环肽受体羊毛硫氨酸合成酶C样蛋白(LANCL)及其用途的制作方法

环肽受体羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白(lancl)及其用途
发明领域
1.本发明大体上涉及一种环肽受体及其用于筛选和鉴定治疗剂的用途，并且涉及所鉴定的治疗剂的用途，包括用于疼痛治疗的用途。
2.背景
3.所有参考文献，包括在本说明书中引用的任何专利或专利申请，都在此通过引用并入，以便能够充分理解本发明。然而，这样的参考文献不应被理解为在澳大利亚或在任何其他国家构成对任何这些文献形成本领域公知常识的一部分的承认。
4.疼痛可以是一种使人衰弱的感觉经验，通常与组织损伤和/或潜在的神经紊乱相关。疼痛，无论是急性的还是慢性的，都可能在不存在任何可察觉的刺激、损伤或潜在疾病的情况下出现。急性疼痛通常持续短的时间段(例如，几个小时或几天)，并且通常将在潜在刺激停止后消失。相比之下，慢性疼痛持续较长的时间段(例如，几周或几个月)，并且甚至可能在不存在潜在刺激的情况下持续。
5.存在两种广泛认可的疼痛类型——伤害性疼痛和神经性疼痛。伤害性疼痛是对感觉神经纤维的潜在有害刺激的结果，由身体上对机械或物理损伤做出反应的伤害感受器检测。伤害性疼痛提供保护性生物功能，通过警告组织损伤，来引起对有害刺激的回避。伤害性疼痛可以由热损伤诸如烧伤或冻伤引起，或由机械创伤诸如裂伤或压力引起。
6.不同于伤害性疼痛，神经性疼痛由外周神经系统或中枢神经系统中的原发性损害、功能失常或功能障碍引起。神经性疼痛不具有保护作用，并且可以在损伤之后或疾病状态消退之后数天或数月发展，并且经常是长期的和慢性的。
7.神经性疼痛可以由通过创伤造成的神经损伤引起，所述创伤诸如运动损伤、事故、跌倒或贯穿伤(penetrating injury)，或者神经损伤可以由疾病过程引起，所述疾病过程诸如中风、病毒感染、暴露于毒素、退行性疾病和糖尿病。
8.在一些情况下，伤害性疼痛和神经性疼痛可以重叠，由此一些损伤或疾病状态可以影响组织和神经两者，引起两种类型的疼痛。
9.尽管有许多可用的镇痛药物，但镇痛药的选择及其有效性通常取决于报告的疼痛水平、急性还是慢性、疼痛的位置和类型、和/或潜在的禁忌症。根据世界卫生组织(who)的镇痛阶梯，轻度或短暂的疼痛状况应该响应于非处方药，诸如扑热息痛和非甾体抗炎药，诸如阿司匹林、布洛芬和萘普生。中度至重度、慢性或复杂疼痛的治疗目前依赖于基于阿片类的镇痛药的使用，包括轻度可待因、羟考酮、美沙酮、吗啡和芬太尼。
10.非阿片类镇痛药，诸如选择性cox-2抑制剂，由于无法接受的心血管疾病相关风险而被撤回。药用大麻和大麻素的使用仍有争议，几乎没有证据支持其广泛用于治疗疼痛，特别是慢性疼痛。因此，阿片类镇痛药仍然是金标准。然而，阿片类镇痛药带有明显的副作用，诸如镇静和嗜睡，并且在长期使用的情况下，有药物耐受性和药物依赖性的风险。因此，仍然迫切需要新的和替代的有效地治疗或预防疼痛同时限制对许多其他镇痛药观察到的一些不良副作用的选择。为此，本发明人先前已经鉴定了一类能够治疗疼痛包括神经性疼痛的环肽。本发明人现在首次鉴定和表征了这些环肽的分子靶，从而允许鉴定和使用用于治
疗疼痛包括神经性疼痛的新类别的治疗剂。本发明人的发现还允许鉴定和使用用于治疗除疼痛(包括先前已将治疗归因于本文所述肽的状况)以外的状况的新类别的治疗剂。
11.发明概述
12.本发明至少部分地基于本发明人对先前已被认为具有镇痛特性的新类别的环肽分子的分子靶(受体)的鉴定和表征。这是首次鉴定和表征该新类别的环肽分子的分子靶，从而允许鉴定新的和改进的治疗剂，包括能够治疗状况诸如疼痛的治疗剂。
13.因此，在一方面，本发明提供了一种治疗受试者的疼痛的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合的剂，其中所述剂不是源自人类生长激素或源自其非人类同源物的肽，并且其中所述剂与包含seq id no:1(ylrivqcrsvegscgf)的环肽竞争结合lancl1。
14.本文还公开了一种筛选镇痛剂的方法，该方法包括：(a)在存在包含seq id no:1(ylrivqcrsvegscgf)的肽或其结构类似物的情况下并在将允许候选剂与lancl结合的条件下使候选剂与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白(lancl)接触，和(b)确定候选剂是否与lancl结合并与包含seq id no:1的肽或与其结构类似物竞争结合lancl，其中候选剂与包含seq id no:1的肽或与其结构类似物竞争结合lancl的能力指示候选剂是镇痛剂。
15.本文还公开了一种筛选羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白(lancl)的配体的方法，该方法包括：(a)在存在包含seq id no:1的环肽或其结构类似物的情况下并在将允许候选剂与lancl结合的条件下使候选剂与lancl接触，和(b)确定候选剂是否与lancl结合并与包含seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl，其中候选剂与包含seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl的能力指示候选剂是lancl的配体。
16.在实施方案中，lancl选自由lancl1、lancl2和lancl3组成的组。在优选实施方案中，lancl是lancl1。
17.在另一方面，提供了一种组合物，该组合物包含通过本文公开的筛选方法鉴定的镇痛剂，其中所述镇痛剂不是源自人类生长激素或源自其非人类同源物的肽。
18.本文还公开了一种用于治疗有相应需要的受试者的疼痛的组合物，该组合物包含与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合并与包含seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl1的剂，其中该剂不是源自人类生长激素或源自其非人类同源物的肽。
19.本公开内容还延伸到与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合并与seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl1的剂在制备用于治疗有相应需要的受试者的疼痛的药物中的用途，其中所述剂不是源自人类生长激素或源自其非人类同源物的肽。
20.本公开内容还延伸到治疗受试者的状况的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合的剂，其中所述剂不是源自人类生长激素或源自其非人类同源物的肽，并且其中所述剂与包含seq id no:1(ylrivqcrsvegscgf)的环肽竞争结合lancl1，其中所述状况选自由以下组成的组：肌少症，糖耐量受损，糖尿病，肥胖症，代谢疾病和肥胖症相关状况，神经性疼痛，骨关节炎，肌肉紊乱(disorder of muscle)，消耗性紊乱(wasting disorder)，恶病质，厌食症，aids消耗性综合征，肌营养不良，神经肌肉疾病，运动神经元疾病，神经肌肉接头疾病，炎性肌病，烧伤，损伤或创伤，与ldl胆固醇升高相关的状况，与软骨细胞、蛋白聚糖或胶原产生或质量受损相关的状况，与软骨组织形成或质量受损相关的状况，与肌肉、韧带或肌腱质量、形态或功
能受损相关的状况，与影响肌肉或结缔组织的炎症、创伤或遗传异常相关的状况，呼吸道状况和骨紊乱(bone disorder)。
21.本文还公开了一种用于治疗有相应需要的受试者的状况的组合物，该组合物包含与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合并与包含seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl1的剂，并且其中所述剂不是源自人类生长激素或其非人类同源物的肽，其中所述状况选自由以下组成的组：肌少症，糖耐量受损，糖尿病，肥胖症，代谢疾病和肥胖症相关状况，神经性疼痛，骨关节炎，肌肉紊乱，消耗性紊乱，恶病质，厌食症，aids消耗性综合征，肌营养不良，神经肌肉疾病，运动神经元疾病，神经肌肉接头疾病，炎性肌病，烧伤，损伤或创伤，与ldl胆固醇升高相关的状况，与软骨细胞、蛋白聚糖或胶原产生或质量受损相关的状况，与软骨组织形成或质量受损相关的状况，与肌肉、韧带或肌腱质量、形态或功能受损相关的状况，与影响肌肉或结缔组织的炎症、创伤或遗传异常相关的状况，呼吸道状况和骨紊乱。
22.本公开内容还延伸到与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合并与seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl1的剂在制备用于治疗有相应需要的受试者的状况的药物中的用途，其中所述剂不是源自人类生长激素或其非人类同源物的肽，并且其中所述状况选自由以下组成的组：肌少症，糖耐量受损，糖尿病，肥胖症，代谢疾病和肥胖症相关状况，神经性疼痛，骨关节炎，肌肉紊乱，消耗性紊乱，恶病质，厌食症，aids消耗性综合征，肌营养不良，神经肌肉疾病，运动神经元疾病，神经肌肉接头疾病，炎性肌病，烧伤，损伤或创伤，与ldl胆固醇升高相关的状况，与软骨细胞、蛋白聚糖或胶原产生或质量受损相关的状况，与软骨组织形成或质量受损相关的状况，与肌肉、韧带或肌腱质量、形态或功能受损相关的状况，与影响肌肉或结缔组织的炎症、创伤或遗传异常相关的状况，呼吸道状况和骨紊乱。
23.附图简述
24.图1示出了lat9991-pal配体(seq id no:12-pal；5μm)与来自用紫杉醇处理(上图)或未处理(下图)的小鼠的背根神经节(drg)神经元的结合——红色染色揭示lat9991-pal仅与来自处理的动物和神经病动物的神经元选择性结合。比例尺代表10μm。
25.图2是显微照片的高倍图像，示出了神经压迫(constriction)后，来自神经病小鼠的神经元中lat9991-pal(图像中的红色染色)的分子靶仅在神经元细胞膜内表达，并在细胞质中呈点状染色。比例尺代表10μm。
26.图3示出了来自神经病动物的神经组织的组织匀浆中由交联的lat9991-pal(seq id no:12-pal；5μm)形成的复合物的凝胶分离。结果揭示了鉴定出以下三个分子量范围的靶的特定染色模式：12-15kda、37kda和40-50kda。在不存在pal配体的情况下的匀浆、和在存在过量lat8881(seq id no:1；50μm)的情况下的匀浆与lat9991-pal(5μm)用作对照。
27.图4示出了lat9991-pal、lat9993-pal(seq id no:41-pal)和lat7771-pal(seq id no:52-pal)与来自组织匀浆的lancl1结合(通过质谱术鉴定)，并且这种结合在存在过量lat8881时被抑制。
28.图5示出了在蛋白印迹分析中使用商业lancl1抗体对lancl1的检测，以确认与lat9991-pal结合的推定靶蛋白的身份。
29.图6示出了lat9991-pal与重组lancl1结合，并且这种结合在存在过量lat8881时
被抑制。
30.图7示出了lat7771-pal与重组lancl1结合，并且这种结合在存在过量lat8881时被抑制。
31.图8示出了lat9993s-pal(seq id no:44-pal)与重组lancl1结合，并且这种结合在存在过量lat8881时被抑制。
32.图9示出了lat9991-pal与重组lancl1结合，并且这种结合在存在(从左到右)过量的lat8881、lat9991、lat7771和lat9993s时被抑制。
33.图10示出了lat7771-pal与重组lancl2结合，并且这种结合在存在过量lat8881时被抑制。
34.图11示出了lat9993-pal与重组lancl3结合，并且这种结合在存在过量lat8881时被抑制。
35.图12示出了根据对修饰的肽idphapnem(ox)lygr(seq id no:59)进行的依赖性肽ms分析，lancl1的针对环肽lat9991-pal的结合位点。修饰的肽以特征性的454.199的δm(pal-cr-n2)来鉴定。
36.图13示出了与用对照sirna转染的a549细胞(sicontrol)相比，在通过sirna基因沉默后腺癌肺泡基底上皮细胞(a549)(silancl1)中lancl1的损失。在lancl1沉默48小时后，lancl1蛋白耗尽，如通过～37kda lancl1蛋白从细胞分离物中的损失证明的，如通过使用抗lancl1抗体(invitrogen)进行蛋白印迹分析确定的(a)。这与通过使用抗lancl1抗体(invitrogen)进行共聚焦显微术(b)确定的观察到的lancl1染色降低一致，尽管silancl a549细胞的胞质溶胶中保留了一些内源性lancl1染色。
37.发明详述
38.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等效的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，在下文中定义了以下术语。
39.除非上下文另外明确指明，否则单数术语“一(a)”、“一(an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物。还应理解，为核酸或多肽提供的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似的，并提供用于描述。
40.在整个本说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括/包含(comprise)”、“包括/包含(comprises)”和“包括/包含(comprising)”将被理解为意味着包括陈述的步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。因此，使用术语“包括/包含(comprising)”等指示所列出的要素是要求的或必需的，但其他要素是任选的并且可以存在或可以不存在。“基本上由...组成(consisting essentially of)”意图包括在该措辞之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于本公开内容中指定的所列出的要素的活性或作用的其他要素。因此，措辞“基本上由...组成”指示所列出的要素是要求的或必需的，但其他要素是任选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响所列出的要素的活性或作用。
41.如本文使用的，“和/或(and/or)”是指并且涵盖一个或更多个相关列出的项(item)的任何和所有可能的组合，以及当以替代(或)解释时缺少组合。
42.如本文使用的，术语“约”是指对于参考数量、水平、值、维度、尺寸或量变化最多10％(例如，10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)的数量、水平、值、维度、尺寸或量。
43.除非另有特别说明，否则本文描述的每种实施方案经必要修改后将适用于每种和每一种实施方案。
44.筛选方法
45.如本文别处所述，本发明人首次鉴定并表征了一类先前已认为具有镇痛特性的环肽分子的分子靶，从而允许筛选可以用于治疗疼痛特别是神经性疼痛的候选化合物的方法。因此，本文公开了一种筛选镇痛剂的方法，该方法包括：(a)在存在包含seq id no:1(ylrivqcrsvegscgf)的肽或其结构类似物的情况下并在将允许候选剂与lancl结合的条件下使候选剂与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白(lancl)接触，和(b)确定候选剂是否与lancl结合并与包含seq id no:1的肽或与其结构类似物竞争结合lancl，其中候选剂与包含seq id no:1的肽或与其结构类似物竞争结合lancl的能力指示候选剂是镇痛剂。在一种实施方案中，lancl选自由lancl1、lancl2和lancl3组成的组。在优选实施方案中，lancl是lancl1。
46.本发明人的发现还允许筛选lancl的配体的一般方法。因此，本文还公开了一种筛选lancl的配体的方法，该方法包括：(a)在存在包含seq id no:1的环肽或其结构类似物的情况下并在将允许候选剂与lancl结合的条件下使候选剂与lancl接触，和(b)确定候选剂是否与lancl结合并与包含seq id no:1的环肽或其结构类似物竞争结合lancl，其中候选剂与包含seq id no:1的环肽或其结构类似物竞争结合lancl的能力指示候选剂是lancl的配体。在一些实施方案中，鉴定的配体是可以用于治疗可以受益于lancl活性的调节的状况的治疗剂，所述状况的说明性实例包括肌少症，糖耐量受损，糖尿病，肥胖症，代谢疾病和肥胖症相关状况，神经性疼痛，骨关节炎，肌肉紊乱，消耗性紊乱，恶病质，厌食症，aids消耗性综合征，肌营养不良，神经肌肉疾病，运动神经元疾病，神经肌肉接头疾病，炎性肌病，烧伤，损伤或创伤，与ldl胆固醇升高相关的状况，与软骨细胞、蛋白聚糖或胶原产生或质量受损相关的状况，与软骨组织形成或质量受损相关的状况，与肌肉、韧带或肌腱质量、形态或功能受损相关的状况，与影响肌肉或结缔组织的炎症、创伤或遗传异常相关的状况，疼痛(例如，神经性疼痛)和骨紊乱。
47.羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白(lancl)是细菌lanc的真核同源物，细菌lanc是一种参与羊毛硫菌素中的羊毛硫氨酸环形成的环化酶。人类具有三种lancl蛋白——lancl1、lancl2和lancl3，分别编码于染色体2、染色体7和染色体x上。从人类红细胞膜分离了真核lanc样(lancl)蛋白家族的第一个成员lancl1。随后在人类中鉴定出lancl2。lancl1同源物也在其他哺乳动物中被发现并表征，包括小鼠、大鼠和牛(cattle)。真核lancl蛋白与原核lanc酶的氨基酸序列的比较揭示了若干关键的相似性，并且这些相似性形成了真核细胞中lancl蛋白的定义的基础。例如，lancl蛋白包含七个疏水序列重复，每个重复序列具有一个特征性gxxg一致基序(其中g＝甘氨酸，并且x＝任何氨基酸)。此外，lancl蛋白含有三个关键基序：重复序列4中的组氨酸(h)-甘氨酸(g)基序，重复序列5中的色氨酸(w)-半胱氨酸(c)-x-甘氨酸(g)基序，以及重复序列6中的半胱氨酸(c)-组氨酸(h)-甘氨酸(g)基序。如通过乳酸乳球菌(lactococcus lactis)lanc蛋白、乳链菌肽环化酶(nisc)的晶体结构和通过定点诱变研究揭示的，重复序列4的hg基序是底物去质子化的关键，以便允许正确的环化，
并且重复序列5的wcxg基序和重复序列6的chg基序含有保守的锌配位点(参见chen和ellis,plant signal behav.2008；3(5):307
–
310)。
48.羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)是一种399个氨基酸的外周膜蛋白，被认为是三种相关的哺乳动物lancl蛋白(lancl1、lancl 2和lancl 3)之一，最初作为膜相关红细胞gpcr p40/gpr69a被发现，与参与抗生素合成的细菌酶羊毛硫氨酸合成酶组分c(lanc)具有序列和结构同源性。lanc是一种含锌酶，它与特定的脱水酶协同作用，以促进半胱氨酸与丝氨酸或苏氨酸残基的分子内缀合，从而生成半胱氨酸的大环硫醚类似物，称为羊毛硫氨酸。这些产物显示出强大的抗菌活性，并且也被称为羊毛硫菌素。随后的研究显示，动物体内的lancl1不是gpcr，并且不具有细菌酶的环化酶活性。
49.人类染色体2q34的靠近lancl1的基因组区域被牵涉在家族性精神分裂症的早发性ad易感性形式和神经管缺陷中。lancl1还被牵涉在哮喘的遗传关联研究中。lancl1还被鉴定为小鼠中与mtmp神经毒性毒性(帕金森病模型)易感性相关的三个基因之一。
50.lancl2已被显示参与脱落酸(aba)信号传导途径，发挥下游作用以在免疫细胞和胰岛素瘤细胞中传播aba特异性效应。先前的研究已报道，lancl2通过与激酶和底物两者的直接物理相互作用调节akt，特别是参与促进雷帕霉素复合物2(mtorc2)的哺乳动物靶对akt的最佳磷酸化。人类lancl2也被认为在阿霉素致敏中起作用。lancl2在睾丸和大脑中高表达，在检测的所有其他组织中具有较少但普遍的表达。对lancl3的了解相对较少。
51.如本文使用的，术语“lancl1”包括其来自天然lancl1多肽，但保留或基本上保留天然蛋白的生物活性的结构上(例如，氨基酸序列)不同的功能变体。在一种实施方案中，lancl1是人类lancl1。人类lancl1分子的实例将是本领域技术人员已知的，其说明性实例描述于genbank登录号cag46576(版本cag46576.1)和genbank登录号np_006046.1中。因此，在一种实施方案中，lancl1包含genbank登录号cag46576(版本cag46576.1)或genbank登录号np_006046.1的氨基酸序列，或与上述任一项具有至少70％序列同一性或相似性的氨基酸序列。
