用于3d打印的生物墨水、有关缀合物和由光反应性连接基组成的中间体的制备方法1.发明目的2.本发明描述了生物墨水用于3d打印的用途、有关的中间体缀合物以及由光反应性连接基(linker)组成的中间体的制备方法。3.本发明的一个目的是生物墨水用于3d打印的用途，即墨水用于3d打印领域中和3d生物打印领域中的用途，所述生物墨水包含透明质酸和双官能光反应性连接基的光可交联缀合物，或明胶和双官能光反应性连接基的光可交联缀合物，或两种光可交联缀合物的混合物。4.本发明的另一个目的是明胶和双官能光反应性连接基的缀合物，所述连接基由通过醚键结合的伞形酮和三甘醇间隔基(spacer)组成，所述缀合物是可交联的。5.本发明的另一个目的是由通过醚键结合至以下链的伞形酮组成的双官能光反应性连接基的制备方法：6.●三甘醇链，7.或8.●直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链，9.这样的连接基能够通过酰胺键形成结合至ha或明胶，并从而形成光可交联的ha缀合物或明胶缀合物，所述方法包含下述步骤：10.i)在有丙酮和碳酸钾存在下，将伞形酮用n-boc-2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺或用8-((叔丁氧基羰基)氨基)(c4-c20烷基)4-甲基苯磺酸酯醚化；[0011]ii)在室温进行胺基团的去保护反应。
背景技术：
：：[0012]组织和器官损伤修复的最有趣的领域之一当然是所谓的组织工程，其目的主要是创造用于各种损伤的构建体(支架)，从而促进原始组织再生或完全替代受损的器官。[0013]在再生过程中，所述构建体可以承载在损伤部位存在的细胞，所述细胞将定植于它，或者它们可以包含在构建体制备步骤中插入的细胞，具有活化、刺激和改善再生过程的功能，决定损伤闭合或器官整合。这样的构建体自然必须具有一些基本特征：它们必须完全没有毒性；它们必须是生物相容的；它们必须具有适合植入部位的强度和弹性的机械特征；在它接近存在于植入部位中的细胞时，和在制造步骤中将细胞封装在生物材料中并将它们混合到水凝胶中时，它们必须能够保证细胞活力、增殖和组构。[0014]因此，组织工程通常将生物学方面与其它确定的工程方面进行总结，也考虑到组织具有非常不同的生物学、生化、机械特征：骨骼与皮肤非常不同，肝脏与血管非常不同。[0015]三维打印(3d打印)的技术发展给组织工程领域带来了确定的冲击：它是一组能够从数字信息生成物理模型的技术。简而言之，根据适当编程的计算机提供的指令，特定打印机将低粘度聚合物“墨水”(墨水)转化为与解剖模型完全一致的三维实体结构。[0016]随着墨水从打印机逐渐递送(挤出)，墨水固化通常通过辐照发生：通过光诱导的聚合反应，墨水交联，即聚合，从而转变为刚好具有预定形式的固体。如果希望最终的构建体包含细胞，则有必要在挤出阶段之前将它们与墨水混合(封装)：墨水必须明显保证在其中所包含的细胞材料的活力和增殖能力。在该情况下，说3d生物打印更正确，并且墨水被定义为生物墨水。[0017]在医疗和外科手术领域，能够为每位患者定制解剖模型当然非常有用，这些模型旨在修复组织或甚至替换整个器官。[0018]采用这些技术可以获得的结构也特别适用于释放在构建体中包含的活性物质和创建用于试验新药物的基质，从而有助于它们更快的开发、更少的侵入性、更便宜和道德上正确。[0019]制备所述结构的一个决定因素是墨水类型，由于产生具有非常特殊性能的支架的事实，从技术观点(例如，易于加工)和从生物学观点(诸如生物相容性和非常低毒性或无毒性)，所述墨水类型必须具有特殊要求。[0020]迄今为止，技术人员已知的更常见墨水基本上由生物相容性聚合物组成，其中包括明胶、透明质酸、丝心蛋白、海藻酸盐、纤维素、各种改性的和/或彼此混合的。[0021]例如，wo2011088213描述了由透明质酸和明胶形成的墨水，其用甲基丙烯酸酸酐衍生化并在有光引发剂存在下用uv光光聚合；k等人(biofabrication2016,8(3):032002)描述了基于在特定光引发剂存在下用戊烯酸酐酯化的透明质酸聚合的墨水；yinj.(acsappl.mater.interfaces2018,10,6849-6857)描述了基于甲基丙烯酸酯交联的明胶的墨水的特征，所述墨水为了改善其印刷适性进一步与明胶混合。[0022]一般而言，在现有技术中，无论使用的聚合物如何，聚合都通过光引发剂的应用而发生，与用于起始聚合物的化学修饰的甲基丙烯酸酯一样，所述光引发剂可能有毒。[0023]因此，本发明的一个目的是发现(identify)克服根据现有技术的墨水的缺点的墨水。[0024]实际上，根据本发明使用的墨水对象不涉及使用光引发剂并且不使用有毒物质来衍生化起始聚合物，因此当原样使用时以及当还包含细胞材料时都产生具有非常高安全性谱的材料。[0025]它们还具有所有的功能特征、流变特征和机械特征，使其适合用于3d打印和3d生物打印；这就是为什么并且为了简洁起见，在本发明中描述的墨水总是被定义为生物墨水(bio-ink)或生物墨水(bioink)，即使在不包含细胞时。[0026]发明详述[0027]本发明的一个目的是生物墨水用于3d打印的用途，即墨水用于3d打印领域中和3d生物打印领域中的用途，所述生物墨水包含透明质酸和双官能光反应性连接基的光可交联缀合物，或明胶和双官能光反应性连接基的光可交联缀合物，或两种光可交联缀合物的混合物。[0028]本发明的另一个目的是通过酰胺键结合的明胶和双官能光反应性连接基的缀合物，所述连接基由通过醚键结合的伞形酮和三甘醇间隔基组成，所述缀合物是可交联的且具有式(iii)的结构。[0029][0030]本发明的另一个目的是由通过醚键结合至以下链的伞形酮组成的双官能光反应性连接基的制备方法：[0031]●三甘醇链，[0032]或[0033]●直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链，[0034]这样的连接基能够通过酰胺键形成结合至ha或明胶，并从而形成光可交联的ha缀合物或明胶缀合物，所述方法包含下述步骤：[0035]i)在有丙酮和碳酸钾存在下，将伞形酮用n-boc-2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺或用8-((叔丁氧基羰基)氨基)(c4-c20烷基)4-甲基苯磺酸酯醚化；[0036]ii)在室温进行胺基团的去保护反应。[0037]因此，本发明涉及生物墨水用于3d打印领域中和3d生物打印领域中的用途，所述生物墨水包含光可交联的透明质酸缀合物或光可交联的明胶缀合物或其光可交联的混合物，其具有以下特征：[0038]·总体生物相容性；[0039]·附着存在于植入部位的细胞的能力，并允许它们随后增殖；[0040]·在聚合前步骤中封装细胞的能力，维持其聚合后活力的完整性；[0041]·在低于体温的温度进行低粘度预聚合，以便允许在打印步骤中的良好挤出，内含或不含细胞材料；[0042]·粘度和屈服应力(切向应力值，在其以下材料是静态)的组合，其能够允许材料挤出并在挤出后保持形状足够长的时间以进行交联；[0043]·可灭菌性；根据本发明的生物墨水可以通过0.45μ过滤器过滤和/或在高压釜中热处理进行灭菌；[0044]·高聚合速率，从而减少uv光暴露时间；这样的特征是非常合乎需要的，尤其是当生物墨水包含细胞时；[0045]·合适的聚合后流变机械特征，根据具体的应用范围而有所不同。[0046]根据本发明使用的生物墨水也通过使用低毒性和危险性反应物(不易燃烧、不易爆炸)的方法来制备，并且在不使用任何光引发剂的情况下进行交联。[0047]在已知的各种聚合物中，明胶和透明质酸(ha)特别适用于本发明的目的，它们通过与双官能光反应性连接基缀合而成为光可交联的，当暴露于精确波长的uv光时，其通过交联而诱导聚合，并然后生物墨水固化，无需使用光引发剂。[0048]根据本发明使用的双官能光反应性连接基(为简洁起见被定义为“连接基”)是香豆素连接基，即由与间隔基结合的伞形酮残基组成，其中间隔基可以是聚乙二醇，特别是三甘醇(teg)或直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链。[0049]双官能光反应性连接基teg-伞形酮由下式(i)表示：[0050][0051]其中：[0052]r＝-nh2，用于形成酰胺键；[0053]r＝-i，用于形成酯键。[0054]双官能光反应性连接基烷基链-伞形酮由下式(ii)表示：[0055][0056]因此，无论它是什么，间隔基在一端总是通过醚键结合伞形酮，并在另一端它结合选定的聚合物，即ha或明胶。间隔基适当地被官能化，这与要与聚合物与一起产生的酯或酰胺键类型相关。更确切地说：[0057]●在伞形酮-聚乙二醇连接基和ha之间的键可以是酯或酰胺键；[0058]●在伞形酮-烷基连接基和ha之间的键排它地是酰胺键；[0059]●在连接基伞形酮-聚乙二醇或伞形酮-烷基和明胶之间的键总是酰胺键。[0060]明胶是胶原变性的产物，它可溶于水，在水中形成粘稠溶液，并被美国监管机构fda认定为gras(公认为安全的)。[0061]它广泛用于食品、制药、化妆品和营养品行业，用于皮肤、头发和关节健康的食品添加物中。与生产它的胶原相比，明胶的免疫原性低得多，但它保留了rgd结构域(氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，提供对细胞迁移、增殖和分化的刺激效应以及用于通过mmp(基质金属蛋白酶)降解的攻击位点，这使其成为酶可降解的。[0062]优选用于本发明的明胶属于b型牛来源(即通过胶原的碱性水解获得)并且具有约225gbloom(冷却后的胶凝能力，根据uspxx(1990)1017测量)。[0063]光可交联的明胶缀合物通过明胶的羧基缀合而获得，所述缀合通过用双官能光反应性连接基酰胺化实现，所述连接基由与以下物质结合的伞形酮残基组成：聚乙二醇间隔基，优选三甘醇；或直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链。[0064]更优选地，明胶光可交联缀合物通过明胶的羧基缀合而获得，所述缀合通过用双官能光反应性连接基酰胺化实现，所述连接基由与三甘醇间隔基结合的伞形酮残基组成。[0065]然后通过涉及明胶的羧基和适当官能化的间隔基的酰胺键形成，将明胶与如上所述的光反应性连接基缀合，优选与连接基teg-伞形酮缀合，获得如下所示的式(iii)的缀合物[0066][0067]透明质酸是一种由d-葡糖醛酸和n-乙酰基-d-葡糖胺的残基交替组成的杂多糖，为直链，具有可以在400至3x106da之间的分子量，取决于使用的提取源或制备方法。ha存在于生物有机体的每个区域中，并且它参与与许多组织(诸如皮肤、肌腱、肌肉和软骨)的细胞的机械支持有关的许多过程。ha在组织修复过程中起决定性作用，无论是从结构观点看还是作为刺激其直接或间接参与的一系列过程的物质(weigelp.等人,jtheoreticalbiol,1986:219-234；abatangelog.等人,jsurgres,1983,35:410-416；goak.等人,drugs,1994,47:536-566)。此外，ha具有抗炎活性，因为它调节细胞因子释放，特别是il-1，并且它具有镇痛活性，因为它结合阿片样物质特异性受体。[0068]从化学观点看，ha分子具有众多官能团，这些官能团使其可变地修饰，例如通过与有机或无机碱成盐、通过用各种性质的醇酯化、通过用非治疗活性胺酰胺化。[0069]根据已知方法，例如，通过从鸡冠花中提取(ep138572)、通过从链球菌属发酵(wo2018020458；wo2019016699)、通过从芽孢杆菌属生物合成(wo2012032154)，可以生产和纯化本文描述的用于制备一种或多种生物墨水的起始透明质酸。从链球菌属或芽孢杆菌属、更优选地从链球菌属生产和纯化的ha是优选的，其重均mw被包含在100,000至250,000da之间，优选在180,000至230,000da之间，为简洁起见定义为“mw200kda”，或重均mw介于500,000至730,000da之间的ha。