槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及药物制备技术领域，具体涉及槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。


背景技术：

2.癌症是致死率最高的疾病之一。由于生活习惯的改变和致癌物暴露风险增加，癌症发生逐渐呈现年轻化和普遍化。与癌症相关的危险因素包括不健康的饮食、接触污染物、精神压力和炎症等。传统的放化疗会严重降低病人的生活质量，而新晋的靶向治疗费用极高，目前难以大面积推广。流行病学研究表明，摄入富含天然产物的水果和蔬菜对抑制胃癌的发展具有显著作用。与现有临床癌症药物相比，天然来源的生物活性化合物具有更好的生物安全性，对生活质量的影响较小。因此，筛选具有抗癌作用或辅助治疗作用的天然产物是十分必要的。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。槲皮素的氧甲基修饰物能够抑制肿瘤细胞增殖、抑制体内移植瘤增殖和肿瘤细胞迁移，以及诱导肿瘤细胞凋亡。
4.本发明提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。
5.本发明还提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制体内移植瘤增殖的药物中的应用。
6.本发明还提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞迁移的药物中的应用。
7.本发明还提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。
8.优选的是，所述槲皮素的氧甲基修饰物包括槲皮素-3-甲醚和/或槲皮素-3,3'-二甲醚。
9.优选的是，所述肿瘤细胞包括骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肺癌、肠癌、胶质瘤、前列腺癌或甲状腺癌的细胞。
10.本发明提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。本发明发现，在特定位点对槲皮素进行修饰后，将显著提升物质对肿瘤细胞的增殖抑制能力。如在3位和3,3'位进行甲基化后，衍生物的对肿瘤细胞增殖的半抑制浓度显著降低。槲皮素的氧甲基修饰物能够抑制肿瘤细胞增殖、抑制体内移植瘤增殖和肿瘤细胞迁移，以及诱导肿瘤细胞凋亡。试验结果表明，槲皮素-3-甲醚对所有检测的肿瘤细胞系均具有抑制作用，相较槲皮素的抑制作用提升了2.4～3.6倍；槲皮素-3,3'-二甲醚对相较槲皮素-3-甲醚的抑制作用进一步提升了4.3～14.5倍，其中对hepg2的抑制作用最强，半抑制浓度仅为
5.85mg/l。槲皮素3,3'-二甲醚对15种癌细胞具有体外增殖抑制作用，对4种正常细胞具有生物安全性；对hepg2小鼠移植瘤具有体内增殖抑制作用；对hepg2细胞的迁移能力有抑制作用；对14种细胞均有显著凋亡诱导效果。
附图说明
11.图1为本发明提供的槲皮素-3,3'-二甲醚的液相图；
12.图2为本发明提供的槲皮素-3,3'-二甲醚的质谱图；
13.图3为本发明提供的槲皮素3,3'-二甲醚对15种癌细胞和4种正常细胞的体外增殖抑制作用对比结果图；
14.图4为本发明提供的槲皮素3,3'-二甲醚对hepg2小鼠移植瘤的体内增殖抑制作用结果图，其中，a为肿瘤体积，b为肿瘤重量，c为肿瘤照片，d为小鼠体重，e为肝脏指数，f为脾脏指数，g为肾脏指数；
15.图5为本发明提供的槲皮素3,3'-二甲醚对hepg2细胞的迁移能力抑制结果图。
具体实施方式