52.术语“lancl1”还涵盖非人类同源物，诸如鼠科动物、犬科动物、猫科动物和马科动物的lancl1亚型。lancl1的非人类亚型将是本领域技术人员已知的，其说明性实例描述于genbank登录号rlq75574.1、owk13010.1、np_001177913.1、np_001177914.1和np_067270.1中。
53.如本文使用的，术语“lancl2”包括其来自天然lancl2多肽，但保留或基本上保留天然蛋白的生物活性的结构上(例如，氨基酸序列)不同的功能变体。在一种实施方案中，lancl2是人类lancl2。人类lancl2分子将是本领域技术人员已知的，其说明性实例描述于genbank登录号np_061167.1(版本np_061167.1)中。因此，在一种实施方案中，lancl2包含genbank登录号np_061167.1(版本cag46576.1)的氨基酸序列，或与上述任一项具有至少70％序列同一性或相似性的氨基酸序列。
54.术语“lancl2”还涵盖非人类同源物，如鼠科动物、犬科动物、猫科动物和马科动物的lancl2亚型。lancl2的非人类亚型将是本领域技术人员已知的，其说明性实例描述于genbank登录号aah16072.1、aai49312.1和np_001014209.1中。
55.如本文使用的，术语“lancl3”包括其来自天然lancl3多肽，但保留或基本上保留天然蛋白的生物活性的结构上(例如，氨基酸序列)不同的功能变体。在一种实施方案中，
lancl3是人类lancl3。人类lancl3分子的实例将是本领域技术人员已知的，其说明性实例描述于genbank登录号np_001163802(版本np_001163802.1)中。因此，在一种实施方案中，lancl3包含genbank登录号np_001163802(版本np_001163802.1)的氨基酸序列，或与上述任一项具有至少70％序列同一性或相似性的氨基酸序列。
56.术语“lancl3”还涵盖非人类同源物，如鼠科动物、犬科动物、猫科动物和马科动物的lancl3亚型。lancl3的非人类亚型将是本领域技术人员已知的，其说明性实例描述于genbank登录号np_775590.2、xp_031301363.1和xp_018875202.2中。
57.术语“功能变体”在本文中用于表示通过一个或更多个氨基酸插入、缺失和/或取代(保守或非保守的)而与天然lancl1肽(人类或非人类亚型)不同的分子，其中变体保留或基本上保留天然蛋白的生物活性，包括其与包含seq id no:1的环肽或与其结构类似物结合的能力，如本文别处所述。用于确定肽是否是lancl1、lancl2和/或lancl3的功能变体的方法将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例在本文别处描述(例如，功能变体与包含seq id no:1的环肽或与其结构类似物结合和/或与之形成复合物的能力，如本文别处所述)。lancl1、lancl2和/或lancl3的功能变体也分别扩展到lancl1、lancl2和/或lancl3的功能片段。应理解，功能片段可以是任何合适的长度，只要它保留或基本上保留天然蛋白的生物活性，包括其与包含seq id no:1的环肽或与其结构类似物结合的能力，如本文别处所述。在一种实施方案中，功能片段长度为至少50个氨基酸残基(即，50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个等)，优选地长度为至少100个氨基酸残基，优选地长度为至少150个氨基酸残基，优选地长度为至少200个氨基酸残基，优选地长度为至少250个氨基酸残基，优选地长度为至少300个氨基酸残基，优选地长度为至少350个氨基酸残基，或更优选地长度为至少350个氨基酸残基。
58.术语“天然”、“野生型”、“天然存在”等在本文可互换地使用，以指具有当从天然存在的来源分离时的基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型、天然或天然存在的基因或基因产物(例如，多肽)是在群体中最常观察到的，并且因此被任意指定为基因或基因产物的“正常”或“野生型”形式。
59.如本文别处所述，lancl1、lancl2和lancl3的功能变体包括但不限于，具有与天然lancl序列共有至少70％(和至少71％到至少99％以及其间所有整数％)序列同一性或相似性的氨基酸序列的分子。天然lancl多肽序列的说明性实例在本文别处描述，包括但不限于genbank登录号cag46576(例如，版本cag46576.1)、np_006046.1、rlq75574.1、owk13010.1、np_001177913.1、np_001177914.1和np_067270.1。lancl1、lancl2和lancl3的功能变体还包括lancl肽的天然等位基因变体，这些变体可能从一个生物到另一个生物存在和发生。糖基化或其他翻译后修饰的程度和位置也可以取决于所选择的宿主和宿主细胞环境的性质而不同。lancl1、lancl2和lancl3的功能变体也延伸到相对于参考或天然存在(天然)的lancl肽已被化学修饰(例如，磷酸化、甲基化或乙酰化)的lancl肽、和/或相对于参考或天然存在的lancl肽包含一个或更多个氨基酸序列改变的lancl肽、和/或相对于参考或天然存在的全长或经处理的lancl肽包含截短的氨基酸序列的lancl肽，如本文别处所述。lancl1、lancl2和lancl3的功能变体还包括具有轻微修饰的氨基酸序列的蛋白质分子，例如，具有修饰的n-末端(包括n-末端氨基酸缺失或添加)的肽、和/或相对于参考或天然存在的lancl肽已被化学修饰的多肽。如本文别处所述，lancl的功能变体还延伸到具有通过一
个或更多个氨基酸的插入、缺失或取代而不同于参考或天然存在的lancl肽的氨基酸序列的肽，如本文别处所述。
[0060]“保守氨基酸取代”应理解为意指其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中被定义，其通常可以如下表1所示地进行亚分类：
[0061]
表1-氨基酸亚分类
[0062][0063]
保守氨基酸取代还包括基于侧链的分组。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，合理地预期，用异亮氨酸或缬氨酸替换亮氨酸、用谷氨酸替换天冬氨酸、用丝氨酸替换苏氨酸或用结构相关的氨基酸类似地替换氨基酸，将不会对所得变体多肽的性质具有大的影响。氨基酸的变化是否产生功能性多肽可以容易地通过测定其活性来确定。
[0064]
保守取代在下表2中在示例性和优选的取代的标题下示出。落入本发明范围内的氨基酸取代通常通过选择在其维持(a)在取代区域中的肽骨架的结构，(b)在靶位点的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的作用中没有显著差异的取代来实现。引入取代后，针对生物活性筛选变体。
[0065]
有许多方法来针对候选剂的以下能力筛选候选剂：(i)与lancl1、lancl2和/或lancl3结合以及(ii)与seq id no:1的环肽或其结构类似物竞争结合。各种筛选测定或方法将足够，并且根据本公开内容，本领域普通技术人员仍将理解本文中未明确描述的那些。
[0066]
表2-示例性和优选的氨基酸取代
[0067][0068]
如本文所述，候选化合物(剂)可以通过任何组合化学方法产生。可选地，候选剂可以是从合适的来源提取和纯化或者体内或体外合成的天然存在的分子。待测试(筛选)的候选剂(化合物)可以例如由细菌、酵母、植物或其他生物体产生(例如，天然产物)，化学产生(例如，小分子，包括肽模拟物)或重组产生。候选化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、肽模拟物、糖和激素。
[0069]
如本文使用的术语“剂”包括诱导期望的药理和/或生理效应的化合物。该术语还涵盖本文具体提及的那些化合物的药学上可接受且药理上有活性的成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用上述术语时，应理解其包括活性剂本身，以及药学上可接受的药理上有活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。术语“剂”不应狭义地解释，而是延伸到小分子、蛋白质分子诸如肽、多肽和蛋白以及包含它们的组合物、和其化学类似物以及细胞剂。术语“剂”包括能够产生和分泌本文提到的剂的细胞，以及包含编码该剂的核苷酸序列的多核苷酸。因此，术语“剂”延伸到核酸构建体，包括用于在一系列细胞中表达和分泌的载体，诸如病毒或非病毒载体、表达载体和质粒。术语“候选剂”和“测试剂”在本文中可互换地使用以指待筛选其与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合的能力的剂和/或组合物，如本文所述的。
[0070]
候选化合物可以作为单个、离散的实体提供，或者以更复杂的库提供，诸如通过组合化学制备的库。这些库可以包括，例如，醇、烃基卤化物、胺、酰胺、酯、醛、醚和其他类别的有机化合物。向本文公开的筛选方法呈现的候选化合物可以是分离的形式，或作为化合物的混合物，特别是在初始筛选步骤中。任选地，候选化合物可以用其他化合物衍生化，并具
有辅助化合物分离的衍生基团。衍生基团的非限制性实例包括生物素、荧光素、地高辛、绿色荧光蛋白、同位素、多组氨酸、磁珠、谷胱甘肽s-转移酶(gst)、光可激活交联剂或其任何组合。
[0071]
在许多测试化合物和天然提取物的库的药物筛选程序中，为了使特定时间段内调查的化合物数量最大化，期望高通量测定。在无细胞系统(诸如可以用纯化或半纯化的蛋白获得)中进行的测定通常被优选为“初级”筛选，因为可以产生它们以允许快速开发和相对容易地检测由候选化合物介导的分子靶的改变。此外，候选化合物的细胞毒性或生物利用度的影响在体外系统中通常上可以忽略，而测定主要集中在候选化合物对分子靶(即，lancl1)的影响。
[0072]
候选化合物也可以通过对熟知的大型化合物库进行电子筛选来选择，诸如可用化学品目录(available chemical directory，acd；http://www.organicworldwide.net/content/available-chemical-directory)。这样的库的化合物可以通过对接程序(docking program)进行分析。特别地，为了评价候选化合物与lancl1之间的配合质量和相互作用强度，可以使用对接程序诸如autodock(可从oxford molecular,oxford,uk获得)、dock(可从molecular design institute,university of california san francisco,calif.获得)、gold(可从cambridge crystallographic data centre,cambridge,uk获得)以及flexx和flexidock(均可从tripos,st.louis,mo.获得)。这些程序和程序affinity(可从molecular simulations,san diego,calif.获得)还可以用于对候选化合物的进一步开发和优化。标准的分子力学力场诸如charmm和amber还可以用于能量最小化和分子动力学。
[0073]
在本发明筛选测定的说明性实例中，使候选化合物与lancl1肽接触。在一种实施方案中，lancl1包含氨基酸序列：maqrafpnpy adynkslaeg yfdaagrltp efsqrltnki rellqqmerg pksadprdgt gytgwagiav lylhlydvfg dpaylqlahg yvkqslnclt krsitflcgd agplavaavl yhkmnnekqa edcitrlihl nkidphapne mlygrigyiy allfvnknfg vekipqshiq qicetiltsg enlarkrnft aksplmyewy qeyyvgaahg lagiyyylmq pslqvsqgkl hslvkpsvdy vcqlkfpsgn yppcigdnrd llvhwchgap gviymliqay kvfreekylc dayqcadviw qygllkkgyg lchgsagnay afltlynltq dmkylyrack faewcleyge hgcrtpdtpf slfegmagti yfladllvpt karfpafel(seq id no:2)，如genbank登录号cag46576(版本cag46576.1)中所述。
[0074]
在本发明的筛选测定的另一说明性实例中，使候选化合物与lancl2肽接触。在一种实施方案中，lancl2包含genbank登录号np_061167(版本np_061167.1)的氨基酸序列。
[0075]
在本发明的筛选测定的另一说明性实例中，使候选化合物与lancl3肽接触。在一种实施方案中，lancl3包含genbank登录号np_001163802(版本np_001163802.1)的氨基酸序列。
[0076]
在本发明的筛选测定的另一说明性实例中，使候选化合物与lancl1肽、lancl2肽和lancl3肽中的两种或更多种(例如，(i)lancl1和lancl2；(ii)lancl1、lancl2和lancl3；(iii)lancl1和lancl3；(iv)lancl2和lancl3)接触。
[0077]
lancl1、lancl2和lancl3可以通过重组技术使用如ausubel等人“current protocols in molecular biology”,john wiley&sons inc,1994-2003中描述的标准方案方便地制备。例如，lancl1、lancl2和lancl3可以通过包括以下步骤的程序制备：(a)制备包含lancl1、lancl2和/或lancl3的编码序列的构建体，其中编码序列可操作地连接到调控元
件；(b)将构建体引入宿主细胞中；(c)培养宿主细胞以表达编码序列，从而产生编码的肽；和(d)从宿主细胞分离编码的lancl肽。如本文使用的术语“可操作地连接(operably connect)”或“可操作地连接(operably link)”是指其中如此描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并置(juxtaposition)。例如，调控序列(例如，启动子)“可操作地连接”到感兴趣的核苷酸序列(例如，编码和/或非编码序列)是指控制序列相对于感兴趣的核苷酸序列的定位和/或取向，以允许该序列在与控制序列相容的条件下表达。控制序列不必与感兴趣的核苷酸序列相邻，只要控制序列发挥作用以指导感兴趣的核苷酸序列表达。因此，例如，间插非编码序列(例如，不翻译但转录的序列)可以存在于启动子和编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”到编码序列。
[0078]
代表性的lancl1编码序列包括genbank登录号nm_006055(版本nm_006055.3)的核苷酸序列或对应于其的序列，包括用于在选择的宿主细胞中增强表达的密码子优化序列。代表性的lancl2编码序列包括genbank登录号nm_018697.3的核苷酸序列或对应于其的序列，包括用于在选择的宿主细胞中增强表达的密码子优化序列。代表性的lancl3编码序列包括genbank登录号nm_001170331.2的核苷酸序列或对应于其的序列，包括用于在选择的宿主细胞中增强表达的密码子优化序列。
[0079]
在一种实施方案中，向候选化合物和lancl的混合物添加含有包含seq id no:1的环肽或其结构类似物的组合物。对lancl1与环肽或其结构同源物之间形成的复合物的检测和定量，提供了用于确定候选化合物抑制lancl1与环肽或其结构类似物之间形成复合物的能力的手段。候选化合物抑制lancl与环肽或其结构类似物之间形成复合物的功效可以通过从使用不同浓度的候选化合物获得的数据生成剂量响应曲线来评估。还可以进行对照测定，以提供用于比较的基线。例如，在对照测定中，将lancl1添加到包含环肽或其结构类似物的组合物中，并在不存在候选化合物的情况下对lancl1/环肽复合物的形成进行定量。应理解，通常，反应物可以混合的顺序可以改变，并且可以同时混合。此外，可以使用细胞提取物和裂解物代替纯化的蛋白来提供合适的无细胞测定系统。
[0080]
如本文使用的，术语“复合物”是指分子(例如，肽、多肽，等等)彼此直接和/或间接接触的集聚或集合体。在特定实施方案中，“接触”，或更特别地，“直接接触”意指两个或更多个分子足够接近，从而吸引性的非共价相互作用(诸如范德华力、氢键合、离子相互作用和疏水相互作用等)主导分子的相互作用。在这样的实施方案中，分子(例如，肽和多肽)的复合物在使得热力学上有利于复合物的条件(例如，与其组成分子的非聚集或非复合的状态相比)下形成。如本文使用的术语“复合物”，除非另有说明，否则指两个或更多个分子(例如，肽、多肽或其组合)的集聚。术语“相互作用”，包括其语法等同物在述及两个分子之间的相互作用时是指分子彼此的物理接触。通常，这样的相互作用导致一个或两个所述分子的活动(这产生生物效应)。物理接触通常要求分子彼此结合或缔合，并且可以包括感应磁场或顺磁场的形成、共价键形成、离子相互作用(诸如，例如发生在离子晶格中)、氢键，或者可选地，范德华相互作用，诸如，例如偶极-偶极相互作用、偶极诱导的偶极相互作用、诱导的偶极-诱导的偶极相互作用、或排斥相互作用或上述吸引力的任何组合。
[0081]
候选化合物调节(竞争)lancl和环肽或其结构类似物之间相互作用的能力，可以通过本领域技术人员已知的适于评估两种蛋白之间相互作用的任何方法来测试。说明性实例包括免疫印迹、免疫沉淀分析、par焦点的免疫荧光、荧光偏振、fret(荧光共振能量转
移)、bret(生物发光共振能量转移)、alphascreen
tm
(放大发光接近均匀测定(amplified luminescent proximity homogeneous assay))、闪烁接近测定、elisa(酶联免疫吸附测定)、spr(表面等离子体共振，也称为biacore
tm
)、等温滴定量热法(itc)、差示扫描量热法、微尺度热泳、凝胶电泳和色谱术包括凝胶过滤。这些和其他方法，包括本文别处描述的方法，可以利用lancl1、lancl2和/或lancl3和/或环肽或其结构类似物的融合伴侣或标记(例如，光激活的标记(photo-activated labelling，pal))，如本文别处所述)。测定可以使用各种检测方法，包括但不限于生色标记、荧光标记、发光标记或同位素标记。
[0082]
如本文使用的，术语“调节”意指引起或促进感兴趣的分子、过程、途径或现象的定性或定量变化、改变或修饰。不限制地，这样的变化可以是结合特性的增加、减少、变化，或者过程、途径或现象的不同组分或分支的相对强度或活性的变化。
[0083]
本公开内容还设想了使用相互作用阱测定(interaction trap assay)，也称为“双杂交测定”，用于鉴定破坏lancl和包含seq id no:1的环肽或其结构类似物之间相互作用的候选化合物(参见例如，美国专利第5,283,317号；zervos等人(1993)cell 72:223-232；madura等人(1993)j biol chem268:12046-12054；bartel等人(1993)biotechniques 14:920-924；和iwabuchi等人(1993)oncogene 8:1693-1696)。在一种实施方案中，本公开内容设想了使用反向双杂交系统来鉴定使lancl与包含seq id no:1的环肽或其结构类似物之间的相互作用解离的化合物(例如，小分子或肽)(参见例如，vidal和legrain,(1999)nucleic acids res 27:919-29；vidal和legrain,(1999)trends biotechnol 17:374-81；和美国专利第5,525,490号、第5,955,280号和第5,965,368号)。
[0084]
候选化合物可在动物模型中进一步测试，以鉴定那些在体内具有期望的治疗谱的化合物。这些候选物可以用作用于药物进一步开发的“先导化合物(lead compound)”，通过例如对化合物进行依次修饰、分子建模和用于合理药物设计的其他常规程序。
[0085]