[0070]平均分子量(mw)是指通过“固有粘度”方法计算的重均mw(terbojevich等人,carbohydrres,1986,363-377)。[0071]在本发明的范围内，通过ha羧基与如上所述的双官能光反应性连接基的酯化或酰胺化获得感兴趣的缀合物，所述连接基优选由与伞形酮结合的三甘醇组成，获得如下所示的式(iv)和(v)的缀合物：[0072]ha-teg-伞形酮酯(iv)[0073][0074]ha-teg-伞形酮酰胺(v)[0075][0076]ha-双官能光反应性连接基键在通过交联聚合后产生具有不同降解程度(取决于它涉及(dealwith)的酯(更可降解)或酰胺(不易降解)键)，但保持生物相容性和无毒性特征完整的物质。[0077]透明质酸的光可交联缀合物通过透明质酸羧基的缀合而获得，所述缀合是通过用双官能光反应性连接基酯化或酰胺化，所述连接基由与以下物质结合的伞形酮残基组成：聚乙二醇间隔基，优选三甘醇，或直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链。[0078]更优选地，所述透明质酸的光可交联缀合物通过透明质酸羧基的缀合而得到，所述缀合通过用双官能光反应性连接基酰胺化，所述连接基由与三甘醇间隔基结合的伞形酮组成；甚至更优选地起始透明质酸从链球菌属制备和纯化(wo2018020458；wo2019016699)，并具有被包含在100,000至250,000da之间、优选在180,000至230,000da之间的重均mw。[0079]这样的衍生物是技术人员已经已知的：wo2014122580描述了其合成并要求保护形成“形状记忆”海绵或水凝胶的能力，即非常耐久、致密并且在切割、扭转和处理之后也能够维持它们的形状。[0080]在本发明范围内，证实了通常用于治疗骨关节炎和软骨损伤、预防手术后粘连、软组织填充以及深部和空洞损伤(deepandcavitatedinjuries)的这样的衍生物适用于用作生物墨水通过3d打印来制造构建体。[0081]因此，本发明的一个目的也是本文所述的生物墨水用于通过3d打印制造构建体的用途。[0082]申请人还已经开发了双官能光反应性连接基的新制备方法，其适用于形成随后的酰胺键，相对于在wo2014122580中描述的，其使用无毒且不易燃的反应物，更快速、更便宜、总体上更安全且在工业上更方便。[0083]本发明也涉及由通过醚键结合至以下链的伞形酮组成的双官能光反应性连接基的制备方法：[0084]●三甘醇链(teg)，[0085]或[0086]●直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链，[0087]这样的连接基能够通过酰胺键形成结合至ha或明胶，并从而形成光可交联的ha缀合物或明胶缀合物，所述方法包含下述步骤：[0088]i)在有丙酮和碳酸钾存在下，将伞形酮用n-boc-2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺或用8-((叔丁氧基羰基)氨基)(c4-c20烷基)4-甲基苯磺酸酯醚化；[0089]ii)在室温进行胺基团的去保护反应。[0090]简而言之，上述方法仅涉及两个不同的步骤：最初是醚化步骤，其中伞形酮通过快速和清洁反应结合至反应物n-boc2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺或8-((叔丁氧基羰基)氨基)(c4-c20烷基)4-甲基苯磺酸酯，优选4-甲基苯磺酸8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酯(由ambeed销售)，所述快速和清洁反应涉及使用丙酮作为回流溶剂和碳酸钾作为碱。[0091]然后，将胺基团在室温在1至6小时之间的时间脱保护，以定量收率提供期望产物(伞形酮-teg-nh2或伞形酮-c4-c20-烷基-nh2)，无需进一步纯化。[0092]相对于在wo2014122580中描述的内容，上述方法具有许多优点：[0093]所述合成更快速且更便宜，因此仅需要两个步骤而不是在wo'580中预期的五个步骤。此外，使用的溶剂量要少得多；避免了使用导致高化学风险的叠氮化钠；避免了涉及使用pd/c(钯/碳)作为催化剂的氢化；钯由于其潜在的毒性，也必须作为特殊废物处理。[0094]根据本发明使用的生物墨水，当由ha缀合物或明胶缀合物组成时以及当由上述缀合物的混合物组成时，可以任选地进一步与细胞材料混合，诸如、例如结缔组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织的细胞或间充质细胞，和/或与其它组分混合，所述其它组分选自本领域已知的以下透明质酸衍生物，诸如：[0095]·在ep1095064和ep1853279中描述的酰胺衍生物。脂族酰胺衍生物是优选的，尤其是由具有被包含在500kda至730kda之间的重均分子量的ha制备的十六烷基酰胺，且其具有被包含在0.1％至10％摩尔之间、优选地被包含在1％至3％摩尔之间的平均酰胺化程度，这在酰胺水解和离去的十六烷基胺与荧光团物质的缀合以后通过hplc检测。具有上述特征和被包含在1％至3％摩尔之间的平均衍生化程度的十六烷基酰胺描述于ep1853279中，并且它可在商业名称-4下得到；[0096]·具有不高于20％、优选在0.05至10％之间的酯化百分比的自交联内酯，如在ep0341745中所述，且是在现有技术中作为已知；[0097]·交联衍生物，其通过使用交联剂诸如bdde(1,4-丁二醇二缩水甘油醚(diglycilether))获得，其衍生化程度相对于透明质酸重复单元为2.5至25％摩尔，优选在5至15％摩尔之间，并由具有被包含在500至730kda之间的重均mw的ha制备，如在ep2470230中所述，并且在名称hbc下已知。[0098]与ha的其它衍生物的混合会增加生物墨水的流变学特征并使其可调节，并增加其对透明质酸酶的降解作用的抗性(pavan2016)，从而使其适用于任何类型的应用。[0099]优选地，生物墨水可以包含以下物质作为其它ha衍生物[0100]·在ep1095064和ep1853279中描述的酰胺，优选由具有被包含在500kda至730kda之间的重均分子量的ha制备的十六烷基酰胺，且其具有被包含在0.1％至10％摩尔之间、优选地被包含在1％至3％摩尔之间的平均酰胺化程度(-4)；[0101]·具有不高于20％、优选在0.05至10％之间的酯化百分比的自交联内酯，如在ep0341745中所述[0102]·通过使用交联剂诸如bdde(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)获得的交联衍生物，其衍生化程度相对于透明质酸重复单元为2.5至25％摩尔，优选在5至15％摩尔之间，并由具有被包含在500至730kda之间的重均mw的ha制备，如在ep2470230中所述(hbc)。[0103]甚至更优选地，生物墨水可以包含-4或hbc诸如其它ha衍生物。[0104]在处理条件下，在生物墨水本身内存在或不存在细胞的情况下，与要获得的结果有关，用不同浓度的前面描述的聚合物制备生物墨水。[0105]具体地，生物墨水可以包含[0106]·如前面描述的通过酯或酰胺键与双官能光反应性连接基缀合的ha，在20-60mg/ml的不同浓度，优选地被包含在30至50mg/ml之间，甚至更优选地等于40mg/ml；[0107]·通过酰胺键与双官能光反应性连接基缀合的明胶，在20-60mg/ml的不同浓度，优选地被包含在30至50mg/ml之间，甚至更优选地等于40mg/ml；[0108]·ha缀合物和明胶缀合物的混合物，其组成与待生产的材料关联地变化，混合物中两种组分的总浓度范围为30-80mg/ml，优选30-70mg/ml，且更优选地被包含在30至60mg/ml之间；优选地，相对于上述总浓度，明胶缀合物的浓度范围为10-30mg/ml，更优选15至30mg/ml，且甚至更优选地它等于20mg/ml；[0109]·与hbc、-4、的混合物：将额外聚合物(选自hbc、-4、)以1:1至5:1、优选3:1至4:1之间变化的比率与ha缀合物或明胶缀合物混合。当额外聚合物是hbc时，优选的比率是1:1。形成混合物的组分的总浓度在20-80mg/ml，优选40-70mg/ml，更优选40-60mg/ml，且甚至更优选40-50mg/ml之间变化。[0110]在特殊情况下，例如当需要特定流变条件并且额外聚合物选自-4和时，额外聚合物与ha缀合物或明胶缀合物之间的比率甚至可以在1:1至1:2之间变化，优选地它等于1:1.5。[0111]为了更好地说明本发明的目的和优点，提供了一些实施例，尽管它们不以任何方式构成对权利要求范围的限制。[0112]实施例1:由hatbamw200kda合成通过酯键的ha-teg-伞形酮缀合物(如在wo2014122580的实施例9中所报告)[0113]简而言之，在配备热稳定的(thermostatable)乙二醇夹套和磁力搅拌的玻璃反应器中，将2.0g的hatba(ha四丁基铵)溶解在240ml的无水dmso中并加入521mg的7-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮(如在wo2014122580的实施例3中所报告制备)。反应在40℃进行48小时；然后在搅拌下加入nabr饱和溶液，因此通过加入etoh实现沉淀。通过在etoh/h2o95:5和纯etoh中洗涤纯化产物，然后在高真空下干燥。将如此得到的产物通过ft-ir、rp-hplc和1hnmr分析，表现出等于32％的官能化和92％的收率。[0114]实施例2：通过酰胺键键合至ha或明胶的连接基伞形酮-teg-胺的合成(2步)[0115]2步的第1步：(2-(2-(2-((2-氧代-2h-色烯-7-基(il))氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯合成[0116]在配备磁力搅拌、氮气流、油浴和冷却剂的2颈烧瓶中，引入伞形酮(221mg)、k2co3(0.94g；5当量)和无水丙酮(10ml)，随后引入催化量(0.01当量)的18-冠-6，然后引入n-boc2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺(0.49g；0.85当量)。在搅拌下让反应进行至回流48小时。将反应混合物冷却，穿过gooch漏斗过滤，并在低压除去丙酮。将它用dcm(二氯甲烷)回收，并用h2o:nahco3(饱和)1:1萃取。将穿过mgso4·12h2o的有机相在旋转蒸发器和机械泵上干燥。1hnmr和hplc-ms分析证实微黄褐色油形式的期望产物的形成(0.50g；收率：94％)。[0117]2步的第2步：7-(2-(2-(2-氨基(ammino)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮合成[0118]在含有(2-(2-(2-((2-氧代-2h-色烯-7-基(il))氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.50g)的2颈烧瓶中，建立无水气氛。然后引入dcm(10ml)、milli-水(200μl)(蒸馏水或双蒸馏水)，随后引入tfa(三氟乙酸-20.0ml)，并在搅拌下在室温继续反应3小时。通过旋转蒸发器除去溶剂，用dcm回收3次，然后将它在旋转蒸发器上和在机械泵中干燥一夜。hplc-ms分析证实期望产物的性质，具有95％的色谱纯度。[0119]实施例3：由hanamw200kda合成通过酰胺键的ha-teg-伞形酮缀合物[0120]在配备磁力搅拌器和氮气流的2颈烧瓶中，在室温将hana200kda(1.20g；2.99mmol)溶解在40ml的mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)缓冲液0.1m(ph＝6)中。