16.本发明提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。在本发明中，所述槲皮素的氧甲基修饰物包括槲皮素-3-甲醚和/或槲皮素-3,3'-二甲醚。在本发明中，所述肿瘤细胞包括骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肺癌、肠癌、胶质瘤、前列腺癌或甲状腺癌的细胞。本发明发现，在特定位点对槲皮素进行修饰后，将显著提升物质对肿瘤细胞的增殖抑制能力。如在3位和3,3'位进行甲基化后，衍生物的对肿瘤细胞增殖的半抑制浓度显著降低。本发明对所述槲皮素、槲皮素-3-甲醚和槲皮素-3,3'-二甲醚的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可。槲皮素3,3'-二甲醚是常见黄酮醇槲皮素的衍生物，本发明发现槲皮素3,3'-二甲醚具有广泛肿瘤增殖抑制能力。槲皮素3,3'-二甲醚英文名：quercetin 3,3'-dimethyl ether，中文名：槲皮素3,3'-二甲醚，cas：4382-17-6，结构如式i所示，液相图如图1所示，质谱图如图2所示。槲皮素3,3'-二甲醚在具有显著抑制肿瘤增殖能力的同时，对正常细胞的毒性较弱，在腹腔注射时具有安全性。
[0017][0018]
本发明还提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制体内移植瘤增殖的药物中的应用。在本发明中，所述槲皮素的氧甲基修饰物包括槲皮素-3-甲醚和/或槲皮素-3,3'-二甲醚。在本发明中，所述肿瘤细胞包括骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肺癌、肠癌、胶质瘤、前列腺癌或甲状腺癌的细胞。
[0019]
本发明还提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞迁移的药物中的应用。在本发明中，所述槲皮素的氧甲基修饰物包括槲皮素-3-甲醚和/或槲皮素-3,3'-二甲
醚。在本发明中，所述肿瘤细胞包括骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肺癌、肠癌、胶质瘤、前列腺癌或甲状腺癌的细胞。
[0020]
本发明还提供了槲皮素的氧甲基修饰物在制备诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。在本发明中，所述槲皮素的氧甲基修饰物包括槲皮素-3-甲醚和/或槲皮素-3,3'-二甲醚。在本发明中，所述肿瘤细胞包括骨肉瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、肺癌、肠癌、胶质瘤、前列腺癌或甲状腺癌的细胞。
[0021]
下面结合具体实施例对本发明所述的槲皮素的氧甲基修饰物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
[0022]
实施例1
[0023]
槲皮素、槲皮素-3-甲醚和槲皮素-3,3'-二甲醚的体外细胞增殖抑制对比方法：
[0024]
骨肉瘤细胞系143b、hos、u2，肝癌细胞系hepg2，乳腺癌细胞系mda-mb-231、t47d，胃癌细胞系ags、bgc-823、sgc-7901，宫颈癌细胞hela，肺癌细胞a549，肠癌细胞caco2，小鼠胶质瘤细胞bv-2，人前列腺癌细胞pc3，人甲状腺癌bcpap，人正常肝细胞系l02，人正常胃细胞系ges，人脐静脉上皮细胞huvec和人胚肺成纤维细胞wi-38用含10％胎牛血清和1
×
hepes的dmem培养基在湿式培养箱(37℃，5％co2)中培养。细胞在对数生长期用胰蛋白酶-edta传代。将一定密度的细胞(ags、t47d、caco2、bcpap、ges、huvec每孔1
×
105细胞，hepg2、mda-mb-231、bgc-823、a549、pc3、l02每孔8
×
104细胞，143b、hos、u2、sgc-7901、hela、bv-2每孔5
×
104细胞，wi-38每孔3
×
