用于伤口愈合和组织再生的血液制品的制作方法

用于伤口愈合和组织再生的血液制品
1.本发明涉及含有富含血小板和淋巴细胞的血浆的血液制品、其用于伤口愈合和身体组织再生的用途、含有其的药物组合物及其制备方法。


背景技术：

2.皮肤伤口愈合是一个高度组织化和动态的过程，由可溶性介质、血细胞和细胞外基质发挥作用，从而恢复组织的完整性和功能。完成该过程所需的三个步骤是：炎症阶段，其特征在于血细胞溢出、白细胞介素趋化性和ros产生；增殖阶段，描述为血管生成、肉芽组织形成、成纤维细胞和角质形成细胞增殖，允许伤口闭合和表皮和真皮隔室重新连接；组织重塑，其中伤口收缩和细胞外基质重组完成组织修复。正常伤口愈合过程的中断会导致没有愈合的慢性伤口的形成，这是几种疾病的典型并发症，例如糖尿病引起的足溃疡和脊髓损伤引起的压疮。这些慢性伤口在我们的社会中是高发问题，因为其愈合不良并且经常复发而对医疗保健系统而言是一个巨大的成本。除了清创步骤(伤口护理的重要组成部分)之外，还提出了不同的方法来治疗这些损伤：药理学策略，例如生长因子的应用或刺激、不同类型的伤口敷料和皮肤替代物。如果仅应用简单的敷料还不够，则将抗菌作用与促进伤口闭合相结合是一种替代方法。对于大面积伤口，有多种皮肤替代物可用，这些替代物可按来源(同种异体、异种和自体)、组分(真皮、表皮或二者)或时间(持久或临时替代物)分类。理想的皮肤替代物具有皮肤的功能，同时具有成本效益、广泛可用性且易于应用。与其他治疗相结合的另一种方法是局部负压疗法，其具有血管生成、减少水肿和伤口大小的作用。在所有情况下(使用自体皮肤替代物除外)，在损伤部位引入外部试剂的问题可能会在已经不稳定的微环境中诱导其他的炎性反应。已经在文献中报道了prp(富含血小板的血浆)是成功用于外科创伤的再生治疗(sanchez,anitua et al.2007,arora,ramanayake et al.2009,sanchez,anitua et al.2009)。血小板衍生物的使用代表了一种递送浓缩生长因子的方式，该浓缩生长因子通常在止血过程中由血小板释放(anitua,andia et al.2004)。正如不同临床研究所报道的，这种血小板的浓缩和应用提供了更多促进伤口愈合的生物活性因子(crovetti,martinelli et al.2004,saldalamacchia,lapice et al.2004)，但方法论的方法并不总是标准的且可重复的。溃疡治疗的进一步改善表现为加入氯化钙的prp活化；这种操作可以形成纤维蛋白凝块，一种适用于三维伤口的“凝胶状”质地(anitua,aguirre et al.2008,rainys,cepas et al.2019)。与细胞外重塑一起，损伤的伤口愈合也依赖于缺乏新生血管；内皮祖细胞(epc)是单能性成体干细胞，来源于骨髓龛内的成血管细胞，其最初作为外周血中的循环细胞被发现。这些细胞已通过表达不同的标记物进行分离，例如识别血液学起源的cd45，组合不同的内皮表面标记物，例如cd31、cd144或cd146。此外，表达内皮潜能的t淋巴细胞被描述为tang(miao,qiu et al.2016,manetti,pratesi et al.2017)；血管生成t细胞通常通过cd3、cd31和cd184的共表达来识别。体外实验表明，tang细胞可通过分泌高水平的促血管生成因子(如血管内皮生长因子(vegf)、白细胞介素(il)-8、il-17和基质金属蛋白酶(mmp)-9)来刺激早期epc，从而促进血管生成和内皮修复(hur,yang et al.2007)。
[0021]-粒细胞是cd15

/16

。
[0022]
在一个优选的实施方案中，如流式细胞术分析所测定的，该制品包含以25％-75％百分位数表示的以下白细胞群：
[0023][0024][0025]
根据另一个实施方案，本发明提供了一种制备富含淋巴-血小板的血浆血液制品的方法，其包括以下步骤：
[0026]-在室温下在离心管中以1200-1800rpm(每分钟转数，对应293-660g)离心2至7ml，优选2至4ml全血，优选以1500rpm(对应458g)离心5至10分钟，优选离心5分钟，从而获得上下层相的分离，其中上层相含有富含血小板和淋巴细胞的血浆，下层相含有红细胞；