完全溶解以后，加入516mg的n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基-碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)、310mg的n-羟基琥珀酰亚胺和7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮(预溶解在10ml的mes中)，然后在无水气氛下在25℃继续反应18小时。将反应混合物对milli-q水透析2天，并将它低压冻干，得到1.496g的白色冻干物。将冻干物再溶解在milli-q水中，加入nacl(饱和)(1/10体积的水)，在剧烈摇动溶液下将它用etoh沉淀。最后，将它用水醇混合物etoh/h2o9:1洗涤，然后用etoh(纯)最终洗涤。在低压除去溶剂，得到白色粉状固体形式的产物(1.50g；定量收率)。摩尔衍生化程度等于10-11％mol/mol(nmr)。通过hplc的滴度分析证实游离香豆素的不存在。[0121]实施例4:缀合物明胶-teg-伞形酮的合成[0122]在配备磁力搅拌器和乙二醇浴的100ml2颈烧瓶中，引入60ml的pbs(磷酸盐缓冲溶液)0.01m,ph＝7.4和1.2g的牛明胶，然后使温度达到50℃保持10分钟。将反应混合物放置冷却至30℃并将它在氮气流下脱气10分钟。加入0.38g的n-(3-二甲基氨基丙基(propil))-n-乙基-碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)、0.23g的n-羟基琥珀酰亚胺和1.30g的7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮，同时维持溶液的ph在5至6之间。使它在搅拌下在30℃进行24小时。将反应混合物穿过0.45μmrc(再生纤维素)过滤，然后将它对milli-水透析2天。最后，将它低压冻干，得到白色-微黄色冻干物(0.74g,收率：57％)。通过uv计算的摩尔取代度结果为28％。[0123]实施例5：通过酰胺键键合至ha的连接基伞形酮-辛基胺的合成[0124]2步的第1步：(8-((2-氧代-2h-色烯-7-基(il))氧基)辛基)氨基甲酸叔丁酯合成[0125]在配备磁力搅拌器、氮气流、油浴和冷却剂的2颈烧瓶中，引入伞形酮(221mg)、k2co3(0.94g；5当量)和无水丙酮(10ml)，随后引入催化量(0.01当量)的18-冠-6，然后引入4-甲基苯磺酸8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酯(0.49g；0.85当量)。让反应在搅拌下进行至回流48小时。将反应混合物冷却，穿过gooch漏斗过滤，并在低压下除去丙酮。将它用dcm回收，并将它用h2o:nahco3(饱和)1:1萃取。将穿过mgso4·12h2o的有机相在旋转蒸发器和机械泵上干燥。1hnmr和hplc-ms分析证实微黄褐色油形式的期望产物的形成(0.50g；收率：94％)。[0126]2步的第2步：7-((8-氨基辛基)氧基)-2h-色烯-2-酮合成[0127]在含有(8-((2-氧代-2h-色烯-7-基(il))氧基)辛基)氨基甲酸叔丁酯(0.50g)的2颈烧瓶中，建立无水气氛。然后引入dcm(10ml)、milli-q(200μl)水，随后引入tfa(20.0ml)，并使反应在搅拌下在室温进行3小时。通过旋转蒸发器除去溶剂，用dcm回收3次，然后将它在旋转蒸发器上和在机械泵中干燥一夜。hplc-ms分析证实期望产物的性质，具有96％的色谱纯度。[0128]实施例6：由hana200kda合成ha-辛基-伞形酮[0129]在配备磁力搅拌器和氮气流的2颈烧瓶中，在室温将hana200kda(1.20g；2.99mmol)溶解在40ml的mes缓冲液0.1m(ph＝6)中。完全溶解以后，加入516mg的n-(3-二甲基氨基丙基(propil))-n-乙基-碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)、310mg的n-羟基琥珀酰亚胺和7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮(预溶解在10ml的mes中)，然后在无水气氛中在25℃继续反应18小时。将反应混合物对milli-q水透析2天，并将它低压冻干，得到1.496g的白色冻干物。将冻干物再溶解在milli-q水中，加入nacl(饱和)(1/10体积的水)，在剧烈摇动溶液下将它用etoh沉淀。最后，将它用水醇混合物(etoh/h2o9:1)洗涤，然后用etoh(纯)最终洗涤。在低压除去溶剂，得到白色粉状固体形式的产物(1.50g；定量收率)。摩尔衍生化程度等于9.1％mol/mol(gpc-uv)，或10-11％(nmr)。通过hplc的滴度分析证实游离香豆素的不存在。[0130]实施例6a：由ha-tba合成ha-辛基-伞形酮(ha的mw为500kda)[0131]在配备热稳定的乙二醇夹套和磁力搅拌的玻璃反应器中，引入ha-tba(2.23g)和无水dmso(230ml)，然后将混合物在搅拌下在25℃进行直到ha-tba完全溶解。然后引入甲磺酸(70μl)和1,1′‑羰基二咪唑(cdi,58mg)，并将混合物在搅拌下在室温进行1h。最后，加入预溶解在20ml的dmso中的如在实施例5中所报告制备的7-((8-氨基辛基)氧基)-2h-色烯-2-酮(1.04g)，并继续在42℃反应42小时。使混合物达到室温，然后在搅拌下逐滴加入nabr的盐水溶液(28ml)。通过加入冷etoh96％(500ml)使它缓慢地沉淀，并将它穿过gooch过滤。将沉淀物用etoh/水9:1水醇混合物(×4次)洗涤并最后用纯etoh洗涤，然后将它在高真空下在40℃干燥3天。产物以白色-微黄色粉状固体的形式呈现(1.54g，定量收率)。摩尔衍生化程度等于11％mol/mol(1hnmr)。[0132]实施例6b：由ha-tba合成ha-十二烷基-伞形酮(ha的mw为500kda)[0133]7-((12-氨基十二烷基)氧基)-2h-色烯-2-酮合成：该化合物已经如在实施例5，步骤1和2中所报告合成，以相同化学计量比用12-((叔丁氧基羰基)氨基)十二烷基4-甲基苯磺酸酯)替换4-甲基苯磺酸8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酯。[0134]在配备热稳定的乙二醇夹套和磁力搅拌的玻璃反应器中，引入ha-tba(2.23g)和无水dmso(230ml)，然后将混合物在25℃下进行搅拌直到ha-tba完全溶解。然后引入甲磺酸(70μl)和1,1′‑羰基二咪唑(cdi,58mg)，并将混合物在搅拌下在室温进行1小时。最后加入预溶解在20ml的dmso中的7-((12-氨基十二烷基)氧基)-2h-色烯-2-酮(1.24g)，并继续在42℃反应42小时。使混合物达到室温，然后在搅拌下逐滴加入nabr饱和溶液(28ml)。通过加入冷etoh96％(500ml)使它缓慢地沉淀，并将它穿过gooch过滤。将沉淀物用etoh/水9:1水醇混合物(×4次)洗涤并最后用纯etoh洗涤，然后将它在高真空下在40℃干燥3天。产物呈现白色-微黄色粉状固体的形式(1.53g,收率：97％)。摩尔衍生化程度等于13％mol/mol(1hnmr)。[0135]实施例6c：明胶-辛基-伞形酮合成[0136]2步的第1步：明胶-tba合成[0137]在烧瓶内将60g的树脂用milli-水洗涤，将混合物静置5'，然后穿过gooch过滤。将该程序重复4次。加入tba-oh55％(约180ml)，将它搅拌，并将它在室温静置一夜。根据上下文，将5.2g的明胶溶解在250ml的milli-水中，在搅拌下在室温放置一夜。将树脂用大约5l的milli-水洗涤，直到洗脱液显示ph《10.5(最初ph＝12.84；最终ph＝10.48)，然后将它转移进1l烧杯，并将树脂/明胶混合物在搅拌下在水中在室温进行24小时。最后，将混合物穿过gooch过滤，用另外的milli-水(200ml)冲洗，并在搅拌下放置30'，然后将它再次穿过gooch重新过滤。完全过滤后，通过加入hcl1.0m将溶液的ph调至5.0±0.1，然后将它低压冻干。以白色-微黄色冻干物的形式得到期望产物(4.2g，收率64％)。产物在室温在dmso中显示出的溶解度等于20mg/ml。通过gpc-sec-tda进行的分析揭示等于74.1％的明胶-tba滴度。[0138]2步的第2步：明胶-辛基-伞形酮合成[0139]在配备热稳定的乙二醇夹套和磁力搅拌的玻璃反应器中，先后引入明胶-tba(2g)和200ml的无水dmso，然后将它在80℃溶解30分钟。冷却至42℃以后，引入1,1′‑羰基二咪唑(cdi,84mg)并使混合物在搅拌下进行1h。然后引入如在实施例5中所报告制备的7-((8-氨基辛基)氧基)-2h-色烯-2-酮(0.5g)，并继续在搅拌下在42℃反应42小时。然后使温度达到20℃，逐滴加入nabr(饱和)(20ml)，并通过加入冷etoh(600ml)使它沉淀。将沉淀物用水醇混合物etoh/水9:1(×4次)洗涤，并最后用纯etoh洗涤，然后将它在高真空下在40℃干燥3天。产物呈现白色-微黄色粉状固体的形式(1.5g,收率：89％)。摩尔衍生化程度等于22％mol/mol(uv)。[0140]实施例7：生物墨水的配制[0141]已经配制含有下述组分的生物墨水：[0142]fid-e:ha-teg-伞形酮酯，如在实施例1中所报告制备；[0143]fid-a:ha-teg-伞形酮酰胺，如在实施例3中所报告制备；[0144]gel:明胶-teg-伞形酮，如在实施例4中所报告制备；[0145]fid-c8:ha-辛基-伞形酮，如在实施例6a中所报告制备。[0146]7.1fid-e40mg/ml的配制[0147]在玻璃烧杯中，称量400mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的盐水溶液(nacl0.9％)，并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将它用0.45μm醋酸纤维素无菌过滤器过滤。[0148]7.2fid-a40mg/ml的配制[0149]在玻璃烧杯中，称量400mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a；加入10ml的盐水溶液(nacl0.9％)，并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将溶液转移进3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0150]7.3fid-e40mg/ml gel20mg/ml的配制[0151]在玻璃烧杯中，称量400mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e和200mg的如在实施例4中所报告制备的gel；加入10ml的盐水溶液(nacl0.9％)，并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将溶液加热至80℃保持5’并将它用0.45μm醋酸纤维素无菌过滤器过滤。