨基酸残基的总数的同源性的间隔最多至5％。
[0987]
具有在seq id no：138-181和182-185中示出的氨基酸序列的hbcag变体和前体彼此相对类似。因此，提及位于对应于seq id no：186中特定位置的位置处的hbcag变体的氨基酸残基，是指存在于seq id no：186中所示的氨基酸序列中的所述位置的氨基酸残基。这些hbcag变体之间的同源性在大多数情况下在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒中足够高，因此本领域技术人员在查看seq id no：186和seq id no：136中所示的氨基酸序列和特定hbcag变体的氨基酸序列以及鉴定“对应的”氨基酸残基时几乎没有困难。此外，seq id no：182(其显示来源于感染土拨鼠的病毒的hbcag的氨基酸序列)中所示的hbcag氨基酸序列与具有seq id no：186中所示的氨基酸序列的hbcag具有足够的同源性，很明显在seq id no：182中seq id no：186的氨基酸残基155与156之间存在三氨基酸残基插入物。
[0988]
如上文所讨论，游离半胱氨酸残基的消除减少了有毒组分可结合至hbcag的位点的数目，并且还消除了相同或相邻hbcag分子的赖氨酸和半胱氨酸残基可能发生交联的位点。因此，在一些实施方案中，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一个或多个半胱氨酸残基已被缺失或被另一个氨基酸残基取代。
[0989]
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含已去除c末端区域(例如，seq id no：186的氨基酸残基145-185或150-185)的hbcag。因此，适用于本公开的实践的另外的修饰hbcag包括c末端截短突变体。合适的截短突变体包括已从c末端去除1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的hbcag。
[0990]
适用于本公开的实践的hbcag还包括n末端截短突变体。合适的截短突变体包括已从n末端去除1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰hbcag。
[0991]
适用于本公开的实践的其他修饰hbcag包括n和c末端截短突变体。合适的截短突变体包括已从n末端去除1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸以及已从c末端去除1、5、10、15、20、25、30、34个氨基酸的hbcag。
[0992]
在一些实施方案中，包含hbcag多肽的组合物包含与上述截短突变体具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列。
[0993]
在一些实施方案中，将赖氨酸残基引入hbcag多肽中，以介导抗原或抗原决定簇与hbcag的vlp的结合。在一些实施方案中，本文所述的组合物使用包含seq id no：186的氨基酸1-144或1-149、1-185的hbcag制备，所述hbcag经过修饰使得对应于位置79和80的氨基酸被具有氨基酸序列gly-gly-lys-gly-gly(seq id no：187)的肽替换。这些组合物在抗原决定簇与hbcag的vlp偶联的那些实施方案中特别有用。在一些实施方案中，seq id no：186的位置48和107处的半胱氨酸残基突变为丝氨酸。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含对应的多肽，其具有seq id no：138-183中任一个所示的氨基酸序列，其还具有上述氨基酸改变。本公开的范围内还包括能够缔合以形成衣壳或vlp并具有上述氨基酸改变的另外的hbcag变体。因此，本公开还包括以下组合物，其包含有包含与任何野生型氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的hbcag多肽，以及这些蛋白质在适当的情况下被加工以去除n末端前导序列并用上述改变进行修饰的形式。
[0994]
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含不同hbcag的混合物。因此，这些组合物可由氨基酸序列不同的hbcag构成。例如，可制备包含“野生型”hbcag和其中一个或多个氨基酸残基已被改变(例如，缺失、插入或取代)的修饰hbcag的组合物。
[0995]
已经确定了几种rna噬菌体的晶体结构(golmohammadi，r.等人，structure 4：543-554(1996))。使用此类信息，可鉴定表面暴露的残基，并且因此可修饰rna噬菌体外壳蛋白，使得可通过插入或取代来插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，那些修饰形式的噬菌体外壳蛋白也可用于本公开。因此，形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体(例如，噬菌体qβ、噬菌体r17、噬菌体fr、噬菌体ga、噬菌体sp和噬菌体ms2、噬菌体ap 205的外壳蛋白)也可用于制备本文所述的组合物。
[0996]
尽管上文讨论的变体蛋白的序列与其野生型对应物不同，但这些变体蛋白通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还包括还包含形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的组合物，以及用于制备此类组合物的方法、用于制备此类组合物的个别蛋白质亚基和编码这些蛋白质亚基的核酸分子。因此，本公开的范围内包括野生型蛋白的变体形式，其形成衣壳或衣壳样结构并保留缔合和并形成衣壳或衣壳样结构的能力。
[0997]
抗原和抗原决定簇
[0998]
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含与病毒样颗粒结合的抗原或抗原决定簇。本公开提供了根据考虑到所需治疗效果所选择的抗原或抗原决定簇而变化的组合物。适用于本发明的示例性抗原或抗原决定簇公开于美国专利号7,229,624、美国专利号6,964,769和美国专利号7,264,810中，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0999]
抗原可以是任何已知的或仍然未知的种源的抗原。其可从细菌、病毒或其他病原体中分离出来，或者可以是从为此编码的合适核酸的表达获得的重组抗原。其还可从朊病毒、肿瘤、自身分子、非肽半抗原分子、过敏原和激素中分离出来。在一些实施方案中，抗原是重组抗原。当然，抗原的选择取决于所需免疫反应和宿主。
[1000]
在一些实施方案中，针对vlp本身诱导免疫反应。在一些实施方案中，病毒样颗粒与需要增强的免疫反应的抗原/免疫原偶联、融合或以其他方式附接。
[1001]
在一些实施方案中，至少一个抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒融合。如上所述，vlp通常由至少一个组装成vlp的亚基构成。因此，在一些实施方案中，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒或能够掺入vlp中的蛋白质的至少一个亚基融合，产生嵌合的vlp-亚基-抗原融
合物。
[1002]
抗原或抗原决定簇的融合可通过插入到vlp亚基序列中，或通过与vlp-亚基或能够掺入vlp中的蛋白质的n或c末端融合来实现。在下文中，当提及肽与vlp亚基的融合蛋白时，涵盖与亚基序列的任一端的融合或肽在亚基序列内的内部插入。
[1003]
还可通过将抗原或抗原决定簇序列插入vlp亚基的其中部分亚基序列已被缺失的变体(其被进一步称为截短突变体)中来实现融合。截短突变体可具有n或c末端，或vlp亚基的部分序列的内部缺失。例如，具有例如氨基酸残基79至81的缺失的特定vlp hbcag是具有内部缺失的截短突变体。在一些实施方案中，抗原或抗原决定簇与截短突变体vlp-亚基的n或c末端融合。同样，表位向vlp亚基的序列中的融合还可通过取代来实现，例如对于特定的vlp hbcag，氨基酸79-81被外来表位替换。因此，如下文所提及的融合可通过在vlp亚基的序列中插入抗原或抗原决定簇序列，通过用抗原或抗原决定簇取代vlp亚基的部分序列，或通过缺失、取代或插入的组合来实现。
[1004]
嵌合抗原或抗原决定簇-vlp亚基通常能够自组装成vlp。展示与其亚基融合的表位的vlp在本文中也称为嵌合vlp。如所指出的，病毒样颗粒包含至少一个vlp亚基或者替代地由其构成。在一些实施方案中，病毒样颗粒包含嵌合vlp亚基和非嵌合vlp亚基(即不具有与其融合的抗原的vlp亚基)的混合物或者替代地由其构成，从而产生所谓的镶嵌颗粒(mosaic particle)。这可能有利于确保vlp的形成和组装。在那些实施方案中，嵌合vlp-亚基的比例可以是1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。
[1005]
可将旁侧氨基酸残基添加到肽或表位的序列的任一端，以与vlp亚基的序列的任一端融合，或用于将此类肽序列内部插入到vlp亚基的序列中。甘氨酸和丝氨酸残基是在添加到待融合的肽的旁侧序列中使用的特别有利的氨基酸。甘氨酸残基赋予额外的灵活性，这可减少将外来序列融合到vlp亚基序列中的潜在不稳定作用。
[1006]
在一些实施方案中，至少一个抗原或抗原决定簇与qβ外壳蛋白融合。已经描述了表位与qβ的a1蛋白的截短形式的c末端融合或插入a1蛋白内的融合蛋白构建体(kozlovska，t.m.，等人，intervirology，39：9-15(1996))。a1蛋白由uga终止密码子处的遏制产生，并且其长度为329aa或328aa(如果考虑到n末端蛋氨酸的裂解)。在丙氨酸(qβ cp基因编码的第二个氨基酸)之前的n末端蛋氨酸裂解通常发生在大肠杆菌中，并且qβ外壳蛋白的n末端就是这种情况。a1基因部分(uga琥珀密码子的3
′
)编码cp延伸，其长度为195个氨基酸。在cp延伸的位置72与73之间插入至少一个抗原或抗原决定簇导致本发明的其他实施方案(kozlovska，t.m.，等人，intervirology 39：9-15(1996))。在c末端截短的qβ a1蛋白的c末端处抗原或抗原决定簇的融合导致本发明的其他实施方案。例如，kozlovska等人(intervirology，39：9-15(1996))描述了qβ a1蛋白融合物，在所述融合物中表位融合于在位置19处截短的qβ cp延伸的c末端。
[1007]
如kozlovska等人(intervirology，39：9-15(1996))所描述，展示出融合表位的颗粒的组装通常需要a1蛋白-抗原融合物和野生型cp两者的存在以形成镶嵌颗粒。然而，包含病毒样颗粒，并且在此特别是包含rna噬菌体qβ外壳蛋白的vlp的实施方案，其仅由具有与其融合的至少一个抗原或抗原决定簇的vlp亚基构成，也在本公开的范围内。
[1008]
镶嵌颗粒的产生可以多种方式实现。kozlovska等人，intervirology，39：9-15
(1996)描述了三种方法，它们都可用于本公开的实践中。在第一种方法中，融合表位在vlp上的有效展示由编码qβ a1蛋白融合物的质粒的表达介导，所述融合物在大肠杆菌菌株的cp与cp延伸之间具有uga终止密码子，所述菌株含有编码导致uga密码子翻译成trp的克隆的uga抑制性trna的质粒(pism3001质粒(smiley b.k.，等人，gene 134：33-40(1993)))。在另一种方法中，将cp基因终止密码子修饰为uaa，并且共转化表达a1蛋白-抗原融合物的第二质粒。第二质粒编码不同的抗生素抗性并且复制起点与第一质粒相容(kozlovska，t.m.，等人，intervirology 39：9-15(1996))。在第三种方法中，cp和a1蛋白-抗原融合物以双顺反子(bicistronic)方式编码，可操作地连接至启动子诸如trp启动子，如kozlovska等人，intervirology，39：9-15(1996)的图1所述。
[1009]
在一些实施方案中，可利用重组dna技术来将异源蛋白与vlp蛋白融合(kratz，p.a.，等人，proc.natl.acad.sci.usa 96：1915(1999))。例如，本公开涵盖与抗原(或其部分，优选地至少10、20或50个氨基酸)重组融合或化学缀合(包括共价和非共价缀合两者)以产生融合蛋白或缀合物的vlp。融合不一定需要是直接的，但可通过接头序列进行。更一般地说，在根据本发明将与病毒样颗粒融合、缀合或以其他方式附接的表位用作抗原的情况下，通常在表位的一端或两端添加间隔序列或接头序列。此类接头序列优选地包含被蛋白酶体、内体的蛋白酶或细胞的其他囊泡隔室识别的序列。
[1010]
一种偶联方式是通过肽键，其中缀合物可以是邻接多肽，即融合蛋白。在一些实施方案中，不同的肽或多肽在框架内彼此连接以形成邻接多肽。因此，融合蛋白的第一部分包含抗原或免疫原，并且融合蛋白的第二部分(在第一部分的n末端或c末端)包含vlp。替代地，根据本发明还可使用向vlp中的内部插入，在抗原的两端具有任选的连接序列。
[1011]
可将灵活的接头序列(例如，含有聚甘氨酸/聚丝氨酸的序列，诸如[gly4 ser]2(huston等人，meth.enzymol 203：46-88(1991))插入抗原与配体之间的融合蛋白中。另外，融合蛋白可构建为含有“表位标签”，其允许融合蛋白结合抗体(例如，单克隆抗体)，例如以用于标记或纯化目的。表位标签的一个实例是被单克隆抗体yl1/2识别的glu-glu-phe三肽。
[1012]
本公开还涉及含有编码vlp的序列和编码抗原/免疫原的序列的嵌合dna。例如，dna可在用杆状病毒转化的昆虫细胞、在酵母或在细菌中表达。表达系统没有限制，其中有大量可供常规使用的选择。优选地，使用允许大量表达蛋白质的系统。一般来说，使用细菌表达系统是因为它们的效率。适于在本发明范围内使用的细菌表达系统的一个实例是由clarke等人，j.gen.virol.71：1109-1117(1990)；borisova等人，j.virol.67：3696-3701(1993)；和studier等人，methods enzymol.185：60-89(1990)描述的细菌表达系统。合适的酵母表达系统的一个实例是由emr，methods enzymol.185：231-3(1990)描述的酵母表达系统；以前用于制备衣壳蛋白的杆状病毒系统也是合适的。可使用组成型或诱导型表达系统。通过对可用表达系统的选择和可能的修改，有可能控制获得蛋白质的形式。
[1013]
在一些实施方案中，至少一个抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与病毒样颗粒结合。在一些实施方案中，至少一个抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与病毒样颗粒结合，所述共价键是分别导致抗原或抗原决定簇阵列和抗原或抗原决定簇-vlp缀合物的非肽键。由于至少一个抗原或抗原决定簇以取向方式与vlp结合，因此这种抗原或抗原决定簇阵列和缀合物分别通常且优选地具有重复且有序的结构。在一些实施方案中，等于并多
于120、等于并多于180、多于270以及等于并多于360个抗原与vlp结合。重复且有序的抗原或抗原决定簇-vlp阵列和缀合物的形成分别通过至少一个抗原或抗原决定簇分别与vlp的取向和定向以及确定的结合和附接来确保，这将在下文中变得明显。此外，vlp的典型固有的高度重复且有组织的结构有利地有助于以高度有序且重复的方式展示抗原或抗原决定簇，从而分别导致高度有组织且重复的抗原或抗原决定簇-vlp阵列和缀合物。
[1014]
qβ外壳蛋白的vlp或衣壳在其表面展示出确定数量的赖氨酸残基，具有确定的拓扑结构，其中三个赖氨酸残基指向衣壳内部并与rna相互作用，并且另外四个赖氨酸残基暴露在衣壳的外部。这些确定的特性有利于抗原附接至颗粒的外部，而不是附接至赖氨酸残基与rna相互作用的颗粒内部。其他rna噬菌体外壳蛋白的vlp在其表面上也具有确定数量的赖氨酸残基和这些赖氨酸残基的确定拓扑结构。
[1015]
在一些实施方案中，第一附接位点是赖氨酸残基并且/或者第二附接位点包含巯基或半胱氨酸残基。在一些实施方案中，第一附接位点是赖氨酸残基并且第二附接位点是半胱氨酸残基。
[1016]
在一些实施方案中，抗原或抗原决定簇经由半胱氨酸残基与rna噬菌体外壳蛋白的vlp的赖氨酸残基，并且特别是与qβ外壳蛋白的vlp结合。
[1017]
使用vlp作为载剂可允许具有可变抗原密度的稳健抗原阵列和缀合物分别形成。具体地说，使用rna噬菌体的vlp，并且在此特别是使用rna噬菌体qβ外壳蛋白的vlp，允许实现非常高的表位密度。具体地说，通过将例如人aβ 1-6肽与qβ外壳蛋白的vlp偶联，已经达到每个亚基多于1.5个表位的密度(wo 2004/016282)。可使用本技术的教导来制备具有高表位密度的rna噬菌体外壳蛋白的vlp组合物。在一些实施方案中，当抗原或抗原决定簇与vlp qβ外壳蛋白偶联时，使用0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或更高的每个亚基的抗原或抗原决定簇的平均数量。
[1018]
如本文所定义，第二附接位点可与抗原或抗原决定簇天然或非天然存在。在抗原或抗原决定簇上不存在合适的天然存在的第二附接位点的情况下，必须针对抗原对此类非天然第二附接进行工程改造。
[1019]
如上所述，四个赖氨酸残基暴露在qβ外壳蛋白的vlp表面上。通常这些残基在与交联剂分子反应时被衍生化。在不是所有暴露的赖氨酸残基都可以与抗原偶联的情况下，与交联剂反应的赖氨酸残基在衍生化步骤后与附接于正交-氨基(.quadrature.-amino group)的交联剂分子一起留下。这导致一个或几个正电荷消失，这可能不利于vlp的溶解度和稳定性。如在下文描述的公开的qβ外壳蛋白突变体中通过用精氨酸替换一些赖氨酸残基，防止了正电荷的过度消失，因为精氨酸残基不与交联剂反应。此外，用精氨酸替换赖氨酸残基可能导致更确定的抗原阵列，因为可用于与抗原反应的位点更少。
[1020]
在一些实施方案中，暴露的赖氨酸残基在以下qβ外壳蛋白突变体和本文公开的突变体qβ vlp中被精氨酸替换：qβ-240(lys13-arg；seq id no：125)、qβ-250(lys 2-arg、lys13-arg；seq id no：127)和qβ-259(lys 2-arg、lys16-arg；seq id no：129)。
[1021]
在一些实施方案中，qβ突变体外壳蛋白包含一个另外的赖氨酸残基，适用于获得更高密度的抗原阵列。将这种突变体qβ外壳蚤白qβ-243(asn 10-lys；seq id no：126)克隆，使蛋白质表达，并且分离和纯化衣壳或vlp，表明另外的赖氨酸残基的引入与亚基自组