应理解，术语“结构类似物”就其指包含seq id no:1的环肽而言，意指与seq id no:1的氨基酸序列差异在于一个或更多个氨基酸插入、缺失和/或取代(保守或非保守的)的分子，但其他方面将保留或基本上保留环构象(例如，通过保留对应于seq id no:1的两个半胱氨酸残基的半胱氨酸残基之间的二硫键；ylrivqcrsvegscgf)和与lancl1、lancl2或lancl3结合的能力，如本文所述。在此上下文中，并且在没有任何明确的相反指示的情况下，术语“结构类似物”和“功能类似物”在本文可互换使用。“对应于(correspond to)”或“对应于(corresponding to)”意指显示出与参考氨基酸序列大体上的序列相似性或同一性的氨基酸序列。通常该氨基酸序列将显示出与参考氨基酸序列的至少一部分至少约70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％％、82％、83、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至高达100％的序列相似性或同一性。在一种实施方案中，结构类似物包括与seq id no:1具有至少70％、优选地至少75％、优选地至少80％、优选地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、或更优选地至少99％序列同一性的氨基酸序列。
[0086]
seq id no:1的合适结构类似物的说明性实例描述在wo2019/136528中，其全部内容通过引用并入本文。在一种实施方案中，该结构类似物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：式(i)的肽：
[0087]r1-crsvegscg-r2(i)(seq id no:3)
[0088]
其中
[0089]
r1选自由ylrivq(seq id no:4)、lrivq(seq id no:5)、rivq(seq id no:6)、ivq(seq id no:7)、vq(seq id no:8)和q(seq id no:9)组成的组，或r1不存在；和
[0090]
r2是f(苯丙氨酸；seq id no:10)，或r2不存在，
[0091]
其中式(i)的肽是由两个半胱氨酸残基之间的二硫键形成的环肽。
[0092]
在一种实施方案中，结构类似物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：选自由lrivqcrsvegscgf(seq id no:11)、crsvegscg(seq id no:12；lat9991)、crsvegscgf(seq id no:13；lat9991f)组成的组的氨基酸序列和与前述任一项具有至少70％、优选地至少75％、优选地至少80％、优选地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、或更优选地至少99％序列同一性的氨基酸序列。
[0093]
在一种实施方案中，结构类似物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：式(ii)的肽或其药学上可接受的盐：
[0094]r1-c-r-x
1-x
2-p-x
3-x
4-x
5-x
6-c-r2(ii)(seq id no:14)
[0095]
其中
[0096]
x1、x3、x5和x6是选自由丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甘氨酸组成的组的氨基酸残基；
[0097]
x2是丙氨酸、精氨酸或赖氨酸；
[0098]
x4是谷氨酸或天冬氨酸；
[0099]
r1选自由以下组成的组：
[0100]
s(seq id no:15)，
[0101]
hs(seq id no:16)，
[0102]
ghs(seq id no:17)，
[0103]
pghs(seq id no:18)，
[0104]
apghs(seq id no:19)，
[0105]
eapghs(seq id no:20)，
[0106]
seapghs(seq id no:21)，
[0107]
sseapghs(seq id no:22)，
[0108]
psseapghs(seq id no:23)，
[0109]
dpsseapghs(seq id no:24)和
[0110]
idpsseapghs(seq id no:25)，
[0111]
或r1不存在；并且
[0112]
r2选自由以下组成的组：
[0113]
s(seq id no:26)，
[0114]
ss(seq id no:27)，
[0115]
ssk(seq id no:28)，
[0116]
sskf(seq id no:29)，
[0117]
sskfs(seq id no:30)，
[0118]
sskfsw(seq id no:31)，
[0119]
sskfswd(seq id no:32)，
[0120]
sskfswde(seq id no:33)，
[0121]
sskfswdey(seq id no:34)，
[0122]
sskfswdeye(seq id no:35)，
[0123]
sskfswdeyeq(seq id no:36)，
[0124]
sskfswdeyeqy(seq id no:37)，
[0125]
sskfswdeyeqyk(seq id no:38)，
[0126]
sskfswdeyeqykk(seq id no:39)和
[0127]
sskfswdeyeqykke(seq id no:40)，
[0128]
或r2不存在；并且
[0129]
其中式(ii)的肽是由两个半胱氨酸残基之间的二硫键形成的环肽。
[0130]
在一种实施方案中，结构类似物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：选自由scrsrpvessc(seq id no:41；lat9993)、crsrpvessc(seq id no:42)、crsrpvesscs(seq id no:43)、scrsrpvesscs(seq id no:44；lat9993s)组成的组的氨基酸序列和与前述任一项具有至少70％、优选地至少75％、优选地至少80％、优选地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、或更优选地至少99％序列同一性的氨基酸序列。
[0131]
在另一种实施方案中，结构类似物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：式(iii)的肽：
[0132]r1-c-r-i-x
1-x
2-x
3-x
4-n-c-r2(iii)(seq id no:45)
[0133]
其中
[0134]
x1是选自异亮氨酸(i)和缬氨酸(v)的氨基酸残基；
[0135]
x2是选自组氨酸(h)和酪氨酸(y)的氨基酸残基；
[0136]
x3是选自天冬氨酸(d)和天冬酰胺(n)的氨基酸残基；
[0137]
x4是选自天冬酰胺(n)和丝氨酸(s)的氨基酸残基；
[0138]
r1选自由ylkllk(seq id no:46)、lkllk(seq id no:47)、kllk(seq id no:48)、llk(seq id no:49)、ll(seq id no:50)、k(seq id no:51)组成的组或r1不存在；并且
[0139]
r2是g(甘氨酸)，或r2不存在
[0140]
其中式(iii)的肽是由两个半胱氨酸残基之间的二硫键形成的环肽。
[0141]
在一种实施方案中，结构类似物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：选自由criihnnnc(seq id no:52；lat7771)、criihnnncg(seq id no:53)、crivydsnc(seq id no:54)、crivydsncg(seq id no:55)组成的组的氨基酸序列和与前述任一项具有至少70％、优选地至少75％、优选地至少80％、优选地至少85％、优选地至少90％、优选地至少95％、或更优选地至少99％序列同一性的氨基酸序列。
[0142]
在一种实施方案中，包含seq id no:1的环肽的结构类似物源自人类白细胞介素-1受体相关激酶3(irak-3)。
[0143]
在一种实施方案中，包含seq id no:1的环肽的结构类似物源自人类催乳素。
[0144]
本公开内容还延伸到分离和/或产生通过本文公开的方法鉴定的镇痛剂。因此，在一种实施方案中，该方法还包括分离、合成或以其他方式产生根据本文公开的方法鉴定为镇痛剂的候选剂。
[0145]
如本文别处所述，如本文所述的功能变体和结构类似物包括具有与天然蛋白的氨
biomedical research foundation,washington,d.c.,usa)开发并且由gribskov(nucl.acids res.14(6):6745-6763,1986)标准化的评分矩阵与肽序列一起使用。用于计算序列之间的同一性或相似性百分比的合适程序在本领域中是众所周知的。
[0151]
用于对齐比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化工具(wisconsin genetics software package发布7.0中的gap、bestfit、fasta和tfasta，genetics computer group,575science drive madison,wi,usa)或通过检查来进行，并且选择多种方法的任一种产生的最佳比对(即，得到比较窗口的最高同源性百分比)。还可以参考如例如由altschul等人(1997，nucl.acids res.25:3389)公开的blast程序家族。序列分析的详细讨论可以在ausubel等人，(“current protocols in molecular biology”,john wiley&sons inc,1994-1998,chapter 15)的unit 19.3中找到。
[0152]“相似性(similarity)”是指相同或构成如以上表1和表2中定义的保守取代的氨基酸的百分数。相似性可以使用序列比较程序诸如gap(deveraux等人1984,nucleic acids research 12:387-395)来确定。以此方式，可以通过将空位插入到比对中来比较与本文提及的那些序列长度相似或基本不同的序列，这样的空位通过例如gap使用的比较算法来确定。
[0153]
治疗方法
[0154]
如本文别处所述，本发明至少部分地基于本发明人对最近已认为具有镇痛特性的新类别的环肽分子的分子靶的鉴定和表征。这是首次鉴定和表征该新类别的镇痛肽的分子靶，从而允许鉴定和/或设计用于治疗疼痛(包括神经性疼痛)的新治疗剂。因此，在本文公开的一方面，提供了一种治疗受试者的疼痛的方法，该方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合的剂，其中所述剂不是源自人类生长激素或源自其非人类同源物的肽，并且其中所述剂与包含seq id no:1(ylrivqcrsvegscgf)的肽竞争结合lancl1。
[0155]
如本领域技术人员将知悉的，存在许多可能的疼痛的原因。因此，应理解，本文设想的是治疗或预防疼痛，无论原因如何。在一些实施方案中，疼痛是组织的损伤或创伤、影响神经的疾病或状况(例如，原发性神经病)和/或由全身性疾病引起的疼痛(继发性神经病)的结果，所述组织的损伤或创伤、影响神经的疾病或状况(例如，原发性神经病)和/或由全身性疾病引起的疼痛(继发性神经病)的说明性实例包括糖尿病性神经病；带状疱疹(herpes zoster)(带状疱疹(shingles))相关神经病；纤维肌痛；多发性硬化、中风、脊髓损伤；慢性手术后疼痛、幻肢痛、帕金森病；尿毒症相关神经病；淀粉样变性神经病；hiv感觉神经病；遗传性运动和感觉神经病(hmsn)；遗传性感觉神经病(hsn)；遗传性感觉和自主神经病；伴有溃疡残毁的遗传性神经病；呋喃妥因神经病；腊肠样肿胀神经病；营养缺乏引起的神经病、肾衰竭引起的神经病以及复杂的区域性疼痛综合征。可以引起疼痛的状况的其他说明性实例包括重复性活动诸如打字或在装配线上工作，已知引起外周神经病的药物诸如若干种抗逆转录病毒药物ddc(扎西他滨(zalcitabine))和ddi(地达诺新(didanosine))、抗生素(甲硝唑、用于克罗恩病的抗生素、用于结核病的异烟肼)、金化合物(用于类风湿性关节炎)、一些化疗药物(诸如长春新碱和其他化疗药物)以及许多其他药物。还已知引起外周神经病的化学化合物，包括醇类(alcohol)、铅、砷、汞和有机磷杀虫剂。一些外周神经病与感染过程(诸如吉兰-巴雷综合征)相关。神经性疼痛的其他说明性实例包括热性或机械
性痛觉过敏(thermal or mechanical hyperalgesia)、热性或机械性痛觉超敏(thermal or mechanical allodynia)、糖尿病性疼痛、影响口腔的神经性疼痛(例如，三叉神经神经性疼痛、非典型牙痛(幻牙痛)、灼口综合征)、纤维肌痛以及卡压疼痛(entrapment pain)。
[0156]
在本文公开的一种实施方案中，疼痛选自由以下组成的组：癌症疼痛；牙痛；内脏疼痛，诸如胰腺炎；骨盆痛；热灼伤和化学灼伤；与炎症或细菌、真菌或病毒感染相关的疼痛；与代谢性疾病、厌食症、肥胖症和肥胖症相关状况相关的疼痛，与糖耐量受损和糖尿病相关的疼痛；与骨关节炎相关的疼痛；与肌肉骨骼和神经肌肉疾病相关的疼痛；与软骨细胞、蛋白聚糖或胶原生成或质量受损的状况相关的疼痛；与软骨组织形成或质量受损的状况相关的疼痛；与肌肉、韧带或肌腱质量、形态或功能受损的状况相关的疼痛；与影响肌肉或结缔组织的炎症、创伤或遗传异常和骨紊乱相关的疼痛；肌营养不良相关的疼痛，与aids消耗性综合症相关的疼痛，与带状疱疹(herpes zoster)(带状疱疹(shingles))相关神经病有关的疼痛；纤维肌痛；多发性硬化、中风、脊髓损伤；慢性手术后疼痛、幻肢痛、帕金森病；尿毒症相关神经病；淀粉样变性神经病；hiv感觉神经病；遗传性运动和感觉神经病(hmsn)；遗传性感觉神经病(hsn)；遗传性感觉和自主神经病；伴有溃疡残毁的遗传性神经病；呋喃妥因神经病；腊肠样肿胀神经病；营养缺乏引起的神经病、肾衰竭引起的神经病、三叉神经神经性疼痛、非典型牙痛(幻牙痛)、灼口综合征、复杂的区域性疼痛综合征、重复性劳损、痛觉超敏、感觉过敏、痛觉过敏、灼痛和射痛、药物诱发的外周神经病(例如，化疗诱发的神经病)以及与感染相关的外周神经病。
[0157]
在一些实施方案中，疼痛可以伴随有麻木、无力和反射丧失。疼痛可以是严重的和致残的。“痛觉过敏(hyperalgesia)”意指对通常疼痛的刺激的增加的响应。痛觉过敏状况是与由通常不疼痛的刺激引起的疼痛相关的状况。术语“感觉过敏(hyperesthesia)”是指过度的身体特别是皮肤的敏感性。如本文使用的术语“痛觉超敏(allodynia)”是指由无害性的刺激引起的疼痛；即，由于通常不引起疼痛的刺激引起的疼痛。痛觉超敏的说明性实例包括热性痛觉超敏(由于冷刺激或热刺激引起的疼痛)、触觉性痛觉超敏(由于较轻压力或触摸引起的疼痛)、机械性痛觉超敏(由于较重压力或针刺引起的疼痛)等。
[0158]
疼痛可以是急性或慢性的，并且在这种情况下，应理解疼痛的时间过程可以基于疼痛的潜在原因而变化。例如，对于创伤，疼痛的症状的发作可以是急性或突然的；然而，最严重的症状可以随着时间推移而发展并且持续数年。经数周至数月的慢性时间过程通常指示中毒性疼痛综合征或代谢性疼痛综合征。慢性、缓慢进展性疼痛综合征(诸如伴随疼痛性糖尿病性神经病发生，或伴随大多数遗传性神经病发生，或伴随被称为慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根病(cidp)的状况发生)可以具有许多年的时间过程。具有复发和缓解的症状的神经病状况包括吉兰-巴雷综合征。
[0159]
在一些实施方案中，神经性疼痛由特征为神经元超敏反应性的状况(诸如纤维肌痛或肠易激综合征)引起。
[0160]
在其他实施方案中，神经性疼痛由与导致神经元超敏反应性的异常神经再生相关的紊乱引起。这样的紊乱包括乳房疼痛、间质性膀胱炎、外阴痛以及癌症化疗诱导的神经病。
[0161]
在一些实施方案中，疼痛涉及手术、手术前疼痛和手术后疼痛，特别是手术后疼痛。
[0162]
在一些实施方案中，疼痛涉及组织创伤或损伤、化学灼伤或热灼伤或内脏疼痛。
[0163]
在一种实施方案中，疼痛是神经性疼痛。不受理论或特定的应用模式所束缚，神经性疼痛通常被表征为由神经组织或神经元本身的受伤或疾病而造成的损伤引起的疼痛，或者神经组织内的功能障碍引起的疼痛。疼痛可以是外周的疼痛、中枢的疼痛或其组合；换句话说，术语“神经性疼痛”通常是指由外周神经系统或中枢神经系统的原发性损伤或功能障碍引发或引起的任何疼痛综合征。神经性疼痛也是基于以下可区分的：其通常不有效地响应于通过普通疼痛药物诸如阿片样物质的治疗。相比之下，伤害性疼痛被表征为由可能对组织造成损伤或受伤的有毒的或可能有害的刺激产生的伤害感受器的刺激而引起的疼痛。伤害性疼痛通常响应于普通疼痛药物，诸如阿片样物质。
[0164]
神经性疼痛的类型将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例包括糖尿病性神经病；带状疱疹(herpes zoster)(带状疱疹(shingles))相关神经病；纤维肌痛；多发性硬化、中风、脊髓损伤；慢性手术后疼痛、幻肢痛、帕金森病；尿毒症相关神经病；淀粉样变性神经病；hiv感觉神经病；遗传性运动和感觉神经病(hmsn)；遗传性感觉神经病(hsn)；遗传性感觉和自主神经病；伴有溃疡残毁的遗传性神经病；呋喃妥因神经病；腊肠样肿胀神经病；营养缺乏引起的神经病、肾衰竭引起的神经病、三叉神经神经性疼痛、非典型牙痛(幻牙痛)、灼口综合征、复杂的区域性疼痛综合征、重复性劳损、偏头痛、药物诱发的外周神经病(例如，化疗诱发的神经病)和与感染相关的外周神经病、慢性腰痛、复杂局部疼痛综合征、颞下颌关节紊乱、扁平苔藓和反射交感性营养不良。
[0165]
因此，在一种实施方案中，神经性疼痛选自由以下组成的组：糖尿病性神经病；带状疱疹(herpes zoster)(带状疱疹(shingles))相关神经病；纤维肌痛；多发性硬化、中风、脊髓损伤；慢性手术后疼痛、幻肢痛、帕金森病；尿毒症相关神经病；淀粉样变性神经病；hiv感觉神经病；遗传性运动和感觉神经病(hmsn)；遗传性感觉神经病(hsn)；遗传性感觉和自主神经病；伴有溃疡残毁的遗传性神经病；呋喃妥因神经病；腊肠样肿胀神经病；营养缺乏引起的神经病、肾衰竭引起的神经病、三叉神经神经性疼痛、非典型牙痛(幻牙痛)、灼口综合征、复杂的区域性疼痛综合征、重复性劳损、偏头痛、药物诱发的外周神经病(例如，化疗诱发的神经病)和与感染相关的外周神经病、慢性腰痛、复杂局部疼痛综合征、颞下颌关节紊乱、扁平苔藓和反射交感性营养不良。
[0166]
在一种实施方案中，剂不是源自人类白细胞介素-1受体相关激酶3(irak-3)的环肽。
[0167]
在一种实施方案中，剂不是源自人类催乳素的环肽。
[0168]
本公开内容还延伸到辅助疗法。因此，在一种实施方案中，所述方法还包括向有相应需要的受试者施用另外的镇痛剂，其中另外的镇痛剂不是(i)与lancl1结合的剂，或(ii)与包含seq id no:1的环肽竞争结合lancl1的剂。合适的镇痛剂将是本领域技术人员熟悉的，并且可以包括治疗伤害性疼痛和/或神经性疼痛的剂。合适的镇痛剂的说明性实例包括吗啡、芬太尼、曲马多、可待因、二氢可待因、氢可酮、乙酰二氢可待因、羟考酮、羟吗啡酮和丁丙诺啡以及非甾体抗炎药(nsaid)。合适的nsaid的说明性实例包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、二氟尼柳、双水杨酸酯(salsalate)、非那西丁、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、萘丁美酮、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、帕瑞昔布、罗美昔布(lumiracoxib)、
依托昔布、菲洛昔布、尼美舒利和利克飞龙(licofelone)。
[0169]
在一种实施方案中，另外的镇痛剂包括能够减轻受试者的伤害性疼痛的剂。在一种实施方案中，另外的镇痛剂选自由以下组成的组：吗啡、芬太尼、曲马多、可待因、二氢可待因、氢可酮、乙酰二氢可待因、羟考酮、羟吗啡酮和丁丙诺啡以及非甾体抗炎药(nsaid)。在一种实施方案中，另外的镇痛剂是非甾体抗炎药(nsaid)。在优选的实施方案中，nsaid选自由以下组成的组：阿司匹林、布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、二氟尼柳、双水杨酸酯、非那西丁、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、萘丁美酮、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、帕瑞昔布、罗美昔布、依托昔布、菲洛昔布、尼美舒利和利克飞龙。在一种实施方案中，另外的镇痛剂不是与lancl1结合的剂。