105细胞)接种于96孔板，培养24小时后再处理。更换新鲜培养基后，在dmso溶解的培养基中加入12.5～400mg/l的槲皮素、槲皮素-3-甲醚、槲皮素3,3'-二甲醚(最终体积比为0.1％，dmso为阳性对照)。孵育48小时后，用含10％cck-8试剂的无血清培养基替换完全培养基。细胞孵育1h后检测450nm和620nm处的吸光度。每个实验独立重复三次。
[0025]
结果如表1所示：
[0026]
表1槲皮素、槲皮素-3-甲醚和槲皮素-3,3'-二甲醚的体外细胞增殖抑制对比结果
[0027]
[0028][0029]
注：“/”代表无法计算ic50值。
[0030]
由表1所示，对槲皮素进行3位和3,3'位氧甲基修饰后，对多种肿瘤细胞的增殖抑制能力大幅度提升，半抑制浓度显著下降。槲皮素仅对hepg2、mda-mb-231、ags、hela和
bcpap具有抑制效应。槲皮素-3-甲醚对所有检测的肿瘤细胞系均具有抑制作用，相较槲皮素的抑制作用提升了2.4～3.6倍。槲皮素-3,3'-二甲醚对相较槲皮素-3-甲醚的抑制作用进一步提升了4.3～14.5倍，其中对hepg2的抑制作用最强，半抑制浓度仅为5.85mg/l。
[0031]
实施例2
[0032]
槲皮素3,3'-二甲醚对15种癌细胞和4种正常细胞的体外增殖抑制作用对比
[0033]
方法：
[0034]
骨肉瘤细胞系143b、hos、u2，肝癌细胞系hepg2，乳腺癌细胞系mda-mb-231、t47d，胃癌细胞系ags、bgc-823、sgc-7901，宫颈癌细胞hela，肺癌细胞a549，肠癌细胞caco2，小鼠胶质瘤细胞bv-2，人前列腺癌细胞pc3，人甲状腺癌bcpap，人正常肝细胞系l02，人正常胃细胞系ges，人脐静脉上皮细胞huvec和人胚肺成纤维细胞wi-38用含10％胎牛血清和1
×
hepes的dmem培养基在湿式培养箱(37℃，5％co2)中培养。细胞在对数生长期用胰蛋白酶-edta传代。将一定密度的细胞(ags、t47d、caco2、bcpap、ges、huvec每孔1
×
105细胞，hepg2、mda-mb-231、bgc-823、a549、pc3、l02每孔8
×
104细胞，143b、hos、u2、sgc-7901、hela、bv-2每孔5
×
104细胞，wi-38每孔3
×
105细胞)接种于96孔板，培养24小时后再处理。更换新鲜培养基后，在dmso溶解的培养基中加入12.5～400mg/l的槲皮素3,3'-二甲醚(最终体积比为0.1％，dmso为阳性对照)。孵育48小时后，用含10％cck-8试剂的无血清培养基替换完全培养基。细胞孵育1h后检测450nm和620nm处的吸光度。每个实验独立重复三次。
[0035]
结果如图3所示，槲皮素3,3'-二甲醚对多种癌细胞表现出了广谱抑制能力，对骨肉瘤细胞的半抑制浓度为143b：21.62mg/l，hos：18.60mg/l，u2：49.47mg/l；对肝癌细胞hepg2细胞的半抑制浓度为5.85mg/l，对乳腺癌细胞的半抑制浓度为mda-mb-231：11.39mg/l，t47d：13.33mg/l，对胃癌细胞的半抑制浓度为sgc7901：28.38mg/l，bgc823：26.07mg/l，ags：15.83mg/l，对宫颈癌hela细胞的半抑制浓度为11.13mg/l，对肺癌细胞a549的半抑制浓度为17.38mg/l，对肠癌细胞caco2的半抑制浓度为21.39mg/l，对小鼠胶质瘤bv2的半抑制浓度为21.12mg/l，对人前列腺癌细胞pc3的半抑制浓度为31.29mg/l，对人甲状腺癌bcpap的半抑制浓度为12.30mg/l。
[0036]
同时本发明发现，槲皮素3,3'-二甲醚对人正常肝细胞l02、人正常胃细胞ges、人脐静脉上皮细胞huvec和人胚肺成纤维细胞wi-38的半抑制浓度均在100mg/l以上，表明槲皮素3,3'-二甲醚对癌细胞具有选择性增殖抑制作用，同时对正常细胞表现出了低毒性。
[0037]
实施例3
[0038]
槲皮素3,3'-二甲醚对hepg2小鼠移植瘤的体内增殖抑制作用
[0039]
方法：
[0040]