装成衣壳或vlp相容。因此，可使用qβ外壳蛋白突变体的vlp来分别制备抗原或抗原决定簇阵列和缀合物。将抗原附接于vlp，并且特别是附接于rna噬菌体外壳蛋白的vlp的一种特别有利的方法是将存在于rna噬菌体外壳蛋白的vlp表面上的赖氨酸残基与添加至抗原的半胱氨酸残基连接。为了使半胱氨酸残基有效地作为第二附接位点，巯基必须可用于偶联。因此，半胱氨酸残基必须处于其还原状态，即，游离半胱氨酸或具有游离巯基的半胱氨酸残基必须可用。在充当第二附接位点的半胱氨酸残基处于氧化形式的情况下，例如如果其正在形成二硫键，则需要用例如dtt、tcep或β-巯基乙醇还原此二硫键。必须针对每个抗原调整还原剂的浓度和还原剂相对于抗原的摩尔过量。测试了滴定范围，从低至10μm或更低的浓度开始，直至10至20mm或更高的还原剂(如果需要的话)，并且评估了抗原与载剂的偶联。尽管如wo 02/056905中所描述，低浓度的还原剂与偶联反应相容，但如技术人员所知，较高浓度抑制偶联反应，在这种情况下，必须例如通过渗析、凝胶过滤或反相hplc，来去除还原剂或降低其浓度。有利地，渗析或平衡缓冲液的ph低于7，优选地6。必须测试低ph缓冲液与抗原活性或稳定性的相容性。
[1022]
rna噬菌体外壳蛋白的vlp上的表位密度可通过选择交联剂和其他反应条件来调节。例如，交联剂sulfo-gmbs和smph通常允许达到高表位密度。衍生化受到高浓度反应物的积极影响，并且反应条件的操作可用于控制与rna噬菌体外壳蛋白的vlp，并且特别是与qβ外壳蛋白的vlp偶联的抗原数目。
[1023]
在设计非天然第二附接位点之前，必须选择其应融合、插入或通常工程改造的位置。第二附接位点位置的选择，例如，可基于抗原的晶体结构。抗原的此类晶体结构可提供关于分子的c或n末端的可用性(例如根据它们对溶剂的可及性确定)或关于适于用作第二附接位点的残基(诸如半胱氨酸残基)暴露于溶剂的信息。与fab片段的情况一样，暴露的二硫键也可为第二连接位点的来源，因为它们通常可通过使用例如2-巯基乙胺、tcep、β-巯基乙醇或dtt的温和还原来转化为单一半胱氨酸残基。将选择不影响抗原的免疫原性的温和还原条件。一般来说，在用自身抗原免疫的目的是抑制这种自身抗原与其天然配体的相互作用的情况下，将添加第二附接位点，使得允许产生针对与天然配体相互作用的位点的抗体。因此，将选择第二附接位点的位置，使得避免来自第二附接位点或任何含有所述位点的氨基酸接头的空间位阻。在其他实施方案中，需要针对不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点的位点的抗体反应。在此类实施方案中，可选择第二附接位点，使得其防止产生针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。
[1024]
选择第二附接位点的位置的其他标准包括抗原的低聚化状态、低聚化的位点、辅因子的存在以及公开抗原结构和序列中的位点的实验证据的可用性，其中抗原的修饰与自身抗原的功能或与识别自身抗原的抗体的产生相容。
[1025]
在一些实施方案中，抗原或抗原决定簇包含能够分别与核心颗粒和vlp或vlp亚基上的第一附接位点缔合的单一第二附接位点或单一反应性附接位点。这进一步确保了至少一个，但通常多于一个，优选地多于10、20、40、80、120、150、180、210、240、270、300、360、400、450个抗原分别与核心颗粒和vlp的确定且均一的结合和缔合。因此，在抗原上提供单一第二附接位点或单一反应性附接位点确保了单一且均一的结合和缔合类型，分别导致非常高度有序且重复的阵列。例如，如果结合和缔合分别通过赖氨酸(作为第一附接位点)相互作用和半胱氨酸(作为第二附接位点)相互作用实现，则根据本发明的一个实施方案确保
每个抗原只有一个半胱氨酸残基(无论此半胱氨酸残基是天然地还是非天然地存在于抗原上)能够分别与分别vlp和核心颗粒的第一附接位点结合和缔合。
[1026]
在一些实施方案中，将第二附接位点工程改造到抗原上需要融合含有根据本发明的公开内容适合作为第二附接位点的氨基酸的氨基酸接头。因此，在一些实施方案中，氨基酸接头通过至少一个共价键与抗原或抗原决定簇结合。在一些实施方案中，氨基酸接头包含第二附接位点。在一些实施方案中，氨基酸接头包含巯基或半胱氨酸残基。在一些实施方案中，氨基酸接头是半胱氨酸。
[1027]
在一些实施方案中，病毒样颗粒包含至少一个第一附接位点并且抗原或抗原决定簇包含至少一个第二附接位点。在一些实施方案中，第一附接位点包含氨基或赖氨酸残基。在一些实施方案中，第二附接位点选自由以下组成的组：(a)非天然存在于所述抗原或抗原决定簇内的附接位点；以及(b)天然存在于所述抗原或抗原决定簇内的附接位点。在一些实施方案中，第二附接位点包含巯基或半胱氨酸残基。在一些实施方案中，抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒的结合通过第一附接位点与第二附接位点之间的缔合来实现，其中缔合是通过至少一个非肽键进行的，并且其中抗原或抗原决定簇和病毒样颗粒通过所述缔合相互作用以形成有序且重复的抗原阵列。在一些实施方案中，第一附接位点是赖氨酸残基并且第二附接位点是半胱氨酸残基。在一些实施方案中，第一附接位点是氨基并且第二附接位点是巯基。
[1028]
本公开适用于多种抗原。在一些实施方案中，抗原是蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，抗原是dna。抗原也可以是脂质、碳水化合物或有机分子，特别是小有机分子，诸如尼古丁。
[1029]
用于制备vlp和在vlp中包装rlr激动剂的方法
[1030]
用于分别表达外壳蛋白和突变体外壳蛋白，导致自组装成vlp的方法描述于美国专利号7,138,252中，所述专利以引用的方式整体并入。合适的大肠杆菌菌株包括但不限于大肠杆菌k802、jm 109、rr1。合适的载体和菌株及其组合可通过以下方式来鉴定：通过sds-page分别测试外壳蛋白和突变体外壳蛋白的表达；以及通过任选地首先通过凝胶过滤来纯化衣壳并随后在免疫扩散测定(ouchterlony测试)或电子显微镜中对它们进行测试来测试衣壳形成和组装(kozlovska，t.m.等人，gene 137：133-37(1993))。
[1031]
使用来源于rna噬菌体的vlp的一个优势是它们在细菌中的表达产量高，允许以负担得起的成本产生大量材料。用于制造本文所述的病毒样颗粒的方法(包括可扩展至商业规模的方法)描述于美国专利号9,518,095和9,657,065中，所述专利以引用的方式整体并入本文。
[1032]
本公开还提供了一种产生包含vlp和包装到vlp中的rlr激动剂的组合物的方法，所述方法包括将vlp与rlr激动剂一起孵育，添加rna酶以及纯化所述组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括将抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合的步骤。在一些实施方案中，在将病毒样颗粒与rlr激动剂一起孵育之前，将抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在一些实施方案中，在纯化组合物之后，将抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在一些实施方案中，所述方法包括将vlp与rna酶一起孵育，添加rlr激动剂以及纯化组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括将抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合的步骤。在一些实施方案中，在将病毒样颗粒与rna酶一起孵育之前，将抗原或抗原决定簇与病毒样颗
粒结合。在一些实施方案中，在纯化组合物之后，将抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在一些实施方案中，vlp在细菌表达系统中产生。在另一个实施方案中，rna酶是rna酶a。
[1033]
本公开还提供了一种产生包含包装在vlp中的rlr激动剂的组合物的方法，所述方法包括拆卸vlp、添加rlr激动剂以及重新组装vlp。在一些实施方案中，拆卸的vlp在制造vlp时产生。在一些实施方案中，拆卸的vlp包含外壳蛋白的分离二聚体(例如，qβ二聚体)。在一些实施方案中，分离二聚体围绕rlr激动剂组装成vlp以将激动剂包装到vlp中。所述方法还可包括去除拆卸的vlp的核酸和/或在重新组装后纯化组合物。在一些实施方案中，所述方法还包括将抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合的步骤。在一些实施方案中，在拆卸病毒样颗粒之前，将抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。在一些实施方案中，在重新组装病毒样颗粒之后并且优选地在纯化组合物之后，将抗原或抗原决定簇与病毒样颗粒结合。
[1034]
本公开提供了抗原或抗原决定簇与vlp结合的方法。如所指出的，在一些实施方案中，至少一个抗原或抗原决定簇通过化学交联的方式，通常且优选地通过使用异双功能交联剂与vlp结合。几种异双功能交联剂是本领域已知的。在一些实施方案中，异双功能交联剂含有可与第一附接位点(即与vlp或至少一个vlp亚基的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的官能团，以及可与第二附接位点反应的另外的官能团(即与抗原或抗原决定簇融合，并且任选地还可通过还原进行反应的半胱氨酸残基)。过程的第一步，通常称为衍生化，是vlp与交联剂的反应。这种反应的产物是活化的vlp，也称为活化载剂。在第二步中，使用诸如凝胶过滤或渗析的常用方法去除未反应的交联剂。在第三步中，抗原或抗原决定簇与活化的vlp反应，并且这个步骤通常称为偶联步骤。未反应的抗原或抗原决定簇可任选地在第四步中例如通过渗析去除。几种异双功能交联剂是本领域已知的。这些包括交联剂smph(pierce)、sulfo-mbs、sulfo-emcs、sulfo-gmbs、sulfo-siab、sulfo-smpb、sulfo-smcc、svsb、sia以及例如可从pierce chemical company(rockford，ill，usa)获得，并且具有一个对氨基有反应性的官能团和一个对半胱氨酸残基有反应性的官能团的其他交联剂。上述交联剂全部都导致形成硫醚键联。另一类合适的交联剂的特征在于在偶联时在抗原或抗原决定簇与vlp之间引入二硫键联。在一个实施方案中，属于这一类的交联剂包括例如spdp和sulfo-lc-spdp(pierce)。vlp与交联剂的衍生程度可受到不同的实验条件的影响，诸如每种反应伴侣(reaction partner)的浓度、一种试剂相对于另一种试剂的过量、ph、温度和离子强度。偶联程度，即每个vlp亚基的抗原或抗原决定簇的量，可通过改变上述实验条件来调整以匹配疫苗的要求。
[1035]
在一些实施方案中，抗原或抗原决定簇与vlp结合的方法包括将vlp表面上的赖氨酸残基与抗原或抗原决定簇上的半胱氨酸残基连接。在一些实施方案中，可能需要将含有半胱氨酸残基作为第二附接位点或其一部分的氨基酸接头与抗原或抗原决定簇融合以实现与vlp的偶联。
[1036]
在一些实施方案中，使用柔性氨基酸接头。氨基酸接头的实例选自由以下组成的组：(a)cgg；(b)n末端γ1-接头；(c)n末端γ3-接头；(d)ig铰链区；(e)n末端甘氨酸接头；(f)(g)kc(g)n，其中n＝0-12并且k＝0-5；(g)n末端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(g)kc(g)m(s)l(ggggs)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(seq id no：188)；(i)ggc；(k)ggc-nh2；(1)c末端γ1-接头；(m)c末端γ3-接头；(n)c末端甘氨酸接头；(o)(g)nc(g)k，其中n＝0-12
并且k＝0-5；(p)c末端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(g)m(s)l(ggggs)n(g)oc(g)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2并且o＝0-8(seq id no：189)。
[1037]
氨基酸接头的其他实例是免疫球蛋白的铰链区、甘氨酸丝氨酸接头(ggggs)n(seq id no：190)和甘氨酸接头(g)n，它们全部都进一步含有半胱氨酸残基作为第二附接位点和任选地另外的甘氨酸残基。所述氨基酸接头的典型实例是n末端γ1：cgdkthtspp(seq id no：191)；c末端γ1：dkthtsppcg(seq id no：192)；n末端γ3：cggpkpstppgssggap(seq id no：193)；c末端γ3：pkpstppgssggapggcg(seq id no：194)；n末端甘氨酸接头：gcgggg(seq id no：195)；c末端甘氨酸接头：ggggcg(seq id no：196)；c末端甘氨酸-赖氨酸接头：ggkkgc(seq id no：197)；n末端甘氨酸-赖氨酸接头：cgkkgg(seq id no：198)。
[1038]
在一些实施方案中，当疏水性抗原或抗原决定簇与vlp结合时，其他氨基酸接头是用于n末端接头的cgkkgg(seq id no：199)或cgdegg(seq id no：200)或者用于c末端接头的ggkkgc(seq id no：201)和ggedgc(seq id no：202)。对于c末端接头，末端半胱氨酸任选地是c末端酰胺化的。
[1039]
在一些实施方案中，将肽的c末端处的ggcg(seq id no：203)、ggc或ggc-nh2(“nh2”代表酰胺化)接头或其n末端处的cgg用作氨基酸接头。一般来说，甘氨酸残基将插入在大的氨基酸与待用作第二附接位点的半胱氨酸之间，以避免在偶联反应中较大氨基酸的潜在空间位阻。在一些实施方案中，氨基酸接头ggc-nh2与抗原或抗原决定簇的c末端融合。
[1040]
存在于抗原或抗原决定簇上的半胱氨酸残基必须处于其还原状态以与活化的vlp上的异双功能交联剂反应，即游离半胱氨酸或具有游离巯基的半胱氨酸残基必须可用。在充当结合位点的半胱氨酸残基处于氧化形式的情况下，例如如果其正在形成二硫键，则需要用例如dtt、tcep或β-巯基乙醇还原此二硫键。低浓度的还原剂与如wo 02/05690中所描述的偶联相容，如技术人员所知，较高浓度抑制偶联反应，在这种情况下，必须在偶联之前，例如通过渗析、凝胶过滤或反相bplc，来去除还原剂或降低其浓度。
[1041]
根据上述方法，通过使用异双功能交联剂将抗原或抗原决定簇与vlp结合，允许抗原或抗原决定簇以取向方式与vlp偶联。将抗原或抗原决定簇与vlp结合的其他方法包括使用碳二亚胺edc和nhs将抗原或抗原决定簇与vlp交联的方法。在进一步的方法中，抗原或抗原决定簇使用同双功能交联剂诸如戊二醛、dsg、bm[peo]4、bs3(pierce chemical company，rockford，ill.，usa)或其他已知的同双功能交联剂附接于vlp，这些交联剂具有对vlp的胺基或羧基有反应性的官能团。
[1042]
将vlp与抗原或抗原决定簇结合的其他方法包括将vlp生物素化，并且将抗原或抗原决定簇表达为链霉亲和素融合蛋白的方法，或将抗原或抗原决定簇和vlp两者生物素化的方法，例如如wo 00/23955中所述。在这种情况下，可通过调整抗原或抗原决定簇与链霉亲和素的比使抗原或抗原决定簇首先与链霉亲和素或亲和素结合，使得游离结合位点仍然可用于结合在下一步中添加的vlp。替代地，所有组分可在“一锅”反应中混合。可将其他配体-受体对(当受体和配体的可溶形式可用，并且能够与vlp或抗原或抗原决定簇交联时)用作将抗原或抗原决定簇与vlp结合的结合剂。替代地，配体或受体可与抗原或抗原决定簇融合，并且因此介导与分别化学结合或融合至受体或配体的vlp的结合。融合还可通过插入或取代来实现。
[1043]
药物组合物和制剂
[1044]
在某些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含rlr激动剂和药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。
[1045]
在某些实施方案中，可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。在某些实施方案中，制剂材料用于皮下和/或静脉内施用。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于调节、维持或保持例如组合物的ph、渗透压摩尔浓度(osmolality)、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的制剂材料。在某些实施方案中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(诸如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(诸如硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；增积剂(诸如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(诸如乙二胺四乙酸(edta))；络合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；双糖；和其他碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(诸如钠)；防腐剂(诸如氯化苯甲烃铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞(thimerosal)、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(诸如甘露糖醇或山梨糖醇)；助悬剂；表面活性剂或润湿剂(诸如普朗尼克(pluronic)、peg、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯(诸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、曲通(triton)、缓血酸胺(tromethamine)、卵磷脂(lecithin)、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂(诸如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(诸如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾)、甘露糖醇山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(remington