[0027]-收集含有富含血小板和淋巴细胞的血浆的上层相。
[0028]
优选地，离心管(图3)具有5ml的内部体积，并且其配备有将管分成上部体积和下部体积的隔膜或膜(2)，由此在上部体积中收集富含血小板和淋巴细胞的血浆相，在下部体积中积聚红细胞。可以通过在管底部(4)放置环形螺母来调节下部体积，操作可以在下部管腔内上下移动的活塞(3)，从而限定上部体积约为3ml，其中包含离心后富含血小板和淋巴细胞的血浆相，以及通过环形螺母-活塞系统调节包含红细胞的下部管体积，使其可在1至2ml之间变化。
[0029]
还更优选地，隔膜或膜由疏水性盘屏障或膜组成，其具有15至200微米孔隙率并且具有直径为1.5至2.5mm的中心孔。用于盘屏障或膜的合适的材料包括但不限于聚乙烯。
[0030]
在另一方面，本发明涉及可通过本文公开的方法获得的血液制品，其由具有上述特征的富含血小板和淋巴细胞的血浆组成。该制品显示出血管生成潜力，促进对皮肤损伤的促血管生成作用，并在体内诱导更有效的伤口愈合。
[0031]
因此，根据本发明的血液制品可方便地用于损伤身体组织的再生和促进伤口愈合。在具体实施方案中，本文定义的血液制品用于美容和治疗应用，其中：
[0032]-美容应用包括抗衰老、疤痕修复、皱纹、痤疮、脱发和烧伤治疗,
[0033]-治疗应用包括伤口愈合、外科或肿瘤起源损伤的治疗，例如骨和软骨损伤、手术后损伤或伤口；皮肤溃疡、褥疮、压疮、静脉性腿部溃疡、动脉性溃疡、糖尿病足溃疡、角膜损伤如角膜瘢痕和角膜溃疡；牙周组织损伤或骨膜损伤。
[0034]
本发明的血液制品可用于同种异体或自体的治疗方法。在一个优选的实施方案中，血液制品用于自体应用，即，将其施用于供体，从同一供体的全血中分离富含淋巴血小板的血浆。
[0035]
通过本文公开的方法获得的血液制品是即用型的，即可以在其获得后立即将其应
用或施用于有需要的受试者。或者，可以将其冷冻并在需要时解冻并使用，或者可以通过例如添加合适的载剂、载体、赋形剂、防腐剂、缓冲剂、稳定剂来加工。例如，可以通过在用于其收集的注射器内直接添加氯化钙溶液(2.5-10％w/v)以凝胶形式使用血液制品。
[0036]
因此，在另一方面，本发明提供了药物或化妆品组合物，其包含如上定义的血液制品以及合适的载体或赋形剂。
[0037]
本发明通过以下附图和实施例进一步说明，但不限于此。
附图说明
[0038]
图1-angio
prp
表征。产品组分，表示为angio
prp
中存在的血小板和细胞的百分比(a)；分析了与原始全血相比的angio
prp
的血小板富含(b；非配对t检验，**p《0,01)和分离前后白细胞浓度相比(c)。angio
prp
细胞亚群的图形表示：与全血白细胞配方相比，粒细胞、单核细胞和淋巴细胞百分比(d)；总angio
prp
的细胞计数分析(e)和细胞组分(compartment)cd45 /cd31 /cd34-范围为85.00％-97.73％(f)。不同细胞亚群的进一步细胞计数特征，表示为范围：淋巴细胞(g)、单核细胞(h)和粒细胞(i)。
[0039]
图2-体外器官培养和体内动物模型中angio
prp
的验证。
[0040]
用angio
prp
、单组分(angio
cells
和prp)或pbs作为阴性对照治疗皮肤组织的体外模型中伤口闭合面积的百分比(a)。在用angio
prp
、hyalomatrix或pbs治疗的皮肤损伤小鼠模型中评估体内伤口闭合。伤口闭合率定量为在不同时间点测量的面积与初始损伤面积之间的比率：治疗4、7、10、14和21天(b；****p《0,0001双向方差分析(anova)bonferroni校正)。从背部皮肤分析中获得的应力-应变曲线的图形表示，以确定与pbs和健康皮肤相比，用angio
prp
和hyalomatrix治疗的皮肤的机械性能(c，未配对t检验，*p《0,05)。基于对与健康皮肤相比的angio
prp
和hyalomatrix或pbs治疗的组织的阿辛蓝组织学染色，定量高密度(d)和低密度(e)弹性蛋白的存在(未配对t检验，*p《0,05；**p《0,01；****p《0,0001)。基于免疫荧光染色的胶原蛋白vi面积的定量(f，未配对t检验，*p《0,05)。用angio