balb/c裸鼠(5-6周龄)，体重19～22g，购于中国科学院上海实验动物中心。将hepg2细胞收集在无血清dmem培养基中制成细胞悬液，然后将细胞悬液注射到每只小鼠腋下区域，大约2.0
×
106个细胞，每只小鼠一个位点。所有小鼠均在浙江大学实验动物中心饲养，在23～25℃环境下，湿度50％～60％，光照12小时/黑暗12小时循环。肿瘤形成后，将小鼠随机分成3组，每组7只。模型组，腹腔注射给药生理盐水；阳性药物组，腹腔注射给药替吉奥10mg/kg bw
·
d；处理组，腹腔注射槲皮素3,3'-二甲醚50mg/kg bw
·
d。根据肿瘤体积变化，待肿瘤成型后，每隔1～2天，腹腔注射，并测量肿瘤体积，称量小鼠体重，待不同处理组间肿瘤体积产生显著差异时，颈椎脱臼处死小鼠，仔细剥下瘤组织，称重，计算：成瘤率(％)
＝(处理组成瘤小鼠个数/接瘤组成瘤小鼠个数)
×
100；肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重g-给药组平均瘤重g)/对照组平均瘤重g
×
100。收集血清、肝脏、脾脏、肾脏，称重。
[0041]
结果如图4所示。根据图4中的a可知，自首次给药至24天，共注射10次，与对照组相比，在第24天时，肿瘤体积显著降低，对照组为443.20
±
123.27mm3，而注射槲皮素3,3'-二甲醚组肿瘤体积为284.19
±
85.47mm3。如图4中的b，将肿瘤玻璃后称重发现，对照组肿瘤重量为407.00
±
134.91mg，而注射槲皮素3,3'-二甲醚组肿瘤重量为194.57
±
75.45mg，比对照组相比降低52.19％，且具有显著性。图4中的c为对照组和处理组的肿瘤照片。以上结果说明槲皮素3,3'-二甲醚具有hepg2体内移植瘤的增殖抑制效果。
[0042]
同时，槲皮素3,3'-二甲醚表现出了生物安全性。如图4中的d所示，对照组和处理组的体重无显著差异，而阳性药物组小鼠在第12天体重极显著下降，且全部死亡。肝脏指数(图4中的e)、脾脏指数(图4中的f)和肾脏指数(图4中的g)均显示，槲皮素3,3'-二甲醚与对照组没有显著差异。以上结果说明槲皮素3,3'-二甲醚具有生物安全性。
[0043]
实施例4
[0044]
槲皮素3,3'-二甲醚对hepg2细胞的迁移能力抑制
[0045]
方法：
[0046]
将细胞密度为5
×
105个/ml的hepg2细胞铺于6孔板(每孔1ml)上，加入含10％胎牛血清的dmem培养基，培养过夜，使形成单层细胞。用200ul移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用pbs清洗3次，加入含10％胎牛血清的dmem培养基，然后加入1mg/l的槲皮素3,3'-二甲醚溶液，以dmso为溶剂对照，孵育24h。
[0047]
结果如图5所示。根据图5可知，对照组与处理组划痕时的细胞间隙举例相同，孵育1天后，处理组的细胞间隙显著高于对照组的细胞间隙。说明槲皮素3,3'-二甲醚具有抑制hepg2细胞迁移能力的效果。。
[0048]
实施例5
[0049]
槲皮素3,3'-二甲醚对肿瘤细胞的迁移能力抑制作用
[0050]
方法：
[0051]
将一定密度的细胞(ags、t47d、caco2、bcpap、ges、huvec每ml 6
×
105个细胞，hepg2、mda-mb-231、bgc-823、a549、pc3、l02每ml 5
×
105个细胞，143b、hos、u2、sgc-7901、hela、bv-2每ml 3
×
105个细胞，wi-38每ml 1.8
×