′
s pharmaceutical sciences，第18版，a.r.gennaro编，mack publishing company(1995))。在某些实施方案中，制剂包含pbs；20mm naoac(ph 5.2)、50mm nacl；和/或10mm naoac(ph 5.2)、9％蔗糖。在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的施用途径、递送形式和所需剂量来确定。参见例如remington
′
s pharmaceutical sciences，同上。在某些实施方案中，此类组合物可影响rlr激动剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和/或体内清除速率。
[1046]
在某些实施方案中，药物组合物中的主要媒介物或载剂在性质方面可以是水性或非水性。例如，在某些实施方案中，合适的媒介物或载剂可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能补充有用于胃肠外施用的组合物中常见的其他材料。在某些实施方案中，盐水包括等渗磷酸盐缓冲盐水。在某些实施方案中，中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其他示例性媒介物。在某些实施方案中，药物组合物包含ph约7.0-8.5的tris缓冲液或ph约4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其还可包含山梨糖醇或其合适的替代物。在某些实施方案中，可通过将具有所需纯度的所选组合物与任选的配制剂(remington
′
s pharmaceutical sciences，同上)以冻干饼或水溶液的形式混合来制备包含rlr激动剂的组合物以供储存。此外，在某些实施方案中，包含rlr激动剂的组合物可使用合适的赋形剂诸如蔗糖配制成冻干物。
[1047]
在某些实施方案中，可选择药物组合物以用于胃肠外递送。在某些实施方案中，可选择组合物以用于吸入或通过消化道(诸如口服)递送。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。
[1048]
在某些实施方案中，制剂组分以对于施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲剂用于维持组合物在生理ph或略微较低的ph下，通常在约5至约8的ph范围内。
[1049]
在某些实施方案中，当考虑胃肠外施用时，治疗组合物可以是在药学上可接受的媒介物中的包含rlr激动剂的无热原、胃肠外可接受的水溶液的形式。在某些实施方案中，用于胃肠外注射的媒介物是无菌蒸馏水，在无菌蒸馏水中将rlr激动剂配制成无菌等渗溶液并适当保存。在某些实施方案中，制备可涉及将所需分子与可提供产品控制或持续释放因而所述产品可经由贮库式注射递送的递送媒介物或剂，诸如可注射微球、生物可侵蚀颗粒、聚合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸或聚乙烯亚胺(例如，))、珠或脂质体一起配制。在某些实施方案中，还可使用透明质酸，并且其可具有促进在循环中的持续时间的作用。在某些实施方案中，可植入的药物递送装置可用于引入所需分子。
[1050]
在某些实施方案中，可配制药物组合物来用于吸入。在某些实施方案中，rlr激动剂可配制成干粉以用于吸入。在某些实施方案中，包含rlr激动剂的吸入溶液可与推进剂一起配制用于气溶胶递送。在某些实施方案中，溶液可以是雾化的。在pct申请号pct/us94/001875中进一步描述了肺部施用，所述专利描述了化学修饰蛋白的肺部递送。
[1051]
在某些实施方案中，考虑了制剂可口服施用。在某些实施方案中，以这种方式施用的rlr激动剂可与或不与通常用于混配固体剂型诸如片剂和胶囊的那些载剂一起配制。在某些实施方案中，胶囊可被设计来在于胃肠道中时释放制剂的活性部分，此时生物利用度最大，并且系统前降解最小。在某些实施方案中，可包括至少一种另外的剂以促进rlr激动剂的吸收。在某些实施方案中，还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、助悬剂、片剂崩解剂和粘合剂。
[1052]
在某些实施方案中，药物组合物可包括有效数量的rlr激动剂或rig-vlp与适用于制造片剂的无毒赋形剂的混合物。在某些实施方案中，通过将片剂溶解于无菌水或另一种适当媒介物中，可制备呈单位剂量形式的溶液。在某些实施方案中，合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠或碳酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，诸如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，诸如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。
[1053]
其他药物组合物对本领域技术人员来说是显而易见的，包括涉及呈持续或控制递送制剂形式的rlr激动剂或rig-vlp的制剂。在某些实施方案中，用于配制多种其他持续或控制递送手段的技术，诸如脂质体载剂、生物可侵蚀微粒或多孔珠和贮库型注射剂，也是本领域技术人员已知的。参见例如pct申请号pct/us93/00829，所述专利描述了用于药物组合物递送的多孔聚合物微粒的控制释放。在某些实施方案中，持续释放制剂可包括呈成形物品形式的半渗透聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(美国专利号3,773,919和ep 058,481)、l-谷氨酸和γ乙基-l-谷氨酸的共聚物(sidman等人，biopolymers，22：547-556(1983))、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(langer等人，j.biomed.mater.res.，15：167-277(1981)和langer，chem.tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(langer等人，同上)或聚-d(-)-3-羟基丁酸(ep 133,988)。在某些实施方案中，持续释放组合物还可包含脂质体，其可通过本领域已知的几种方法中的任一种来制备。参见例如，eppstein等人，proc.natl.acad.sci.usa，82：3688-3692(1985)；ep 036,676；ep 088,046和ep 143,949。
[1054]
待用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。在某些实施方案中，这可通过经无
菌滤膜过滤来完成。在某些实施方案中，当组合物被冻干时，使用这种方法的灭菌可在冻干和复原之前或之后进行。在某些实施方案中，用于胃肠外施用的组合物可以冻干形式或溶液形式储存。在某些实施方案中，通常将胃肠外组合物放置在具有无菌接取口的容器，例如具有可用皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。
[1055]
在某些实施方案中，一旦药物组合物已被配制，其即可以溶液、混悬液、凝胶剂、乳液、固体形式或以脱水或冻干粉末形式储存在无菌小瓶中。在某些实施方案中，此类制剂可以即用形式或以在施用之前复原的形式(例如，冻干形式)储存。
[1056]
在某些实施方案中，提供用于产生单一剂量施用单位的药盒。在某些实施方案中，药盒可含有具有干燥的蛋白质的第一容器和具有水性制剂的第二容器两者。在某些实施方案中，包括含有单室和多室的预填充注射器(例如液体注射器和冻干注射器(lyosyringe))的药盒。
[1057]
在某些实施方案中，待治疗性采用的包含rlr激动剂或rig-vlp的药物组合物的有效量将取决于例如治疗背景和目标。因此，本领域的技术人员应理解，根据某些实施方案，用于治疗的适当剂量水平将部分地取决于以下因素：所递送分子、使用rlr激动剂或rig-vlp所针对的适应症、施用途径和患者的体型(体重、体表面积或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)。在某些实施方案中，临床医师可进行剂量滴定并修改施用途径以获得最佳治疗效果。
[1058]
在某些实施方案中，给药频率将考虑所用制剂中rlr激动剂或rig-vlp的药物动力学参数。在某些实施方案中，临床医师将施用组合物直至达到实现所需效果的剂量。在某些实施方案中，因此，组合物可以单剂量形式，或随时间以两次或更多次剂量(其可能含有或可能不含有相同量的所需分子)形式施用，或经由植入装置或导管以连续输注形式施用。适当剂量的进一步细化由本领域普通技术人员按常规进行并且处于由其常规执行的任务范围内。在某些实施方案中，可通过使用适当剂量-反应数据确定适当剂量。
[1059]
在某些实施方案中，药物组合物的施用途径与已知方法一致，例如口服，通过静脉内、腹膜内、脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、皮下、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；通过持续释放系统或植入装置。在某些实施方案中，组合物可通过弹丸式注射施用，或通过输注连续施用，或通过植入装置施用。在某些实施方案中，可通过不同途径施用组合疗法的个别要素。
[1060]
在某些实施方案中，组合物可经由植入上面已吸附或囊封有所需分子的膜、海绵或另一种适当材料来局部施用。在某些实施方案中，当使用植入装置时，所述装置可植入任何合适的组织或器官中，并且所需分子的递送可经由扩散、定时释放弹丸式或连续施用来实现。在某些实施方案中，以离体方式使用包含rlr激动剂的药物组合物是合乎需要的。在此类情况下，将已从患者体内取出的细胞、组织和/或器官暴露于包含rlr激动剂或rig-vlp的药物组合物，随后将细胞、组织和/或器官植入回患者体内。
[1061]
在某些实施方案中，rlr激动剂或rig-vlp可使用诸如本文所述的那些方法，通过植入某些已经过基因工程改造的细胞来递送，以表达和分泌激动剂。在某些实施方案中，此类细胞可以是动物或人细胞，并且可以是自体的、异源的或异种的。在某些实施方案中，细胞可以是永生化的。在某些实施方案中，为了减少免疫反应的机会，可将细胞囊封以避免周围组织的浸润。在某些实施方案中，囊封材料通常是允许蛋白产物释放但防止患者的免疫
系统或来自周围组织的其他有害因素破坏细胞的生物相容性、半渗透聚合物外壳或膜。
[1062]
在一些方面，本公开提供了一种药物组合物，其包含根据本公开的用于刺激有需要的受试者的免疫反应、治疗其癌症或延缓其癌症的进展或者减少或抑制其肿瘤生长的rlr激动剂或rig-vlp以及药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，rlr激动剂被配制在聚乙烯亚胺(pei)载剂中。在一些实施方案中，pei载剂是
[1063]
应用
[1064]
本文所述的组合物可用于诊断和治疗应用。例如，可检测标记rlr激动剂或rig-vlp可用于检测样品(例如，生物样品)中靶蛋白的存在或量的测定。所述组合物可用于研究靶功能的抑制(例如，rlr介导的细胞信号传导或反应)的体外测定。在例如组合物结合并激活靶标(例如，蛋白质或多肽)的一些实施方案中，所述组合物可在设计成鉴定另外的新型化合物的测定中用作阳性对照，所述新型化合物同样诱导靶蛋白或多肽的活性和/或另外可用于治疗与靶蛋白或多肽相关的病症。例如，rlr激活组合物可用作鉴定诱导、增加或刺激rlr功能的另外的化合物(例如，小分子、适体或抗体)的测定中的阳性对照。所述组合物还可用于如下详述的治疗方法。
[1065]
药盒
[1066]
药盒可包括如本文公开的rlr激动剂或rig-vlp以及使用说明。药盒可在合适的容器中包括rlr激动剂、一种或多种对照以及本领域众所周知的各种缓冲液、试剂、酶和其他标准成分。
[1067]
容器可包括至少一个其中可放置并且在一些情况下适当地等分rlr激动剂或rig-vlp的小瓶、孔、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器部件。在提供额外组分的情况下，药盒可含有可放置所述组分的额外容器。药盒还可包括用于容纳rlr激动剂或rig-vlp和任何其他紧密封闭用于商业销售的试剂容器的部件。此类容器可包括其中保留所需小瓶的注塑或吹塑的塑料容器。容器和/或药盒可包括具有使用说明和/或警告的标记。
[1068]
在一些方面，本公开提供了一种药盒，其包括本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp，或包括本公开提供的药物组合物和在刺激受试者的免疫反应、或治疗受试者的癌症或延缓其癌症的进展、或抑制其肿瘤生长中的使用说明，任选地有与一种或多种另外的治疗剂组合的使用说明。
[1069]
在一些实施方案中，激动剂或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用，其中一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如，调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
[1070]
在一些实施方案中，rlr激动剂或药物组合物在一种或多种另外的治疗剂的施用之前或之后施用，或者其中一种或多种另外的治疗剂与rlr激动剂或药物组合物的施用同时、在其之前或之后施用。
[1071]
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是pd-1/pd-l1拮抗剂、tim-3拮抗剂、vista拮抗剂、腺苷a2ar拮抗剂、b7-h3拮抗剂、b7-h4拮抗剂、btla拮抗剂、ctla-4拮抗剂、ido拮抗剂、kir拮抗剂、lag-3拮抗剂、toll样受体3(tlr3)激动剂、toll样受体7(tlr7)激动剂、toll样受体9(tlr9)激动剂。
[1072]
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是包含特异性结合至cd137(4-1bb)
的多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
[1073]
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是包含特异性结合至cd134(ox40)的多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)的激动剂。
[1074]
使用方法
[1075]
本发明的组合物具有多种体外和体内效用，包括rlr的检测和/或量化和/或rlr功能的激动。
[1076]
上述组合物尤其可用于治疗或预防受试者的多种癌症或感染性疾病的方法。可使用多种方法将组合物施用于受试者，例如人受试者，所述方法部分取决于施用途径。所述途径可以是例如静脉内注射或输注(iv)、皮下注射(sc)、皮内注射(id)、腹膜内(ip)注射、肌肉内注射(im)、瘤内注射(it)或鞘内注射。注射可以是弹丸式或连续输注。
[1077]
施用可通过例如局部输注、注射或通过植入物来实现。植入物可以是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜诸如硅橡胶膜(sialastic membranes，或纤维。植入物可被配置用于向受试者持续或周期性地释放组合物。参见例如，美国专利申请公布号20080241223；美国专利号5,501,856；4,863,457；和3,710,795；ep488401；和ep 430539，所述专利各自的公开内容以引用的方式整体并入本文。可通过基于例如扩散、可侵蚀或对流系统的例如以下的可植入装置将组合物递送至受试者：渗透压泵、可生物降解的植入物、电扩散系统、电渗系统、蒸汽压力泵、电解泵、泡腾泵、压电泵、基于侵蚀的系统或机电系统。
[1078]
在一些实施方案中，通过局部施用将rlr激动剂治疗性递送至受试者。在一些实施方案中，rlr激动剂被包装到vlp中。在一个实施方案中，rlr激动剂与抗原一起治疗性递送。在其他实施方案中，vlp可与抗原偶联。在其他实施方案中，rlr激动剂被包装到vlp中并与偶联至抗原的单独的vlp组合施用。
[1079]
本文所述的rlr激动剂或rig-vlp的合适剂量(所述剂量能够治疗或预防受试者的癌症)可取决于多种因素，包括例如待治疗的受试者的年龄、性别和体重以及所使用的特定抑制剂化合物。影响向受试者施用的剂量的其他因素包括例如癌症或感染性疾病的类型或严重性。例如，患有转移性黑色素瘤的受试者可能需要施用与患有胶质母细胞瘤的受试者不同剂量的rlr激动剂或rig-vlp。其他因素可包括例如同时或之前影响受试者的其他医学病症、受试者的一般健康状况、受试者的遗传倾向、饮食、施用时间、排泄速率、药物组合以及施用于受试者的任何其他另外的治疗剂。还应该理解，任何特定受试者的具体剂量和治疗方案也将取决于治疗医师(例如，医生或护士)的判断。合适的剂量在本文中描述。
[1080]
药物组合物可包含治疗有效量的本文所述的rlr激动剂或其rig-vlp。本领域普通技术人员可部分地基于所施用的rlr激动剂或rig-vlp的效果或者rlr激动剂或rig-vlp与一种或多种另外的活性剂(如果使用多于一种剂)的组合效果容易地确定此类有效量。本文所述的rlr激动剂或rig-vlp的治疗有效量还可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及激动剂(和一种或多种另外的活性剂)引出个体的所需反应(例如，肿瘤生长的减少)的能力的因素而变化。例如，治疗有效量的rlr激动剂或rig-vlp可抑制(减轻其严重性或消除其发生)和/或预防特定病症，和/或本领域已知或本文所述的特定病症的症状中的任一种。治疗有效量也是其中组合物的任何毒性或有害作用被治疗有益效果胜过的量。
[1081]
本文所述的任何rlr激动剂或rig-vlp的合适人剂量可在例如i期剂量递增研究中进一步评价。参见例如van gurp等人(2008)am j transplantation 8(8)：1711-1718；
hanouska等人(2007)clin cancer res 13(2，第1部分)：523-531；和hetherington等人(2006)antimicrobial agents and chemotherapy 50(10)：3499-3500。
[1082]
在一些实施方案中，组合物含有本文所述的任何rlr激动剂或rig-vlp和一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或十一种或更多种)另外的治疗剂，使得组合物作为整体是治疗有效的。例如，组合物可含有本文所述的rlr激动剂或rig-vlp和烷化剂，其中激动剂和剂各自处于当组合时对治疗或预防受试者的癌症(例如，黑色素瘤)治疗有效的浓度。