[0170]
术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等在本文中可互换地使用，以意指缓解、减少、减轻、改善或以其他方式抑制疼痛，包括疼痛的一种或更多种症状，诸如痛觉超敏或痛觉过敏。术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prophylaxis)”、“预防(prophylactic)”、“预防(preventative)”等在本文中可互换地使用，以意指阻止或延迟疼痛的发作或发展疼痛的风险。
[0171]
术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等还包括在至少一段时间内缓解、减少、减轻、改善或以其他方式抑制疼痛的影响。还应理解，术语“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等并不意味着疼痛或其症状被永久地缓解、减少、减轻、改善或以其他方式抑制，并且因此还涵盖暂时缓解、减少、减轻、改善或以其他方式抑制疼痛或其症状。
[0172]
如本文别处所述，本发明至少部分地基于本发明人对已认为具有治疗(除了镇痛以外)特性的新类别的环肽分子的分子靶的鉴定和表征。因此，在本文公开的另一方面，提供了一种治疗受试者的状况的方法，所述方法包括向有相应需要的受试者施用治疗有效量的与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合的剂，其中所述剂不是源自人类生长激素或源自其非人类同源物的肽，并且其中所述剂与包含seq id no:1(ylrivqcrsvegscgf)的环肽竞争结合lancl1，其中所述状况选自由以下组成的组：肌少症，糖耐量受损，糖尿病，肥胖症，代谢疾病和肥胖症相关状况，神经性疼痛，骨关节炎，肌肉紊乱，消耗性紊乱，恶病质，厌食症，aids消耗性综合征，肌营养不良，神经肌肉疾病，运动神经元疾病，神经肌肉接头疾病，炎性肌病，烧伤，损伤或创伤，与ldl胆固醇升高相关的状况，与软骨细胞、蛋白聚糖或胶原产生或质量受损相关的状况，与软骨组织形成或质量受损相关的状况，与肌肉、韧带或肌腱质量、形态或功能受损相关的状况，与影响肌肉或结缔组织的炎症、创伤或遗传异常相关的状况，呼吸道状况和骨紊乱。
[0173]
在一种实施方案中，剂不是源自白细胞介素-1受体相关激酶3(irak-3)的肽。在一种实施方案中，剂不是源自人类催乳素的肽。在一种实施方案中，状况是呼吸道状况。呼吸道状况的说明性实例包括慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化和肺癌以及呼吸道感染。因此，在一种实施方案中，呼吸道状况选自由以下组成的组：慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化和肺癌以及呼吸道感染。在一种实施方案中，呼吸道状况是呼吸道感染。
[0174]
呼吸道感染(rti)通常定义为上呼吸道或下呼吸道的任何感染性疾病。上呼吸道感染(urti)包括普通感冒、喉炎、咽炎/扁桃体炎、急性鼻炎、急性鼻窦炎和急性中耳炎。下呼吸道感染(lrti)包括急性支气管炎、毛细支气管炎、肺炎和气管炎。在初级护理中，抗生
素通常被开处方用于成人和儿童的rti。rti是全科医学的所有抗生素处方的60％的原因，并且这对卫生系统构成了重大成本(nice clinical guidelines,no.69；centre for clinical practice at nice(uk),london:national institute for health and clinical excellence(uk)；2008)。
[0175]
引起人类和非人类受试者的上呼吸道和/或下呼吸道感染的病原体将是本领域技术人员已知的，并且包括细菌和病毒，其说明性实例在charlton等人(clinical microbiology reviews；2018,32(1):e00042-18)、popescu等人(microorganisms.2019；7(11):521)和kikkert,m.(j innate immun.2020；12(1):4-20)中描述，其内容通过引用以其整体并入本文。在一种实施方案中，呼吸道感染是病毒感染。
[0176]
引起人类和非人类受试者的呼吸道(上呼吸道和/或下呼吸道)感染的病毒将是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括微小rna病毒、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肠道病毒和偏肺病毒。因此，在本文公开的实施方案中，病毒选自由以下组成的组：微小rna病毒、冠状病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肠道病毒和偏肺病毒。在一种实施方案中，病毒是流感病毒。在另一种实施方案中，病毒是冠状病毒。引起呼吸道感染的冠状病毒的说明性实例将是本领域的技术人员熟悉的，其说明性例子包括sars-cov-2，如先前在zhu n等人,(2019.n engl j med.2020)和在美国专利公布第20190389816号中描述的，其内容通过引用以其整体并入本文。在一种实施方案中，病毒是sars-cov-2。
[0177]
如本文所述的方法、组合物及其用途可以特别用于治疗呼吸道感染，包括患有潜在医学状况的受试者的呼吸道感染，否则该医学状况会加剧呼吸道感染。这样的潜在状况将是本领域技术人员已知的，其说明性实例包括慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化、肺气肿和肺癌。在一种实施方案中，状况选自由以下组成的组：慢性阻塞性肺病、哮喘、囊性纤维化、呼吸道感染、肺癌和上述任一项的组合。在另一种实施方案中，受试者免疫功能受损，无论是作为治疗的结果(例如，因化疗、放疗)或以其他方式(例如，因hiv感染)。在一种实施方案中，呼吸道感染是病毒感染。
[0178]
如本文使用的，术语“施用”是指通过导致化合物至少部分定位在期望部位的方法或途径将本文所述的剂放置到受试者中。本文所述的剂可以通过在受试者中产生有效治疗的任何适当的途径施用，即，施用导致将递送的组合物的至少一部分递送到受试者中的期望位置。示例性施用模式包括但不限于注射、输注、滴注或摄入。“注射”包括但不限于静脉内注射、肌内注射、动脉内注射、鞘内注射、脑室内注射、囊内注射、眶内注射、心内注射、皮内注射、腹膜内注射、经气管注射、皮下注射、表皮下注射、关节内注射、囊下注射、蛛网膜下注射、椎管内注射、脑脊髓内注射和胸骨内注射以及输注。
[0179]
术语“并行施用(administration concurrently)”或“并行施用(administering concurrently)”或“共施用(co-administering)”等是指含有两种或更多种活性物(actives)的单一组合物的施用，或各活性物同期地(contemporaneously)或同时地(simultaneously)或在足够短的时间段内顺序地作为单独组合物和/或通过各自的途径递送而施用，有效结果等同于当所有这些活性物作为单一组合物施用时获得的有效结果。“同时地(simultaneously)”意指，活性剂基本上同一时间被施用，并且合意地在同一制剂中一起被施用。“同期地(contemporaneously)”意指活性剂在时间上紧密地被施用，例如，一种
剂在另一种剂之前或之后约1分钟内至约1天内被施用。任何同期的时间都是可用的。然而，通常情况是，当不同时被施用时，剂将在约1分钟内至约8小时内，并且合适地在小于约1小时至约4小时内被施用。当被同期(comtemporaneously)施用时，剂适当地被施用在受试者的相同部位。术语“相同部位(same site)”包括确切的位置，但可以在约0.5厘米至约15厘米内，优选地在约0.5厘米至约5厘米内。如本文使用的术语“分别地(separately)”意指剂以间隔被施用，例如以约一天至几周或数月的间隔被施用。活性剂可以任一顺序被施用。如本文使用的术语“顺序地(sequentially)”意指剂按顺序被施用，例如以数分钟、数小时、数天或数周的一个或更多个间隔被施用。如果合适，活性剂可以有规律的重复周期被施用。如本文使用的，术语“状况”包括从正常状态的解剖学和生理学偏离，这构成对活体动物或其一部分的正常状态的损害，干扰或改变身体功能的表现。
[0180]
术语“减少(decrease)”、“降低(reduce)”或“抑制(inhibit)”及其语法等同物在本文中都用于通常意指减少统计上显著的量。然而，为避免疑问，术语“减少”、“降低”或“抑制”及其语法等同物意指与参考水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％，其中减少小于100％。在一种实施方案中，减少包括100％的减少(例如，与参考样品相比不存在水平)，或与参考水平相比减少10％-100％之间。
[0181]
术语“增加”、“增强”或“激活”及其语法等同物在本文都用于通常意指统计上显著的量的增加；为避免任何疑问，术语“增加”、“增强”或“激活”及其语法等同物意指与参考水平相比增加至少10％，例如增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％，或与参考水平相比多达并包括100％的增加或10％-100％之间的任何增加，或者与参考水平相比至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍或至少约10倍的增加，或2倍和10倍之间或更大的任何增加。
[0182]
措辞“治疗有效量”通常意指获得期望的响应(包括延迟被治疗的疼痛的发作或抑制被治疗的疼痛的进展或完全停止被治疗的疼痛的发作或进展)所必要的量。本领域技术人员将理解，肽的治疗有效量将取决于若干因素而变化，所述因素的说明性实例包括待治疗的受试者的健康和身体状况、待治疗的受试者的分类群、待治疗的疼痛的严重程度、待施用的组合物的制剂、施用途径以及前述中任一项的组合。
[0183]
治疗有效量通常将落在本领域技术人员可以通过常规试验确定的相对宽的范围内。用于施用至受试者的通过本文公开的方法鉴定的治疗剂的合适的治疗有效量的说明性实例包括从约0.001mg/kg的体重至约1g/kg的体重，优选地从约0.001mg/kg的体重至约50g/kg的体重，更优选地从约0.01mg/kg的体重至约1.0mg/kg的体重。在本文公开的一种实施方案中，治疗有效量是每剂量从约0.001mg/kg的体重至约1g/kg的体重(例如，0.001mg/kg的体重、0.005mg/kg的体重、0.01mg/kg的体重、0.05mg/kg的体重、0.1mg/kg的体重、0.15mg/kg的体重、0.2mg/kg的体重、0.25mg/kg的体重、0.3mg/kg的体重、0.35mg/kg的体重、0.4mg/kg的体重、0.45mg/kg的体重、0.5mg/kg的体重、0.5mg/kg的体重、0.55mg/kg的体重、0.6mg/kg的体重、0.65mg/kg的体重、0.7mg/kg的体重、0.75mg/kg的体重、0.8mg/kg的体重、0.85mg/kg的体重、0.9mg/kg的体重、0.95mg/kg的体重、1mg/kg的体重、1.5mg/kg的体重、2mg/kg的体重、2.5mg/kg的体重、3mg/kg的体重、3.5mg/kg的体重、4mg/kg的体重、4.5mg/kg的体重、5mg/kg的体重、5.5mg/kg的体重、6mg/kg的体重、6.5mg/kg的体重、7mg/kg
的体重、7.5mg/kg的体重、8mg/kg的体重、8.5mg/kg的体重、9mg/kg的体重、9.5mg/kg的体重、10mg/kg的体重、10.5mg/kg的体重、11mg/kg的体重、11.5mg/kg的体重、12mg/kg的体重、12.5mg/kg的体重、13mg/kg的体重、13.5mg/kg的体重、14mg/kg的体重、14.5mg/kg的体重、15mg/kg的体重、15.5mg/kg的体重、16mg/kg的体重、16.5mg/kg的体重、17mg/kg的体重、17.5mg/kg的体重、18mg/kg的体重、18.5mg/kg的体重、19mg/kg的体重、19.5mg/kg的体重、20mg/kg的体重、20.5mg/kg的体重、21mg/kg的体重、21.5mg/kg的体重、22mg/kg的体重、22.5mg/kg的体重、23mg/kg的体重、23.5mg/kg的体重、24mg/kg的体重、24.5mg/kg的体重、25mg/kg的体重、25.5mg/kg的体重、26mg/kg的体重、26.5mg/kg的体重、27mg/kg的体重、27.5mg/kg的体重、28mg/kg的体重、28.5mg/kg的体重、29mg/kg的体重、29.5mg/kg的体重、30mg/kg的体重、35mg/kg的体重、40mg/kg的体重、45mg/kg的体重、50mg/kg的体重、55mg/kg的体重、60mg/kg的体重、65mg/kg的体重、70mg/kg的体重、75mg/kg的体重、80mg/kg的体重、85mg/kg的体重、90mg/kg的体重、95mg/kg的体重、100mg/kg的体重、105mg/kg的体重、110mg/kg的体重等)。在一种实施方案中，治疗有效量是从约0.001mg/kg的体重至约50mg/kg的体重。在一种实施方案中，治疗有效量是从约0.01mg/kg的体重至约1.0mg/kg的体重。剂量方案可以被调整以提供最佳的治疗响应。例如，若干分开的剂量可以每天、每周、每月或以其他合适的时间间隔被施用，或剂量可以如由情况的紧迫性指示的按比例减少。
[0184]
术语“镇痛”在本文中用于描述疼痛感觉减小的状态，包括不存在疼痛感觉的状态，以及对于有毒刺激的敏感性减小或不存在对于有毒刺激的敏感性的状态。如本领域通常理解的，这样的疼痛感觉减小或不存在疼痛感觉的状态通常通过施用一种或更多种疼痛控制剂来诱导，并且在不存在意识丧失的情况下发生。用于确定化合物是否能够提供镇痛作用的合适的方法对于本领域技术人员而言将是熟悉的，所述方法的说明性实例包括使用神经性疼痛的动物模型，诸如慢性压迫性损伤(chronic constriction injury)、脊神经结扎(spinal nerve ligation)和部分坐骨神经结扎(参见bennett等人(2003)；curr.protoc.neurosci.，第9章，第9.14单元)以及伤害性疼痛的动物模型，诸如福尔马林、角叉菜胶或完全弗氏佐剂(complete freund’sadjuvant)(cfa)诱导的炎性疼痛。其他合适的疼痛的模型在gregory等人(2013,j.pain.；14(11)；“an overview of animal models of pain:disease models and outcome measures”)中讨论。
[0185]
如本文使用的，术语“受试者”是指期望治疗或预防疼痛的哺乳动物受试者。合适的受试者的说明性实例包括灵长类动物，特别是人类，伴侣动物诸如猫和狗以及类似动物，工作动物诸如马、驴以及类似动物，牲畜动物诸如绵羊、牛、山羊、猪以及类似动物，实验室测试动物诸如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠以及类似动物，以及圈养野生动物诸如动物园和野生动物园中的圈养野生动物、鹿、澳洲野狗(dingo)以及类似动物。在一种实施方案中，受试者是人类。在另一种实施方案中，受试者选自由犬科动物、猫科动物和马科动物组成的组。
[0186]
应理解，本文提及受试者并不意味着受试者患有疼痛或其症状，而是还包括处于发展疼痛或其症状的风险的受试者。在一种实施方案中，受试者患有(即，正在经历)疼痛或其症状。在另一种实施方案中，受试者在治疗时没有经历疼痛或其症状，但是处于发展疼痛或其症状的风险。在说明性实例中，受试者患有使受试者处于发展疼痛风险的疾病或状况，例如，管理不善的糖尿病，这可能导致糖尿病性神经病。在另一种实施方案中，受试者已经患有可能导致疼痛的疾病或状况，例如带状疱疹(herpes zoster)(带状疱疹(shingles))
相关神经病，其可能导致疱疹后神经痛。
[0187]
在一种实施方案中，疼痛是偏头痛。偏头痛通常以持续4-72小时之间的偶发性、复发性失能性头痛为特征，偏头痛可能伴有其他症状，诸如恶心、呕吐、声音恐惧、畏光、言语障碍和视觉先兆。偏头痛发作将通常具有四个阶段：1)预兆期，发生在头痛前数小时，并且特征为诸如疲劳、易怒、注意力难以集中、情绪变化、打哈欠、颈部僵硬、声音恐惧和/或恶心等症状；2)先兆期，伴有感觉或认知障碍的症状；3)头痛期，包括悸动性疼痛、恶心、呕吐和感觉敏感；和4)头痛后期(postdrome phase)，发生在头痛消退后数小时至数天，伴随症状诸如无力、认知困难、情绪变化和胃肠道症状。
[0188]
偏头痛可以是偶发性的(急性的)或慢性的。如国际头痛疾病分类(the international classification of headache disorders)(第3版,the international headache society,2018)定义的，当偏头痛每月发生少于15天时，被认为偶发性的，而慢性偏头痛通常被定义为在三个月的时间段里每月头痛超过15天，其中超过8天是偏头痛性的。
[0189]
应理解，本文设想的是治疗或预防偏头痛，无论原因如何。在一些实施方案中，偏头痛伴有麻木、无力和/或反射丧失。在一些实施方案中，偏头痛伴有严重和/或失能性疼痛。应理解，本文提及受试者并不意味着受试者患有偏头痛或其症状，而是还包括处于发展偏头痛或其症状的风险的受试者。在一种实施方案中，受试者患有(即，正在经历)偏头痛或其症状。在另一种实施方案中，受试者在治疗时没有经历偏头痛或其症状，但是处于发展偏头痛或其症状的风险。在一种实施方案中，受试者罹患慢性偏头痛。在另一种实施方案中，受试者罹患偶发性(急性)偏头痛。
[0190]
本文公开的治疗剂(即，能够与lancl1结合并与包含seq id no:1的环肽或其结构同源物竞争结合lancl1)可以通过任何合适的途径施用至受试者，所述合适的途径允许将肽以治疗有效量递送至受试者，如本文描述的。合适的施用途径将是本领域技术人员已知的，所述合适的施用途径的说明性实例包括肠内施用途径(例如，口服和直肠)、肠胃外施用途径，通常通过注射或微注射(microinjection)(例如，肌内、皮下、静脉内、硬膜外、关节内、腹膜内、脑池内(intracisternal)或鞘内)和表面(经皮或经粘膜)施用途径(例如，含服、舌下、阴道、鼻内或通过吸入)。本文公开的治疗剂还可以作为控制释放剂型合适地施用至受试者，以在延长的时间段内提供活性剂的控制释放。术语“控制释放”通常意指释放活性剂以在一段时间内(例如，约8小时至多达约12小时、多达约14小时、多达约16小时、多达约18小时、多达约20小时、多达一天、多达一周、多达一个月或多于一个月)在受试者中提供恒定的或大体上恒定的活性剂浓度。根据可能的需要，活性剂的控制释放可以在施用之后几分钟内开始，或在施用之后的延迟时间段(滞后时间(lag time))期满之后开始。合适的控制释放剂型对于本领域技术人员而言将是已知的，其说明性实例在anal,a.k.(2010；controlled-release dosage forms.pharmaceutical sciences encyclopedia.11:1
–
46)中描述。
[0191]
不受理论或特定的应用模式所束缚，可以合意的是基于疼痛是局部的还是广泛的(generalised)来选择施用途径。例如，在疼痛是局部的情况下，可以合意的是将剂施用至受影响的区域或与受影响的区域紧邻的区域。例如，在疼痛在关节(例如，颈、膝、肘、肩、髋等)中的情况下，剂可以被关节内地施用至受试者，进入受影响的关节中。可选或另外地，剂可以在受影响的关节处或大体上邻近受影响的关节处被施用。作为另一个说明性实例，当
疼痛在口腔中时(例如，三叉神经神经性疼痛、非典型牙痛(幻牙痛)或灼口综合征)，剂可以被配制为用于经由口腔粘膜施用(例如，通过含服施用和/或舌下施用)。相反地，在疼痛在受试者的多个解剖部位广泛或散播的情况下，为了将剂分布在受神经性疼痛影响的多个解剖部位，剂可以在任何部位被表面地、肠内地和/或肠胃外地施用。在本文公开的一种实施方案中，本文公开的剂被肠内地施用至受试者。在本文公开的一种实施方案中，本文公开的剂被口服施用至受试者。在本文公开的一种实施方案中，本文公开的剂被肠胃外地施用至受试者。在本文公开的另一种实施方案中，本文公开的剂被表面地施用至受试者。如本文别处描述的，“表面”施用通常意指将合适地呈乳膏、洗剂、泡沫、凝胶、软膏、滴鼻剂、滴眼剂、滴耳剂、经皮贴剂、经皮膜(例如，舌下膜)等形式的剂施加至身体的表面，诸如皮肤或粘膜。表面施用还涵盖通过吸入或吹入经由呼吸道的粘膜的施用。在本文公开的一种实施方案中，表面施用选自由经皮施用和经粘膜施用组成的组。在一种实施方案中，本文公开的肽被经皮地施用至受试者。