prp
、hyalomatrix或pbs治疗后皮肤组织中血管生成cd31(g)和炎性cd206(h)阳性细胞的定量(非配对t检验，*p《0,05，**p《0.01，***p《0.001)。
[0041]
图3
–
用于分离血细胞制品的离心管。
实施例
[0042]
实施例1-富含淋巴-血小板的血浆的制备(angio
prp
)
[0043]
根据本发明用于分离富含淋巴-血小板的血浆的离心管-下文称为angio
prp
装置-基本上由以下组成(图3)：
[0044]
1.主体由无菌外部有刻度的5ml聚丙烯管制成；
[0045]
2.橡胶封盖(bd vacutainer haemogard-like)(1)；
[0046]
3.将管分成两部分的隔膜(56％上部体积和44％下部体积)，其包含hdpe，多孔(孔径《200微米)、疏水、直径13mm和厚度1.5mm的盘屏障，中心为直径2mm的孔(2)；
[0047]
4.底部包含环形螺母(4)，其带内部活塞(3)。
[0048]
将先前收集在柠檬酸钠管中的外周血样品通过管中的橡胶封盖注入，内部屏障将血液样品保留在上部体积中。
[0049]
然后将该装置以1500rpm(458-460g)离心5分钟。没有中断的减速。
[0050]
内膜有助于将富含血小板(prp)的血浆和感兴趣的细胞群(上部)与废弃材料(红细胞、下部)分离。
[0051]
环形螺母允许调节上部腔内(膜上方)的整个prp相。
[0052]
用注射器抽取上部血浆和细胞，准备以液体形式使用。
[0053]
angio
prp
产品回收
[0054]
可能会出现三种情况：
[0055]
(1)血浆相完全在膜上方。
[0056]
在2.5ml注射器上使用50mm和21g针头。将针刺入橡胶塞以抽取angio
prp
产品。将针头置于离膜3-5mm处并吸取产品，重新悬浮在血浆相中的细胞和血小板。从每个novysep装置回收1ml平均体积的angio
prp
。
[0057]
angio
prp
产品体积可根据患者参数(性别、年龄、血细胞比容、水合水平)而不同。
[0058]
(2)血浆相部分位于膜上方和下方。
[0059]
逆时针方向旋转novysep螺杆(环形螺母)以减少膜下方的体积，直到血浆相完全在膜上方。因此，如情况(1)所述收集angio
prp
产品
[0060]
(3)血浆相明显被位于膜上方的红细胞污染。
[0061]
丢弃产品。
[0062]
在1、2、3、4和7天后，在体外对angio
prp
进行活/死染色(l3224，life technologies，ca，usa)以评估细胞存活。在这些天，活力降低，但在7天后，82.26
±
8.50％的细胞在体外存活。为了评估内皮电位，将8x104的huvec(atcc-lgc,va,usa)铺板在3d matrigel(bd biosciences)上；加入150ul angio
prp
或prp或angio
cells
，24小时后通过imagej软件(nih)对细胞分支进行定量。angio
prp
诱导的分支量比其他条件更长(与对照条件相比，327,75
±
9,72x103与293,05
±
8,35x103μm，t检验*p《0.05)。
[0063]
实施例2-facs分析
[0064]
外周血(pb)取自米兰policlinico医院输血医学和血液科血库，在知情同意后，根据米兰policlinico医院人类受试者使用的研究委员会的指南，从健康志愿者获得。将收集在柠檬酸钠管中的2.5ml外周血填充到novysep装置中并在室温下以1500rpm离心5分钟以诱导相分离。收集富含血小板的血浆相和红细胞与血浆界面处的细胞。通过血液库尔特计数器仪器(dxh 500,beckman coulter)，我们分析了分离前的血液和angio
prp
。收集的分离前血液和细胞相直接用如下所示的单克隆抗体标记。将细胞与syto
tm