[1083]
此类组合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物(例如，本文所述的任何癌症的动物模型)中的已知药学程序确定。这些程序可用于例如确定ld
50
(对50％群体致死的剂量)和ed
50
(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗效果之间的剂量比是治疗指数并且其可表示为比率ld
50
/ed
50
。表现出高治疗指数的rlr激动剂或rig-vlp是优选的。虽然可使用表现出毒性副作用的组合物，但是应谨慎设计将此类化合物靶向受影响的组织的部位的递送系统，并且使对正常细胞的潜在损害降至最小，并由此减少副作用。
[1084]
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。对于本文所述的rlr激动剂或rig-vlp，治疗有效剂量可最初从细胞培养测定估计。可在动物模型中配制剂量以达到包括如在细胞培养中确定的ec
50
(即，达到症状的半数最大抑制的激动剂的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定在人体内的有用剂量。血浆中的水平可例如通过高效液相色谱法来测量。在例如需要局部施用(例如，至眼睛或关节)的一些实施方案中，细胞培养或动物模型可用于确定在局部部位内达到治疗有效浓度所需的剂量。
[1085]
在一些实施方案中，所述方法可与癌症或感染性疾病的其他疗法结合执行。例如，组合物可在放射、外科手术、靶向或细胞毒性化学疗法、化学放射疗法、激素疗法、免疫疗法、基因疗法、细胞移植疗法、精准医学、基因组编辑疗法或其他药物疗法的同时、之前或之后施用于受试者。
[1086]
如上所述，本文所述的组合物(例如，rlr激动剂或rig-vlp组合物)可用于治疗多种癌症，诸如但不限于：卡波西氏肉瘤(kaposi
′
s sarcoma)、白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、成髓细胞早幼粒细胞粒单核细胞红细胞自血病、慢性白血病、慢性髓细胞(粒细胞)白血病、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(burkitt
′
s lymphoma)、边缘区b细胞淋巴瘤、真性红细胞增多症、霍奇金氏病(hodgkin
′
s disease)、非霍奇金氏病、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(waldenstrom
′
s macroglobulinemia)、重链病、实性瘤、肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(ewing
′
s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠肉瘤、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤(wilm
′
s tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑血管瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、鼻咽癌、食管癌、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌症、骨癌、脑和中枢神经
系统(，cns)癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结直肠癌症、结缔组织癌、消化系统癌、子宫内膜癌、食道癌、眼癌、头颈癌、胃癌(gastric cancer)、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌症(小细胞肺癌症、大细胞肺癌症)、黑色素瘤、神经母细胞瘤；口腔癌(例如，唇癌、舌癌、口腔癌和咽癌)、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌；呼吸系统癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌(stomach cancer)、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌和泌尿系统癌。
[1087]
在一些实施方案中，本公开提供了一种疫苗，其包含包装到vlp中的rlr激动剂以及与vlp结合的抗原或抗原决定簇。在一些实施方案中，疫苗诱导针对与vlp结合的抗原或抗原决定簇的免疫反应。在一些实施方案中，疫苗是预防性的。在一些实施方案中，疫苗是治疗性的。在一些实施方案中，与vlp结合的抗原或抗原决定簇是癌症或肿瘤抗原，并且因此疫苗诱导抗肿瘤免疫反应。在一些实施方案中，疫苗诱导保护性免疫。
[1088]
在一些方面，本公开提供了一种增加细胞中rlr介导的一种或多种细胞因子的产生的方法，所述方法包括使细胞与本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp接触，其中激动剂增加细胞中rlr介导的细胞因子产生。
[1089]
在一些方面，本公开提供了一种增加细胞中rlr介导的一种或多种干扰素刺激基因的表达的方法，所述方法包括使细胞与本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp接触，其中激动剂增加细胞中rlr介导的一种或多种干扰素刺激基因的表达。
[1090]
在一些方面，本公开提供了一种增加细胞中rlr依赖性胞内信号传导的方法，所述方法包括使细胞与本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp接触，其中激动剂增加rlr依赖性胞内信号传导。
[1091]
在一些方面，本公开提供了一种刺激受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp，或本公开提供的药物组合物。
[1092]
在一些方面，本公开提供了一种治疗受试者的癌症或延缓其癌症的进展的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp，或本公开提供的药物组合物。
[1093]
在一些方面，本公开提供了一种减少或抑制有需要的受试者的肿瘤生长的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp，或本公开提供的药物组合物。
[1094]
在一些方面，本公开提供了一种用于刺激有需要的受试者的免疫反应、治疗其癌症或延缓其癌症的进展或抑制其肿瘤生长的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp，或本公开提供的药物组合物，其中激动剂或药物组合物增加细胞中rlr介导的一种或多种细胞因子的产生，增加细胞中rlr介导的一种或多种干扰素刺激基因的表达和/或增加细胞中rlr依赖性胞内信号传导，从而刺激免疫反应，治疗癌症或延缓癌症的进展或抑制肿瘤的生长。
[1095]
rlr激动剂与另外的治疗剂的组合
[1096]
在一些实施方案中，本文所述的rlr激动剂或rig-vlp可作为单一疗法施用于受试者。替代地，rlr激动剂或rig-vlp可作为与另一种治疗(例如，癌症的另一种治疗)的组合疗法施用于受试者。例如，组合疗法可包括向受试者(例如，人患者)施用一种或多种另外的剂，所述剂为患有癌症或处于发展出癌症的风险中的受试者提供治疗益处。
[1097]
在本公开提供的方法的一些实施方案中，rlr激动剂或rig-vlp或药物组合物与一
种或多种另外的治疗剂组合施用，其中一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的组：化学疗法、靶向抗癌疗法、溶瘤药物、细胞死亡诱导剂、调理剂(例如，调理抗体)、细胞毒性剂、基于免疫的疗法、细胞因子、共刺激分子的激活剂或激动剂、抑制性分子的抑制剂、疫苗、细胞免疫疗法或其组合。
[1098]
在一些实施方案中，组合可例如作为掺加物(admixture)伴随施用，单独但同时(simultaneously)或并行(concurrently)施用；或依次施用。这包括组合剂作为治疗混合物一起施用的演示，以及组合剂例如通过单独的静脉内管线进入同一个体的单独但同时施用的程序。“组合”施用还包括单独施用首先给出的化合物或剂之一，之后施用第二个。
[1099]
在一些实施方案中，rlr激动剂、rig-vlp或药物组合物在一种或多种另外的治疗剂的施用之前或之后施用，或者其中一种或多种另外的治疗剂与激动剂或药物组合物的施用同时、在其之前或之后施用。
[1100]
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂是pd-1/pd-l1拮抗剂、tim-3拮抗剂、vista拮抗剂、腺苷a2ar拮抗剂、b7-h3拮抗剂、b7-h4拮抗剂、btla拮抗剂、ctla-4拮抗剂、ido拮抗剂、kir拮抗剂、lag-3拮抗剂、toll样受体3(tlr3)激动剂、toll样受体7(tlr7)激动剂、toll样受体9(tlr9)激动剂。
[1101]
与化学治疗剂组合
[1102]
适于与本发明的组合物组合和/或共同施用的化学治疗剂包括例如：紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。其他剂包括例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如，二氯甲基二乙胺、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)、洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素c、顺-二氯二胺铂(ii)(ddp)、丙卡巴肼、六甲密胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、沙铂、或四硝酸三铂)、蒽环类抗生素(例如，柔红霉素(原名道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(原名放线菌素)、博来霉素、光神霉素和安曲霉素(amc))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春花碱)以及替莫唑胺。
[1103]
与pd-1/pd-l1拮抗剂组合
[1104]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂、rig-vlp或其药物组合物与一种或多种pd-1/pd-l1拮抗剂组合(例如，组合施用)，所述拮抗剂特异性结合至人pd-1或pd-l1并抑制pd-1/pd-l1生物学活性和/或由人pd-1/pd-l1信号传导介导的下游通路和/或细胞过程或其他人pd-1/pd-l1介导的功能。
[1105]
因此，本文提供了直接或变构阻断、拮抗、遏制、抑制或降低pd-1/pd-l1生物学活性，包括由pd-1/pd-l1信号传导介导的下游通路和/或细胞过程，诸如受体结合和/或引出对pd-1/pd-l1的细胞反应的pd-1/pd-l1拮抗剂。本文还提供了减少细胞或受试者产生的人pd-1或pd-l1的数量或量的pd-1/pd-l1拮抗剂。
[1106]
在一些实施方案中，本公开提供了一种结合人pd-1并防止、抑制或减少pd-l1与pd-1结合的pd-1/pd-l1拮抗剂。在一些方面，pd-1/pd-l1拮抗剂结合至编码pd-1或pd-l1的mrna并防止翻译。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂结合至编码pd-1或pd-l1的mrna并
引起降解和/或周转。
[1107]
在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂抑制pd-1信号传导或功能。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂阻断pd-1与pd-l1、pd-l2或与pd-l1和pd-l2两者的结合。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂阻断pd-1与pd-l1的结合。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂阻断pd-1与pd-l2的结合。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂阻断pd-1与pd-l1和pd-l2的结合。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂特异性结合pd-1。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂特异性结合pd-l1。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂特异性结合pd-l2。
[1108]
在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂抑制pd-1与其同源配体的结合。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂抑制pd-1与pd-l1、pd-1与pd-l2或pd-1与pd-l1和pd-l2两者的结合。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂不抑制pd-1与其同源配体的结合。
[1109]
在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是特异性结合至pd-1或pd-l1的分离单克隆抗体(mab)或其抗原结合片段。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是特异性结合至人pd-1的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是特异性结合至人pd-l1的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是结合至人pd-l1并抑制pd-l1与pd-1结合的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是结合至人pd-1并抑制pd-l1与pd-1结合的抗体或抗原结合片段。
[1110]
几种抑制或破坏pd-1与其配体pd-l1和pd-l2之一或两者之间的相互作用的免疫检查点拮抗剂正处于临床开发阶段或目前可供临床医生用于治疗癌症。
[1111]
在本公开提供的任何组合物、方法和用途中可包含pd-1/pd-l1拮抗剂的抗人pd-1单克隆抗体或其抗原结合片段的实例包括但不限于：(派姆单抗(pembrolizumab)，mk-3475，h409a11；参见us8952136、us8354509、us8900587和ep2170959，所有这些专利都以引用的方式整体包括在本文中；merck)、(纳武单抗(nivolumab)，bms-936558，mdx-1106，ono-4538；参见us7595048、us8728474、us9073994、us9067999、ep1537878、us8008449、us8779105和ep2161336，所有这些专利都以引用的方式整体包括在本文中；bristol myers squibb)、medi0680(amp-514)、bgb-a317和bgb-108(beigene)、244c8和388d4(参见wo2016106159，所述专利以引用的方式整体并入本文；enumeral biomedical)、pdr001(novartis)和regn2810(regeneron)。因此，在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是派姆单抗。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是纳武单抗。
[1112]
在本公开提供的任何组合物、方法和用途中可包含pd-1/pd-l1拮抗剂的抗人pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段的实例包括但不限于：(阿维鲁单抗(avelumab)，msb0010718c，参见wo2013/79174，所述专利以引用的方式整体并入本文；merck/pfizer)、(度伐鲁单抗(durvalumab)，medi4736)、(阿替利珠单抗(atezolizumab)，mpdl3280a，rg7446；参见wo2010/077634，所述专利以引用的方式整体并入本文；roche)、mdx-1105(bms-936559，12a4；参见us7943743和wo2013/173223，两者均以引用的方式整体并入本文；medarex/bms)和faz053(novartis)。因此，在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是阿维鲁单抗。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是度伐鲁单抗。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是阿替利珠单抗。
[1113]
在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是特异性结合至人pd-1或人pd-l1的免疫粘附素，例如，含有融合至恒定区诸如免疫球蛋白分子的fc区的pd-l1或pd-l2的胞外或pd-1结合部分的融合蛋白。特异性结合至pd-1的免疫粘附分子的实例描述于wo2010/027827和wo2011/066342中，两者均以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是amp-224(也称为b7-dcig)，其是一种特异性结合至人pd-1的pd-l2-fc融合蛋白。
[1114]
普通技术人员将理解，任何结合至pd-1或pd-l1并破坏pd-1/pd-l1信号传导通路的pd-1/pd-l1拮抗剂都适用于本文公开的组合物、方法和用途。
[1115]
在一些实施方案中，pd-1/pd-l1拮抗剂是小分子、核酸、肽、肽模拟物、蛋白质、碳水化合物、碳水化合物衍生物或含糖聚合物(glycopolymer)。示例性小分子pd-1抑制剂描述于zhan等人，(2016)drug discov today 21(6)：1027-1036中。
[1116]