[0192]
在一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂口服施用至人类。在另一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂口服施用至非人类受试者。在又一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂口服施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类受试者。
[0193]
在一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂表面地施用至人类。在另一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂表面地施用至非人类受试者。在又一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂表面地施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类受试者。
[0194]
在本文公开的一种实施方案中，本文公开的剂作为控制释放剂型被施用至受试者，所述控制释放剂型的说明性实例在本文别处描述。在一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂作为控制释放剂型施用至人类。在另一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂作为控制释放剂型施用至非人类受试者。在又一种实施方案中，方法包括将本文公开的剂作为控制释放剂型施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类受试者。
[0195]
如本文别处所述，若干(即，多个)分开的剂量可以每天、每周、每月或以其他合适的时间间隔被施用，或剂量可以如由情况的紧迫性指示的按比例减少。在需要或另外期望多个剂量的过程的情况下，经由多于一种途径施用如本文公开的剂可以是有益的。例如，可以合意的是，肠胃外地施用第一剂量(例如，经由肌内施用途径、静脉内施用途径；皮下施用途径、硬膜外施用途径、关节内施用途径、腹膜内施用途径、脑池内施用途径或鞘内施用途径)，以在受试者中诱导迅速的镇痛作用或急性镇痛作用，随后是肠内地(例如，口服地或直肠地)和/或表面地(例如，经由经皮施用途径或经粘膜施用途径)施用的随后的(例如，第二、第三、第四、第五等)剂量，以在治疗的急性阶段后的延长时间段内提供活性剂的继续的可用性。可选地，可以合意的是肠内地(例如，口服地或直肠地)施用剂量，随后是肠胃外地(例如，经由肌内施用途径、静脉内施用途径；皮下施用途径、硬膜外施用途径、关节内施用途径、腹膜内施用途径、脑池内施用途径或鞘内施用途径)和/或表面地(例如，经由经皮施用途径或经粘膜施用途径)施用的随后的(例如，第二、第三、第四、第五等)剂量。可选地，可以合意的是表面地(例如，经由经皮施用途径或经粘膜施用途径)施用剂量，随后是肠胃外
地(例如，经由肌内施用途径、静脉内施用途径；皮下施用途径、硬膜外施用途径、关节内施用途径、腹膜内施用途径、脑池内施用途径或鞘内施用途径)和/或肠内地(例如，口服地或直肠地)施用的随后的(例如，第二、第三、第四、第五等)剂量。
[0196]
施用途径可以基于疼痛是表面的还是广泛的来合适地选择，如本文别处讨论的。可选或另外地，可以考虑诸如受试者的总体健康、年龄、体重以及特定施用途径的耐受性(或缺乏耐受性)的因素来合适地选择施用途径(例如，在存在恐针症(phobia of needle)的情况下，可以选择替代的施用途径，诸如肠内的和/或表面的)。
[0197]
还应理解，在期望多于一种施用途径的情况下，可以根据本文公开的方法使用两种或更多种施用途径的任何组合。合适的组合的说明性实例包括但不限于，(按施用顺序)，(a)肠胃外-肠内；(b)肠胃外-表面；(c)肠胃外-肠内-表面；(d)肠胃外-表面-肠内；(e)肠内-肠胃外；(f)肠内-表面；(g)肠内-表面-肠胃外；(h)肠内-肠胃外-表面；(i)表面-肠胃外；(j)表面-肠内；(k)表面-肠胃外-肠内；(l)表面-肠内-肠胃外；(m)肠胃外-肠内-表面-肠胃外；(n)肠胃外-肠内-表面-肠内；等。
[0198]
在一种实施方案中，方法包括(i)向受试者肠胃外地施用本文公开的剂，和(ii)向受试者非肠胃外地(即，肠内地或表面地)施用本文公开的剂，其中非肠胃外的(肠内的或表面的)施用在肠胃外施用之后。在一种实施方案中，肠胃外施用选自由肌内施用、皮下施用和静脉内施用组成的组。在另外的实施方案中，肠胃外施用是皮下的。在一种实施方案中，非肠胃外施用是口服的。
[0199]
在一种实施方案中，本文公开的方法包括(i)向人类受试者肠胃外地施用本文公开的剂，和(ii)向人类受试者口服施用本文公开的剂，其中口服施用在肠胃外施用之后。在一种实施方案中，肠胃外施用是皮下的。在另一种实施方案中，肠胃外施用是鞘内的。
[0200]
在一种实施方案中，本文公开的方法包括(i)向非人类受试者肠胃外地施用本文公开的剂，和(ii)向非人类受试者口服施用本文公开的肽，其中口服施用在肠胃外施用之后。
[0201]
在一种实施方案中，非人类受试者选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组。在一种实施方案中，肠胃外施用是皮下的。在另一种实施方案中，肠胃外施用是鞘内的。
[0202]
在另一种实施方案中，本文公开的方法包括(i)向人类受试者肠胃外地施用本文公开的剂，和(ii)向人类受试者表面地施用本文公开的剂，其中表面施用在肠胃外施用之后。
[0203]
在另外的实施方案中，本文公开的方法包括(i)向非人类受试者肠胃外地施用本文公开的剂，和(ii)向非人类受试者表面地施用本文公开的剂，其中表面施用在肠胃外施用之后。在一种实施方案中，非人类受试者选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组。在一种实施方案中，肠胃外施用途径是皮下的。在另一种实施方案中，表面施用途径是经皮的。在另一种实施方案中，肠胃外施用是皮下的，并且表面施用是经皮的。
[0204]
可选或另外地，本文公开的剂可以合适地作为控制释放剂型被施用。因此，在一种实施方案中，方法包括(i)向受试者肠胃外地施用本文公开的剂，和(ii)向受试者施用作为控制释放剂型的本文公开的剂，其中控制释放剂型在肠胃外施用之后被施用。在另一种实施方案中，方法包括(i)向受试者非肠胃外地(肠内地或表面地)施用本文公开的剂，和(ii)向受试者施用作为控制释放剂型的本文公开的剂，其中控制释放剂型在非肠胃外施用之后
被施用至受试者。在又一种实施方案中，方法包括(i)向受试者肠内地施用本文公开的剂，和(ii)向受试者施用作为控制释放剂型的本文公开的剂，其中控制释放剂型在肠内施用之后被施用至受试者。在又一种实施方案中，方法包括(i)向受试者表面地施用本文公开的剂，和(ii)向受试者施用作为控制释放剂型的本文公开的剂，其中控制释放剂型在表面施用之后被施用至受试者。在优选的实施方案中，控制释放剂型被配制为用于肠胃外施用。
[0205]
如本文别处所述，通过本文公开的方法鉴定的治疗剂可以合适地与一种或更多种另外的活性剂一起顺序地或组合地(例如，作为共混物)施用。本领域技术人员将理解，其他活性剂的性质将取决于待治疗或待预防的状况。例如，在受试者具有癌症的情况下，本文公开的治疗剂可以与一种或更多种化疗剂一起顺序地或组合地(例如，作为共混物)施用至受试者，化疗剂的说明性实例对于本领域技术人员而言将是熟悉的。该性质的组合治疗通过减轻通常与一些化疗剂相关的疼痛可以是有利的，所述化疗剂的说明性实例包括顺铂、卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、长春新碱、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇、izbepilone、硼替佐米(bortezomib)、沙利度胺(thalidomide)以及来那度胺。因此，在一种实施方案中，本文公开的方法还包括向受试者施用治疗有效量的化疗剂。
[0206]
本文公开的剂还可以合适地与一种或更多种能够减轻受试者的疼痛的另外的镇痛剂一起顺序地或组合地(例如，作为共混物)施用至受试者。合适的另外的镇痛剂对于本领域技术人员而言将是熟悉的，其说明性实例包括能够减轻伤害性疼痛的镇痛剂、能够减轻神经性疼痛的剂或其任何组合。因此，在一种实施方案中，本文公开的方法还包括向受试者施用治疗有效量的能够减轻受试者的疼痛的另外的镇痛剂。
[0207]
在一种实施方案中，另外的镇痛剂能够减轻受试者的伤害性疼痛。在另一种实施方案中，另外的镇痛剂能够减轻受试者的神经性疼痛。
[0208]
能够减轻伤害性疼痛的合适的剂将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例在本文别处描述并且包括阿片剂诸如吗啡、芬太尼、曲马多、可待因、二氢可待因、氢可酮、乙酰基二氢可待因、羟考酮、羟吗啡酮以及丁丙诺啡；以及非甾体抗炎药物(nsaid)，诸如阿司匹林、布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、二氟尼柳、双水杨酸酯、非那西丁、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、萘丁美酮、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、帕瑞昔布、罗美昔布、依托昔布、菲洛昔布、尼美舒利以及利克飞龙。在一种实施方案中，能够减轻伤害性疼痛的另外的镇痛剂是阿片样物质。在一种实施方案中，另外的镇痛剂是nsaid。
[0209]
在本文公开的其他实施方案中，本文公开的剂与另一种治疗或减轻神经性疼痛或引起神经性疼痛的潜在状况的疗法一起顺序地或组合地(例如，作为共混物)施用。在一些情况下，当施用是与本文公开的肽一起时，另外的镇痛剂的量可以减小。能够治疗神经性疼痛的合适的剂的说明性实例包括度洛西汀、普瑞巴林、加巴喷丁、苯妥英、褪黑激素(melatonin)、卡马西平(carbamazepine)、左卡尼汀、辣椒碱(capsaicin)、三环抗抑郁药诸如阿米替林以及钠通道阻断剂诸如利多卡因。
[0210]
本文还公开了一种用于治疗有相应需要的受试者的状况的组合物，该组合物包含与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合并与包含seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl1的剂，并且其中所述剂不是源自人类生长激素或其非人类同源物的肽，其中所述状况选自由以下组成的组：肌少症，糖耐量受损，糖尿病，肥胖症，代谢疾病和肥胖
症相关状况，神经性疼痛，骨关节炎，肌肉紊乱，消耗性紊乱，恶病质，厌食症，aids消耗性综合征，肌营养不良，神经肌肉疾病，运动神经元疾病，神经肌肉接头疾病，炎性肌病，烧伤，损伤或创伤，与ldl胆固醇升高相关的状况，与软骨细胞、蛋白聚糖或胶原产生或质量受损相关的状况，与软骨组织形成或质量受损相关的状况，与肌肉、韧带或肌腱质量、形态或功能受损相关的状况，与影响肌肉或结缔组织的炎症、创伤或遗传异常相关的状况，呼吸道状况和骨紊乱。
[0211]
本公开内容还延伸到与羊毛硫氨酸合成酶c样蛋白1(lancl1)结合并与seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl1的剂在制备用于治疗有相应需要的受试者的状况的药物中的用途，其中所述剂不是源自人类生长激素或其非人类同源物的肽，并且其中所述状况选自由以下组成的组：肌少症，糖耐量受损，糖尿病，肥胖症，代谢疾病和肥胖症相关状况，神经性疼痛，骨关节炎，肌肉紊乱，消耗性紊乱，恶病质，厌食症，aids消耗性综合征，肌营养不良，神经肌肉疾病，运动神经元疾病，神经肌肉接头疾病，炎性肌病，烧伤，损伤或创伤，与ldl胆固醇升高相关的状况，与软骨细胞、蛋白聚糖或胶原产生或质量受损相关的状况，与软骨组织形成或质量受损相关的状况，与肌肉、韧带或肌腱质量、形态或功能受损相关的状况，与影响肌肉或结缔组织的炎症、创伤或遗传异常相关的状况，呼吸道状况和骨紊乱。
[0212]
药物组合物
[0213]
本文公开的治疗剂可以被配制为用于以纯化学品(neat chemical)或化合物施用至受试者。然而，在某些实施方案中，可以优选的是将本文公开的剂配制为药物组合物，包括兽医组合物。因此，本文还公开了一种组合物，该组合物包含通过本文公开的筛选方法鉴定的剂，其中所述剂不是源自人类生长激素或源自其非人类同源物的肽。
[0214]
根据本文公开的方法鉴定的剂将适当地(i)能够与lancl1结合，和(ii)能够与seq id no:1的环肽或与其结构类似物竞争结合lancl1，其中所述剂不是源自人类生长激素或其非人类同源物的肽。
[0215]
在一种实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。在一种实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0216]
如本文使用的，术语“药学上可接受”是指在合理的医学判断范围内，适合于向受试者施用，没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的权益/风险比相称的那些化合物、剂、材料、组合物和/或剂型。
[0217]
如本文使用的，术语“药学上可接受的载体”通常意指参与将主题剂从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体的一部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、制备助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)、或溶剂封装材料。每种载体必须是“可接受的”，其含义是与制剂的其他成分相容并且对患者无害。
[0218]
药学上可接受的载体是本领域熟知的(参见例如，remington,the science and practice of pharmacy(第21版,lippincott williams and wilkins,philadelphia,pa.)和the national formulary(american pharmaceutical association,washington,d.c.))，并且包括糖(例如，乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨糖醇)、淀粉、纤维素制品、磷酸钙(例如，磷酸二钙、磷酸三钙和磷酸氢钙)、柠檬酸钠、水、水性溶液(例如，盐水、氯化钠注射液、
林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液)、醇类(例如，乙醇、丙醇和苯甲醇)、多元醇(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)、有机酯(例如，油酸乙酯和甘油三酯)、可生物降解的聚合物(例如，聚乳酸-聚乙交酯，聚(原酸酯)和聚(酸酐))、弹性体基质、脂质体、微球、油(例如，玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、棉籽油和花生油)、可可脂、蜡(例如，栓剂蜡)、石蜡、硅酮、滑石、水杨酸盐等。在本发明的药物组合物中使用的每种药学上可接受的载体在与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上必须是“可接受的”。适用于所选剂型和预期施用途径的载体是本领域熟知的，并且用于所选剂型和施用方法的可接受的载体可以使用本领域普通技术确定。
[0219]
本文公开的药物组合物还可以包含药物组合物(包括治疗性抗原结合分子制品)中常用的另外的成分和/或材料。这些成分和材料是本领域熟知的，并且包括(1)填料或填充剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(2)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和阿拉伯胶；(3)保湿剂，诸如甘油；(4)崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5)缓溶剂，诸如石蜡；(6)吸收促进剂，诸如季铵化合物；(7)润湿剂，诸如十六醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，诸如高岭土和膨润土粘土；(9)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和十二烷基硫酸钠；(10)悬浮剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和失水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶；(11)缓冲剂；(12)赋形剂，诸如乳糖、奶糖、聚乙二醇、动物脂肪和植物脂肪、油、蜡、石蜡、可可脂、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石、水杨酸盐、氧化锌、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉；(13)惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；(14)防腐剂；(15)表面活性剂；(16)分散剂；(17)控制释放剂或吸收延迟剂，诸如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、可生物降解聚合物、脂质体、微球、单硬脂酸铝、明胶和蜡；(18)乳浊剂；(19)辅料；(20)润湿剂；(21)乳化剂和悬浮剂；(22)增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和失水山梨醇脂肪酸酯；(23)推进剂，诸如氟氯烃和挥发性未被取代的烃，诸如丁烷和丙烷；(24)抗氧化剂；(25)使制剂与预期接受者的血液等渗的剂，诸如糖和氯化钠；(26)增稠剂；(27)包衣材料，诸如卵磷脂；和(28)甜味剂、调味剂、着色剂、香料和防腐剂。每种这样的成分或材料在与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上必须是“可接受的”。适用于所选剂型和预期施用途径的成分和材料是本领域熟知的，并且用于所选剂型和施用方法的可接受的成分和材料可以使用本领域普通技术确定。
[0220]
在一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于以治疗有效量施用至受试者，该治疗有效量减轻受试者的待治疗的疼痛或任何其他状况，如本文别处描述的。
[0221]
在一种实施方案中，剂被配制为用于与能够减轻受试者的疼痛的另外的镇痛剂顺序地或组合地施用。在一种实施方案中，剂被配制为用于与能够治疗受试者的状况的另外治疗剂顺序地或组合地施用，如本文所述的。在一种实施方案中，另外的镇痛剂能够减轻受试者的伤害性疼痛，所述伤害性疼痛的说明性实例在本文别处描述。在另一种实施方案中，另外的镇痛剂能够减轻受试者的神经性疼痛，所述神经性疼痛的说明性实例也在本文别处描述。在一种实施方案中，另外的镇痛剂是阿片样物质。
[0222]
本文公开的剂可以与一种或更多种其他活性剂一起顺序地或组合地(例如，作为共混物)施用，所述其他活性剂将可能取决于待治疗的状况。例如，在受试者具有癌症的情况下，本文公开的组合物可以被配制为用于与一种或更多种化疗剂一起顺序地或组合地(例如，作为共混物)施用，所述化疗剂的说明性实例对于本领域技术人员而言将是熟悉的。该性质的组合治疗通过减轻通常与一些化疗剂相关的疼痛可以是有利的，所述化疗剂的说明性实例包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、长春新碱、多西他赛、紫杉醇、izbepilone、硼替佐米、沙利度胺以及来那度胺。
[0223]
在一种实施方案中，本文公开的组合物还包含能够减轻受试者的疼痛的另外的剂。在一种实施方案中，另外的镇痛剂不是与lancl1结合的剂。
[0224]
在一种实施方案中，另外的镇痛剂能够减轻受试者的伤害性疼痛。在另一种实施方案中，另外的镇痛剂能够减轻受试者的神经性疼痛。
[0225]