16、抗cd45v500、抗cd3 v450、抗cd56 pe-cy7、抗cd14 apc-h7、抗cd16 pe、抗cd19 apc-r700或抗cd31 pe、抗cd184 apc(bd biosciences-pharmingen,san diego,california,usa)孵育。对照是同种型匹配的小鼠免疫球蛋白。每次在4℃下孵育20分钟后，将细胞在含有1％热灭活的fcs和0.1％叠氮化钠的pbs 1x中洗涤。在lyric流式细胞仪上进行流式细胞仪分析，使用facsuite
tm
软件(bd biosciences-immunocytometry system)。对于每个门，每次分析包括至少1-2x 104事件。设置光散射门以从分析中消除细胞碎片。在校正相对于与特定荧光团缀合的同种型对照的反应百分比后，评估阳性细胞的百分比。在syto
tm
16阳性门上计算不同细胞亚群的百分比。
[0065]
实施例3-angio
prp
的体外评估
[0066]
通过novysep装置分离外周血，并分析angio
prp
以表征细胞和血小板组分。如图1a所报道的，angio
prp
主要由血小板组成(85.19
±
7.03％)，白细胞(wbc)的存在率为0.85
±
0.53％。与全血中存在的原始数量相比，angio
prp
中的血小板浓度增加(146.8
±
11.35x103而不是108.5
±
6.62x103血小板/μl，图1b)。特别是，在分离步骤之前，通过库尔特计数器进一步表征细胞组分，并与原始外周血组分进行比较。与全血相比，在angio
prp
中富含了淋巴细胞组分(angio
prp
中为67.15
±
9.25％，全血中为29.98
±
6.52％)，而粒细胞群严重减少(angio
prp
中为12.32
±
7.67％，全血为62.36
±
7.38％)，单核细胞部分增加(angio
prp
中为20.13
±
6.30％，全血为7.69
±
1.56％)，图1d。
[0067]
实施例4-体外临床前实验：器官型皮肤培养
[0068]
使用人真皮和表皮的多层模型(mattek’s epidermft full thickness eft-400)作为体外模型，以更好地研究novysep装置产品的组织再生能力。如epiderm-ft制造商的方案所述，通过5mm冲孔获得组织模型(角质层和表皮)上的皮肤活检。测试了四种不同的培养条件：使用1)angio
prp
、2)angio
cells
、3)prp、4)pbs 1x(作为阴性对照)进行的器官型皮肤培养。在培养24小时、2、4、5、6和7天后,我们分析了人皮肤组织，我们进行了免疫组织化学和免疫荧光分析，以评估伤口闭合和上皮再生。进行了苏木精和伊红染色以更好地表征伤口愈合；使用imagej软件(nih)进行图像定量和处理。
[0069]
如图2a所示，用angio
prp
治疗的损伤在6天后显示完全愈合，而prp治疗需要再多1天才能达到相同的结果。使用angio
cells
和pbs不能在一周内达到完全愈合。
[0070]
实施例5-体内伤口愈合实验
[0071]
5个月大的scid小鼠(n＝10)获自charles river laboratories international,inc.(calco,italy)；本研究中动物的使用得到了国家卫生部的授权(协议号51/2018-pr)。用阿佛丁麻醉动物，并在背部产生两个5mm的全厚度切口，包括肉膜，在小鼠中线两侧的每一侧一个。在粘合剂的帮助下将硅胶夹板放置在伤口周围，然后用间断缝合法固定夹板。每只小鼠以自身作为对照，一个伤口接受治疗，另一个接受磷酸盐缓冲盐水(pbs 1x)。施加透明的封闭敷料以防止污染。通过每2-3天拍照检查伤口，并使用imagej软件(nih)相对于毫米参照对面积进行定量，并表示为对应于伤口闭合在受伤后第0、4、7、10、15和21天测量的伤口面积百分比；全身深度麻醉下颈椎脱臼处死小鼠，去除背部皮肤损伤；活检分为两组，分别用于组织学或分子生物学分析。将一组置于异戊烷中并在-80℃冷冻以进行蛋白质组学分析。另一组在4℃下在含有4％多聚甲醛的pbs中孵育过夜，然后转移到含有30％蔗糖的pbs 1x溶液中，在4℃下再维持24小时，包埋在o.c.t.化合物中并在-80℃冷冻。切割12μm厚的连续切片并通过免疫荧光和组织学分析进行检查。
[0072]
我们比较了分别用angio