[0152]7.4fid-a40mg/ml gel20mg/ml的配制[0153]在玻璃烧杯中，称量400mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a和200mg的如在实施例4中所报告制备的gel；加入10ml的盐水溶液(nacl0.9％)，并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将溶液转移进3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0154]7.5fid-e10mg/ml -430mg/ml的配制[0155]在玻璃烧杯中，称量100mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的pbsph7.0并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将10ml转移至50mlfalcon试管，加入300mg的-4并将它置于加热器中在80℃保持2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0156]7.6fid-e10mg/ml -440mg/ml的配制[0157]在玻璃烧杯中，称量100mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的pbsph7.0并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将10ml转移至50mlfalcon试管，加入400mg的-4并将它置于加热器中在80℃保持2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0158]7.7fid-e10mg/ml hbc30mg/ml的配制[0159]在玻璃烧杯中，称量100mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的pbsph7.0并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将10ml转移至50mlfalcon试管，加入300mg的hbc并将它置于加热器中在80℃保持2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0160]7.8fid-e10mg/ml hbc40mg/ml的配制[0161]在玻璃烧杯中，称量100mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的pbsph7.0并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将10ml转移至50mlfalcon试管，加入400mg的hbc并将它置于加热器中在80℃保持2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0162]7.9fid-c850mg/ml的配制[0163]在50mlfalcon试管中，称量1200mg的如在实施例6a中所报告制备的fid-c8；加入24ml的pbsph7.0并使它在室温水合。大约1小时以后，将试管置于60℃加热器中，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0164]7.10fid-c830mg/ml gel20mg/ml的配制[0165]在50mlfalcon试管中，称量720mg的如在实施例6a中所报告制备的fid-c8和480mg的如在实施例4中所报告制备的gel；加入24ml的pbsph7.0并使它在室温水合。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入5ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0166]7.11fid-c820mg/ml gel10mg/ml的配制[0167]在50mlfalcon试管中，称量480mg的如在实施例6a中所报告制备的fid-c8和240mg的如在实施例4中所报告制备的gel；加入24ml的pbsph7.0并使它在室温水合。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0168]7.12fid-a30mg/ml hbc30mg/ml的配制[0169]在50mlfalcon试管中，称量900mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a和900mg的hbc粉末；加入30ml的pbsph7.0并使它在室温在旋转振荡器中溶解。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0170]7.13fid-a20mg/ml gel10mg/ml hbc30mg/ml的配制[0171]在50mlfalcon试管中，称量600mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a、300mg的如在实施例4中所报告制备的gel和900mg的hbc粉末；加入30ml的pbsph7.0并使它在室温在旋转振荡器中溶解。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中大约2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入5ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0172]7.14fid-a20mg/ml gel10mg/ml hbc20mg/ml的配制[0173]在50mlfalcon试管中，称量600mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a、300mg的如在实施例4中所报告制备的gel和600mg的hbc粉末；加入30ml的pbsph7.0并使它在室温在旋转振荡器中溶解。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中大约2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在大约0.5mm预过滤器上过滤，将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0174]上述生物墨水的表征已经完成，评价了其交联前和交联后流变行为，以便预测它们在挤出和挤出后阶段的可挤出性和特征，以及生物行为，即与细胞物种(特别是在挤出前封装在生物墨水中的细胞)的相互作用。[0175]通过检查不同的参数来评价交联前和交联后流变行为：[0176]-动态粘度(η)(交联前)：使用配备1°板/锥系统的流变仪，在20℃从0.01s-1至2000s-1增加剪切速率(剪切应力)，并监测非牛顿流体中随着剪切速率的增加而降低的动态粘度(η)。在施加应力后材料的流动能力称为剪切稀化，它是理解所评价的材料是否具有生物墨水的流变特征的基本参数。在剪切稀化与封装在生物墨水中的细胞的活力之间也存在直接相关性(townsendjm等人.progressinpolymerscience2019,91:126-140)；[0177]-屈服应力(交联前)被定义为这样的剪切应力值：在该值以上材料开始流动，且在该值以下材料保持静止。换而言之，如果可能测量材料的屈服应力，那么这种材料在打印后可能能够在发生光网状化(photoreticulation)所需的时间内维持挤出后沉积的形状。对于生物墨水，这类特征优于高粘度，因为具有屈服应力的材料不会随时间变形，这与高粘度材料不同；[0178]-粘弹性模量(交联后)：粘弹性模量(g’：粘弹性模量；g”：粘性模量(viscosemodulus))被用在uv辐照后交联后所形成的水凝胶上，以确认水凝胶聚合形成致密结构并且能够维持其自己形状的能力。[0179]交联前[0180]水凝胶形状的试验混合物是：[0181]如在实施例7.6中所报告的fid-e -4；[0182]如在实施例7.3中所报告的fid-e gel。[0183]为方便起见，在附图4-7中表示的图表的图例中也报告了各自的浓度。[0184]使用配备1°板/锥系统的antonpaarrheocompass流变仪进行评价，将剪切速率从0.01s-1增加至2000s-1，并监测在20℃的动态粘度(η)，以帕·秒表示。[0185]对于试验混合物所获得的值与妮维雅乳霜(niveacreme)(打印的“黄金标准”)(paxtonn等人.biofabrication2017,9,044107)和商业墨水(cellinkstart)的相应值相关联。[0186]在图1中报告的图表突出显示所有试验的混合物都具有剪切稀化行为。[0187]屈服应力：对于评价的混合物，用配备1°板/锥系统的流变仪测量屈服应力值，在25℃将剪切应力从0.01pa增加到1000pa，并总结在下表1中：[0188][0189]测得的屈服应力值(非常接近妮维雅乳霜的屈服应力值)进一步证实了所试验的混合物适用于根据本发明的应用。[0190]在相同条件下，对于如在实施例7.4中所报告制备的fid-a gel制剂已经获得了可比较的结果，其动态粘度值报告在图2中。[0191]交联后[0192]已在pwr100(dymaxbluewaveqx4；输出强度13.9w/cm2，没有聚焦透镜)对水凝胶fid-e(如在实施例7.1中所报告)和fid-a(如在实施例7.2中所报告)进行了30秒的uv辐照(λmax：365nm)。已使用配备平行板/板的antonpaarrheocompass流变仪(间隙0.3mm，应变10％和ω从0.1至100rad/s)评价了粘性(viscose)和弹性模量(g’；g”)。图3中报告的图表证实，溶液-凝胶转变发生，从而导致紧凑的和固体结构的形成。对fid-e -4重复的相同实验表明，正如预期的那样，ha的其它衍生物的添加显著改善了交联后的流变性能(图4)。[0193]为了确认所试验的水凝胶的粘弹性特征适用于根据本发明的应用，已经进行了打印样张，如下所述：[0194]已经将3ml的如在实施例7.6中所报告制备的制剂fid-e -4转移至3d打印机(bioxtm-cellink)的筒并打印出3x3cm尺寸的网格(图5)；在每一层(层)的沉积结束时，材料已在365nm辐照15秒(图6)，然后沉积下一层。沉积共4层以后，视为打印完成。当所述过程完成时，获得了一个紧凑的、易于管理的网格，并且其能够稳定地维持辐照后获得的形状(图7)。[0195]生物学行为评价水凝胶与细胞物种的体外相互作用，用交联后细胞活力来表示。[0196]试验了以下内容：[0197]fid-e:ha-teg-伞形酮酯，如在实施例7.1中配制；[0198]fid-a:ha-teg-伞形酮酰胺，如在实施例7.2中配制；[0199]封装在水凝胶中并交联后的细胞活力[0200]通过体外试验在6天时评价封装在所检查物种的水凝胶中的鼠成纤维细胞(balb/3t3克隆a31，atccccl-163)的细胞活力。在标准条件(37℃，5％co2)下在含有胎牛血清10％(lifetechnologies，目录号10270106，意大利)的dmem培养基(gibco，目录号41965-039，意大利)中培养鼠成纤维细胞，直到它们达到80％的汇合度。[0201]然后将细胞以等于7.5×105个细胞/ml的浓度重新悬浮在选定的水凝胶溶液中；在24-孔多孔板(sarstedt，目录号83.3922，德国)的每个孔中移入300μl这样的细胞悬浮液(2.25×105个细胞)，并且它们已在365nm用紫外灯(dymax，美国)交联10秒。然后，将1ml的含有胎牛血清10％(lifetechnologies，目录号10270106，意大利)的dmem培养基加入每个孔(gibco，目录号41965-039，意大利)，并将平板在标准条件(37℃，5％co2)下温育。因此，试验的实验条件分为三组：[0202]1)一个对照组,其中将细胞直接接种在板的孔中(2.25×105个细胞)；[0203]2)一个组，其中将细胞封装在fid-e水凝胶中,40mg/ml；[0204]3)一个组，其中将细胞封装在fid-a水凝胶中,40mg/ml。[0205]一式三份地试验每种条件。[0206]在预定时间点的前一天，将水凝胶在标准条件(37℃,5％co2)下与酶透明质酸酶(52000ui-fidia,意大利)一起温育，以溶解它们并使成纤维细胞粘附在孔的底部。在预定的温育时间结束时，根据制造商给出的说明，通过alamar测定(lifetechnologies,目录号dal1025,意大利)将细胞活力量化，以确定小鼠成纤维细胞的代谢活性，这在线粒体水平完成。在图8中提供的数据已针对对照进行了标准化；从他们的分析显而易见，fid-e和fid-a在封装后均记录了鼠成纤维细胞活力的最佳百分比，高于80％，其中酰胺衍生物(fid-a)具有更好百分比。[0207]这样的结果突出表明，水凝胶的封装和交联过程不会损害细胞活力；为根据本发明的生物墨水交联而获得的构建体因此被活细胞定居，从而增殖，因此能够充当活组织或器官的真正替代物。当前第1页12当前第1页12