能够减轻伤害性疼痛的合适的剂将是本领域技术人员熟悉的，其说明性实例在本文别处描述并且包括阿片剂诸如吗啡、芬太尼、曲马多、可待因、二氢可待因、氢可酮、乙酰基二氢可待因、羟考酮、羟吗啡酮以及丁丙诺啡；以及非甾体抗炎药物(nsaid)，诸如阿司匹林、布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、二氟尼柳、双水杨酸酯、非那西丁、非诺洛芬、酮洛芬、氟比洛芬、奥沙普秦、洛索洛芬、吲哚美辛、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、萘丁美酮、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、托芬那酸、塞来昔布、帕瑞昔布、罗美昔布、依托昔布、菲洛昔布、尼美舒利以及利克飞龙。在一种实施方案中，能够减轻伤害性疼痛的另外的镇痛剂是阿片样物质。在一种实施方案中，另外的镇痛剂是nsaid。
[0226]
在本文公开的其他实施方案中，本文公开的组合物被配制为用于与另一种治疗或减轻疼痛或引起疼痛的潜在状况的疗法一起顺序地或组合地(例如，作为共混物)施用。在一些情况下，当施用是与本文公开的肽一起时，另外的镇痛剂的量可以减少。本文别处描述了能够治疗神经性疼痛的合适的剂的说明性实例。
[0227]
在本文公开的其他实施方案中，本文公开的组合物被配制为用于与用于治疗受试者的任何其他状况的另一种治疗剂顺序地或组合地(例如，作为共混物)施用。在一些情况下，当施用是与本文公开的肽一起时，另外的治疗剂的量可以减少。
[0228]
合适的药物制剂的说明性实例包括适合于肠内施用或肠胃外施用的药物制剂，肠内施用或肠胃外施用的说明性实例在本文别处描述，包括口服、直肠、含服、舌下、阴道、鼻、表面(例如，经皮)、肌内、皮下、静脉内、硬膜外、关节内以及鞘内。在一种实施方案中，组合物被配制为用于口服施用。
[0229]
本文描述的治疗剂可以合适地被置于药物组合物的形式和其单位剂量中，以作为以下使用：用于口服使用的固体(例如，片剂或填充胶囊)或液体(例如，溶液、悬浮液、乳液、酏剂或用其填充的胶囊)，用于直肠施用的软膏、栓剂或灌肠剂的形式，用于肠胃外使用(例如，肌内施用、皮下施用、静脉内施用、硬膜外施用、关节内施用和鞘内施用)的无菌可注射溶液的形式；或用于局部(例如，表面、含服、舌下、阴道)施用的软膏、洗剂、乳膏、凝胶、贴剂、舌下条(sublingual strip)或膜等形式。在一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于表面(例如，经皮)递送。合适的经皮递送系统对于本领域技术人员而言将是熟悉的，其说明性实例由prausnitz和langer(2008；nature biotechnol.26(11):1261-1268)描述，该文献的内容通过引用并入本文。在另一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于舌下递送
或含服递送。合适的舌下递送系统和含服递送系统对于本领域技术人员而言将是熟悉的，其说明性实例包括可溶解的条或膜，如由bala等人(2013；int.j.pharm.investig.3(2):67-76)描述的，该文献的内容通过引用并入本文。
[0230]
合适的药物组合物及其单位剂型可以包含常规比例的常规成分，具有或不具有另外的活性化合物或要素，并且这样的单位剂型可以包含与待采用的预期的每日剂量范围相称的任何合适的有效量的活性成分。
[0231]
在一些实施方案中，可以合意的是，基于疼痛或其他状况是局部的还是广泛的来选择施用途径。例如，在疼痛或状况是局部的情况下，可以合意的是将本文公开的组合物配制用于施用至受影响的区域或与受影响的区域紧邻的区域。例如，在疼痛在关节(例如，颈、膝、肘、肩或髋)中的情况下，组合物可以被配制为用于关节内施用到受影响的关节中。可选或另外地，组合物可以被配制为用于在受影响的关节处或大体上邻近受影响的关节处施用。作为另一个说明性实例，当疼痛在口腔中时(例如，三叉神经神经性疼痛、非典型牙痛(幻牙痛)或灼口综合征)，组合物可以被配制为用于经由口腔粘膜施用(例如，通过含服施用和/或舌下施用)。
[0232]
相反地，在疼痛或其他状况在受试者的多个解剖部位广泛或散播的情况下，为了将活性剂分布在受疼痛或状况影响的多个解剖部位，可以方便的是将组合物配制成用于肠内施用途径、表面施用途径和/或肠胃外施用途径，如本文别处描述的。
[0233]
在一种实施方案中，组合物被配制为用于口服施用至人类。在另一种实施方案中，组合物被配制为用于口服施用至非人类受试者。在又一种实施方案中，组合物被配制为用于口服施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类受试者。
[0234]
在另一种实施方案中，组合物被配制为用于肠胃外施用至人类。在另一种实施方案中，组合物被配制为用于肠胃外施用至非人类受试者。在又一种实施方案中，组合物被配制为用于肠胃外施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类受试者。在一种实施方案中，肠胃外施用是皮下施用。
[0235]
在另一种实施方案中，组合物被配制为用于表面施用至人类。在另一种实施方案中，组合物被配制为用于表面施用至非人类受试者。在又一种实施方案中，组合物被配制为用于表面施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类受试者。在一种实施方案中，表面施用是经皮的。
[0236]
在另一种实施方案中，组合物被配制为待施用至人类的控制释放剂型。在另一种实施方案中，组合物被配制为待施用至非人类受试者的控制释放剂型。在又一种实施方案中，组合物被配制为待施用至非人类受试者的控制释放剂型，所述非人类受试者选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组。合适的控制释放剂型的说明性实例在本文别处描述。
[0237]
对于制备本文描述的组合物，药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体形式制品(preparation)的说明性实例包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂以及可分散颗粒剂。固体载体可以是一种或更多种物质，所述一种或更多种物质还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。在粉剂中，载体可以是与细分的(finely divided)活性组分混合的细分的固体。在片剂中，活性组分可以与处于适合的比例的具有必需的结合能力的载体混合并且以期望的形状和尺寸被压实。
[0238]
在一些实施方案中，粉剂和片剂包含从5％或10％至约70％的活性化合物。合适的载体的说明性实例包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂及类似物。术语“制品”意图包括活性物与包封材料的制剂，提供其中活性物(存在或不存在载体)被载体包围的胶囊。类似地，本文还设想了扁囊剂和锭剂。片剂、粉剂、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适合于口服施用的固体形式。
[0239]
为了制备栓剂，首先将低熔点蜡诸如脂肪酸甘油酯或可可脂的共混物熔融，并且将活性物如通过搅拌均匀地分散于其中。然后将熔融的均匀混合物倾入方便尺寸的模具中，允许冷却并且从而固化。
[0240]
适合于阴道施用的制剂可以作为阴道栓、止血栓、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂(除了活性成分之外还包含诸如本领域已知的适当的载体)被呈现。
[0241]
液体形式制品包括溶液、悬浮液和乳液，例如水或水-丙二醇溶液。例如，肠胃外注射液体制品可以被配制为在聚乙二醇水溶液中的溶液。
[0242]
本文公开的剂可以合适地配制为用于肠胃外施用(例如，通过注射，例如团注或连续输注)，并且可以以具有添加的防腐剂的安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或多剂量容器的单位剂型呈现。组合物可以采取在油性或水性媒介物中的诸如悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以包含配制剂诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性化合物可以呈粉剂形式，所述粉剂形式通过无菌固体的无菌分离或通过从溶液冻干获得，用于在使用之前用合适的媒介物例如无菌、无热原水构制。
[0243]
适合于口服使用的水溶液可以通过将活性物溶解在水中并且根据需要添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。适合于口服使用的水性悬浮液可以通过将细分的活性物与粘性材料分散在水中来制备，所述粘性材料诸如天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或其他熟知的悬浮剂。
[0244]
本文还设想了意图在使用之前不久转化为用于口服施用的液体形式制品的固体形式制品。这样的液体形式包括溶液、悬浮液和乳液。除了活性剂之外，这些制品还可以包含着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工甜味剂和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂以及类似物。
[0245]
对于向表皮的表面施用，本文描述的治疗剂可以被配制为软膏、乳膏或洗剂，或配制为经皮贴剂。软膏和乳膏可以例如用水性或油性基质，添加合适的增稠剂和/或胶凝剂来配制。洗剂可以用水性或油性基质配制并且通常还将包含一种或更多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。
[0246]
适合于在口中表面施用的制剂包括包含在调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)中的活性剂的锭剂；包含在惰性基质诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶中的活性成分的软锭剂(pastille)；以及包含在合适的液体载体中的活性成分的漱口水(mouthwash)。
[0247]
溶液或悬浮液通过常规手段例如用滴管、移液器或喷雾器直接施加至鼻腔。制剂可以以单剂量或多剂量形式提供。在滴管或移液器的后一种情况下，这可以通过患者施用适当的预先确定体积的溶液或悬浮液来实现。在喷雾器的情况下，这可以例如借助于计量雾化喷雾泵(metering atomising spray pump)来实现。为了改善鼻递送和保留，本发明中
使用的肽可以用环糊精包封，或者用预计增强鼻粘膜中的递送和保留的剂配制。
[0248]
向呼吸道的施用还可以借助于气雾剂制剂来实现，其中活性剂以具有合适的推进剂的加压包装提供，所述推进剂诸如氯氟烃(cfc)，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。气雾剂还可以方便地包含表面活性剂诸如卵磷脂。药物的剂量可以通过提供计量阀来控制。
[0249]
可选或另外地，治疗剂可以以干燥粉剂的形式提供，所述干燥粉剂例如化合物在合适的粉剂基质诸如乳糖、淀粉、淀粉衍生物(诸如羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮(pvp))中的粉剂混合物。方便地，粉剂载体将在鼻腔中形成凝胶。粉剂组合物可以以例如明胶的胶囊或药筒(cartridge)或粉剂可以借助于吸入器从其中被施用的泡罩包装的单位剂型呈现。
[0250]
在意图用于向呼吸道施用的制剂(包括鼻内制剂)中，剂通常将具有例如1微米至10微米或更小量级的小粒度。这样的粒度可以通过本领域已知的手段，例如通过微粉化来获得。
[0251]
当需要时，可以采用适于给予活性剂的控制释放或持续释放的制剂，如本文别处描述的。
[0252]
在一种实施方案中，如本文描述的药物制品优选地呈单位剂型。以这样的形式，制品被细分为包含适当量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制品，包装包含离散的量的制品，诸如包装于小瓶或安瓿中的片剂、胶囊和粉剂。此外，单位剂型本身可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂，或者其可以是呈包装形式的适当数目的这些中的任何单位剂型。
[0253]
本文还公开了包含如本文描述的治疗剂的组合物，该组合物用于用作药物。
[0254]
在一种实施方案中，本文公开的组合物被配制为用于口服施用至人类。在又另一种实施方案中，本文公开的组合物被配制为用于口服施用至非人类。在另外的实施方案中，本文公开的组合物被配制为用于口服施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类。
[0255]
在另一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于口服施用至人类受试者。在另一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于口服施用至非人类受试者。在又一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于口服施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类受试者。
[0256]
在另一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于表面施用至人类受试者。在又一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于表面施用至非人类受试者。在另一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于表面施用至选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组的非人类受试者。在一种实施方案中，表面施用是经皮的。
[0257]
在另一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于作为控制释放剂型施用至人类受试者。在又一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于作为控制释放剂型施用至非人类受试者。在另一种实施方案中，本文公开的剂被配制为用于作为控制释放剂型施用至非人类受试者，其中非人类受试者选自由猫科动物、犬科动物和马科动物组成的组。在一种实施方案中，控制释放剂型被配制为用于肠胃外施用。
[0258]
如本文别处所述，若干(即，多于一个)分开的剂量可以每天、每周、每月或以其他
合适的时间间隔被施用，或剂量可以如由情况的紧迫性指示的按比例减少。在需要或另外期望多个剂量的过程的情况下，本文公开的组合物可以合适地被配制为用于经由所述多种途径施用。例如，可以合意的是，肠胃外地施用第一剂量(例如，肌内、静脉内地；皮下地等)，以在受试者中诱导迅速的镇痛作用或急性镇痛作用，随后是非肠胃外地(例如，肠内地和/或表面地)施用的随后的(例如，第二、第三、第四、第五等)剂量，以在治疗的急性阶段后的延长时间段内提供活性剂的继续的可用性。因此，在一种实施方案中，如本文公开的剂和组合物被配制为用于作为第一剂量肠胃外施用至受试者(即，作为肠胃外剂型)，并且被配制为用于在第一剂量之后非肠胃外施用至受试者(例如，作为肠内剂型和/或表面剂型)。在一种实施方案中，肠胃外施用选自由肌内施用、皮下施用和静脉内施用组成的组。在另外的实施方案中，肠胃外施用是皮下的。
[0259]
在另一种实施方案中，肠内施用是口服施用。因此，在一种实施方案中，如本文公开的剂和组合物被配制为用于作为第一剂量肠胃外施用至受试者，并且被配制为用于在第一剂量之后口服施用至受试者(例如，作为口服剂型)。
[0260]
在另一种实施方案中，肠内施用是表面施用。因此，在一种实施方案中，如本文公开的剂和组合物被配制为用于作为第一剂量肠胃外施用至受试者，并且被配制为用于在第一剂量之后表面施用至受试者(例如，作为口服剂型)。在一种实施方案中，表面施用是经皮施用。
[0261]
在另一种实施方案中，可以合意的是，肠胃外地施用第一剂量(例如，肌内、静脉内地；皮下地等)，以在受试者中诱导迅速的镇痛作用或急性镇痛作用，随后是如本文别处描述的控制释放剂型的随后的(例如，第二、第三、第四、第五等)施用，以在治疗的急性阶段后的延长时间段内提供活性剂的控制释放。因此，在另一种实施方案中，如本文公开的剂和组合物被配制为用于作为第一剂量肠胃外施用至受试者，并且被配制为控制释放剂型以在第一剂量之后被施用至受试者。在一种实施方案中，控制释放剂型被配制为用于肠胃外施用。
[0262]
还可以合意的是肠内地(例如，口服地或直肠地)施用第一剂量，随后是表面地(例如，经皮地)施用的随后的(例如，第二、第三、第四、第五等)剂量。因此，在一种实施方案中，如本文公开的剂和组合物被配制为用于作为第一剂量肠内施用至受试者(即，作为肠内剂型；口服的或直肠的)，并且被配制为用于在第一剂量之后表面施用至受试者(例如，作为经皮剂型或经粘膜剂型)。在另一种实施方案中，如本文公开的剂和组合物被配制为用于表面施用，所述表面施用选自由经皮施用和经粘膜施用组成的组。在另外的实施方案中，如本文公开的肽和组合物被配制为用于经皮施用。
[0263]
在又一种实施方案中，可以合意的是将如本文公开的剂或组合物作为第一剂量肠内地(例如，口服地或直肠地)施用，随后是作为如本文别处描述的控制释放剂型的随后的(例如，第二、第三、第四、第五等)剂量。因此，在一种实施方案中，如本文公开的剂和组合物被配制为用于作为第一剂量肠内地施用，并且被配制为用于作为控制释放剂型施用，其中控制释放剂型被配制为用于在第一剂量后施用。在一种实施方案中，肠内剂量被配制为用于口服施用。在另一种实施方案中，控制释放剂型被配制为用于肠胃外施用。
[0264]
在一种实施方案中，可以合意的是将如本文公开的剂或组合物作为第一剂量表面地(例如，口服地或直肠地)施用，随后是作为如本文别处描述的控制释放剂型的随后的(例如，第二、第三、第四、第五等)剂量。因此，在一种实施方案中，如本文公开的剂和组合物被
配制为用于作为第一剂量表面施用，并且被配制为用于作为控制释放剂型施用，其中控制释放剂型被配制为用于在第一表面剂量后施用。在一种实施方案中，表面剂量被配制为用于经皮施用。在另一种实施方案中，控制释放剂型被配制为用于肠胃外施用。
[0265]
适于口服施用的本发明的药物组合物可以呈以下形式：胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉末、颗粒、水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油或油包水液体乳剂、酏剂或糖浆剂、锭剂、丸(bolus)、冲剂或糊剂。这些制剂可以通过本领域已知的方法制备，例如，通过常规的锅包衣(pan-coating)、混合、造粒或冻干工艺。
[0266]
可以制备用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣剂、粉末、颗粒等)，例如，通过将活性成分与一种或更多种药学上可接受的载体和任选地一种或更多种填料、填充剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收促进剂、润湿剂、吸附剂、润滑剂和/或着色剂混合。类似类型的固体组合物可以使用合适的赋形剂用作软硬填充明胶胶囊中的填料。片剂可通过任选地与一种或更多种辅助成分一起压制或模制来制备。压制片剂可以使用合适的粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、表面活性剂或分散剂制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模压来制备。片剂和其他固体剂型，诸如糖衣剂、胶囊、丸剂和颗粒，可以任选地刻划(score)或用包衣和外壳(诸如肠溶包衣和药物配制领域中熟知的其他包衣)制备。它们也可以被配制以提供其中活性成分的缓慢或控制释放。它们可以通过，例如，过滤通过细菌截留过滤器来灭菌。这些组合物也可以任选地含有乳浊剂并且可以是这样的组合物：该组合物仅在胃肠道的特定部分释放活性成分或优先在胃肠道的特定部分释放活性成分，任选地以延迟方式释放。活性成分也可以呈微胶囊化形式。
[0267]
本发明的用于直肠或阴道施用的药物组合物可以以栓剂提供，栓剂可以通过将一种或更多种活性成分与一种或更多种合适的无刺激性载体混合而制备，所述无刺激性载体在室温为固体，但在体温为液体，并且因此将在直肠或阴道腔中融化并释放活性化合物。本发明的适于阴道施用的药物组合物还包括含有本领域已知合适的药学上可接受的载体的子宫帽、卫生棉条、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