在本公开提供的方法的一些实施方案中，rlr激动剂与pd-1/pd-l1拮抗剂组合，其中pd-1/pd-l1拮抗剂选自由以下组成的组：pdr001、(派姆单抗)、(纳武单抗)、匹地利珠单抗、medi0680、regn2810、tsr-042、pf-06801591和amp-224。在一些实施方案中，pi)-1/pd-l1拮抗剂选自由以下组成的组：faz053、(阿替利珠单抗)、(阿维鲁单抗)、(度伐鲁单抗)和bms-936559。
[1117]
与tim-3拮抗剂组合
[1118]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂、rig-vlp或其药物组合物与tim-3拮抗剂组合(例如，组合施用)。tim-3拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，tim-3拮抗剂选自mgb453(novartis)、tsr-022(tesaro)或ly3321367(eli lilly)。
[1119]
与lag-3拮抗剂组合
[1120]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂、rig-vlp或其药物组合物与lag-3拮抗剂组合(例如，组合施用)。lag-3拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。在一些实施方案中，lag-3抑制剂选自lag525(novartis)、bms-986016(bristol-myers squibb)、tsr-033(tesaro)、mk-4280(merck&co)或regn3767(regeneron)。
[1121]
与toll样受体(tlr)激动剂组合
[1122]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂、rig-vlp或其药物组合物与tlr激动剂组合(例如，组合施用)。
[1123]
toll样受体(tlr)是生殖系编码(germline-encoded)的跨膜蛋白家族，促进病原体识别和先天免疫系统的激活。(hoffmann等人，(1999)science 284：1313-1318；rock等人，(1998)proc natl acad sci usa 95：588-593)。tlr是模式识别受体(prr)，并且由先天免疫系统的细胞表达。tlr的已知配体的实例包括革兰氏阳性菌(tlr-2)、细菌内毒素(tlr-4)、鞭毛蛋白(tlr-5)、细菌dna(tlr-9)、双链rna和poly i：c(tlr-3)和酵母(tlr-2)。tlr的体内激活引发了涉及特定细胞因子、趋化因子和生长因子的先天免疫反应。虽然所有tlr都可激活某些胞内信号传导分子，诸如核因子κβ(nf-κb)和丝裂原活化蛋白激酶(map激酶)，但每个tlr释放的特定细胞因子和趋化因子组似乎是独一无二的。tlr7、8和9构成tlr的亚
家族，它们位于免疫细胞(诸如树突状细胞和单核细胞)的内体或溶酶体隔室中。与在浆细胞样树突状细胞(pdc)上高度表达的tlr7和9相比，tlr8主要在髓系dc(mdc)和单核细胞上表达。这个亚家族介导微生物核酸诸如单链rna的识别。
[1124]
与嘌呤核苷酸腺苷和鸟苷类似的小型、低分子量(小于400道尔顿)合成咪唑喹啉化合物是首先被鉴定的tlr7和tlr8激动剂。许多这些化合物已展示出抗病毒和抗癌特性。例如，tlr7激动剂咪喹莫特(aldara
tm
)已被美国食品和药物管理局批准为治疗由某些人乳头瘤病毒株引起的皮肤损伤的局部剂。咪喹莫特还可用于治疗原发性皮肤癌和皮肤肿瘤，诸如基底细胞癌、角化棘皮瘤、光化性角化病和鲍文氏病(bowen
′
s disease)。tlr7/8激动剂雷西莫特(r-848)正在被评价为治疗人生殖器疱疹的局部剂。
[1125]
根据本公开的tlr激动剂可以是任何tlr激动剂。例如，tlr激动剂可包括天然或合成tlr配体、tlr配体的突变蛋白或衍生物、tlr配体的肽模拟物、模拟tlr配体的生物学功能的小分子或刺激tlr受体的抗体。tlr配体是结合至tlr的任何分子。
[1126]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂、rig-vlp或其药物组合物与tlr激动剂组合，其中tlr激动剂选自由以下组成的组：tlr1激动剂、tlr2激动剂、tlr3激动剂、tlr4激动剂、tlr5激动剂、tlr6激动剂、tlr7激动剂、tlr8激动剂、tlr9激动剂、tlr10激动剂和tlr11激动剂。
[1127]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp与tlr3激动剂组合。tlr3激动剂是通过tlr3引起信号传导反应的激动剂。示例性tlr3激动剂包括但不限于聚肌苷：聚胞苷酸(poly i：c)、(poly iclc)、聚腺苷-聚尿苷酸(poly a：u)、(100)、(50生物缀合物)和(50)。
[1128]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp与聚肌苷：聚胞苷酸(poly i：c)组合。在一些实施方案中，rlr激动剂或rig-vlp与(poly iclc)组合。在一些实施方案中，rlr激动剂与聚腺苷-聚尿苷酸(poly a：u)组合。在一些实施方案中，rlr激动剂或rig-vlp与(100)组合。在一些实施方案中，rlr激动剂或rig-vlp与(50生物缀合物)组合。在一些实施方案中，rlr激动剂与组合。
[1129]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp与tlr7激动剂组合。tlr7激动剂是通过tlr7引起信号传导反应的激动剂。tlr7激动剂的非限制性实例包括单链rna(ssrna)、洛索立宾(loxoribine)(在位置n7和c8处衍生的鸟苷类似物)、咪唑喹啉化合物(例如，咪喹莫特和雷西莫特)或其衍生物。其他示例性tlr7激动剂包括但不限于gs-9620(vesatolimod)、咪喹莫特(aldara
tm
)和雷西莫特(r-848)。
[1130]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp与gs-9620(vesatolimod)组合。在一些实施方案中，rlr激动剂与咪喹莫特(aldara
tm
)组合。在一些实施方案中，rlr激动剂或rig-vlp与雷西莫特(r-848)组合。
[1131]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp与tlr9激动剂组合。tlr9激动剂是通过tlr9引起信号传导反应的激动剂。示例性tlr9激动剂包括但不限于cpg寡脱
氧核苷酸(gpg odn)。在一些实施方案中，cpg odn是a类cpg odn(cpg-a odn)、b类cpg odn(cpg-b odn)或c类cpg odn(cpg-c odn)。
[1132]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂或rig-vlp与cpg寡脱氧核苷酸(gpg odn)组合。在一些实施方案中，cpg odn是a类cpg odn(cpg-a odn)。在一些实施方案中，cpg odn是b类cpg odn(cpg-b odn)。在一些实施方案中，cpg odn是c类cpg odn(cpg-c odn)。
[1133]
其他组合
[1134]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂、rig-vlp或其药物组合物与vista拮抗剂、腺苷a2ar拮抗剂、b7-h3拮抗剂、b7-h4拮抗剂、btla拮抗剂、ctla-4拮抗剂、ido拮抗剂或kir拮抗剂组合(例如，组合施用)。
[1135]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂、rig-vlp或其药物组合物与包含特异性结合至cd137(4-1bb)的多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)的激动剂组合(例如，组合施用)。
[1136]
在一些实施方案中，本公开提供的rlr激动剂、rig-vlp或其药物组合物与包含特异性结合至cd134(ox40)的多肽(例如，抗体或其抗原结合部分)的激动剂组合(例如，组合施用)。
[1137]
本文所述的rlr激动剂或rig-vlp可替换或增强先前或当前施用的疗法。例如，在用rlr激动剂或rig-vlp治疗后，一种或多种另外的活性剂的施用可停止或减少，例如以较低水平或剂量施用。在一些实施方案中，可维持先前疗法的施用。在一些实施方案中，将维持先前疗法，直到rlr激动剂或rig-vlp的水平达到足以提供治疗效果的水平。两种疗法可组合施用。
[1138]
如本文所定义，监测受试者(例如，人患者)的癌症改善意指评价受试者疾病参数的变化，例如肿瘤生长的减少。在一些实施方案中，评价在施用后至少一(1)小时，例如至少2、4、6、8、12、24或48小时，或至少1天、2天、4天、10天13天、20天或更长时间，或至少1周、2周、4周、10周、13周、20周或更长时间进行。受试者可在以下时间段中的一个或多个进行评价：在治疗开始之前；在治疗过程中；或在施用治疗的一个或多个要素之后。评价可包括评价是否需要进一步治疗，例如，评价是否应当改变剂量、施用频率或治疗持续时间。其还可包括评价是否需要添加或删除所选择的治疗方式，例如，添加或删除本文所述的癌症的任何治疗。
[1139]
在一些实施方案中，施用本文所述的rlr激动剂或rig-vlp以例如通过增加t细胞活化和/或增殖来调节患者的t细胞反应。t细胞增殖、ifn产生和分泌和/或t细胞的溶细胞活性的增强可能有益于需要其来治疗疾病或病状的患者。因此，在一些实施方案中，将本公开的rlr激动剂或rig-vlp施用于有需要的患者以诱导或增加t细胞活化、增强t细胞增殖、诱导ifn的产生和/或分泌和/或诱导溶细胞性t细胞反应。
[1140]
虽然本公开已经参考其特定实施方案进行描述，但是本领域技术人员应理解，可在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下进行各种改变并且可进行等同物替代。另外，为了使特定情况、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤适应本公开的目的、精神和范围，可进行许多修改。所有此类修改都旨在处于本公开的范围内。
[1141]
定义
[1142]
除非另外规定，否则权利要求和说明书中所用的术语如下文所陈述加以定义。在
与母临时专利申请中使用的术语发生直接冲突的情况下，应以本技术中使用的术语为准。
[1143]
应注意，除非另外在上下文中明确指出，否则在说明书和所附加权利要求中使用的单数形式“一个(种)”和“所述”包括复数指示物。另外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
[1144]
关于：如本文所用，术语“约”(替代地“大约”)将被普通技术人员理解并且将在一定程度上根据使用其的上下文而变化。如果所述术语的使用对于普通技术人员来说在使用其的上下文中是不清楚的，则“约”将意味着最多至特定值的正负10％。
[1145]
激动剂：如本文所用，术语“激动剂”以其最广泛的含义使用并且涵盖部分或完全促进、诱导、增加和/或激活本文公开的天然多肽的生物学活性的任何分子或化合物。根据本公开的激动剂分子可包括核酸(例如，寡核苷酸、多核苷酸)、抗体或抗原结合片段、天然多肽的片段或氨基酸序列变体、肽、寡核苷酸、脂质、碳水化合物和有机小分子。在一些实施方案中，以剂量依赖性方式观察到在激动剂存在的情况下的活化。在一些实施方案中，测得的信号(例如，生物学活性)比在可比条件下用阴性对照测得的信号高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％。本文还公开了鉴定适于在本公开方法中使用的激动剂的方法。例如，这些方法包括但不限于结合测定，诸如酶联免疫吸附测定(elisa)、系统、荧光偏振(fp)测定和放射免疫测定(ria)。这些测定确定激动剂结合感兴趣的多肽(例如受体或配体)的能力，并且因此表明激动剂促进、增加或激活多肽活性的能力。激动剂的功效还可使用功能测定来确定，诸如激动剂激活或促进多肽功能的能力。例如，功能测定可包括使多肽与候选激动剂分子接触并测量通常与多肽相关的一种或多种生物学活性的可检测变化。激动剂的效力通常由其ec
50
值(激活50％的激动剂反应所需的浓度)定义。ec
50
值越低，激动剂的效力越大，并且激活最大生物反应所需的浓度越低。
[1146]
改善：如本文所用，术语“改善”是指在疾病状态例如癌症的治疗中的任何治疗上有益的结果，包括其预防严重性或进展的减轻、缓解或治愈。
[1147]
氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后期修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即所述基本化学结构是结合至氢的碳、羧基、氨基和r基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋硫氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
[1148]
氨基酸可在本文中由其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可用它们通常接受的单字母代码来表示。
[1149]
氨基酸取代：如本文所用，“氨基酸取代”是指将预先确定的氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现存氨基酸残基替换为第二个不同的“替换”氨基酸残基。“氨基酸插入”是指将至少一个其他氨基酸掺入至预先确定的氨基酸序列中。尽管插入通常由
一个或两个氨基酸残基的插入组成，但也可进行较大“肽插入”，例如约三个至约五个或甚至多达约十个、十五个或二十个氨基酸残基的插入。如以上所公开，插入的残基可以是天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指将至少一个氨基酸残基从预先确定的氨基酸序列去除。
[1150]
抗原：如本文所用，术语“抗原”是指当由mhc分子呈递时能够被抗体或t细胞受体(tcr)结合的分子。如本文所用，术语“抗原”还涵盖t细胞表位。抗原另外能够被免疫系统识别和/或能够诱导体液免疫反应和/或细胞免疫反应，从而导致b淋巴细胞和/或t淋巴细胞的活化。然而，这可能要求，至少在某些情况下，抗原含有或连接至辅助性t细胞表位(th细胞表位)并以佐剂形式给予。抗原可具有一个或多个表位(b和t表位)。以上提及的特异性反应意在表明抗原将以高度选择性方式与其对应抗体或tcr反应，而不是与可能由其他抗原诱发的大量其他抗体或tcr反应。如本文所使用的抗原也可以是几种个别抗原的混合物。
[1151]
抗原决定簇：如本文所用，术语“抗原决定簇”意在指被b淋巴细胞或t淋巴细胞特异性识别的抗原部分。b淋巴细胞经由抗体产生对外来抗原决定簇作出反应，而t淋巴细胞是细胞免疫的介体。因此，抗原决定簇或表位是被抗体识别，或在mhc的情形下，被t细胞受体识别的抗原部分。
[1152]
缔合：如本文所用，当应用于第一和第二附接位点时，术语“缔合”是指第一附接位点和第二附接位点的优选通过至少一个非肽键的结合。缔合的性质可以是共价的、离子的、疏水的、极性的或其任何组合，优选地，缔合的性质是共价的，并且再次更优选地，缔合是通过至少一个，优选一个非肽键来实现。如本文所用，当应用于第一附接位点和第二附接位点时，术语“缔合”不仅涵盖形成本发明的组合物的第一附接位点和第二附接位点的直接结合或缔合，而且替代地且优选地，还涵盖导致本发明组合物的第一附接位点和第二附接位点的间接缔合或结合，并且因此通常且优选地通过使用异双功能交联剂来实现。
[1153]
第一附接位点：如本文所用，短语“第一附接位点”是指通常且优选地由病毒样颗粒所包含的非天然或天然来源的元件，通常且优选地由抗原或抗原决定簇所包含的第二附接位点可缔合至所述元件。第一附接位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或其组合、或其化学反应性基团。第一附接位点通常且优选地位于病毒样颗粒的表面上。多个第一附接位点通常以重复构造存在于病毒样颗粒的表面上。优选地，第一附接位点是氨基酸或其化学反应性基团。
[1154]
第二附接位点：如本文所用，短语“第二附接位点”是指与抗原或抗原决定簇缔合的，通常且优选地由所述抗原或抗原决定簇包含的元件，位于病毒样颗粒表面上的第一附接位点可缔合至所述元件。抗原或抗原决定簇的第二附接位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或其组合、或其化学反应性基团。抗原或抗原决定簇上存在至少一个第二附接位点。术语“具有至少一个第二附接位点的抗原或抗原决定簇”因此是指至少包含抗原或抗原决定簇和第二附接位点的抗原或抗原构建体。然而，特别是对于非天然来源的，即不是天然存在于抗原或抗原决定簇内的第二附接位点，这些抗原或抗原构建体包含“氨基酸接头”。
[1155]
碱基组成：如本文所用，术语“碱基组成”是指由鸟嘌呤(或次黄嘌呤) 胞嘧啶和/
或尿嘧啶(或胸腺嘧啶) 腺嘌呤核碱基组成的核酸(例如，rna)的总核苷酸的比例。
[1156]
碱基对：如本文所用，术语“碱基对”是指相对的互补多核苷酸链或同一条链的区域上的两个核碱基，它们经由特定氢键的形成相互作用。如本文所用，可与“互补碱基配对”互换使用的术语“沃森-克里克碱基配对”是指一组碱基配对规则，其中嘌呤总是与嘧啶结合，使得在dna分子中，核碱基腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)形成互补碱基对，而鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)形成互补碱基对。在rna分子中，胸腺嘧啶被尿嘧啶(u)替换，其与胸腺嘧啶(t)类似，与腺嘌呤(a)形成互补碱基对。互补碱基对通过氢键结合在一起，并且碱基对之间的氢键数目不同。如本领域已知的，鸟嘌呤(g)-胞嘧啶(c)碱基对由三(3)个氢键结合，并且腺嘌呤(a)-胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)碱基对由两(2)个氢键结合。
[1157]
不遵循这些规则的碱基配对相互作用可发生在天然、非天然和合成核酸中，并且在本文中称为“非沃森-克里克碱基配对”或者替代地“非经典碱基配对”。“摆动碱基对”是rna分子中两个核碱基之间不遵循沃森-克里克碱基对规则的配对。例如，肌苷是结构类似于鸟苷，但缺少2-氨基的核苷。肌苷能够与四种天然核碱基中的每一种形成两个氢键(oda等人，(1991)nucleic acids res 19：5263-5267)，并且其经常被研究人员用作“通用”碱基，这意味着其可与所有天然存在的或经典碱基进行碱基配对。四个主要的摆动碱基对是鸟嘌呤-尿嘧啶(g-u)碱基对、次黄嘌呤-尿嘧啶(i-u)碱基对、次黄嘌呤-腺嘌呤(i-a)碱基对和次黄嘌呤-胞嘧啶(i-c)碱基对。为了维持核酸命名的一致性，“i”用于次黄嘌呤，因为次黄嘌呤是肌苷的核碱基；否则命名遵循核碱基及其对应核苷的名称(例如，鸟嘌呤和鸟苷以及脱氧鸟苷的“g”)。摆动碱基对的热力学稳定性与沃森-克里克碱基对的热力学稳定性相当。摆动碱基对在rna分子二级结构的形成中起作用。