prp
治疗(n＝5)、hyalomatrix(n＝5)和pbs治疗(n＝10)的皮肤伤口闭合的时间。此外，我们评估了在不同条件下达到完全闭合所需的时间。结果表明，用angio
prp
治疗在第21天诱导了损伤的完全闭合；相反，用hyalomatrix治疗的皮肤在受伤后第21天显示伤口闭合率为75-80％。此外，用pbs治疗的样品在同一时间点显示90％的伤口闭合。用angio
prp
治疗6,5/7天后，观察到实现60％的伤口闭合，相比之下，hyalomatrix治疗在15天实现相应闭合(p《0,0001单因素方差分析(anova)与bonferron校正)。用pbs进行的对照治疗在近10天达到60％的闭合。在21天观察到angio
prp
和hyalomatrix之间的显著差异(p《0,0001，双向方差分析(anova)与bonferroni校正)，以及angio
prp
和pbs之间的显著
差异(p《0,0001，双向方差分析(anova)与bonferroni校正)(图2b)。
[0073]
实施例6-表皮分化
[0074]
切下12μm皮肤组织切片的连续切片，并用苏木精和伊红(h&e)染色，根据制造商的说明进行阿辛蓝和天狼星红染色，以进行形态学评估。使用lmd6000b(leica,germany)捕获图像。
[0075]
对于免疫荧光分析，将组织切片与小鼠单克隆抗体抗citokeratin 10(1:100，abcam)、兔抗外皮蛋白(1:100，abcam)、小鼠单克隆抗体抗citokeratin 14(1:100，abcam)兔抗loricrin(1:100,abcam)一起孵育,在室温下用dapi染色cd206(1:400,abcam)细胞核5分钟。使用荧光显微镜leica dmi8(leica，德国)分析载玻片。
[0076]
21天的期间后，苏木精和伊红染色揭示，与用hyalomatrix(商业产品)治疗的皮肤相比，用angio
prp
治疗的皮肤显示由成纤维细胞和角质形成细胞增殖和迁移到伤口部位所诱导的伤口完全愈合。我们还用针对不同表皮层的特定标志物评估了表皮分化。在21天，用angio
prp
治疗的皮肤显示基底层完全和均匀的再生，如特定标志物细胞角蛋白5的阳性和均匀信号所示。相反，用hyalomatrix和pbs治疗的样品显示出不完全和不连续的再生。关于颗粒层，用angio
prp
治疗诱导完全再生，如细胞角蛋白10染色所示，与健康皮肤样品相当。相反，用hyalomatrix和pbs治疗的皮肤损伤显示颗粒层再生较晚，细胞角蛋白10表达不均匀。至于角质层，我们对loricrin进行了免疫荧光染色，以使最外层可视化；我们仅在用angio
prp
治疗的样品中观察到完全的重新上皮化，而在用hyalomatrix和pbs治疗的皮肤中，我们在第21天观察到不完整的上皮。
[0077]
实施例7-皮肤弹性特性
[0078]
处死后，将用于机械测试的表皮放置在金属螺杆夹中，用橡胶片覆盖夹住的末端。将夹子放入bose electroforce 3100仪器中。施加0.15n的初始牵引力。以mpa为单位测量的牵引力每秒增加0.2％，直至达到断裂点。在xy绘图仪上测量力(n)和位移(mm)，随后将这些点记录为应力(σ＝力/横截面积)和应变(ε＝长度变化/初始长度),并在excel中重新绘图(ashley w.seifert等人；2012)。
[0079]
为了评估皮肤弱度，我们比较了用angio
prp
、pbs、hyalomatrix(作为阴性对照)治疗的皮肤和健康皮肤(作为阳性对照)的机械特性。我们从背侧皮肤得出应力-应变曲线以确定平均拉伸强度。用angio
prp
治疗的皮肤与用hyalomatrix或用pbs治疗的皮肤相比，显示更高的牵引阻力(3mpa
±
0.7、0.3mpa
±
0.3和1.8mpa
±
0.70)(图2c)。此外，用lpep治疗的皮肤显示出与健康皮肤相当的趋势(3mpa
±
0,7和3,1
±
0,7)。在用angio
prp
治疗的皮肤中观察到更高的弹性系数，这可能是由于每单位面积的纤维分子数量增加。由于弹性蛋白是皮肤弹性纤维的主要组成成分，有利于皮肤再生，我们对vi型胶原蛋白进行了免疫荧光染色。用angio