[0268]
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆剂和酏剂。液体剂型可以包含本领域常用的合适的惰性稀释剂。除惰性稀释剂之外，口服组合物还可以包含辅料，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、香料和防腐剂。悬浮液可以含有悬浮剂。
[0269]
本发明的适于肠胃外施用的药物组合物包含一种或更多种剂/化合物/抗原结合分子与以下的组合：一种或更多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，或者可以在使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末，其可以包含合适的抗氧化剂、缓冲剂、使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。合适的流动性可以例如通过使用包衣材料、通过在分散体的情况下维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持。这些组合物还可以包含合适的辅料，诸如润湿剂、乳化剂和分散剂。还可以合意的是包含等渗剂。此外，可注射药物形式的长期吸收可以通过包含延迟吸收的剂来实现。
[0270]
用于表面或经皮施用的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂、滴剂和吸入剂。活性剂(例如，治疗组合)可以在无菌条件下与合适的药学上可接受的载体混合。软膏、糊剂、霜剂和凝胶可以含有赋形剂。粉末和喷雾剂可以含有赋形剂和
推进剂。
[0271]
在一些情况下，为了延长药物组合物的效果，合意的是减缓其从皮下或肌内注射的吸收。这可以通过包含具有较差水溶性的结晶或无定形材料的液体悬液液来实现。
[0272]
治疗组合的个体组分的吸收率则取决于它们的溶解率，溶解率继而可以取决于晶体尺寸和晶体形式。可选地，肠胃外施用的剂或抗体的延迟吸收可以通过将活性剂或抗体溶解或悬浮于油媒介物中来实现。可注射的储库(depot)形式可以通过在可生物降解的聚合物中形成活性成分的微胶囊化基质来制备。取决于活性成分与聚合物的比率以及所使用的特定聚合物的性质，活性成分的释放速率可以被控制。储库式可注射制剂也通过将药物包封在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。可注射材料可以被灭菌，例如，通过过滤通过细菌截留过滤器灭菌。
[0273]
制剂可以在单位剂量或多剂量密封容器例如安瓿和小瓶中提供，并且可以储存于冻干条件，仅需要在临使用前添加无菌液体载体，例如注射用水。即时注射溶液和悬液可以由以上描述的类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
[0274]
提供以下的实施例仅仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
实施例
[0275]
实施例1：凝胶内荧光以鉴定环肽的分子靶
[0276]
如本文别处所述，本发明人先前已经发现，人类生长激素的包含seq id no:1的环区域的肽片段或其非人类类似物可用于治疗疼痛，包括神经性疼痛(参见wo2019/136528)。最近，这些环肽片段的结构类似物也被显示具有相同或相似的性质，包括用于治疗神经性疼痛(参见例如，wo2019/183686、美国专利申请第62/855270号和澳大利亚专利申请第2019902436号)。
[0277]
利用该信息，本发明人寻求鉴定和表征这些环肽的分子靶。
[0278]
使用配体驱动的方法，本发明人利用了来自evotec a.g.的可光激活交联pal(光激活的标记)技术，该技术将活性环肽衍生化以允许uv诱导的与结合靶的交联(本文描述为肽/seq id no:x
–
pal)。这允许随后在细胞、组织分离物的凝胶中、或在肽/靶复合物下拉中进行检测，用于通过质谱术(palms)测序。发现seq id no:12的环肽(lat9991)在与pal基团缀合(seq id no:12-pal；本文中也称为lat9991-pal)时功能稳定，并证实在脊髓切片模型上完全有活性(数据未示出)。
[0279]
凝胶内荧光方案可以简要描述如下：
[0280]
1.lancl1标记，96孔板上测定，pbs中反应体积40μl
[0281]
3μg/孔的人类重组lancl1(abcam目录号ab181923，1mg/ml；表达于大肠杆菌(e.coli)中并掺入n末端23个氨基酸的hexahis标签；uniprotkb/swiss-prot登录号:o43813)；
[0282]
mgsshhhhhhssglvprgshmgsmaqrafpnpyadynkslaegyfdaagrltpefsqrltnkirellqqmerglksadprdgtgytgwagiavlylhlydvfgdpaylqlahgyvkqslncltkrsitflcgdagplavaavlyhkmnnekqaedcitrlihlnkidphapnemlygrigyiyallfvnknfgvekipqshiqqicetiltsgenlarkrnftaksplmyewyqeyyvgaahglagiyyylmqpslqvsqgklhslvkpsvdyvcqlkfpsgnyppcigdnrdllv
hwchgapgviymliqaykvfreekylcdayqcadviwqygllkkgyglchgsagnayafltlynltqdmkylyrackfaewcleygehgcrtpdtpfslfegmagtiyfladllvptkarfpafel(seq id no:56)，体积3μl
[0283]
·
媒介物dmso
[0284]
·
±
lat8881(人类生长激素的环肽片段；seq id no:1)
[0285]
·
seq id no:1)作为竞争物，以25μm、50μm、100μm或200μm，预孵育10min，4μl的10倍浓缩的储备溶液
[0286]
·
±
lat9991-pal、lat7771-pal或lat9993-pal探针以1μm，在室温在板振荡器上(避光)孵育30min，4μl以10μm的储备溶液
[0287]
2.lancl1光标记
[0288]
·
在365nm照射20min(4℃，在含有冰的支持物上)
[0289]
·
将40μl转移到干净的eppendorf管中
[0290]
3.还原&烷基化
[0291]
·
还原：dtt 10mm，在56℃，30min
[0292]
·
烷基化：碘乙酰胺30mm，在rt click-it叠氮tamra 45min，60μl样品
[0293]
4.点击反应
[0294]
·
丙酮沉淀-20℃过夜(on)
[0295]
·
将干燥沉淀物重悬于30μl的50mm tris-hcl ph 7.5中的1％sds中
[0296]
·
使用click-it蛋白反应缓冲液试剂盒(thermofisher scientific)通过铜点击化学法用四甲基罗丹明(tamra)叠氮化物以100μm tamra叠氮化物对光标记的lancl1加标签，持续30分钟
[0297]
·
使用氯仿-甲醇法沉淀，将沉淀物在室温风干10min，重悬于30μlsds上样缓冲液(bio rad的xt样品缓冲液，含2.5％v/v 2-巯基乙醇)中，并加热(60℃，30min)
[0298]
5.对交联蛋白的基于凝胶的分析
[0299]
·
sds-page(4％-15％criteriontm tgx stain-freetm蛋白凝胶，bio rad)
[0300]
·
使用chemidoctm mp成像系统(bio rad)，用作为激发源的绿色led光和bp600/20nm发射滤光器，通过凝胶内荧光扫描进行分析
[0301]
细胞结合荧光方案可以简要描述如下。在来自用紫杉醇处理的小鼠(神经性疼痛模型)的drg神经元中可以观察到lat9991-pal的结合，但在对照未处理的小鼠中没有(图1)。使用紫杉醇在雌性c57/bl6小鼠中产生化疗诱导的外周神经病模型——在第1天、第3天和第5天静脉内(i.v.)注射50mg/kg紫杉醇或媒介物(10ml/kg体重)。在开始媒介物或紫杉醇处理后9天使用von frey(vf)丝证实了机械性痛觉超敏(左爪和右爪)。10只c57/bl6小鼠(媒介物对照和紫杉醇处理的小鼠)中的每一只通过co2吸入进行安乐死并单独解剖。
[0302]
快速解剖l5-l6 drg并放置于含有解剖培养基的培养皿中。去除脑脊膜。
[0303]
对每个drg池依次进行：
[0304]
·
在分离缓冲液(0.5mg/ml分散酶、2.5mg/ml胶原酶、6mg/ml bsa、10mm hepes)中在37℃在800转/min的温和搅拌下孵育30min；
[0305]
·
洗涤；
[0306]
·
在培养基中研磨并在40μm过滤器上过滤；
[0307]
·
重悬于补充有神经生长因子(ngf)250ng/ml的1ml培养基中。
[0308]
对来自每个池的分离的细胞计数，以4
×
104个细胞/孔的密度接种在聚-d-赖氨酸和层粘连蛋白包被的μ载玻片上，并在37℃5％co2孵育。每天更换培养基，持续3天。培养3天后，将来自每种条件(对照或紫杉醇)的drg细胞在37℃、5％co2用以下处理孵育1小时：
[0309]
·
pbs(对照)
[0310]
·
2.5μm的lat9991-pal
[0311]
·
2.5μm的lat9991-pal 50μm的竞争物lat8881
[0312]
·
2.5μm的lat9991-pal 50μm的竞争物lat9991
[0313]
·
5μm的lat9991-pal
[0314]
·
5μm的lat9991-pal 50μm的竞争物lat8881
[0315]
·
5μm的lat9991-pal 50μm的竞争物lat9991
[0316]
去除培养基，并用pbs替换。将细胞在冰上uv光照射(365(365nm)持续20min，以使lat9991-pal与靶蛋白交联。将细胞在rt用3.7％多聚甲醛(mol.probes r37602)固定15min。通过共聚焦显微术下免疫荧光揭示lat-9991-pal配体结合的定位。
[0317]
使用lat9991-pal联合共聚焦显微术以使潜在靶的位置可视化，注意到镇痛剂可以在若干部位具有活性，无论是在中枢或外周神经元上，还是在神经元附近的胶质细胞或炎性细胞上。为了鉴定lat9991-pal结合的细胞类型，从脊神经结扎引起的神经病动物获取来自神经病部位或对照部位的drg的3天细胞培养物。简言之，将雄性sprague dawley大鼠的l5和l6脊神经结扎，以创建稳健且持久的损伤后爪的机械性痛觉超敏。在脊神经结扎手术后2周(第14天)，使用von frey(vf)纤维(上下法)应用于同侧(损伤)和对侧(非损伤)爪，确认神经性疼痛的存在。将活drg细胞按先前描述分离，并与lat9991-pal一起孵育1小时，然后uv照射以将结合原位固定。对于若干次重复实验，显示了lat9991-pal仅定位于来自神经病性drg的神经元，而不定位于来自未受影响的drg(压迫模型中对侧drg或来自化疗模型中健康对照动物的drg)的神经元。作为特异性对照，lat9991-pal与神经病性drg的结合在存在过量未标记的lat9991肽的情况下被阻断。
[0318]
高倍成像显示，lat9991-pal的靶仅在神经元细胞膜内表达，并且在细胞质中具有点状染色(图2)。
[0319]
将lat9991-pal与来自神经病动物的神经的组织匀浆交联。在凝胶上分离后，揭示了鉴定出以下3个分子量范围的靶的特定的染色模式：～12-15kd、～37kd和～50kd(图3)。值得注意的是，环肽缀合物lat9993-pal和lat7771-pal也显示与来自神经病动物的神经的组织匀浆交联。
[0320]
鉴定出至少三个分子量的条带作为潜在靶的代表，切下凝胶的12-15kd、37kd和50kd区域，进行有限蛋白水解，并通过质谱术分析以从差异富集的蛋白中鉴定肽。当与(i)未交联的样品和(ii)在存在过量lat8881(seq id no:1；ylrivqcrsvegscgf)的情况下的lat9991-pal相比时，从lat9991-pal交联样品中富集的蛋白中检测到至少两种不同的肽被认为是阳性特征。还使用了lat9991-pal、lat9993-pal和lat7771-pal。lat9993(seq id no:41)具有氨基酸序列scrsrpvessc。
[0321]
通过质谱术分析从37kda条带鉴定出lancl1为候选物，并满足如上述“命中”(与lat9991-pal结合)的任意统计标准(鉴定出以下lancl1衍生的肽，加下划线和粗体)：
[0322][0323]
注意到在lat9993-pal和lat7771-pal样品中也检测到了lancl1。图4示出相比于对照未交联样品(ctl)和与过量lat8881一起孵育的样品(comp)，lat7771-pal、lat9991-pal和lat9993-pal样品的lancl1以数倍变化富集(y轴按以2为底的对数比例尺提供)。
[0324]
为了通过证实质谱术测序观察到的lancl1富集，使用下拉实验、商业的lancl1抗体(多克隆兔抗lancl1，来自invitrogen的pa557107)来鉴定神经微粒体制品中lancl1的存在。简言之，将大鼠脊髓在裂解液缓冲液(磷酸钠缓冲液5mm ph 7.4、蔗糖0.32m 蛋白酶抑制剂(来自roche的complete ultra片，小型易用装，05892970001))中裂解。以下所有步骤在冰上进行。将样品进行匀浆，并将总提取物在10000g离心持续20分钟。保留上清液，并对沉淀物再添加10ml裂解缓冲液重复裂解步骤，然后进行新的离心步骤。此步骤提取按所述进行两次，并将上清液汇集，然后使用ti50.2 beckman转子在4℃在105000g离心90分钟。将沉淀物作为微粒体级分保存在-80℃。微粒体级分的蛋白浓度为8.8mg/ml。通过与以下中的一个一起孵育将微粒体级分用三种不同的条件处理：1)dmso对照；2)5μm lat9991-pal探针；3)用50μm lat8881作为10倍过量的竞争物预处理，和lat9991-pal探针；然后uv照射以引发光交联(在365nm处20分钟)。随后，探针标记的蛋白通过探针上的脂肪族炔烃官能团与叠氮生物素探针进行点击反应，从而用生物素报告物对探针标记的蛋白选择性地加标签(根据制造商的说明书；thermo fisher click-it测定试剂盒)。取出并保留输入样品。将剩余的反应体积添加到链霉亲和素磁珠浆液反应中，以纯化生物素标记的蛋白。保留流过的级分，并将珠用50mm tris、150mm nacl ph 7.5、2m尿素洗涤两次，然后用50mm碳酸氢铵洗涤两次。然后将珠重悬于50mm碳酸氢铵中，并用于使用兔抗lancl1(invitrogen pa-57107抗体)和山羊抗兔(e bioscience ref-18881633)的蛋白印迹分析中。这些印迹随后用hrp缀合物探测，并通过增强化学发光(supersignal west dura底物，thermofisher)可视化，并用chemidoc
tm mp成像系统(bio rad)记录。用imagelab软件(bio-rad)对chemidoc
tm mp成像系统采集的图像进行分析。
[0325]
在阴性对照pbs样品、lat9991-pal样品和已经与过量lat8881一起孵育的lat9991-pal样品的输入、流过物(flow through，ft)中检测到lancl1(参见图5)。这些数据证实，lancl1在神经细胞中表达。然而，lancl1作为特异性结合的蛋白仅能在lat9991-pal样品的洗脱液中检测到，并且在存在过量lat8881的情况下，水平降低(参见图5中的cp泳道)。
[0326]
在另外的研究中，将lat9991-pal、lat7771-pal和lat9993s-pal与来自神经病动物的神经的组织匀浆交联。在凝胶上分离后，特定的染色模式再次揭示了在3个分子量范围
的靶：～12-15kd、～37kd和～50kd。lat9991-pal、lat7771-pal和lat9993s-pal各自显示与来自神经病动物的神经的组织匀浆交联。在存在过量lat8881的情况下，环肽lat9991-pal、lat7771-pal和lat9993s-pal与重组lancl1的结合被抑制(分别参见图6-图8)。
[0327]
在平行研究中，lat9991-pal与来自神经病动物的神经的组织匀浆交联，如显示3个分子量范围的特定染色模式所证明：～12-15kd、～37kd和～50kd。
[0328]
在存在过量lat8881、lat9991、lat7771和lat9993s的情况下，lat9991-pal与重组lancl1的结合被抑制(参见图9)。
[0329]
实施例2：凝胶内荧光以鉴定环肽与lancl2和lancl3的结合
[0330]
遵循凝胶内荧光方案以确定环肽是否与lancl2和lancl3结合。简言之：
[0331]
1.lancl2和lancl3标记，96孔板上测定，pbs中反应体积40μl
[0332]
·
1μg/孔的人类重组lancl2(氨基酸残基1-450；abcam目录号ab163277，～0.07mg/ml；在小麦胚芽中表达并掺入n末端gst标签；uniprot登录号：q9ns86)；
[0333]
mgetmskrlklhlggeaemeerafvnpfpdyeaaagallasgaaeetgcvrppattdepglpfhqdgkiihnfirriqtkikdllqqmeeglktadphdcsaytgwtgiallylqlyrvtcdqtyllrsldyvkrtlrnlngrrvtflcgdagplavgaviyhklrsdcesqecvtkllqlqrsvvcqesdlpdellygragylyallylnteigpgtvcesaikevvnaiiesgktlsreerktercpllyqwhrkqyvgaahgmagiyymlmqpaakvdqetltemvkpsidyvrhkkfrsgnypsslsnetdrlvhwchgapgvihmlmqaykvfkeekylkeamecsdviwqrgllrkgygichgtagngysflslyrltqdkkylyrackfaewcldygahgcripdrpyslfegmagaihflsdvlgpetsrfpafeldsskrd；seq id no:57)，体积3μl
[0334]
·
3μg/孔的人类重组lancl3(氨基酸残基1-420；abcam目录号ab163277，～0.07mg/ml；在大肠杆菌中表达并掺入n末端10xhis标签和c末端mvc标签；uniprot登录号：q6zv70)；
[0335]
mdtkrcfanrfddyqgsllagqceeavaplvtatierilqelpplgggaeargatagasacqgglyggvagvaymlyhvsqsplfatarerylrsakrlidacaraeewgepdadtraafllggagvyavatlvyhalgrsdyvqplgkfralcavcapvsflecgsdelfvgragylcaalvlkqklaqevltpaqiksicqaildsgkqyaikkrkpfplmysyygteylgaahglssilqmllsyhehlkpsdrelvwqsvdflmeqeqncnwppelgetierenelvhwchgapgiaylfakaylvskkpqyldtcircgeltwqkgllkkgpgichgvagsayvflllyrltgnskyiyraqrfaqflfteefkagsrvlesiyslyegfsgtvcflidllqpnqaefplfsvfv；seq id no:58)，体积3μl
[0336]
·
媒介物dmso
[0337]
·
±
lat8881(人类生长激素的环肽片段；seq id no:1)
[0338]
·
seq id no:1作为竞争物，以50μm、100μm或200μm，预孵育10min，4μl的10倍浓缩的储备溶液
[0339]
·
±
lat9991-pal探针以1μm，在室温在板振荡器上(避光)孵育30min，4μl以10μm的储备溶液
[0340]
2.lancl2和lancl3光标记
[0341]
·
在365nm照射20min(4℃，在含有冰的支持物上)
[0342]
·
将40μl转移到干净的eppendorf管中
[0343]
3.还原&烷基化
[0344]
·
还原：dtt 10mm，在56℃，30min
[0345]
·
烷基化：碘乙酰胺30mm，在rt click-it叠氮tamra 45min，60μl样品
[0346]
4.点击反应
[0347]
·
丙酮沉淀-20℃过夜(on)
[0348]
·
将干燥沉淀物重悬于30μl的50mm tris-hcl ph 7.5中的1％sds中
[0349]
·
使用click-it蛋白反应缓冲液试剂盒(thermofisher scientific)通过铜点击化学法用四甲基罗丹明(tamra)叠氮化物以100μm tamra叠氮化物对光标记的lancl1加标签，持续30分钟