背景技术：
：：[0012]组织和器官损伤修复的最有趣的领域之一当然是所谓的组织工程，其目的主要是创造用于各种损伤的构建体(支架)，从而促进原始组织再生或完全替代受损的器官。[0013]在再生过程中，所述构建体可以承载在损伤部位存在的细胞，所述细胞将定植于它，或者它们可以包含在构建体制备步骤中插入的细胞，具有活化、刺激和改善再生过程的功能，决定损伤闭合或器官整合。这样的构建体自然必须具有一些基本特征：它们必须完全没有毒性；它们必须是生物相容的；它们必须具有适合植入部位的强度和弹性的机械特征；在它接近存在于植入部位中的细胞时，和在制造步骤中将细胞封装在生物材料中并将它们混合到水凝胶中时，它们必须能够保证细胞活力、增殖和组构。[0014]因此，组织工程通常将生物学方面与其它确定的工程方面进行总结，也考虑到组织具有非常不同的生物学、生化、机械特征：骨骼与皮肤非常不同，肝脏与血管非常不同。[0015]三维打印(3d打印)的技术发展给组织工程领域带来了确定的冲击：它是一组能够从数字信息生成物理模型的技术。简而言之，根据适当编程的计算机提供的指令，特定打印机将低粘度聚合物“墨水”(墨水)转化为与解剖模型完全一致的三维实体结构。[0016]随着墨水从打印机逐渐递送(挤出)，墨水固化通常通过辐照发生：通过光诱导的聚合反应，墨水交联，即聚合，从而转变为刚好具有预定形式的固体。如果希望最终的构建体包含细胞，则有必要在挤出阶段之前将它们与墨水混合(封装)：墨水必须明显保证在其中所包含的细胞材料的活力和增殖能力。在该情况下，说3d生物打印更正确，并且墨水被定义为生物墨水。[0017]在医疗和外科手术领域，能够为每位患者定制解剖模型当然非常有用，这些模型旨在修复组织或甚至替换整个器官。[0018]采用这些技术可以获得的结构也特别适用于释放在构建体中包含的活性物质和创建用于试验新药物的基质，从而有助于它们更快的开发、更少的侵入性、更便宜和道德上正确。[0019]制备所述结构的一个决定因素是墨水类型，由于产生具有非常特殊性能的支架的事实，从技术观点(例如，易于加工)和从生物学观点(诸如生物相容性和非常低毒性或无毒性)，所述墨水类型必须具有特殊要求。[0020]迄今为止，技术人员已知的更常见墨水基本上由生物相容性聚合物组成，其中包括明胶、透明质酸、丝心蛋白、海藻酸盐、纤维素、各种改性的和/或彼此混合的。[0021]例如，wo2011088213描述了由透明质酸和明胶形成的墨水，其用甲基丙烯酸酸酐衍生化并在有光引发剂存在下用uv光光聚合；k等人(biofabrication2016,8(3):032002)描述了基于在特定光引发剂存在下用戊烯酸酐酯化的透明质酸聚合的墨水；yinj.(acsappl.mater.interfaces2018,10,6849-6857)描述了基于甲基丙烯酸酯交联的明胶的墨水的特征，所述墨水为了改善其印刷适性进一步与明胶混合。[0022]一般而言，在现有技术中，无论使用的聚合物如何，聚合都通过光引发剂的应用而发生，与用于起始聚合物的化学修饰的甲基丙烯酸酯一样，所述光引发剂可能有毒。[0023]因此，本发明的一个目的是发现(identify)克服根据现有技术的墨水的缺点的墨水。[0024]实际上，根据本发明使用的墨水对象不涉及使用光引发剂并且不使用有毒物质来衍生化起始聚合物，因此当原样使用时以及当还包含细胞材料时都产生具有非常高安全性谱的材料。[0025]它们还具有所有的功能特征、流变特征和机械特征，使其适合用于3d打印和3d生物打印；这就是为什么并且为了简洁起见，在本发明中描述的墨水总是被定义为生物墨水(bio-ink)或生物墨水(bioink)，即使在不包含细胞时。[0026]发明详述[0027]本发明的一个目的是生物墨水用于3d打印的用途，即墨水用于3d打印领域中和3d生物打印领域中的用途，所述生物墨水包含透明质酸和双官能光反应性连接基的光可交联缀合物，或明胶和双官能光反应性连接基的光可交联缀合物，或两种光可交联缀合物的混合物。[0028]本发明的另一个目的是通过酰胺键结合的明胶和双官能光反应性连接基的缀合物，所述连接基由通过醚键结合的伞形酮和三甘醇间隔基组成，所述缀合物是可交联的且具有式(iii)的结构。[0029][0030]本发明的另一个目的是由通过醚键结合至以下链的伞形酮组成的双官能光反应性连接基的制备方法：[0031]●三甘醇链，[0032]或[0033]●直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链，[0034]这样的连接基能够通过酰胺键形成结合至ha或明胶，并从而形成光可交联的ha缀合物或明胶缀合物，所述方法包含下述步骤：[0035]i)在有丙酮和碳酸钾存在下，将伞形酮用n-boc-2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺或用8-((叔丁氧基羰基)氨基)(c4-c20烷基)4-甲基苯磺酸酯醚化；[0036]ii)在室温进行胺基团的去保护反应。[0037]因此，本发明涉及生物墨水用于3d打印领域中和3d生物打印领域中的用途，所述生物墨水包含光可交联的透明质酸缀合物或光可交联的明胶缀合物或其光可交联的混合物，其具有以下特征：[0038]·总体生物相容性；[0039]·附着存在于植入部位的细胞的能力，并允许它们随后增殖；[0040]·在聚合前步骤中封装细胞的能力，维持其聚合后活力的完整性；[0041]·在低于体温的温度进行低粘度预聚合，以便允许在打印步骤中的良好挤出，内含或不含细胞材料；[0042]·粘度和屈服应力(切向应力值，在其以下材料是静态)的组合，其能够允许材料挤出并在挤出后保持形状足够长的时间以进行交联；[0043]·可灭菌性；根据本发明的生物墨水可以通过0.45μ过滤器过滤和/或在高压釜中热处理进行灭菌；[0044]·高聚合速率，从而减少uv光暴露时间；这样的特征是非常合乎需要的，尤其是当生物墨水包含细胞时；[0045]·合适的聚合后流变机械特征，根据具体的应用范围而有所不同。[0046]根据本发明使用的生物墨水也通过使用低毒性和危险性反应物(不易燃烧、不易爆炸)的方法来制备，并且在不使用任何光引发剂的情况下进行交联。[0047]在已知的各种聚合物中，明胶和透明质酸(ha)特别适用于本发明的目的，它们通过与双官能光反应性连接基缀合而成为光可交联的，当暴露于精确波长的uv光时，其通过交联而诱导聚合，并然后生物墨水固化，无需使用光引发剂。[0048]根据本发明使用的双官能光反应性连接基(为简洁起见被定义为“连接基”)是香豆素连接基，即由与间隔基结合的伞形酮残基组成，其中间隔基可以是聚乙二醇，特别是三甘醇(teg)或直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链。[0049]双官能光反应性连接基teg-伞形酮由下式(i)表示：[0050][0051]其中：[0052]r＝-nh2，用于形成酰胺键；[0053]r＝-i，用于形成酯键。[0054]双官能光反应性连接基烷基链-伞形酮由下式(ii)表示：[0055][0056]因此，无论它是什么，间隔基在一端总是通过醚键结合伞形酮，并在另一端它结合选定的聚合物，即ha或明胶。间隔基适当地被官能化，这与要与聚合物与一起产生的酯或酰胺键类型相关。更确切地说：[0057]●在伞形酮-聚乙二醇连接基和ha之间的键可以是酯或酰胺键；[0058]●在伞形酮-烷基连接基和ha之间的键排它地是酰胺键；[0059]●在连接基伞形酮-聚乙二醇或伞形酮-烷基和明胶之间的键总是酰胺键。[0060]明胶是胶原变性的产物，它可溶于水，在水中形成粘稠溶液，并被美国监管机构fda认定为gras(公认为安全的)。[0061]它广泛用于食品、制药、化妆品和营养品行业，用于皮肤、头发和关节健康的食品添加物中。与生产它的胶原相比，明胶的免疫原性低得多，但它保留了rgd结构域(氨基酸序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)，提供对细胞迁移、增殖和分化的刺激效应以及用于通过mmp(基质金属蛋白酶)降解的攻击位点，这使其成为酶可降解的。[0062]优选用于本发明的明胶属于b型牛来源(即通过胶原的碱性水解获得)并且具有约225gbloom(冷却后的胶凝能力，根据uspxx(1990)1017测量)。[0063]光可交联的明胶缀合物通过明胶的羧基缀合而获得，所述缀合通过用双官能光反应性连接基酰胺化实现，所述连接基由与以下物质结合的伞形酮残基组成：聚乙二醇间隔基，优选三甘醇；或直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链。[0064]更优选地，明胶光可交联缀合物通过明胶的羧基缀合而获得，所述缀合通过用双官能光反应性连接基酰胺化实现，所述连接基由与三甘醇间隔基结合的伞形酮残基组成。[0065]然后通过涉及明胶的羧基和适当官能化的间隔基的酰胺键形成，将明胶与如上所述的光反应性连接基缀合，优选与连接基teg-伞形酮缀合，获得如下所示的式(iii)的缀合物[0066][0067]透明质酸是一种由d-葡糖醛酸和n-乙酰基-d-葡糖胺的残基交替组成的杂多糖，为直链，具有可以在400至3x106da之间的分子量，取决于使用的提取源或制备方法。ha存在于生物有机体的每个区域中，并且它参与与许多组织(诸如皮肤、肌腱、肌肉和软骨)的细胞的机械支持有关的许多过程。ha在组织修复过程中起决定性作用，无论是从结构观点看还是作为刺激其直接或间接参与的一系列过程的物质(weigelp.等人,jtheoreticalbiol,1986:219-234；abatangelog.等人,jsurgres,1983,35:410-416；goak.等人,drugs,1994,47:536-566)。此外，ha具有抗炎活性，因为它调节细胞因子释放，特别是il-1，并且它具有镇痛活性，因为它结合阿片样物质特异性受体。[0068]从化学观点看，ha分子具有众多官能团，这些官能团使其可变地修饰，例如通过与有机或无机碱成盐、通过用各种性质的醇酯化、通过用非治疗活性胺酰胺化。[0069]根据已知方法，例如，通过从鸡冠花中提取(ep138572)、通过从链球菌属发酵(wo2018020458；wo2019016699)、通过从芽孢杆菌属生物合成(wo2012032154)，可以生产和纯化本文描述的用于制备一种或多种生物墨水的起始透明质酸。从链球菌属或芽孢杆菌属、更优选地从链球菌属生产和纯化的ha是优选的，其重均mw被包含在100,000至250,000da之间，优选在180,000至230,000da之间，为简洁起见定义为“mw200kda”，或重均mw介于500,000至730,000da之间的ha。[0070]平均分子量(mw)是指通过“固有粘度”方法计算的重均mw(terbojevich等人,carbohydrres,1986,363-377)。