[1158]
在一个方面，本公开提供了激动或激活一种或多种rig-i样受体(rlr)的合成rna分子，其中肌苷只可插入它将与胞苷碱基配对(i-c碱基对)的位置；也就是说，肌苷可取代鸟苷，但不可取代其他核苷。
[1159]
生物学活性的：如本文所使用，短语“生物学活性的”是指在生物系统和/或生物体中具有活性的任何物质的特征。例如，在向生物体施用时对所述生物体具有生物效应的物质被认为是生物学活性的，并且因此具有“生物学活性”。在特定实施方案中，当核酸具有生物学活性时，所述核酸中具有整个核酸的至少一种生物学活性的部分通常称为“生物学活性”部分。
[1160]
结合：如本文所用，术语“结合”是指可以是例如通过化学偶联的共价的结合，或非共价的结合，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是例如酯、醚、磷酸二酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比诸如“偶联”、“融合”、“缔合”和“附接”的术语更广泛，并包括这些术语。此外，关于与病毒样颗粒结合的rlr激动剂，术语“结合”还包括rlr激动剂的封闭或部分封闭。因此，关于与病毒样颗粒结合的rlr激动剂，术语“结合”比诸如“偶联”、“融合”、“封闭”、“包装”和“附接”的术语更广泛，并包括这些术语。例如，rlr激动剂可在不存在实际结合的情况下被vlp封闭，既不是共价的也不是非共价的。
[1161]
外壳蛋白：如本文所用，术语“外壳蛋白”是指能够掺入噬菌体或rna噬菌体的衣壳组装中的噬菌体或rna噬菌体的蛋白质。然而，当提及rna噬菌体外壳蛋白基因的特定基因产物时，使用术语“cp”。例如，rna噬菌体qβ的外壳蛋白基因的特定基因产物被称为“qβ cp”，而噬菌体qβ的“外壳蛋白”包含“qβ cp”以及a1蛋白。噬菌体qβ的衣壳主要由qβ cp构
成，有少量的a1蛋白。同样，vlp qβ外壳蛋白主要含有qβ cp，有少量的a1蛋白。
[1162]
共价连接：如本文所用，在关于两个或更多个部分使用时，术语“共价连接”(替代地“缀合”、“连接”、“附接”、“融合”或“拴系”)意味着所述部分通过包括化学缀合、重组技术或酶活性在内的任何方式直接或经由充当连接剂的一个或多个另外的部分彼此物理缔合或连接，以形成足够稳定的结构，使得所述部分在使用所述结构的条件，例如生理条件下保持物理缔合。
[1163]
互补：如本文所用，术语“互补”或“互补性”是指包含两条多核苷酸链或相同多核苷酸链的区域的核苷酸序列与包含所述链或区域的双链体的形成之间的关系，其中两条链或区域之间的连续碱基配对的程度足以产生双链体结构。已知腺嘌呤(a)与胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)形成特定的氢键或“碱基对”。同样，已知胞嘧啶(c)与鸟嘌呤(g)碱基配对。还已知非经典核碱基(例如，肌苷)可与天然碱基形成氢键。如果当第一多核苷酸链和相同或不同核酸的第二链以反平行方式排列时，两条链之间的碱基配对的程度在使用双链体结构的条件(例如，细胞中的生理条件)下维持双链体结构，则称包含所述第一链或其区域、部分或片段的核苷酸序列被称为与包含所述第二链或其区域、部分或片段的核苷酸序列“充分互补”。应当理解，多核苷酸的互补链或区域可包括一些非互补的碱基对。互补性可以是“部分的”，其中构成多核苷酸的核碱基中仅一些核碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总体”互补性。尽管多核苷酸链或区域之间的互补性程度对所述链或区域之间杂交的效率和强度具有显著影响，但不需要两个互补多核苷酸在每个核苷酸位置处进行碱基配对。在一些实施方案中，第一多核苷酸与第二多核苷酸100％或“完全”互补，并且因此在每个核苷酸位置处形成碱基对。在一些实施方案中，第一多核苷酸不是100％互补的(例如，是90％、或80％或70％互补的)并且在一个或多个核苷酸位置处含有错配的核苷酸。尽管通常期望完美的互补性，但一些实施方案可包括一个或多个但优选6、5、4、3、2或1个错配。
[1164]
接触：如本文所用，术语“接触”意指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使细胞与剂(例如，本公开的rna、脂质纳米颗粒组合物或其他药物组合物)接触意味着使细胞和剂共享物理连接。在体内、体外和离体使细胞与外部实体接触的方法在生物学领域是众所周知的。在本公开的示例性实施方案中，使哺乳动物细胞与组合物(例如，本公开的分离rna、纳米颗粒或药物组合物)接触的步骤在体内进行。例如，可通过任何合适的施用途径(例如，向生物体的胃肠外施用，包括静脉内、肌肉内、皮内和皮下施用)进行使脂质纳米颗粒组合物与可置于生物体(例如，哺乳动物)内的细胞(例如，哺乳动物细胞)接触。对于体外存在的细胞，可例如，通过将组合物添加到细胞的培养基中来使组合物(例如，脂质纳米颗粒或分离rna)与细胞接触，并且可涉及或导致转染。此外，一种剂可接触多于一个细胞。
[1165]
偶联：如本文所用，术语“偶联”是指通过共价键或通过强非共价相互作用的附接。关于抗原与病毒样颗粒的偶联，术语“偶联”优选指通过共价键的附接。此外，关于抗原与病毒样颗粒的偶联，术语“偶联”优选分别指通过至少一个非肽键的缔合和附接。本领域技术人员通常用于偶联生物学活性材料的任何方法均可用于本发明。
[1166]
变性：如本文所用，术语“变性”是指核酸中碱基配对核苷酸之间的氢键合被破坏，导致二级和/或三级核酸结构丧失的过程(例如，先前退火链的分离)。变性可通过将外部物
质、能量或生化过程应用于核酸而发生。
[1167]
抗原呈递细胞：术语“抗原呈递细胞”或“apc”是在其表面展示与mhc复合的外来抗原的细胞。t细胞使用t细胞受体(tcr)识别这种复合物。apc的实例包括但不限于树突状细胞(dc)、外周血单核细胞(pbmc)、单核细胞(诸如thp-1)、b淋巴母细胞(诸如c1r.a2、1518b-lcl)和单核细胞来源的树突状细胞(dc)。一些apc通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用将抗原内化。
[1168]
凋亡：如本文所用，术语“凋亡”是指发生在多细胞生物体(例如，人)中的程序性细胞死亡的过程。导致凋亡的高度调节的生化和分子事件可导致细胞发生可观察到的特征性形态变化，包括膜起泡、细胞体积缩小、染色体dna凝聚(chromosomal dna condensation)和断裂以及mrna衰变。识别经历凋亡的细胞(包括t细胞)的常用方法是将细胞暴露于荧光团缀合蛋白(膜联蛋白v(annexin v))。膜联蛋白v通过其结合至质膜外叶上的磷脂酰丝氨酸的能力而通常用于检测凋亡细胞，其为细胞正在经历凋亡过程的早期指标。
[1169]
平端：如本文所用，术语“平端”“平端的”是指双链体核酸或双链核酸末端的结构，其中构成双链体的两条互补链至少在一端终止于碱基对。因此，构成双链体的两条链都不比另一条链从末端延伸得更远。
[1170]
癌抗原：如本文所用，“癌抗原”是指(i)肿瘤特异性抗原，诸如新抗原；(ii)肿瘤相关抗原；(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞；(iv)表达肿瘤相关抗原的细胞；(v)肿瘤上的胚胎抗原；(vi)自体肿瘤细胞；(vii)肿瘤特异性膜抗原；(viii)肿瘤相关膜抗原；(ix)生长因子受体；(x)生长因子配体；和(xi)与癌症相关的任何其他类型的抗原或抗原呈递细胞或材料。
[1171]
癌：如本文所用，术语“癌”是本领域公认的并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑色素瘤。本文所述的rig-i样受体(rlr)激动剂可用于治疗患有、怀疑患有任何类型癌症(包括肾癌或黑色素瘤)或可能处于发展出所述癌症的高风险中的患者。示例性癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳房、头颈、结肠和卵巢组织形成的那些。所述术语还包括癌肉瘤，其中包括由癌组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指由腺体组织衍生的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。
[1172]
细胞毒性t淋巴细胞(ctl)反应：如本文所用，术语“细胞毒性t淋巴细胞(ctl)反应”是指由细胞毒性t细胞诱导的免疫反应。ctl反应主要由cd8 t细胞介导。
[1173]
双链体：如本文所用，术语“双链体”是指由双链多核苷酸的互补链或自身回折的单链多核苷酸的互补区域形成的结构。核酸的双链体结构是由于互补核苷酸序列通过碱基配对相互作用结合在一起或杂交而产生的。
[1174]
ec
50
：如本文所用，术语“ec
50”是指在体外或体内测定中诱导反应(其为最大反应的50％，即最大反应与基线之间的一半)的激动剂浓度。
[1175]
有效剂量：如本文所用，术语“有效剂量(dose)”或“有效剂量(dosage)”定义为足以实现或至少部分实现所需效果的量。
[1176]
融合：如本文所用，术语“融合”是指不同来源的氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合而组合于一条多肽链中。术语“融合”明确涵盖内部融合，即除了融合至其末端之一以外，在多肽链内插入不同来源的序列。
[1177]
发夹rna：如本文所用，术语“发夹rna”或“rna发夹”是指包含双链rna(dsrna)茎的自身互补rna，所述双链rna茎由碱基配对以形成双链体的互补核苷酸链组成，所述双链体在一端终止于包含未配对核苷酸环的核苷酸接头(例如，四环)或包含柔性化学部分的非核苷酸接头(例如，乙二醇)中，其中任一者连接互补核苷酸链。rna发夹在茎的长度、环和/或接头的大小和/或组成、茎内碱基对错配的数目以及实际核苷酸序列方面可能不同。rna发夹可提供一种或多种功能，包括但不限于指导包含发夹的rna分子的整体折叠、确定核酶中的相互作用、保护信使rna(例如，mrna)免于降解、充当rna结合蛋白的识别基序或结构以及作为酶促反应的底物。rna发夹结构和功能的进一步描述可在svoboda和di cara(2006)cell mol life sci 63(7-8)：901-908以及其中包含的参考文献中找到。在一些实施方案中，包含本公开提供的rlr激动剂的发夹rna的茎区终止于具有5
′
三磷酸或二磷酸的平端。
[1178]
改善的生物学活性：如本文所用，“改善”生物学活性的组合物是指与在不添加组合物的情况下测量的相同生物学活性相比，在添加组合物的情况下观察到的生物学活性以任何方式更大、或增强、或偏离的物质。例如，可例如使用elisa测定从用和不用组合物处理的样品中测量分泌的细胞因子的量。与不使用组合物的细胞因子分泌相比，细胞因子分泌增强的组合物的量被称为足以改善生物学活性的量。在一个实施方案中，生物学活性提高了至少约2倍，更优选地约3倍或更多倍。细胞毒性t细胞的裂解活性也可能发生改变。
[1179]
需要：如本文所用，“需要预防”、“需要治疗”或“有需要”的受试者是指根据适当的医师(例如，在人的情况下是医生、护士或执业护士；在非人哺乳动物的情况下是兽医)的判断，将合理地受益于给定治疗(诸如使用包含rig-i样受体激动剂的组合物的治疗)的受试者。
[1180]
接头：如本文所用，术语“接头”(替代地“系链”或“间隔物”)是指将两条多核苷酸链或区域共价连接、附接或偶联在一起的部分。如本文所用，包含核苷酸的接头称为“核苷酸接头”(例如，四环)。如本文所用，术语“非核苷酸接头”是指包含化学部分且不包含核苷酸的接头。非核苷酸接头的非限制性实例包括包含乙二醇的接头(例如，六乙二醇)、包含烷基链的接头(例如，c9烷基接头)和包含二苯乙烯二醚的接头。接头的进一步描述可在paredes等人，(2011)methods54：251-259中找到，所述文献以引用的方式整体并入本文。
[1181]
lgp2：如本文所用，术语“lgp2”是指遗传学和生理学实验室2多肽，rig-i样受体家族的特定成员并且由人的dhx58基因编码。本领域中lgp2的替代名称和首字母缩略词包括dhx58、d11lgp2、d11igp2e和rlr-3。全长人lgp2的示例性氨基酸序列示于表4中(seq id no：100)和此处：
[1182][1183]
(ncbp登录号：np_077024.2)
[1184]
局部施用：如本文所用，“局部施用”或“局部递送”是指不依赖于将组合物或剂经由血管系统运输至其预期靶组织或部位的递送。例如，组合物可通过注射或植入组合物或剂或通过注射或植入含有所述组合物或剂的装置来递送。在靶组织或部位附近局部施用后，组合物或剂或其一种或多种组分可扩散到预期靶组织或部位。
[1185]
mda5：如本文所用，术语“mda5”是指黑色素瘤分化相关蛋白5多肽，rig-i样受体家族的特定成员并且由人的ifih1基因编码。本领域中mda5的替代名称和首字母缩略词包括ags7、hlcd、iddm19、mda-5、rlr-2、sgmrt1和解旋酶c结构域1诱导的干扰素。全长人mda5的示例性氨基酸序列示于表4中(seq id no：99)和此处：
[1186][1187]
(ncbi登录号：np_071451.2)
[1188]
修饰的：如本文所用，“修饰(modified)”或“修饰(modification)”是指由多核苷酸例如rna的修饰引起的改变状态或结构改变。多核苷酸可以各种方式包括化学上、结构上和/或功能上的方式进行修饰。例如，本公开的rna分子可通过掺入提供生物学活性的非天然碱基或序列基序来修饰，所述序列基序包含功能序列或二级结构。在一个实施方案中，例如，当rna涉及天然核糖核苷酸a、u、g和c时，通过引入非天然或化学修饰碱基、核苷和/或核苷酸来修饰所述rna。
[1189]
天然存在的：如本文所用，术语“天然存在的”当应用于对象时是指可在自然界中找到对象的事实。例如，可从自然界的来源中分离出来，并且在实验室中未经人为有意修饰
的存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列或其组分诸如氨基酸或核苷酸是天然存在的。
[1190]
核酸：如本文所用，术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物或低聚物。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其具有与参考核酸类似的结合特性，并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。核苷酸的聚合物称为“多核苷酸”。本公开的示例性核酸或多核苷酸包括但不限于核糖核酸(rna)、脱氧核糖核酸(dna)、dna-rna杂合体、rnai诱导剂、rnai剂、sirna、shrna、mirna、反义rna、核酶、催化dna、诱导三螺旋形成的rna、苏糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、锁核酸(lna，包括具有β-d-核糖构型的lna、具有α-l-核糖构型的α-lna(lna的非对映体)、具有2
′‑
氨基官能化的2
′‑
氨基-lna和具有2
′‑
氨基官能化的2
′‑
氨基-α-lna)或其杂合体。
[1191]
本文使用的多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰rna或dna或修饰rna或dna。例如，多核苷酸可由以下构成：单链和双链dna；作为单链和双链区域的混合物的dna；单链和双链rna；以及作为单链和双链区域的混合物的rna；包含dna和rna的杂合分子，所述dna和rna可以是单链、或更典型地双链、或单链和双链区域的混合物。另外，多核苷酸可由包含rna或dna或rna和dna两者的三链区域构成。多核苷酸还可含有一个或多个为了稳定性或出于其他原因而修饰的修饰碱基或dna或rna主链。“修饰”碱基包括例如三苯甲基化碱基。“修饰核苷”包括例如肌苷和胸腺嘧啶(当后者存在于rna中或包含rna时)。可对dna和rna进行多种修饰；因此，“多核苷酸”涵盖化学、酶促或代谢修饰形式。
[1192]
核酸结构：如本文所用，术语“核酸结构”是指原子、化学成分、元件、基序和/或包含核酸(例如，rna)的核碱基序列的排列或组织，并且/或者可以指核酸的二维或三维状态。因此，术语“rna结构”是指原子、化学成分、元件、基序和/或包含rna分子(例如，mrna)的核碱基序列的排列或组织，并且/或者可以指rna分子的二维或三维状态。基于增加的组织复杂性，核酸结构可进一步划分为本文称为“分子结构”、“一级结构”、“二级结构”和“三级结构”的四个组织类别。
[1193]
核碱基：如本文所用，术语“核碱基”(替代地“核苷酸碱基”或“含氮碱基”)是指存在于核酸中的嘌呤或嘧啶杂环化合物，包括天然存在的嘌呤和嘧啶的任何衍生物或类似物，其赋予核酸或其部分或区段改善的特性(例如，结合亲和力、核酸酶抗性、化学稳定性)。腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶是主要存在于天然核酸中的主要或经典核碱基。诸如本文公开的那些其他天然、非天然、非典型和/或合成核碱基可掺入核酸中。
[1194]
核苷/核苷酸：如本文所用，术语“核苷”是指含有与核碱基(例如，嘌呤或嘧啶)或者其衍生物或类似物(本文也称为“核碱基”)共价连接的糖分子(例如，rna中的核糖或dna中的脱氧核糖)或者其衍生物或类似物的化合物。如本文所用，术语“核苷酸”是指与磷酸基团共价连接的核苷。如本文所用，术语“核糖核苷”是指包含核糖和核碱基的核苷(例如，腺苷(a)、胞苷(c)、鸟苷(g)、5-甲基尿苷(m5u)、尿苷(u)或肌苷(i))。
[1195]
可操作地连接：如本文所用，核酸或其片段或部分，诸如多核苷酸或寡核苷酸，当其与另一个核酸序列或其片段或部分形成功能关系时“可操作地连接”。
[1196]
有序且重复的抗原或抗原决定簇阵列：如本文所用，未语“有序且重复的抗原或抗
原决定簇阵列”通常指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇分别相对于核心颗粒和病毒样颗粒的通常且优选均一的空间排列。在一些实施方案中，重复模式可以是几何模式。合适的有序且重复的抗原或抗原决定簇阵列的典型实例是具有严格重复的抗原或抗原决定簇次晶顺序的阵列，优选间距为0.5至30纳米，更优选3至15纳米，甚至更优选3至8纳米。
[1197]