[0350]
·
使用氯仿-甲醇法沉淀，将沉淀物在室温风干10min，重悬于30μlsds上样缓冲液(bio rad xt样品缓冲液，含2.5％v/v 2-巯基乙醇)中，并加热(60℃，30min)
[0351]
5.对交联蛋白的基于凝胶的分析
[0352]
·
sds-page(4％-15％criteriontm tgx stain-freetm蛋白凝胶，bio rad)
[0353]
·
使用chemidoctm mp成像系统(bio rad)，用作为激发源的绿色led光和bp600/20nm发射滤光器，通过凝胶内荧光扫描进行分析
[0354]
如图10和图11所示，lat9991-pal与lancl2和lancl3结合，并且所述结合被过量lat8881的存在抑制。
[0355]
实施例3：用lat9991-pal探针体外光标记6his-lancl1及lc-ms/ms分析以鉴定特异性结合位点
[0356]
a.制备标记的lancl1用于ms-分析
[0357]
将530μl pbs中的重组人类6his-lancl1蛋白(2μm，1nmol，53μg)与50μm的lat8881或dmso一起预孵育10min，并且然后在rt在nunc
tm microwell
tm 96孔板(thermo fisher scientific cat#167008)中用25μm的lat9991-pal处理30min(最终反应体积530μl)。将样品在4℃uv照射(365nm)20min。uv照射后，将样品分成含有3μg或50μg蛋白的两个不同样品。
[0358]
b.通过凝胶内荧光扫描对蛋白光标记的控制
[0359]
将蛋白样品(3μg蛋白)调整为1％sds和10mm dtt。将蛋白样品在56℃孵育1h后，在rt在黑暗中用30mm碘乙酰胺处理45min。添加预冷至-20℃的无水丙酮(9体积)，并将混浊的混合物彻底涡旋并在-20℃孵育过夜。离心(在4℃15,000x g离心10min)后，倾去上清液，并将剩余的沉淀物用-20℃丙酮洗涤。通过离心去除洗涤上清液，并将沉淀的蛋白沉淀物在rt风干10min，并重悬于30μl的50mm tris-hcl ph 7.5中的1％sds中。探针标记的lancl1使用#根据制造商的说明书通过铜点击化学法用100μm四甲基罗丹明(tamra)叠氮化物(thermo fisher scientific cat#t10182)加标签。然后使用wessel和fl
ü
gge(wessel和fl
ü
gge,1984)描述的氯仿-甲醇法沉淀蛋白，并在室温将沉淀的蛋白沉淀物风干10min。去除上清液后，将蛋白沉淀物风干并溶解于laemmli缓冲液中，在60℃加热20分钟，并通过凝胶中荧光扫描进行分析。
[0360]
c.用于ms-分析的标记的lancl1
[0361]
剩余的50μg蛋白样品用预冷至-20℃的无水丙酮(9体积)沉淀，将混浊混合物彻底涡旋并在-20℃孵育过夜。离心后，将沉淀物溶解于30μl的50mm nh4hco3中的6m尿素中，并超声处理10秒钟3次。将样品在室温用10mm dtt还原，持续60分钟，并在rt在黑暗中用30mm碘乙酰胺烷基化45min。将样品用50mm nh4hco
3 ph 8.0稀释，并且然后用最终的酶:底物比1:25(w/w)消化，该消化在37℃在温和搅拌下孵育过夜。将肽混合物(50μg)进一步酸化(1％
tfa终浓度)，并使用基于bond elut omix移液管的spe c18枪头(agilent cat#a57003100)进行净化。首先，使用100μl的50％acn预处理移液枪头，并用100μl h2o中的0.1％tfa平衡。通过分撒和抽吸样品10次并用100μl h2o中的0.1％tfa洗涤两次来加载肽混合物。洗脱用100μl的50％acn/0.1％tfa和100μl的80％acn/0.1％tfa依次进行。然后将洗脱液汇集并在真空下蒸发。在lc-ms/ms分析之前，将肽重悬于10μl的0.2％fa/5％dmso中。所得的肽随后在水浴中超声15min，并在rt混合5min。
[0362]
d.对lancl1肽的lc-ms/ms分析
[0363]
通过nanolc-ms/ms分析肽，将ultimate 3000rslc(thermo fisher scientific)与带有nanoflex源的q-exactive plus质谱仪在线耦合。分析柱(40cm长，75μm id)用reprosil-pur 120 c18-aq、1.9μm反相树脂内部装填(dr maisch gmbh cat#r119.aq)，发射器使用基于p-2000激光的微移液器拉出系统(sutter instrument)拉制。为了降低在高流速的背压和增强分离效率，将柱室保持在60℃。用溶剂a(5％dmso，0.2％fa)中的5％溶剂b(80％acn，5％dmso，0.2％fa)以400nl/min的流量将肽混合物(5μl)加载到分析柱上，并以5％至30％溶剂b的线性梯度、300nl/min的流量在103min内分离。由于加载、导入和洗涤步骤，lc-ms/ms运行的总时间为约180min。q-exactive plus使用以下设置以数据依赖采集模式运行：全扫描自动增益控制(agc)目标3
×
106，分辨率为70,000；扫描范围350-1500m/z；orbitrap全扫描最大注入时间45ms；ms2扫描agc目标3.2
×
103，分辨率为17,500；最大注入45ms；归一化碰撞能27；动态排除时间30s；分离窗2.2m/z；10ms2扫描/全扫描。
[0364]
e.ms数据处理
[0365]
用maxquant软件对原始文件进行处理用于肽和蛋白的鉴定和定量。使用以下参数利用andromeda检索引擎针对仅含有重组人类6hislancl1序列的数据库进行消化产物的ms/ms原始文件的检索：将半胱氨酸的脲甲基化设置为固定的修饰，而n末端乙酰化和甲硫氨酸氧化设置为可变修饰。要求所有的肽具有七个氨基酸的最小肽长度和最多两个漏失裂解(miss cleavage)。要求对glu-c裂解的特异性允许在谷氨酸和天冬氨酸之后裂解。质量公差分别设置为ms中4.5ppm和ms/ms中20ppm。蛋白和肽鉴定的错误发现率(fdr)设置为最大1％。为了在不同的运行间验证和传送鉴定，maxquant中的“运行间匹配”选项被启用，匹配时间窗为0.7min，并且对齐时间窗为20min。未知修饰通过maxquant中实施的“依赖性肽”设置以标准检索来鉴定(cox等人,2011；j.am.soc.mass spectrom.22:1373-1380)。该算法对源自已鉴定的肽的修饰的肽进行无偏检索。如果未鉴定的谱与已鉴定的谱匹配，则会报告理论和观察到的前体质量和匹配的序列之间的质量位移(对应于肽的修饰)。修饰的肽只有在其源自fdr为1％且质量公差为6.5mda的已鉴定的未修饰的肽时才会被鉴定。从allpeptides.txt提取修饰的肽以及未修饰的“基础肽”与修饰的肽之间的δm质量位移。所有氨基酸被认为是可能修饰的残基。对于lat9991-pal，用于检索探针修饰的肽的修饰的质量为 454.1991m/z，其是对应探针减去两个氮原子的质量，并在精氨酸氨基酸之后被胰蛋白酶/lys c酶裂解。在所有maxquant检索中，该修饰被设置为可变修饰。简言之，对于“依赖性肽”分析，加载“all.peptides.txt”文件，并过滤dp蛋白＝“sp|dlancl1|”，dp质量差＝454.1991 /-6ppm且dp评分“》60”。具有对应于光加合物的dp质量位移(具有6ppm的公差)，并且其仅在“lat9991-pal”和“lat9991-pal lat8881”两种条件中存在，而在对照“dmso”中不存在的选择的肽被认为是阳性命中。剩余的命中以手动方式进一步验证。用xcalibur软
件对ms谱进行可视化，以验证未修饰和修饰的肽的存在。理想情况下，未修饰的肽应在所有三种条件检测到，而用光加合物修饰的肽应在条件“lat9991-pal”中检测到，并且在条件“lat9991-pal lat8881”中以较小程度检测到，但在对照“dmso”中检测不到。利用maxquant的viewer程序对ms2谱进行可视化，以注释未修饰的肽的y和b离子。利用xcalibur分析感兴趣的未修饰和修饰的肽的ms2谱，以确定光加合物在序列中的位置。与y和/或b离子上的光加合物对应的质量位移是预计的。
[0366]
结果：
[0367]
在lat9991-pal条件唯一差异性地检测到的修饰的肽序列是idphapnem(ox)lygr，其中pnem序列(人类lancl1(seq id no:56)的氨基酸残基171-174)是lat9991-pal加合物最有可能定位的位点(参见图12)。
[0368]
实施例4：呼吸道上皮细胞上lancl1与lat9991f-pal结合的共定位
[0369]
a.细胞成像
[0370]
使用lat8881的光可激活类似物(lat9991f(seq id no:13)-pal)进行实验。用2.5μm的lat9991f-pal处理a549或nci-h358细胞，持续30分钟。记录荧光信号，随后通过uv交联将lat9991f-pal固定在其靶位点上，并且用绿色荧光alexa fluor 488炔烃染料通过点击化学法标记lat9991f-pal-靶复合物。对照细胞分别用媒介物二甲基亚砜(dmso)处理和用lat9991f-pal与大量过量的母体药物lat8881或其他竞争物gsh、nsc61610或aba处理，以分别评价非特异性荧光背景和染色的特异性。对于共定位实验，随后用抗lancl1或lancl2抗体和alexa 568(红色)缀合的二抗进行免疫荧光染色。收集标记有探针的细胞的图像堆叠，并使用metamorph中的measure colocalization插件或imagej中的jacop插件评价lat9991f-pal-靶复合物和lancl1或lancl2的共定位程度。
[0371]
表3-缩略语列表
[0372]
dmemdulbecco改良的eagle培养基
ꢀꢀ
dmso二甲基亚砜fbs胎牛血清lancl1谷胱甘肽s-转移酶lancl1lancl2谷胱甘肽s-转移酶lancl2nscnsc61610gshl-谷胱甘肽还原蛋白aba脱落酸pal光亲和标记pbs磷酸盐缓冲溶液pccpearson相关系数roi感兴趣区域uv紫外线
[0373]
材料和方法
[0374]
1.细胞系及培养条件
[0375]
a549或nci-h358细胞(分别为atcc ccl-185和atcc crl-5807)在含有10％热灭活
fbs(dutscher,#sv30160-036)、1％青霉素/链霉素(gibco,#15140-122)的合适培养基中培养，并在带有5％co2的加湿的37℃培养箱中维持。
[0376]
表4-细胞培养基
[0377][0378][0379]
2.测试物品(item)
[0380]
lat9991f-pal是一种光敏感化合物，对lat9991f-pal的所有操作尽可能在黑暗中进行。blat8881由lateral pharma(melbourne,australia)提供。lat9991f-pal在evotec,toulouse合成。
[0381]
表5：测试物品的特征
[0382][0383]
3.设备
[0384]-离心机1-15pk(sigma)
[0385]-直接加热co2培养箱(thermo electron)
[0386]-uvp cl-1000uv交联箱(hyland scientific)
[0387]-axiovert200m显微镜(zeiss)与csu-w1 yokogawa共聚焦单元
[0388]
4.测试物品准备
[0389]
将lat9991f-pal溶解于dmso中以制成10mm储备溶液。在培养基中分别用lat8881和lat9991f-pal的10mm储备溶液制备25μm和2.5μm的中间溶液。将每种中间溶液两倍稀释到pbs中用于细胞处理。准备其他竞争物如gsh、nsc61610和aba的10mm的储备溶液。25μm的最终浓度用于测定。
[0390]
5.组织化学染色
[0391]
将ibiditreat聚合物盖玻片(ibidi,#80826)在37℃用血清包被1小时，然后用层粘连蛋白(100μg/ml)包被(在37℃孵育1小时)，用于nci-h358细胞。
[0392]
将a549或nci-h358细胞在200μl完全培养基中以2.5
×
105个细胞/cm2接种于ibiditreat聚合物盖玻片(ibidi,#80826)上。24小时后，去除培养基，并用pbs(gibco,#10010049)洗涤细胞，并且然后用1μm紫杉醇预处理3小时或用25μm h2o2预处理2小时。用pbs洗涤细胞两次。然后在存在或不存在lat8881(25μm)或用作竞争物的其他化合物并预孵育10分钟的情况下，将诱导的应激细胞或对照细胞暴露于pbs中的lat9991f-pal(2.5μm)30分钟。处理后，用冷pbs洗涤细胞，并在pbs中uv照射(365nm)20min。在用4％多聚甲醛固定和透化(0.5％triton/pbs)(image-it
tm
固定/透化试剂盒，thermofisher,#r37602)后，在25℃使用click-it
tm
细胞反应缓冲试剂盒(thermofisher,#c10269)根据制造商的方案，用alexa fluor488炔烃(1μm)(thermofisher,#a10267)进行生物正交反应。点击反应后，将细胞用pbs洗涤两次，用pbs中的3％bsa封闭1小时，并用hoechst33342染料(thermofisher,#h1399)染色。
[0393]
对于共定位实验，将细胞进一步与小鼠抗lancl1抗体(invitrogen,pa5-57-107)(稀释度1:1000)或lancl2(atlas antibodies hpa019711)(稀释度1:1000)一起在pbs中的3％bsa中在4℃孵育过夜，用pbs洗涤两次，并且然后分别与山羊抗小鼠alexa 488(molecular probes,#a21467)(稀释度1:800)一起在pbs中的3％bsa中孵育1h。在用pbs的另外三个洗涤步骤后，将细胞包埋在ibidi封固培养基(ibidi,#50001)中。将样本保存于4℃黑暗中，直到分析。
[0394]
6.显微术与图像分析
[0395]
在axiovert200m(zeiss)显微镜上使用csu-w1 yokogawa共聚焦单元采集图像。该显微镜配有平面高度消色差x40干物镜数值孔径(na)0.95和neofluar x100油浸物镜na 1.45。用emccd像机(prior,proem1024x1024)捕获图像。为了考虑不同的实验设置(即，lat9991f-pal-靶复合物、lancl1的定量)，单独调整激光功率和曝光设置，并在整个测量中保持恒定，以允许可比性。用metamorph软件(molecular devices)采集图像。在z-堆叠图像中测量了每种荧光染料的整合强度(ii)和表面(a)。简言之，背景荧光在z-堆叠的所有切片上都被减去。然后，对于每个通道，将为dmso处理的细胞图像定义的阈值应用于分析的所有lat9991f-pal处理的细胞图像，以定量内化的荧光信号。为每个目标定义感兴趣区域(roi)，并使用metamorph软件测量ii和a。确定每种条件的ii/a比值。采用单因素anova结合dunnett多重比较检验(graphpad prism version 7.0)，以对于每种条件、带有或不带有诱导胁迫，比较lat9991f-pal处理、或lat9991f-pal lat8881处理、和lat9991f-pal 其他竞争物处理与dmso。对于共定位分析，对z-堆叠图像使用metamorph软件中的measure colocalization插件进行分析，以确定两个目标在图像的roi中遍及所有像素间的重叠百分比，或者使用imagej软件中的jacop插件(bolte和cordelieres 2006)计算pearson相关
系数(pcc)。在图像的roi中遍及所有像素间测量pcc。pcc值范围为-1至 1。如果两种探针没有共定位，则预计pcc为0。阳性pcc意味着两种探针在一定程度上共定位。对于高级3d可视化，用avizo fire 3d可视化和分析软件(fei)来处理图像。
[0396]
7.通过sirna敲低lancl
[0397]
将ibiditreat聚合物盖玻片(ibidi,#80826)在37℃用血清包被持续1小时，然后用层粘连蛋白(100μg/ml)包被(在37℃孵育1h)，用于nci-h358细胞。将a549或nci-h358细胞在200μl最终体积的完全培养基中以2.5
×
105个细胞/cm2接种于ibiditreat聚合物盖玻片(ibidi,#80826)上。使用试剂盒lipofectamine rnai-max转染试剂(thermo fisher lmrna015)转染a549或nci-h358细胞。24h后，去除培养基，用pbs洗涤细胞2次，并添加完全培养基。制备用于转染的混合溶液，将5μl的sirna对照(sicontrol)或silancl1(沉默谷胱甘肽s-转移酶lancl1)20μm储备溶液添加到125μl的optimem培养基(最终浓度100nm)中作为溶液a。si-rna来自dharmacon:on-target plus human lancl1(10314)sirna
–
smart pool(l-012166-00-0005)。
[0398]
将3μl的lipofectamine rnai max试剂溶液添加到125μl的optimem培养基中作为溶液b。将溶液a和溶液b混合，旋涡，并孵育持续20分钟。将200μl混合溶液添加到细胞上。24小时后，除去培养基，用pbs洗涤两次，并添加含有血清的完全培养基。再24小时后，去除培养基，并且处理完成。
[0399]
结果
[0400]
1.a549腺癌肺泡基底上皮细胞系
[0401]
共聚焦显微术显示了lancl1和lat9991f-pal结合在腺癌肺泡基底上皮细胞系a549中的共定位。在a549细胞中sirna敲低lancl1(silancl1 a549细胞)后，lancl1和lat9991f-pal的共定位损失。尽管通过sirna，lancl1不完全沉默，如silancl1 a549细胞胞质溶胶中内源性lancl1的微弱检测所证明(参见图13)。
[0402]
在用过氧化氢(h2o2；25μm持续2小时)或紫杉醇(1μm持续3小时)诱导氧化应激后，在silancl1 a549细胞中检测到lat9991f-pal结合，但与对照细胞(sicontrol)相比，结合水平较低。
[0403]
在存在过量的lat8881(25μm)、lat9993s(25μm)、lat7771(25μm)和谷胱甘肽(gsh；25μm)的情况下，当与对照细胞相比时，silancl1a549细胞上的lat9991f-pal结合被部分地竞争掉。相比之下，在测试的所有条件，silancl1 a549细胞上的lat9991f-pal结合被lancl2配体nsc61610强烈地竞争掉。
[0404]
2.nci-h358非小细胞肺癌细胞系
[0405]
共聚焦显微术显示lancl1和lat9991f-pal结合在非小细胞肺癌细胞系nci-h358的共定位。在nci-h358细胞中sirna敲低lancl1(silancl1 nci-h358细胞)后，lancl1和lat9991f-pal的共定位损失。尽管通过sirna，lancl1不完全沉默，如silancl1 nci-h358细胞胞质溶胶中内源性lancl1的微弱检测所证明。
[0406]
在应激后，在silancl1 nci-h358细胞中检测到lat9991f-pal结合，但与对照细胞相比，结合水平强度较低。
[0407]
在存在过量的lat8881(25μm)、lat9993s(25μm)、lat7771(25μm)和谷胱甘肽(gsh；25μm)的情况下，当与对照细胞相比时，silancl1nci-h358细胞上的lat9991f-pal结合被部
分地竞争掉。相比之下，在测试的所有条件，silancl1 nci-h358细胞上的lat9991f-pal结合被nsc61610强烈地竞争掉。
[0408]
这些数据证实，lancl1是本文公开的环肽(包括lat8881、lat9991、lat9991f、lat9993和lat7771)的推定靶。
[0409]
本文引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用以其整体并入本文。
[0410]
本文中对任何参考文献的引用不应被解释为承认这样的参考文献作为本技术的“现有技术”可用。
[0411]
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一种实施方案或特定的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，可以在所示例的特定实施方案中进行各种修改和改变，而不脱离本发明的范围。所有这样的修改和改变被意图包括于所附权利要求书的范围内。