prp
治疗的皮肤与用hyalomatrix治疗的皮肤相比，在vi型胶原蛋白表达方面显示出显著差异，如图2f中定量和报告的(非配对t检验，*p《0,05)。
[0080]
除了表皮表征外，我们还对真皮组分进行了分析。阿辛蓝染色用于证明真皮区胶原纤维的存在。由于这种染色的强度，可以区分皮肤样品中的高密度和低密度弹性纤维，并定量这两种密度类型在不同治疗中所占的表面；如图2d和2e所报告的，用angio
prp
治疗的样品显示出比hyalomatrix和pbs条件更类似于健康皮肤的真皮组分，分别具有更多的高密度弹性蛋白和更少的低密度弹性蛋白(未配对t检验，*p《0,05，**p《0,01，****p《0,0001)。
[0081]
实施例8-蛋白质组学和生化分析
[0082]
提取皮肤样品进行蛋白质组学分析，在4℃下以17,000xg离心10分钟，并将上清液在4℃下以200,000xg超速离心1小时。根据先前报道的步骤(bari,perteghella et al.2018)对重新悬浮在0.1m碳酸氢铵(ph 7.9)中的沉淀进行胰蛋白酶化，每个样品使用50
±
0.5μg的蛋白质。通过配备与q-exactive质谱仪(thermo fisher scientific,usa)耦合的chiplc-nanoflex系统(eksigent,ab sciex,usa)的纳米色谱仪分析一微升胰蛋白酶消化的混合物，通过65分钟5-45％梯度的洗脱液b(洗脱液a，0.1％甲酸水溶液；洗脱液b，0.1％甲酸乙腈溶液)进行，流速300nl/min。完整质谱以正离子模式在400-1600m/z范围内以70000fwhm分辨率记录，然后以17,500fwhm的分辨率记录10ms/ms光谱，以数据依赖的方式根据最丰富的离子生成。生成的所有数据均使用基于sequest搜索引擎和人蛋白质数据库的proteome discoverer 2.1平台(thermoscientific)进行搜索(70726个条目，2017年1月从uniprot网站下载，www.uniprot.gov)。将获得的蛋白质列表进行比对，标准化(sereni,castiello et al.2018)然后通过线性判别分析(lda)进行处理(hilario and kalousis 2008)。为了将每个受试者分配到特定组，根据提取的标志物蛋白计算α值参数(brambilla,lavatelli et al.2012)。
[0083]
为了了解不同伤口治疗的蛋白质谱，我们进行了nlc-ms/ms分析；单次pbs治疗用作相关组的内部对照(novysep或hyalomatrix)，同时分析健康皮肤以确定来自同一动物的皮肤的正常对照谱(内部对照)。鉴定的蛋白质总数为1514，具有很高的技术和组重现性。hyalomatrix伤口组织的蛋白质组谱与来自同一动物的对照皮肤样品的谱显著不同。样品的主要组分分析表明，对照样品与从angio
prp
治疗的伤口采集的样品形成了相似的簇。事实上，用hyalomatrix治疗的样品显示出与其内部对照的对应性，而单次angio
prp
样品与其单次相应的内部对照相关，表明治疗的系统作用。健康的皮肤样品与angio
prp
聚类以及相关性高于与hyalomatrix组的聚类和相关性。在bonferroni校正后，179种蛋白质至少在2组之间差异表达，尽管在相同的比较或评估条件下上调和下调的蛋白质相似。分析单次治疗及其特定对照，angio
prp
比(then)hyalomatrix治疗改变了一半数量的差异蛋白。如果将治疗条件与健康皮肤进行比较，则报告了相同的情况。这表明angio
prp
比hyalomatrix有更接近健康皮肤的趋势。然后应用蛋白质组恢复指数(pri)(roffia,de palma et al.2018,sereni,castiello et al.2018)来比较三种不同的条件，因为该算法生成并比较健康和疾病谱，以鉴定参与稳态恢复的蛋白质。我们鉴定了6种在受伤组织中不存在并在angio
prp
治疗后恢复的蛋白质，以及12种在未治疗的损伤中存在而在angio
prp
样品中不存在的蛋白质(pbs样品用作阴性对照)。angio