[0071]在本发明的范围内，通过ha羧基与如上所述的双官能光反应性连接基的酯化或酰胺化获得感兴趣的缀合物，所述连接基优选由与伞形酮结合的三甘醇组成，获得如下所示的式(iv)和(v)的缀合物：[0072]ha-teg-伞形酮酯(iv)[0073][0074]ha-teg-伞形酮酰胺(v)[0075][0076]ha-双官能光反应性连接基键在通过交联聚合后产生具有不同降解程度(取决于它涉及(dealwith)的酯(更可降解)或酰胺(不易降解)键)，但保持生物相容性和无毒性特征完整的物质。[0077]透明质酸的光可交联缀合物通过透明质酸羧基的缀合而获得，所述缀合是通过用双官能光反应性连接基酯化或酰胺化，所述连接基由与以下物质结合的伞形酮残基组成：聚乙二醇间隔基，优选三甘醇，或直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链。[0078]更优选地，所述透明质酸的光可交联缀合物通过透明质酸羧基的缀合而得到，所述缀合通过用双官能光反应性连接基酰胺化，所述连接基由与三甘醇间隔基结合的伞形酮组成；甚至更优选地起始透明质酸从链球菌属制备和纯化(wo2018020458；wo2019016699)，并具有被包含在100,000至250,000da之间、优选在180,000至230,000da之间的重均mw。[0079]这样的衍生物是技术人员已经已知的：wo2014122580描述了其合成并要求保护形成“形状记忆”海绵或水凝胶的能力，即非常耐久、致密并且在切割、扭转和处理之后也能够维持它们的形状。[0080]在本发明范围内，证实了通常用于治疗骨关节炎和软骨损伤、预防手术后粘连、软组织填充以及深部和空洞损伤(deepandcavitatedinjuries)的这样的衍生物适用于用作生物墨水通过3d打印来制造构建体。[0081]因此，本发明的一个目的也是本文所述的生物墨水用于通过3d打印制造构建体的用途。[0082]申请人还已经开发了双官能光反应性连接基的新制备方法，其适用于形成随后的酰胺键，相对于在wo2014122580中描述的，其使用无毒且不易燃的反应物，更快速、更便宜、总体上更安全且在工业上更方便。[0083]本发明也涉及由通过醚键结合至以下链的伞形酮组成的双官能光反应性连接基的制备方法：[0084]●三甘醇链(teg)，[0085]或[0086]●直链c4-c20烷基链，优选c8-c16烷基链，甚至更优选辛基链或十二烷基链，[0087]这样的连接基能够通过酰胺键形成结合至ha或明胶，并从而形成光可交联的ha缀合物或明胶缀合物，所述方法包含下述步骤：[0088]i)在有丙酮和碳酸钾存在下，将伞形酮用n-boc-2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺或用8-((叔丁氧基羰基)氨基)(c4-c20烷基)4-甲基苯磺酸酯醚化；[0089]ii)在室温进行胺基团的去保护反应。[0090]简而言之，上述方法仅涉及两个不同的步骤：最初是醚化步骤，其中伞形酮通过快速和清洁反应结合至反应物n-boc2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺或8-((叔丁氧基羰基)氨基)(c4-c20烷基)4-甲基苯磺酸酯，优选4-甲基苯磺酸8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酯(由ambeed销售)，所述快速和清洁反应涉及使用丙酮作为回流溶剂和碳酸钾作为碱。[0091]然后，将胺基团在室温在1至6小时之间的时间脱保护，以定量收率提供期望产物(伞形酮-teg-nh2或伞形酮-c4-c20-烷基-nh2)，无需进一步纯化。[0092]相对于在wo2014122580中描述的内容，上述方法具有许多优点：[0093]所述合成更快速且更便宜，因此仅需要两个步骤而不是在wo'580中预期的五个步骤。此外，使用的溶剂量要少得多；避免了使用导致高化学风险的叠氮化钠；避免了涉及使用pd/c(钯/碳)作为催化剂的氢化；钯由于其潜在的毒性，也必须作为特殊废物处理。[0094]根据本发明使用的生物墨水，当由ha缀合物或明胶缀合物组成时以及当由上述缀合物的混合物组成时，可以任选地进一步与细胞材料混合，诸如、例如结缔组织、骨组织、软骨组织、肌肉组织的细胞或间充质细胞，和/或与其它组分混合，所述其它组分选自本领域已知的以下透明质酸衍生物，诸如：[0095]·在ep1095064和ep1853279中描述的酰胺衍生物。脂族酰胺衍生物是优选的，尤其是由具有被包含在500kda至730kda之间的重均分子量的ha制备的十六烷基酰胺，且其具有被包含在0.1％至10％摩尔之间、优选地被包含在1％至3％摩尔之间的平均酰胺化程度，这在酰胺水解和离去的十六烷基胺与荧光团物质的缀合以后通过hplc检测。具有上述特征和被包含在1％至3％摩尔之间的平均衍生化程度的十六烷基酰胺描述于ep1853279中，并且它可在商业名称-4下得到；[0096]·具有不高于20％、优选在0.05至10％之间的酯化百分比的自交联内酯，如在ep0341745中所述，且是在现有技术中作为已知；[0097]·交联衍生物，其通过使用交联剂诸如bdde(1,4-丁二醇二缩水甘油醚(diglycilether))获得，其衍生化程度相对于透明质酸重复单元为2.5至25％摩尔，优选在5至15％摩尔之间，并由具有被包含在500至730kda之间的重均mw的ha制备，如在ep2470230中所述，并且在名称hbc下已知。[0098]与ha的其它衍生物的混合会增加生物墨水的流变学特征并使其可调节，并增加其对透明质酸酶的降解作用的抗性(pavan2016)，从而使其适用于任何类型的应用。[0099]优选地，生物墨水可以包含以下物质作为其它ha衍生物[0100]·在ep1095064和ep1853279中描述的酰胺，优选由具有被包含在500kda至730kda之间的重均分子量的ha制备的十六烷基酰胺，且其具有被包含在0.1％至10％摩尔之间、优选地被包含在1％至3％摩尔之间的平均酰胺化程度(-4)；[0101]·具有不高于20％、优选在0.05至10％之间的酯化百分比的自交联内酯，如在ep0341745中所述[0102]·通过使用交联剂诸如bdde(1,4-丁二醇二缩水甘油醚)获得的交联衍生物，其衍生化程度相对于透明质酸重复单元为2.5至25％摩尔，优选在5至15％摩尔之间，并由具有被包含在500至730kda之间的重均mw的ha制备，如在ep2470230中所述(hbc)。[0103]甚至更优选地，生物墨水可以包含-4或hbc诸如其它ha衍生物。[0104]在处理条件下，在生物墨水本身内存在或不存在细胞的情况下，与要获得的结果有关，用不同浓度的前面描述的聚合物制备生物墨水。[0105]具体地，生物墨水可以包含[0106]·如前面描述的通过酯或酰胺键与双官能光反应性连接基缀合的ha，在20-60mg/ml的不同浓度，优选地被包含在30至50mg/ml之间，甚至更优选地等于40mg/ml；[0107]·通过酰胺键与双官能光反应性连接基缀合的明胶，在20-60mg/ml的不同浓度，优选地被包含在30至50mg/ml之间，甚至更优选地等于40mg/ml；[0108]·ha缀合物和明胶缀合物的混合物，其组成与待生产的材料关联地变化，混合物中两种组分的总浓度范围为30-80mg/ml，优选30-70mg/ml，且更优选地被包含在30至60mg/ml之间；优选地，相对于上述总浓度，明胶缀合物的浓度范围为10-30mg/ml，更优选15至30mg/ml，且甚至更优选地它等于20mg/ml；[0109]·与hbc、-4、的混合物：将额外聚合物(选自hbc、-4、)以1:1至5:1、优选3:1至4:1之间变化的比率与ha缀合物或明胶缀合物混合。当额外聚合物是hbc时，优选的比率是1:1。形成混合物的组分的总浓度在20-80mg/ml，优选40-70mg/ml，更优选40-60mg/ml，且甚至更优选40-50mg/ml之间变化。[0110]在特殊情况下，例如当需要特定流变条件并且额外聚合物选自-4和时，额外聚合物与ha缀合物或明胶缀合物之间的比率甚至可以在1:1至1:2之间变化，优选地它等于1:1.5。[0111]为了更好地说明本发明的目的和优点，提供了一些实施例，尽管它们不以任何方式构成对权利要求范围的限制。[0112]实施例1:由hatbamw200kda合成通过酯键的ha-teg-伞形酮缀合物(如在wo2014122580的实施例9中所报告)[0113]简而言之，在配备热稳定的(thermostatable)乙二醇夹套和磁力搅拌的玻璃反应器中，将2.0g的hatba(ha四丁基铵)溶解在240ml的无水dmso中并加入521mg的7-(2-(2-(2-碘乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮(如在wo2014122580的实施例3中所报告制备)。反应在40℃进行48小时；然后在搅拌下加入nabr饱和溶液，因此通过加入etoh实现沉淀。通过在etoh/h2o95:5和纯etoh中洗涤纯化产物，然后在高真空下干燥。将如此得到的产物通过ft-ir、rp-hplc和1hnmr分析，表现出等于32％的官能化和92％的收率。[0114]实施例2：通过酰胺键键合至ha或明胶的连接基伞形酮-teg-胺的合成(2步)[0115]2步的第1步：(2-(2-(2-((2-氧代-2h-色烯-7-基(il))氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯合成[0116]在配备磁力搅拌、氮气流、油浴和冷却剂的2颈烧瓶中，引入伞形酮(221mg)、k2co3(0.94g；5当量)和无水丙酮(10ml)，随后引入催化量(0.01当量)的18-冠-6，然后引入n-boc2-[(2-对甲苯磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙胺(0.49g；0.85当量)。在搅拌下让反应进行至回流48小时。将反应混合物冷却，穿过gooch漏斗过滤，并在低压除去丙酮。将它用dcm(二氯甲烷)回收，并用h2o:nahco3(饱和)1:1萃取。将穿过mgso4·12h2o的有机相在旋转蒸发器和机械泵上干燥。1hnmr和hplc-ms分析证实微黄褐色油形式的期望产物的形成(0.50g；收率：94％)。[0117]2步的第2步：7-(2-(2-(2-氨基(ammino)乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮合成[0118]在含有(2-(2-(2-((2-氧代-2h-色烯-7-基(il))氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.50g)的2颈烧瓶中，建立无水气氛。然后引入dcm(10ml)、milli-水(200μl)(蒸馏水或双蒸馏水)，随后引入tfa(三氟乙酸-20.0ml)，并在搅拌下在室温继续反应3小时。通过旋转蒸发器除去溶剂，用dcm回收3次，然后将它在旋转蒸发器上和在机械泵中干燥一夜。hplc-ms分析证实期望产物的性质，具有95％的色谱纯度。[0119]实施例3：由hanamw200kda合成通过酰胺键的ha-teg-伞形酮缀合物[0120]在配备磁力搅拌器和氮气流的2颈烧瓶中，在室温将hana200kda(1.20g；2.99mmol)溶解在40ml的mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)缓冲液0.1m(ph＝6)中。完全溶解以后，加入516mg的n-(3-二甲基氨基丙基)-n-乙基-碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)、310mg的n-羟基琥珀酰亚胺和7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮(预溶解在10ml的mes中)，然后在无水气氛下在25℃继续反应18小时。将反应混合物对milli-q水透析2天，并将它低压冻干，得到1.496g的白色冻干物。