106个细胞)铺于6孔板(每孔1ml)上，加入含10％胎牛血清的dmem培养基，培养过夜，使形成单层细胞。用200ul移液枪枪头在单层细胞上呈“一”字划痕，用pbs清洗3次，加入含10％胎牛血清的dmem培养基，然后加入对应剂量的槲皮素3,3'-二甲醚(骨肉瘤细胞的剂量为143b：4mg/l，hos：4mg/l，u2：10mg/l；乳腺癌细胞的剂量为mda-mb-231：2mg/l，t47d：3mg/l，胃癌细胞的剂量为sgc7901：6mg/l，bgc823：5mg/l，ags：3mg/l，宫颈癌hela细胞的剂量为2mg/l，肺癌细胞a549的剂量为3mg/l，肠癌细胞caco2的剂量为4mg/l，小鼠胶质瘤bv2的剂量为4mg/l，人前列腺癌细胞pc3的剂量浓度为6mg/l，人甲状腺癌bcpap的剂量为2mg/l)溶液，以dmso为溶剂对照，孵育24h。于显微镜下测量划痕时宽度和测量时宽度，计算划痕闭合比例，划痕比例比例＝(划痕时宽度－测量时宽度)/划痕时宽度
×
100％。划痕抑制比例＝(对照组划痕闭合比例-处理组划痕闭合比例)/对照组划痕闭合比例
×
100％。
[0052]
结果如表2所示，槲皮素3,3'-二甲醚对14种细胞的划痕闭合均有显著抑制能力。
对骨肉瘤细胞划痕闭合的抑制比例为143b：54.34％，hos：57.60％，u2：70.46％；乳腺癌细胞的抑制比例为mda-mb-231：81.98％，t47d：64.12％，胃癌细胞的抑制比例为sgc7901：72.02％，bgc823：73.67％，ags：60.91％，宫颈癌hela细胞的抑制比例为53.97％，肺癌细胞a549的抑制比例为69.61％，肠癌细胞caco2的抑制比例为66.64％，小鼠胶质瘤bv2的抑制比例为75.22％，人前列腺癌细胞pc3的抑制比例为70.92％，人甲状腺癌bcpap的抑制比例为64.66％。槲皮素3,3'-二甲醚处理具有抑制具有抑制多种肿瘤细胞迁移能力的效果。
[0053]
表2槲皮素3,3'-二甲醚处理对划痕闭合比例的影响
[0054][0055][0056]
实施例6
[0057]
槲皮素3,3'-二甲醚对肿瘤细胞的凋亡促进作用
[0058]
方法：
[0059]
胰蛋白酶消化对数期生长的肿瘤细胞，终止后离心收集，制成悬液，进行细胞计数并调整至一定浓度(ags、t47d、caco2、bcpap、ges、huvec每ml 6
×
105个细胞，hepg2、mda-mb-231、bgc-823、a549、pc3、l02每ml 5
×
105个细胞，143b、hos、u2、sgc-7901、hela、bv-2每ml 3
×
105个细胞，wi-38每ml 1.8
×
106个细胞)，将一定浓度细胞按每孔1ml的浓度转移至6孔板内。置于细胞培养箱中培养12h使细胞贴壁。加入对应剂量的槲皮素3,3'-二甲醚(骨肉瘤细胞的剂量为143b：4mg/l，hos：4mg/l，u2：10mg/l；乳腺癌细胞的剂量为mda-mb-231：
2mg/l，t47d：3mg/l，胃癌细胞的剂量为sgc7901：6mg/l，bgc823：5mg/l，ags：3mg/l，宫颈癌hela细胞的剂量为2mg/l，肺癌细胞a549的剂量为3mg/l，肠癌细胞caco2的剂量为4mg/l，小鼠胶质瘤bv2的剂量为4mg/l，人前列腺癌细胞pc3的剂量浓度为6mg/l，人甲状腺癌bcpap的剂量为2mg/l)溶液。以dmso为溶剂对照，孵育24h。作用24h后，300g，4℃离心5min收集细胞，弃去上清液，用预冷的pbs洗细胞两次，每次均在300g，4℃离心5min。收集1～5
×
105细胞。加入100μl 1
×
binding buffer重悬细胞。加入5μlannexinv-fitc和5μl pi，轻轻混匀。避光条件下室温反应10min。加入400μl 1
×
binding buffer，混匀，样品在1h内用流式细胞仪检测。按照流式细胞仪标准检测程序进行分析，激发波长为488nm，计数2万个细胞，结果用细胞周期拟合软件modfit分析。分析时，使用fl2-w和fl2-a显示，去除联体细胞。
[0060]
结果如表3所示，槲皮素3,3'-二甲醚对15种细胞的均有显著凋亡诱导效果。
[0061]
表3凋亡比例
[0062][0063]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。