prp
治疗后97种蛋白质水平恢复(受损组织中57种上调，40种下调)，而在hyalomatrix治疗后仅检测到23种(14种与angio
prp
组相同)。归一化数据的聚类证实了该结果，其中hyalomatrix和相应对照在相同的宏组中，而健康皮肤和angio
prp
单次样品与其相应的阴性对照相关。使用cytoscape平台分析差异表达的蛋白质以评估代谢。网络分析强调了伤口诱导和两种相关治疗的不同代谢簇的差异。特别是，与丝氨酸蛋白酶抑制品(serpins)、参与防御反应、细胞骨架组织、补体和凝血级联的蛋白质、细胞外基质(ecm)和核糖体相关的簇在hyalomatrix治疗及其对照条件下过度表达，而在angio
prp
和相应对照中是标准化的，如在健康样品中一样。相反，角蛋白和参与脂质代谢的蛋白质簇在angio
prp
条件比在hyalomatrix条件中表达更多。在这八个目标组中，我们将注意力集中在17种伤口相
关蛋白质，其在两种治疗后与健康组织相比以不同的方式表达：小窝蛋白-1(caveolin-1)、egfr、纤连蛋白、核心蛋白聚糖(decorin)、网蛋白(plectin)、serpinb2、盘状蛋白结构域受体-2(discoidin domain receptor-2)、凝血酶原、血红素加氧酶1、纤维蛋白原α-β-和γ-链、肌腱蛋白(tenascin)、plastin-2、α-原肌球蛋白、细胞角蛋白-6a和膜联蛋白a1。这些蛋白质的表达在hyalomatrix和angio
prp
治疗中呈相反的趋势：例如，小窝蛋白-1和核心蛋白聚糖在angio
prp
治疗后上调，但在hyalomatrix样品中下调。相反，参与凝血的因子，如纤维蛋白原、serpinb2和凝血酶原在hyalomatrix处理后比angio
prp
治疗表达更高。
[0084]
实施例9-网络和统计分析
[0085]
从通过差异和lda程序选择的蛋白质列表开始，提取相应的智人蛋白质-蛋白质相互作用(ppi)网络，通过cytoscape插件，string 8数据库(pawlowski,muszewska et al.2010)进行，从 prolink、dip、kegg和bind等几个数据库中检索到已知的相互作用。此外，使用cytoscape 3.5(shannon,markiel et al.2003)检查ppi，并且仅保留了经过实验验证且分数》0.15的相互作用。最后，bingo 2.44(maere,heymans et al.2005)用于强调基于功能组织的go术语的模块。
[0086]
肽序列和相关蛋白质的鉴定标准是：胰蛋白酶作为酶；每个肽允许三个错过的切割；前体离子的质量公差为10ppm，碎片离子的质量公差为
±
0.6da。过滤节点与目标诱饵策略一起使用，以基于q值在0.01(严格)的肽谱匹配(psm)水平上给出最终的错误发现率(fdr)，考虑到最大deltacn为0.05(kall,canterbury et al.2007)；最小肽长度为6个氨基酸，考虑的秩为1，采用蛋白分组和严格的节省原则。
[0087]
使用x平方检验评估分类变量的差异。kruskal wallis检验用于比较定量的变量。使用r(3.5.2)统计分析软件进行分析；p值《0.05被认为具有统计学显著性。
[0088]
还通过t检验评估了spcs(zhang,verberkmoes et al.2006)，通过应用ward方法和欧几里得距离度量的层次聚类评估了通过lda和maproma选择的蛋白质(zhao and karypis 2005)。对所有分层组和马氏距离，lda使用通用协方差矩阵(jain ak 1999)，层次聚类通过jmp 5.1软件进行。为了选择区分分层儿童组的蛋白质，我们考虑了那些具有最大f比(≥5)和最小p值(≤0.05)的蛋白质。基于光谱计数(spc，也称为psm)与所鉴定蛋白质的相对丰度之间的直接相关性，maproma(多维算法蛋白质图)软件的dave(差分平均值)和dci(差分系数指数)索引(mauri,riccio et al.2014)用于处理与每个所分析儿童组相对应的平均值(aspc)。施加的阈值是dave》|0.2|和dci》|100|。