将冻干物再溶解在milli-q水中，加入nacl(饱和)(1/10体积的水)，在剧烈摇动溶液下将它用etoh沉淀。最后，将它用水醇混合物etoh/h2o9:1洗涤，然后用etoh(纯)最终洗涤。在低压除去溶剂，得到白色粉状固体形式的产物(1.50g；定量收率)。摩尔衍生化程度等于10-11％mol/mol(nmr)。通过hplc的滴度分析证实游离香豆素的不存在。[0121]实施例4:缀合物明胶-teg-伞形酮的合成[0122]在配备磁力搅拌器和乙二醇浴的100ml2颈烧瓶中，引入60ml的pbs(磷酸盐缓冲溶液)0.01m,ph＝7.4和1.2g的牛明胶，然后使温度达到50℃保持10分钟。将反应混合物放置冷却至30℃并将它在氮气流下脱气10分钟。加入0.38g的n-(3-二甲基氨基丙基(propil))-n-乙基-碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)、0.23g的n-羟基琥珀酰亚胺和1.30g的7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮，同时维持溶液的ph在5至6之间。使它在搅拌下在30℃进行24小时。将反应混合物穿过0.45μmrc(再生纤维素)过滤，然后将它对milli-水透析2天。最后，将它低压冻干，得到白色-微黄色冻干物(0.74g,收率：57％)。通过uv计算的摩尔取代度结果为28％。[0123]实施例5：通过酰胺键键合至ha的连接基伞形酮-辛基胺的合成[0124]2步的第1步：(8-((2-氧代-2h-色烯-7-基(il))氧基)辛基)氨基甲酸叔丁酯合成[0125]在配备磁力搅拌器、氮气流、油浴和冷却剂的2颈烧瓶中，引入伞形酮(221mg)、k2co3(0.94g；5当量)和无水丙酮(10ml)，随后引入催化量(0.01当量)的18-冠-6，然后引入4-甲基苯磺酸8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酯(0.49g；0.85当量)。让反应在搅拌下进行至回流48小时。将反应混合物冷却，穿过gooch漏斗过滤，并在低压下除去丙酮。将它用dcm回收，并将它用h2o:nahco3(饱和)1:1萃取。将穿过mgso4·12h2o的有机相在旋转蒸发器和机械泵上干燥。1hnmr和hplc-ms分析证实微黄褐色油形式的期望产物的形成(0.50g；收率：94％)。[0126]2步的第2步：7-((8-氨基辛基)氧基)-2h-色烯-2-酮合成[0127]在含有(8-((2-氧代-2h-色烯-7-基(il))氧基)辛基)氨基甲酸叔丁酯(0.50g)的2颈烧瓶中，建立无水气氛。然后引入dcm(10ml)、milli-q(200μl)水，随后引入tfa(20.0ml)，并使反应在搅拌下在室温进行3小时。通过旋转蒸发器除去溶剂，用dcm回收3次，然后将它在旋转蒸发器上和在机械泵中干燥一夜。hplc-ms分析证实期望产物的性质，具有96％的色谱纯度。[0128]实施例6：由hana200kda合成ha-辛基-伞形酮[0129]在配备磁力搅拌器和氮气流的2颈烧瓶中，在室温将hana200kda(1.20g；2.99mmol)溶解在40ml的mes缓冲液0.1m(ph＝6)中。完全溶解以后，加入516mg的n-(3-二甲基氨基丙基(propil))-n-乙基-碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)、310mg的n-羟基琥珀酰亚胺和7-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2h-色烯-2-酮(预溶解在10ml的mes中)，然后在无水气氛中在25℃继续反应18小时。将反应混合物对milli-q水透析2天，并将它低压冻干，得到1.496g的白色冻干物。将冻干物再溶解在milli-q水中，加入nacl(饱和)(1/10体积的水)，在剧烈摇动溶液下将它用etoh沉淀。最后，将它用水醇混合物(etoh/h2o9:1)洗涤，然后用etoh(纯)最终洗涤。在低压除去溶剂，得到白色粉状固体形式的产物(1.50g；定量收率)。摩尔衍生化程度等于9.1％mol/mol(gpc-uv)，或10-11％(nmr)。通过hplc的滴度分析证实游离香豆素的不存在。[0130]实施例6a：由ha-tba合成ha-辛基-伞形酮(ha的mw为500kda)[0131]在配备热稳定的乙二醇夹套和磁力搅拌的玻璃反应器中，引入ha-tba(2.23g)和无水dmso(230ml)，然后将混合物在搅拌下在25℃进行直到ha-tba完全溶解。然后引入甲磺酸(70μl)和1,1′‑羰基二咪唑(cdi,58mg)，并将混合物在搅拌下在室温进行1h。最后，加入预溶解在20ml的dmso中的如在实施例5中所报告制备的7-((8-氨基辛基)氧基)-2h-色烯-2-酮(1.04g)，并继续在42℃反应42小时。使混合物达到室温，然后在搅拌下逐滴加入nabr的盐水溶液(28ml)。通过加入冷etoh96％(500ml)使它缓慢地沉淀，并将它穿过gooch过滤。将沉淀物用etoh/水9:1水醇混合物(×4次)洗涤并最后用纯etoh洗涤，然后将它在高真空下在40℃干燥3天。产物以白色-微黄色粉状固体的形式呈现(1.54g，定量收率)。摩尔衍生化程度等于11％mol/mol(1hnmr)。[0132]实施例6b：由ha-tba合成ha-十二烷基-伞形酮(ha的mw为500kda)[0133]7-((12-氨基十二烷基)氧基)-2h-色烯-2-酮合成：该化合物已经如在实施例5，步骤1和2中所报告合成，以相同化学计量比用12-((叔丁氧基羰基)氨基)十二烷基4-甲基苯磺酸酯)替换4-甲基苯磺酸8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛酯。[0134]在配备热稳定的乙二醇夹套和磁力搅拌的玻璃反应器中，引入ha-tba(2.23g)和无水dmso(230ml)，然后将混合物在25℃下进行搅拌直到ha-tba完全溶解。然后引入甲磺酸(70μl)和1,1′‑羰基二咪唑(cdi,58mg)，并将混合物在搅拌下在室温进行1小时。最后加入预溶解在20ml的dmso中的7-((12-氨基十二烷基)氧基)-2h-色烯-2-酮(1.24g)，并继续在42℃反应42小时。使混合物达到室温，然后在搅拌下逐滴加入nabr饱和溶液(28ml)。通过加入冷etoh96％(500ml)使它缓慢地沉淀，并将它穿过gooch过滤。将沉淀物用etoh/水9:1水醇混合物(×4次)洗涤并最后用纯etoh洗涤，然后将它在高真空下在40℃干燥3天。产物呈现白色-微黄色粉状固体的形式(1.53g,收率：97％)。摩尔衍生化程度等于13％mol/mol(1hnmr)。[0135]实施例6c：明胶-辛基-伞形酮合成[0136]2步的第1步：明胶-tba合成[0137]在烧瓶内将60g的树脂用milli-水洗涤，将混合物静置5'，然后穿过gooch过滤。将该程序重复4次。加入tba-oh55％(约180ml)，将它搅拌，并将它在室温静置一夜。根据上下文，将5.2g的明胶溶解在250ml的milli-水中，在搅拌下在室温放置一夜。将树脂用大约5l的milli-水洗涤，直到洗脱液显示ph《10.5(最初ph＝12.84；最终ph＝10.48)，然后将它转移进1l烧杯，并将树脂/明胶混合物在搅拌下在水中在室温进行24小时。最后，将混合物穿过gooch过滤，用另外的milli-水(200ml)冲洗，并在搅拌下放置30'，然后将它再次穿过gooch重新过滤。完全过滤后，通过加入hcl1.0m将溶液的ph调至5.0±0.1，然后将它低压冻干。以白色-微黄色冻干物的形式得到期望产物(4.2g，收率64％)。产物在室温在dmso中显示出的溶解度等于20mg/ml。通过gpc-sec-tda进行的分析揭示等于74.1％的明胶-tba滴度。[0138]2步的第2步：明胶-辛基-伞形酮合成[0139]在配备热稳定的乙二醇夹套和磁力搅拌的玻璃反应器中，先后引入明胶-tba(2g)和200ml的无水dmso，然后将它在80℃溶解30分钟。冷却至42℃以后，引入1,1′‑羰基二咪唑(cdi,84mg)并使混合物在搅拌下进行1h。然后引入如在实施例5中所报告制备的7-((8-氨基辛基)氧基)-2h-色烯-2-酮(0.5g)，并继续在搅拌下在42℃反应42小时。然后使温度达到20℃，逐滴加入nabr(饱和)(20ml)，并通过加入冷etoh(600ml)使它沉淀。将沉淀物用水醇混合物etoh/水9:1(×4次)洗涤，并最后用纯etoh洗涤，然后将它在高真空下在40℃干燥3天。产物呈现白色-微黄色粉状固体的形式(1.5g,收率：89％)。摩尔衍生化程度等于22％mol/mol(uv)。[0140]实施例7：生物墨水的配制[0141]已经配制含有下述组分的生物墨水：[0142]fid-e:ha-teg-伞形酮酯，如在实施例1中所报告制备；[0143]fid-a:ha-teg-伞形酮酰胺，如在实施例3中所报告制备；[0144]gel:明胶-teg-伞形酮，如在实施例4中所报告制备；[0145]fid-c8:ha-辛基-伞形酮，如在实施例6a中所报告制备。[0146]7.1fid-e40mg/ml的配制[0147]在玻璃烧杯中，称量400mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的盐水溶液(nacl0.9％)，并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将它用0.45μm醋酸纤维素无菌过滤器过滤。[0148]7.2fid-a40mg/ml的配制[0149]在玻璃烧杯中，称量400mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a；加入10ml的盐水溶液(nacl0.9％)，并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将溶液转移进3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0150]7.3fid-e40mg/ml gel20mg/ml的配制[0151]在玻璃烧杯中，称量400mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e和200mg的如在实施例4中所报告制备的gel；加入10ml的盐水溶液(nacl0.9％)，并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将溶液加热至80℃保持5’并将它用0.45μm醋酸纤维素无菌过滤器过滤。