包装：如本文所用，术语“包装”是指rlr激动剂相对于vlp的状态。如本文所用，术语“包装”包括可以是例如通过化学偶联的共价的结合，或非共价的结合，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键可以是，例如，酯、醚、磷酸酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。所述术语还包括对物质的封闭或部分封闭。术语“包装”包括诸如“偶联”、“封闭”和“附接”的术语。例如，rlr激动剂可在不存在实际结合的情况下被vlp封闭，既不是共价的也不是非共价的。在一些实施方案中，术语“包装”表示处于包装状态的核酸不能被dna酶或rna酶水解。在一些实施方案中，rlr激动剂最优选以非共价方式包装在vlp衣壳内。
[1198]
多核苷酸/寡核苷酸：如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且指由天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键联组成的核苷酸或核苷单体的单链或双链聚合物或低聚物。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”还包括包含非天然存在的碱基、糖和糖间(主链)键联或其部分的聚合物和低聚物，它们的功能类似。多核苷酸不限于任何特定长度的核苷酸序列，因为术语“多核苷酸”涵盖任何长度的核苷酸的聚合形式。短多核苷酸在本领域中通常称为“寡核苷酸”。在本公开的上下文中，此类修饰或取代多核苷酸和寡核苷酸通常用于天然形式，因为修饰增加了一种或多种所期望的或有益的生物学特性或活性，包括但不限于细胞因子产生增加、细胞摄取增强和/或在核酸酶存在的情况下稳定性增加。在一些实施方案中，本公开的激动剂包含含有至少一个修饰核苷酸区域的多核苷酸和寡核苷酸，所述修饰核苷酸区域赋予一种或多种有益特性或增加生物学活性(例如，核酸酶抗性增加、细胞摄取增加、双链体稳定性增加、与靶多肽的结合亲和力增加)。
[1199]
回文序列：如本文所用，术语“回文序列”(替代地“回文”)是指自身互补的核苷酸序列；其中在5
′
至3
′
方向上的核苷酸序列与在5
′
至3
′
方向上读取时构成互补链的核苷酸序列相同。例如，序列5
′‑
acctaggt-3
′
是回文序列，因为其互补序列3
′‑
tggatcca-5
′
在5
′
至3
′
方向上读取时与原始序列相同。相比之下，序列5
′‑
agtggctg-3
′
不是回文序列，因为其互补序列3
′‑
tcaccgac-5
′
在5
′
至3
′
方向上读取时与原始序列不同。
[1200]
在一个实施方案中，激动剂由第一寡核苷酸构成，其中第一寡核苷酸的序列是回文序列。在另一个实施方案中，激动剂由第一寡核苷酸构成，其中第一寡核苷酸包含回文序列。
[1201]
在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸中的回文序列包括寡核苷酸的5
′
端和寡核苷酸的3
′
端两者，因此形成平端。在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸包含单一回文序列，并且在本发明的另一个实施方案中，寡核苷酸包含两个互补的回文序列，其被连接1或2个不同寡核苷酸内的2个回文序列的间插序列、间隔物或接头中断，以便形成具有平端的发夹双链体。
[1202]
胃肠外施用：如本文所用，“胃肠外施用(parenteral administration)”、“胃肠外施用(administered parenterally)”和其他语法上等同的短语是指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内、鼻内、眼内、肌肉内、动脉内、
鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、皮下、关节内、包膜下、蛛网膜下腔、脊髓内、硬膜外、脑内、颅内、颈动脉内和胸骨内注射和输注。
[1203]
患者：如本文所用，术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
[1204]
百分比同一性：如本文所用，在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“同一性百分比”是指如使用下文所述的序列比较算法(例如，blastp和blastn或技术人员可用的其他算法)之一或通过目测检查所测量，在对于最大对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。取决于应用，“百分比同一性”可存在于所比较的序列的某一区域内，例如在功能结构域内，或者替代地存在于待比较的两个序列的全长内。对于序列比较，通常将一个序列用作参考序列，将其与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列座标，并指定序列算法程序参数。序列比较算法然后基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数量x100)，考虑了为实现两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。两个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定可使用数学算法来完成，如以下在非限制性实例中所述。
[1205]
用于比较的序列的最佳比对可例如通过以下方法进行：smith和waterman，adv.appl.math.2：482(1981)的局部同源算法；needleman和wunsch，j.mol.biol.48：443(1970)的同源比对算法；pearson和lipman，proc.nat
′
l.acad.sci.usa 85：2444(1988)的对于相似性方法的探索；这些算法的计算机化实现(在wisconsin genetics软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta，genetics computer group，575 science dr.，madison，wis.)；或目测检查(大体上参见ausubel等人，下文)。
[1206]
适于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个实例是altschul等人，j.mol.biol.215：403-410(1990)中描述的blast算法。用于执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)网站公开获得。可使用gcg软件包中的gap程序(可在http://www.gcg.com获得)，使用nwsgapdna.cmp矩阵以及空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。两个核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性也可使用已并入align程序(2.0版)的e.meyers和w.miller(cabios，4：11-17(1989))的算法，使用pam120权重残基表，空位长度罚分12和空位罚分4来测定。另外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可使用已并入gcg软件包中的gap程序(可在http://www.gcg.com获得)的needleman和wunsch(j.mol.biol.(48)：444-453(1970))算法，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6来测定。
[1207]
本公开的核酸和蛋白质序列还可用作“查询序列”，以对公共数据库进行搜索，例如，以鉴定相关序列。可使用altschul等人(1990)j.mol.biol.215：403-10的nblast和xblast程序(2.0版)进行此类搜索。blast核苷酸搜索可用nblast程序(得分＝100，字长＝12)来进行以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白质搜索可用xblast程序(得分＝50，字长＝3)来进行以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可利用如altschul等人，(1997)nucleic acids res.25(17)：
3389-3402所描述的gapped blast。当利用blast和gapped blast程序时，可使用相应程序(例如，xblast和nblast)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
[1208]
药学上可接受的：如本文中所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内，适于与人和动物的组织、器官和/或体液接触使用而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[1209]
药学上可接受的载剂：如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指并包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。组合物可包含药学上可接受的盐，例如，酸加成盐或碱加成盐(参见例如berge等人(1977)j pharm sci 66：1-19)。
[1210]
磷酸盐(phosphate)：如本文所用，术语“磷酸盐”意指磷酸的盐或酯。多磷酸盐(polyphosphates)是由通过共享氧原子连接在一起的四面体po4(磷酸盐)结构单元形成的聚合氧阴离子的盐或酯。如本文所用，术语“二磷酸盐”是指包含两个磷酸盐结构单元的多磷酸盐。如本文所用，术语“三磷酸盐”是指包含三个磷酸盐结构单元的多磷酸盐。在一些实施方案中，本公开提供了一种rig-i样受体激动剂，其包含连接至5
′
末端的二磷酸部分或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，本公开提供了一种rig-i样受体激动剂，其包含连接至5
′
末端的三磷酸部分或者其衍生物或类似物。在一些实施方案中，所述二磷酸或三磷酸部分的衍生物或类似物是磷酸酯生物电子等排体。
[1211]
磷酸酯互物电子等排体：如本文所用，术语“磷酸酯生物电子等排体”(替代地“磷酸酯模拟物”)是指具有与磷酸酯类似的物理或化学特性并产生与磷酸酯(包括二磷酸和三磷酸部分)广泛类似的生物学特性的化学取代基或基团。在药物设计中，将一种生物电子等排体交换为另一种的目的是在不显著改变化学结构的情况下增强化合物的所需生物学或物理性质。生物电子等排体的使用在药物开发中很普遍，并且例如用于降低毒性、改变生物利用度或改变母体化合物或先导化合物的活性或代谢(参见例如rye和baell(2005)curr med chem 12(26)：3127-3141；elliot等人，(2012)medchemcom 3(7)：735-751，所述文献以引用的方式整体并入本文)。
[1212]
多肽：如本文所用，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[1213]
预防：如本文所用，术语“预防”当与病状相关使用时，是指组合物的施用，相对于未接受组合物的受试者，所述组合物降低受试者的医学病状的症状的频率或延缓所述症状的发作。
[1214]
纯化的：如本文所用，当应用于本文所述的任何蛋白质(抗体或片段)时，术语“纯化的”或“分离的”是指已从天然伴随其的组分(例如，蛋白质或其他天然存在的生物或有机分子)分离或纯化的多肽，例如表达所述蛋白质的原核生物中的其他蛋白质、脂质和核酸。通常，当多肽占样品中总蛋白质的至少60重量％(例如，至少65重量％、70重量％、75重量％、80重量％、85重量％、90重量％、92重量％、95重量％、97重量％或99重量％)时，多肽是纯化的。
[1215]
参考配体：如本文所用，术语“参考配体”(可与“参考激动剂”互换使用)或“参考分
子”是指rig-i样受体配体，并且用于建立其自身与一种或多种不同的rig-i样受体配体之间的关系，其中所述关系是参考配体和一种或多种不同的rig-i样受体配体的相对激动作用。如本文所用，所述术语表示可作为竞争物用于测试或测定(诸如本文所述的那些(例如，ifn诱导测定))的rig-i样受体配体或激动剂，其中所述测定可用于发现、鉴定或开发一种或多种结合至rig-i样受体的不同激动剂。
[1216]
rig-i：如本文所用，术语“rig-i”是指视黄酸诱导基因i多肽，rig-i样受体家族的特定成员并且由人的ddx58基因编码。本领域中rig-i的替代名称和首字母缩略词包括dead盒多肽58、rigi、rlr-1、sgmrt2和dexd/h盒解旋酶58。全长人rig-i的示例性氨基酸序列示于表4中(seq id no：98)和此处：
[1217][1218][1219]
(ncbi登录号：np_055129.2)
[1220]
rig-i样受体：如本文所用，术语“rig-i样受体”(缩写为“rlr”)是指充当通常在病毒rna中发现的病原体相关分子模式(pamp)的细胞质模式识别传感器的dexd/h盒rna解旋
酶家族的任何成员。配体结合后，rlr发出下游转录因子激活信号以驱动1型干扰素(ifn)产生和抗病毒基因表达，从而引出胞内免疫反应以控制病毒感染。已鉴定出三个rlr成员：rig-i(视黄酸诱导基因i)、mda5(黑色素瘤分化相关因子5)和lgp2(遗传学和生理学实验室2和小鼠d11lgp2的同源物)(loo和gale(2011)immunity34(5)：680-692)。
[1221]
rig-i样受体激动剂：如本文所用，术语“rig-i样受体激动剂”(可与术语“rlr激动剂”互换使用)是指结合至rig-i样受体(rlr)并部分地或完全地促进、诱导、增加和/或激活由rlr信号传导介导的生物学活性、反应和/或下游通路或其他rlr介导的功能的核酸(例如，rna)。本文提供了rig-i受体激动剂的实例。在一些实施方案中，rlr激动剂是单链核酸(例如，rna)。在一些实施方案中，rlr激动剂是双链核酸(例如，rna)。
[1222]
稳定的rna二级结构：如本文所用，术语“稳定的rna二级结构”是指rna分子或其局部区段或部分所采用的结构、折叠或构象，其在生理条件下持续维持并以低自由能状态为特征。稳定的rna二级结构的典型实例包括双链体、发夹和茎环。本领域已知稳定的rna二级结构表现出多种生物学活性。如关于多核苷酸双链体所用的术语“稳定”意味着双链体在生理条件下或在核酸诊断或治疗应用中使用的典型的盐和温度条件下基本上仅以双链体的形式保持杂交、结构化或退火。
[1223]
受试者：如本文所用，术语“受试者”包括任何人或非人动物。例如，本发明的方法和组合物可用于治疗患有免疫病症的受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
[1224]
t细胞：术语“t细胞”是指可通过细胞表面上存在t细胞受体而与其他白细胞区分开来的一类白细胞。有几个t细胞亚组，包括但不限于：辅助性t细胞(叉名th细胞或cd4 t细胞)和亚型，包括th1、th2、th3、th17、th9和tfh细胞；细胞毒性t细胞(又名tc细胞、cd8 t细胞、细胞毒性t淋巴细胞、t杀伤细胞、杀伤性t细胞)；记忆t细胞和亚型，包括中央记忆t细胞(tcm细胞)、效应记忆t细胞(tem和temra细胞)和驻留记忆t细胞(trm细胞)；调节性t细胞(又名treg细胞或抑制性t细胞)和亚型，包括cd4 foxp3 treg细胞、cd4 foxp3-treg细胞、tr1细胞、th3细胞和treg17细胞；自然杀伤t细胞(又名nkt细胞)；粘膜相关恒定t细胞(mait)；和γδ t细胞，包括vγ9/vδ2 t细胞。任何一种或多种上述或未提及的t细胞可以是本发明使用方法的靶细胞类型。
[1225]
t细胞活化：如本文所用，术语“t细胞活化”或“t细胞的活化”是指在其表面表达抗原特异性t细胞受体的成熟t细胞识别它们的同源抗原并通过进入细胞周期、分泌细胞因子或裂解酶以及引发或变得有能力执行基于细胞的效应功能而作出反应的细胞过程。t细胞活化需要至少两个信号以完全激活。第一次发生在t细胞抗原特异性受体(tcr)与抗原主要组织相容性复合物(mhc)的衔接后，并且第二次发生在随后与共刺激分子(例如，cd28)的衔接后。这些信号被传递到细胞核并导致t细胞的克隆扩增、细胞表面上活化标志物的上调、向效应细胞的分化、细胞毒性或细胞因子分泌的诱导、凋亡的诱导或其组合。
[1226]
t细胞介导的反应：如本文所用，术语“t细胞介导的反应”是指由t细胞(包括但不限于效应t细胞(例如，cd8 细胞)和辅助性t细胞(例如，cd4 细胞))介导的任何反应。t细胞介导的反应包括例如t细胞细胞毒性和增殖。
[1227]
四环：如本文所用，术语“四环”是指存在于发夹或茎环rna二级结构中的一类四碱基环基序，其在一端盖住双链体，连接构成双链体的两条链，并为发夹结构提供稳定性。
[1228]
治疗剂：如本文所用，术语“治疗剂”是指当施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引出所需生物学和/或药理学作用的任何剂。
[1229]
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或本文使用的类似术语旨在表示将引出所需生物学或医学反应诸如像治愈或至少部分地阻止已经罹患疾病的患者的病状或疾病及其并发症(例如，癌症的一种或多种症状的改善)的剂(例如，合成rig-i样受体激动剂)的量。对于这种用途有效的量将取决于所治疗病症的严重性和患者自身免疫系统的一般状态。
[1230]
治疗：如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指本文所述的治疗或预防措施。“治疗”的方法采用向需要此类治疗的受试者(例如需要针对特定抗原的免疫反应增强的受试者或最终可能患上这种疾病的受试者)施用本公开的人抗体，以预防、治愈、延缓病症或复发性病症、降低其严重性或改善其一种或多种症状，或者将受试者的存活期延长至超过不存在此类治疗时的预期存活期。
[1231]
肿瘤微环境：如本文所用，术语“肿瘤微环境”(替代地“癌症微环境”；缩写为tme)是指肿瘤或赘生物存在的细胞环境或环境，包括周围血管以及非癌细胞，包括但不限于免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎性细胞和淋巴细胞。信号传导分子和胞外基质也构成tme。肿瘤与周围微环境密切相关，并且不断相互作用。肿瘤可通过释放胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受来影响微环境，而微环境中的免疫细胞可影响肿瘤细胞的生长和进化。
[1232]
病毒样颗粒(vlp)：如本文所用，术语“病毒样颗粒”或“vlp”是指类似于病毒颗粒但尚未证明是致病性的结构。通常，根据本公开的病毒样颗粒不携带编码病毒样颗粒的蛋白质的遗传信息。一般来说，病毒样颗粒缺乏病毒基因组，并且因此是非感染性的。此外，病毒样颗粒通常可通过异源表达大量产生，并且可以很容易地纯化。一些病毒样颗粒可含有与其基因组不同的核酸。如所指出的，根据本公开的病毒样颗粒是非复制性和非传染性的，因为其缺乏病毒基因组的全部或部分，特别是病毒基因组的复制性和感染性组分。根据本公开的病毒样颗粒可含有与其基因组不同的核酸。在一些实施方案中，根据本公开的病毒样颗粒是病毒衣壳，诸如对应病毒、噬菌体或rna噬菌体的病毒衣壳。如本文可互换使用的术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白亚基组成的大分子组装。通常且优选地，病毒蛋白亚基分别组装成病毒衣壳和衣壳，其具有含有固有重复组织的结构，其中所述结构通常是球形或管状的。例如，rna噬菌体或hbcag的衣壳具有二十面体对称的球形。如本文所用，术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白亚基组成的大分子组装，其与上述定义意义上的衣壳形态类似，但偏离典型的对称组装，同时维持足够的有序性和重复性程度。
[1233]
噬菌体的病毒样颗粒：如本文所用，术语“噬菌体的病毒样颗粒”是指一种病毒样颗粒，其类似于噬菌体的结构，具有非复制性和非感染性，并且至少缺少编码噬菌体的复制机制的一种或多种基因，并且通常还缺少编码负责病毒附接于或进入宿主的一种或多种蛋白质的一种或多种基因。然而，这个定义还应涵盖噬菌体的病毒样颗粒，其中上述一个或多个基因仍然存在但无活性，并且因此也导致噬菌体的非复制性和非感染性病毒样颗粒。
[1234]
由rna噬菌体外壳蛋白的180个亚基自组装形成并任选含有宿主rna的衣壳结构称为“rna噬菌体外壳蛋白的vlp”。一个特定的实例是qβ外壳蛋白的vlp。在这种特定情况下，qβ外壳蛋白的vlp可仅由qβ cp亚基组装(通过表达含有例如taa终止密码子的qβ cp基因产
生，通过抑制排除较长a1蛋白的任何表达，参见kozlovska，t.m.，等人，intervirology 39：9-15(1996))，或在衣壳组装中另外含有a1蛋白亚基。
[1235]
病毒颗粒：如本文所用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态形式。在一些病毒类型中，其包含被蛋白质衣壳包围的基因组；其他病毒颗粒具有另外的结构(例如，包膜，尾部等)。无包膜病毒颗粒由围绕并保护病毒基因组的蛋白质衣壳构成。包膜病毒也具有围绕病毒的遗传物质的衣壳结构，但另外还具有围绕衣壳的脂质双层包膜。在一些实施方案中，vlp不含脂蛋白包膜或不含含脂蛋白的包膜。在另一实施方案中，vlp完全不含包膜。
[1236]
除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语所具有的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同。下文描述了方法和材料，但是与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于目前公开的方法和组合物的实践或测试。本文提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献以引用的方式整体并入。
[1237]
等同物和范围
[1238]
本领域技术人员将认识到或仅仅使用常规实验即能够确定本文所述的特定实施方案的许多等同形式。本公开的范围并非意图限制于上述具体实施方式，而是如所附权利要求中所阐述。
[1239]
在权利要求中，除非相反指示或另外从上下文明显看出，否则冠词诸如“一个(a)”、“一种(an)”以及“所述(the)”可意指一个或多于一个。除非指明相反情况或另外从上下文明显看出，否则如果一个、多于一个或所有组成员存在于、被用于给定产品或方法中或以其他方式与给定产品或方法相关，则认为在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是满足的。本公开包括其中所述组的一个成员恰好存在于给定产品或方法中、在其中采用或以其他方式与其相关的实施方案。本公开包括其中多于一个或全部组成员存在于给定产品或方法中、在其中使用或以其他方式与其相关的实施方案。此外，应理解，本公开包括所有的变化、组合和排列，其中一个或多个限制、要素、条款、描述性术语等，从所列出的权利要求中的一个或多个被引入到另一权利要求。例如，任何附属在另一权利要求的权利要求可被修改以包括在任一其他属于同一基本权利要求的权利要求中所见的一个或多个限制。此外，在权利要求列举组合物的情况下，应理解，除非另外指定或除非本领域的普通技术人员明显会出现矛盾或不一致，否则包括出于本文公开的任何目的使用组合物的方法，并且包括根据本文公开的任何制备方法或本领域已知的其他方法制备组合物的方法。
[1240]
在要素以清单形式，例如以马库什组(markush group)形式呈现的情况下，应理解，还公开了所述要素的每个子组，并且可从组中去除任何要素。应理解，一般来说，在本发明或本发明的方面被称为包含特定要素、特征等的情况下，本发明或本发明的方面的某些实施方案由或基本上由此类要素、特征等组成。出于简单的目的，这些实施方案并未在本文中用同样的话来具体阐述。
[1241]
还应注意术语“包含”旨在是开放的并且允许但并非要求包含另外的要素或步骤。当本文中使用术语“包含”时，因此还涵盖并且公开术语“由......组成”。
[1242]
在给出范围时，端点被包括在内。此外，应理解，除非另外指定或另外根据上下文和本领域的普通技术人员的理解明显看出，否则被表示为范围的值可在本发明的不同实施方案中呈现所述范围内的任何具体值或子范围，除非上下文另外明确规定，否则直到所述
范围的下限的单位的十分之一为止。
[1243]
另外，应理解，在现有技术内的本发明的任何具体实施方案可以从任何一个或多个权利要求中明确排除。因为认为此类实施方案是本领域普通技术人员所已知的，即使本文没有明确阐述排除，也可以排除它们。本发明的组合物的任何具体实施方案(例如，由此编码的任何核酸或蛋白质；任何生产方法；任何使用方法等)可出于任何原因而从任何一个或多个权利要求中排除，无论是否与现有技术存在相关。
[1244]
所有引用的来源，例如参考文献、出版物、数据库、数据库条目和本文引用的技术都以引用的方式并入本技术，即使在引用中没有明确说明。在引用的来源与本技术的陈述发生冲突的情况下，应当以本技术中的陈述为准。
[1245]
实施例
[1246]
通过参考以下实施例将更完全地理解本公开。然而，所述实施例并不应当被解释为对本公开的范围进行限制。应理解，本文所述的实施例和实施方案仅出于说明性目的，并且将建议本领域的技术人员根据其进行各种修改或改变，并且它们将包括在本技术的精神和权限以及所附权利要求的范围内。
[1247]
实施例1：用rlr激动剂转染hupbmc诱导体外细胞因子产生
[1248]
为了确定包含各种修饰的rlr激动剂对细胞因子诱导的作用，在体外评估了rlr激动剂诱导细胞因子产生的能力。人外周血单核细胞(hupbmc)由两名健康供体制备，并以2x105个细胞/孔的密度于100μl补充有胎牛血清(fcs)、l-谷氨酰胺和pen/strep的rpmi 1640细胞培养基中接种在标准96孔组织培养板中。如图1所指定，使用lipofectamine2000作为转染试剂，用rlr激动剂对hupbmc进行独立转染。将细胞在加湿培养箱中于37℃下孵育24小时，之后收获细胞培养上清液。立即将上清液冷冻并储存在-20℃下。将样品解冻一次以用于根据制造商的说明书使用u-plex msd平台分析细胞因子ifn-α2a(图1)以及ifn-β、il-1β、ip-10、il-12p70、il-6、mcp-1和mip-1β(数据未示出)。图1示出了用包含各种修饰和/或序列基序的新型候选rlr激动剂处理的人pbmc的细胞因子分泌的剂量依赖性诱导。以10nm、2nm或0.4nm添加rlr激动剂。细胞响应于rlr激动剂转染而释放的细胞因子的量以pg/ml给出。
[1249]
表3和表4示出了每种rlr激动剂的序列。表3还示出了对应于图1中测试的每种化合物的序列和编号。例如，图1中的化合物x25224对应于“rig7”，其包含有包含seq id no：42的第一寡核苷酸，并且具有5
′
二磷酸部分，所述第一寡核苷酸经由接头“uucg”与包含seq id no：73的第二寡核苷酸连接。rig7的序列也如表4中的seq id no：6所示。对于表3中具有经由核苷酸接头连接的第一和第二寡核苷酸的rlr激动剂，使用寡核苷酸合成仪将所述激动剂合成为单一寡核苷酸。如表3所示，某些rlr激动剂具有第一寡核苷酸，其经由合成接头与第二寡核苷酸连接。例如，“rig 43a”包含有包含seq id no：63的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸经由c9烷基接头与包含seq id no：91的第二寡核苷酸连接；“rig 43b”包含有包含seq id no：63的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸经由c9烷基接头与包含seq id no：91的第二寡核苷酸和5
′
二磷酸部分连接；并且“rig 44”包含有包含seq id no：63的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸经由六乙二醇接头与包含seq id no：91的第二寡核苷酸和5
′
二磷酸部分连接。
[1250]
在一项单独的实验中，进一步评价了两种rlr激动剂在不同浓度下诱导ifn-α表达
的效力。rig 50c(x24907)(linehan等人，(2018)sci.adv.4(2)：e1701854)和肌苷取代的rig 27c(x24935)在如上所述的体外测定中以0.2nm、2nm、20nm和200nm的浓度进行测试。图2示出了与非特异性对照(即，用培养基、lipofectamine或免疫血清孵育的pbmc)诱导的细胞因子水平相比，两种化合物对ifn-α表达的剂量依赖性诱导。在测试的较低浓度下，与通过用rig 50c孵育所得出的ifn-α水平相比，用rig 27c孵育pbmc导致更高的ifn-α分泌。用0.2nm或2nm rig 27c转染的pbmc与用相同浓度的rig 50c转染的pbmc相比，得出的ifn-α水平分别为498
±
87pg/ml对167.2
±
21pg/ml和3152
±
200pg/ml对2469
±
91pg/ml。图2。
[1251]
表3：寡核苷酸组合表
[1252]
[1253][1254]
[1255]
(-)表示没有5
′
磷酸；(pp)表示5
′
二磷酸；(ppp)表示5
′
三磷酸；heg＝六乙二醇接头
[1256]
实施例2：qβ vlp合成
[1257]
qβ vlp的合成描述于美国专利号9,518,095中，所述专利以引用的方式并入本文并在下文简要描述。
[1258]
表达质粒ptac-nsd-qb-mut(seq id no：101)的克隆策略
[1259]
大肠杆菌rna噬菌体qβ的外壳蛋白编码基因(c)从质粒psdqb-rout(seq id no：109)扩增。所述质粒包含编码133-aa qβ外壳蛋白(cp)和329-aa通读蛋白(a1)的基因c序列。为了防止通读，根据ncbi genbank登录号m99030 tgaaca(seq id no：102)的核苷酸445-450被序列taatga(seq id no：103)替换。
[1260]
通过pcr扩增来自质粒psdqb-mut的外壳蛋白编码基因c。具有内部ecori位点和合成夏因-达尔加诺(sd，seq id no：105)序列的寡核苷酸qb-for3/2(seq id no：104)与qb cp基因的5
′
端退火。寡核苷酸qblang-rev2/2(seq id no：106)含有一个内部hindiii位点，并引发于基因c非编码区的3
′
端。1054bp扩增的pcr片段包括ncbi genbank登录号m99039的核苷酸46-1062(上述核苷酸变化除外)和合成sd序列。pcr片段用限制酶hindiii/ecori消化，并将得到的1036bp片段插入修饰的pkk223-3载体(pharmacia，ncbi genbank登录号：m77749，seq id no：107)的hindiii/ecori限制位点中。在这个修饰的pkk223-3载体中，氨苄青霉素抗性基因被载体puc4k(pharmacia，ncbi genbank登录号：x06404，seq id no：108)的卡那霉素抗性基因替换。
[1261]
载体ptac-nsdqb-mut(seq id no：109)在夏因-达尔加诺序列方面不同于载体ptacqb-mut。这个夏因-达尔加诺序列(nsd，seq id no：110)是通过经由pcr从质粒ptacqb-mut扩增qβ外壳蛋白编码基因c引入的。具有内部ecori位点和对应的合成夏因-达尔加诺(nsd)序列的寡核苷酸nsdqb-mutecorifor(seq id no：111)与qb cp基因的5
′
端退火。
[1262]
qβ cp在tac启动子和nsd的控制下的表达
[1263]
用质粒ptac-nsd-qb-mut(seq id no：101)转化大肠杆菌菌株rb791。克隆在摇瓶中生长。每个烧瓶含有100ml r40培养基(主培养基，hypep 7455，甘油)与卡那霉素(25μg/ml)，并以起始od
600 0.3接种过夜培养物。摇瓶在30℃和220rpm的搅拌下孵育4小时(od
600
介于4和5之间)。用0.5％的乳糖进行诱导，持续4小时。通过sds-page测定蛋白质产生。凝胶显示出一条强蛋白质谱带，其被鉴定为qβ cp。
[1264]
用于制造和纯化qβ-vlp的规模扩大的工艺公开于美国专利号9,657,065中，所述专利以引用的方式并入本文。简而言之，将大肠杆菌细胞团块悬浮在0.1％(v/v)triton-x-100溶液中，并通过在700
±
50巴下三次通过apv lab 100高压液体均质器(hplh)进行破坏。接着通过切向流过滤(tff)和无菌过滤处理匀浆，并且/或者通过离心进行澄清。
[1265]
使用阴离子交换(aix色谱)在fractogel.rtm.emd tmae柱上进一步纯化细胞匀浆，之后进行0.22μm孔除菌过滤，然后加载到macro-prep.rtm陶瓷羟基磷灰石ii型柱上。
[1266]
实施例3：将rlr激动剂包装到vlp中
[1267]
rlr激动剂可包装到vlp中，如美国专利号9,950,055中所描述，所述专利以引用的方式并入本文。简而言之，如以上实施例2中所述分离纯化的qβ二聚体蛋白。在下文描述的包装步骤中，纯化的qβ二聚体衣壳蛋白围绕rlr激动剂重新组装成vlp。
[1268]
rlr激动剂退火通过将rlr激动剂储备溶液(3.3mg/ml)溶解在nacp1缓冲液(250mm nacl，20nm napi ph 7.2)中至2.2mg/ml的浓度来进行。将混合物加热至70℃持续5分钟，并在室温下冷却15分钟，然后置于冰上直至qβ还原完成。qβ二聚体(4.165mg/ml)在5mm dtt和nacp1缓冲液中被还原。qβ二聚体和rlr激动剂通过在室温下摇动1小时来混合。然后将h2o2添加至10mm，并将qβ rlr激动剂溶液在室温下再摇动一小时。然后用100kda mwco膜渗析qβ rlr激动剂重新组装混合物。
[1269]
替代地，将rlr激动剂溶解在水中并以1、10和100nmol/ml添加到0.2x hbs中的qβ vlp中，并在混匀仪中于37℃下孵育3小时。通过酶促水解或渗析去除过量的核酸。
[1270]
实施例4：用qβ rig转染hupbmc在体外诱导细胞因子产生
[1271]
进一步评价了根据以上实施例3制备的qβ-rig，qβ-rig27c(包装到vlp中的rlr激动剂，其核苷酸序列为seq id no：23，其中rna噬菌体qβ外壳蛋白具有氨基酸序列seq id no：112)，在不同浓度下诱导ifn-α表达的能力。具体地说，qβ-rig27c在如上所述的体外测定中以2nm、20nm、200nm和600nm(基于rlr激动剂的浓度)的浓度进行测试。图3示出了与非特异性对照(即，用培养基、lipofectamine或免疫血清孵育的pbmc)得出的细胞因子表达水平相比，qβ-rig27c对ifn-α表达的剂量依赖性诱导。
[1272]
这个结果表明，qβ vlp递送媒介物可用于包装rlr激动剂，并且所得的rig-vlp，例如qβ-rig27c，在存在免疫血清的情况下诱导pbmc表达ifn-α。虽然用空衣壳转染pbmc，但“衣壳 血清”不诱导ifn-α反应。
[1273]
实施例5：qβ-rig的体内功效
[1274]
qβ-rig的体内功效可在临床前动物研究中进行评价，如美国专利号9,950,055中所描述，所述专利以引用的方式并入本文。给小鼠皮下施用qβ-rig。qβ-rig的免疫刺激作用通过免疫细胞在施用后不同时间点的胞内细胞因子染色来测量。
[1275]
在一项预防性研究中，用qβ-rig和包含病毒抗原的vlp(抗原-vlp)对小鼠进行皮下预敏(primed)。在预敏后的不同时间点，通过四聚体染色测量抗原特异性的频率。然后用表达病毒抗原的活病毒攻击小鼠，并在攻击后在例如四聚体测定中测量抗原特异性t细胞的频率。qβ-rigs的免疫刺激作用可通过比较用qβ-rigs和抗原-vlp预敏的小鼠与单独使用抗原-vlp预敏的小鼠中抗原特异性t细胞的频率来确定。
[1276]
在一项治疗性研究中，用表达病毒抗原的活病毒感染小鼠。进行四聚体染色以测量感染后抗原特异性t细胞的频率。然后给小鼠皮下施用qβ-rigs和抗原-vlp，并在施用后的不同时间点测量抗原特异性t细胞的频率。qβ-rigs的免疫刺激作用可通过比较施用qβ-rigs和抗原-vlp的小鼠与单独施用抗原-vlp的小鼠中抗原特异性t细胞的频率来确定。
[1277]
为了评价qβ-rig作为抗癌疗法的效力，给小鼠双侧皮下施用a20 b细胞淋巴瘤或b16f10黑色素瘤。qβ-rig或盐水对照在肿瘤攻击后3-7天开始在一侧瘤内(i.t.)递送，总共三个剂量，以评估qβ-rig疗法的局部(治疗肿瘤)和全身(未治疗肿瘤)作用。测量体重、肿瘤体积(治疗和未治疗)和总存活期。
[1278]
使用相同的肿瘤模型研究了qβ-rig与抗癌疗法(例如，抗pd1)的组合。小鼠皮下施用a20或b16f10肿瘤细胞，并用单独的如上所述的qβ-rig或其与抗pd-1或盐水对照的组合治疗，从肿瘤攻击后3-7天开始每周两次腹膜内递送。所述研究还包括单独使用抗pd-1的额外治疗组。通过比较单独或组合使用抗pd1或qβ-rig治疗的小鼠的体重、肿瘤体积(治疗和
未治疗)和总体存活率来测量抗癌功效的增强。
[1279]
表4：序列表
[1280]
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再多了解一些
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