[0152]7.4fid-a40mg/ml gel20mg/ml的配制[0153]在玻璃烧杯中，称量400mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a和200mg的如在实施例4中所报告制备的gel；加入10ml的盐水溶液(nacl0.9％)，并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将溶液转移进3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0154]7.5fid-e10mg/ml -430mg/ml的配制[0155]在玻璃烧杯中，称量100mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的pbsph7.0并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将10ml转移至50mlfalcon试管，加入300mg的-4并将它置于加热器中在80℃保持2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0156]7.6fid-e10mg/ml -440mg/ml的配制[0157]在玻璃烧杯中，称量100mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的pbsph7.0并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将10ml转移至50mlfalcon试管，加入400mg的-4并将它置于加热器中在80℃保持2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0158]7.7fid-e10mg/ml hbc30mg/ml的配制[0159]在玻璃烧杯中，称量100mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的pbsph7.0并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将10ml转移至50mlfalcon试管，加入300mg的hbc并将它置于加热器中在80℃保持2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0160]7.8fid-e10mg/ml hbc40mg/ml的配制[0161]在玻璃烧杯中，称量100mg的如在实施例1中所报告制备的fid-e；加入10ml的pbsph7.0并使它在磁力搅拌下溶解。完全溶解以后，将10ml转移至50mlfalcon试管，加入400mg的hbc并将它置于加热器中在80℃保持2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0162]7.9fid-c850mg/ml的配制[0163]在50mlfalcon试管中，称量1200mg的如在实施例6a中所报告制备的fid-c8；加入24ml的pbsph7.0并使它在室温水合。大约1小时以后，将试管置于60℃加热器中，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0164]7.10fid-c830mg/ml gel20mg/ml的配制[0165]在50mlfalcon试管中，称量720mg的如在实施例6a中所报告制备的fid-c8和480mg的如在实施例4中所报告制备的gel；加入24ml的pbsph7.0并使它在室温水合。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入5ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0166]7.11fid-c820mg/ml gel10mg/ml的配制[0167]在50mlfalcon试管中，称量480mg的如在实施例6a中所报告制备的fid-c8和240mg的如在实施例4中所报告制备的gel；加入24ml的pbsph7.0并使它在室温水合。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0168]7.12fid-a30mg/ml hbc30mg/ml的配制[0169]在50mlfalcon试管中，称量900mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a和900mg的hbc粉末；加入30ml的pbsph7.0并使它在室温在旋转振荡器中溶解。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0170]7.13fid-a20mg/ml gel10mg/ml hbc30mg/ml的配制[0171]在50mlfalcon试管中，称量600mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a、300mg的如在实施例4中所报告制备的gel和900mg的hbc粉末；加入30ml的pbsph7.0并使它在室温在旋转振荡器中溶解。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中大约2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在0.5mm预过滤器上过滤，并将它分入5ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0172]7.14fid-a20mg/ml gel10mg/ml hbc20mg/ml的配制[0173]在50mlfalcon试管中，称量600mg的如在实施例3中所报告制备的fid-a、300mg的如在实施例4中所报告制备的gel和600mg的hbc粉末；加入30ml的pbsph7.0并使它在室温在旋转振荡器中溶解。大约1小时以后，将试管置于80℃的加热器中大约2小时，大约每20’用刮勺混合。预加热结束后，将它在大约0.5mm预过滤器上过滤，将它分入3ml玻璃注射器并将它用高压釜在121℃灭菌15分钟。[0174]上述生物墨水的表征已经完成，评价了其交联前和交联后流变行为，以便预测它们在挤出和挤出后阶段的可挤出性和特征，以及生物行为，即与细胞物种(特别是在挤出前封装在生物墨水中的细胞)的相互作用。[0175]通过检查不同的参数来评价交联前和交联后流变行为：[0176]-动态粘度(η)(交联前)：使用配备1°板/锥系统的流变仪，在20℃从0.01s-1至2000s-1增加剪切速率(剪切应力)，并监测非牛顿流体中随着剪切速率的增加而降低的动态粘度(η)。在施加应力后材料的流动能力称为剪切稀化，它是理解所评价的材料是否具有生物墨水的流变特征的基本参数。在剪切稀化与封装在生物墨水中的细胞的活力之间也存在直接相关性(townsendjm等人.progressinpolymerscience2019,91:126-140)；[0177]-屈服应力(交联前)被定义为这样的剪切应力值：在该值以上材料开始流动，且在该值以下材料保持静止。换而言之，如果可能测量材料的屈服应力，那么这种材料在打印后可能能够在发生光网状化(photoreticulation)所需的时间内维持挤出后沉积的形状。对于生物墨水，这类特征优于高粘度，因为具有屈服应力的材料不会随时间变形，这与高粘度材料不同；[0178]-粘弹性模量(交联后)：粘弹性模量(g’：粘弹性模量；g”：粘性模量(viscosemodulus))被用在uv辐照后交联后所形成的水凝胶上，以确认水凝胶聚合形成致密结构并且能够维持其自己形状的能力。[0179]交联前[0180]水凝胶形状的试验混合物是：[0181]如在实施例7.6中所报告的fid-e -4；[0182]如在实施例7.3中所报告的fid-e gel。[0183]为方便起见，在附图4-7中表示的图表的图例中也报告了各自的浓度。[0184]使用配备1°板/锥系统的antonpaarrheocompass流变仪进行评价，将剪切速率从0.01s-1增加至2000s-1，并监测在20℃的动态粘度(η)，以帕·秒表示。[0185]对于试验混合物所获得的值与妮维雅乳霜(niveacreme)(打印的“黄金标准”)(paxtonn等人.biofabrication2017,9,044107)和商业墨水(cellinkstart)的相应值相关联。[0186]在图1中报告的图表突出显示所有试验的混合物都具有剪切稀化行为。[0187]屈服应力：对于评价的混合物，用配备1°板/锥系统的流变仪测量屈服应力值，在25℃将剪切应力从0.01pa增加到1000pa，并总结在下表1中：[0188][0189]测得的屈服应力值(非常接近妮维雅乳霜的屈服应力值)进一步证实了所试验的混合物适用于根据本发明的应用。[0190]在相同条件下，对于如在实施例7.4中所报告制备的fid-a gel制剂已经获得了可比较的结果，其动态粘度值报告在图2中。[0191]交联后[0192]已在pwr100(dymaxbluewaveqx4；输出强度13.9w/cm2，没有聚焦透镜)对水凝胶fid-e(如在实施例7.1中所报告)和fid-a(如在实施例7.2中所报告)进行了30秒的uv辐照(λmax：365nm)。已使用配备平行板/板的antonpaarrheocompass流变仪(间隙0.3mm，应变10％和ω从0.1至100rad/s)评价了粘性(viscose)和弹性模量(g’；g”)。图3中报告的图表证实，溶液-凝胶转变发生，从而导致紧凑的和固体结构的形成。对fid-e -4重复的相同实验表明，正如预期的那样，ha的其它衍生物的添加显著改善了交联后的流变性能(图4)。[0193]为了确认所试验的水凝胶的粘弹性特征适用于根据本发明的应用，已经进行了打印样张，如下所述：[0194]已经将3ml的如在实施例7.6中所报告制备的制剂fid-e -4转移至3d打印机(bioxtm-cellink)的筒并打印出3x3cm尺寸的网格(图5)；在每一层(层)的沉积结束时，材料已在365nm辐照15秒(图6)，然后沉积下一层。沉积共4层以后，视为打印完成。当所述过程完成时，获得了一个紧凑的、易于管理的网格，并且其能够稳定地维持辐照后获得的形状(图7)。[0195]生物学行为评价水凝胶与细胞物种的体外相互作用，用交联后细胞活力来表示。[0196]试验了以下内容：[0197]fid-e:ha-teg-伞形酮酯，如在实施例7.1中配制；[0198]fid-a:ha-teg-伞形酮酰胺，如在实施例7.2中配制；[0199]封装在水凝胶中并交联后的细胞活力[0200]通过体外试验在6天时评价封装在所检查物种的水凝胶中的鼠成纤维细胞(balb/3t3克隆a31，atccccl-163)的细胞活力。在标准条件(37℃，5％co2)下在含有胎牛血清10％(lifetechnologies，目录号10270106，意大利)的dmem培养基(gibco，目录号41965-039，意大利)中培养鼠成纤维细胞，直到它们达到80％的汇合度。[0201]然后将细胞以等于7.5×105个细胞/ml的浓度重新悬浮在选定的水凝胶溶液中；在24-孔多孔板(sarstedt，目录号83.3922，德国)的每个孔中移入300μl这样的细胞悬浮液(2.25×105个细胞)，并且它们已在365nm用紫外灯(dymax，美国)交联10秒。然后，将1ml的含有胎牛血清10％(lifetechnologies，目录号10270106，意大利)的dmem培养基加入每个孔(gibco，目录号41965-039，意大利)，并将平板在标准条件(37℃，5％co2)下温育。因此，试验的实验条件分为三组：[0202]1)一个对照组,其中将细胞直接接种在板的孔中(2.25×105个细胞)；[0203]2)一个组，其中将细胞封装在fid-e水凝胶中,40mg/ml；[0204]3)一个组，其中将细胞封装在fid-a水凝胶中,40mg/ml。[0205]一式三份地试验每种条件。[0206]在预定时间点的前一天，将水凝胶在标准条件(37℃,5％co2)下与酶透明质酸酶(52000ui-fidia,意大利)一起温育，以溶解它们并使成纤维细胞粘附在孔的底部。在预定的温育时间结束时，根据制造商给出的说明，通过alamar测定(lifetechnologies,目录号dal1025,意大利)将细胞活力量化，以确定小鼠成纤维细胞的代谢活性，这在线粒体水平完成。在图8中提供的数据已针对对照进行了标准化；从他们的分析显而易见，fid-e和fid-a在封装后均记录了鼠成纤维细胞活力的最佳百分比，高于80％，其中酰胺衍生物(fid-a)具有更好百分比。[0207]这样的结果突出表明，水凝胶的封装和交联过程不会损害细胞活力；为根据本发明的生物墨水交联而获得的构建体因此被活细胞定居，从而增殖，因此能够充当活组织或器官的真正替代物。当前第1页12当前第1页12
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