橙皮苷在制备预防和/或治疗新型冠状病毒奥密克戎变异株感染的药物中的用途

1.本技术涉及医药技术领域，特别是涉及橙皮苷在制备预防和/或治疗sars-cov-2(新型冠状病毒)omicron(奥密克戎)变异株感染的药物中的用途。


背景技术：

2.奥密克戎(omicron，编号：b.1.1.529)是新型冠状病毒(sars-cov-2，简称新冠病毒)的变异株，omicron感染者症状相对轻，临床表现主要为轻度上呼吸道症状，包括咽喉干/痛/痒、咳嗽、乏力等。鉴于人体感染omicron变异株后的主要临床表现早期很难与急性上呼吸道感染、流行性感冒等多种常见呼吸道疾病鉴别，容易造成漏诊，增加了疫情防控的难度。同时，omicron变异株出现免疫逃逸，使新冠疫苗有效性下降，感染风险增加，这对全球新型冠状病毒肺炎疫情防控提出了新的挑战。
3.sars-cov-2可以通过刺突糖蛋白(spike glycoprotein，s蛋白)与呼吸系统血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ace2)结合感染细胞，sars-cov-2表面的s蛋白是病毒识别靶细胞上相应受体的关键蛋白，其与人细胞表面的ace2有效结合，导致新型冠状病毒肺炎(covid-19，简称新冠肺炎)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ards)，部分患者病情在短期内发生急剧变化，并出现多脏器衰竭甚至死亡。sars-cov-2的s蛋白分为s1和s2两个亚基，s1亚基包括n端结构域(ntd)和c端结构域(ctd)，其中ctd具有受体识别与结合的功能，也称为受体结合结构域(rbd)；ace2是一种肽酶，属于ⅰ型跨膜蛋白，在肺组织中主要分布于ⅱ型肺泡细胞，少量分布于ⅰ型肺泡细胞、气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞；s1亚基上的rbd结构域负责与宿主细胞上的ace2结合，进一步与宿主的细胞膜融合从而感染人体。因此阻断s蛋白与ace2的结合成为了治疗covid-19的重点方向之一，通过阻断或竞争性抑制s蛋白和ace2的结合从而达到阻止病毒感染人体的目的。新型冠状病毒omicron变异株与其他关切变异株相比，在s蛋白上有了32个突变点，其中一些突变会增强与ace2受体的结合力和免疫逃逸。在刺突蛋白突变后，新型冠状病毒就更易附着在人体细胞上，最终导致人类感染新型冠状病毒，给疫情防治防控带来巨大挑战。
4.橙皮苷别名川陈皮素、桔皮苷、柚苷，是中药陈皮的主要活性成分之一，主要存在于芸香科柑橘属植物果实中。橙皮苷为维生素p类药，用于增强毛细血管的韧性。临床上用于心血管系统疾病的辅助治疗，是成药“脉通”的主要组成之一。药理学方面，目前针对橙皮苷的药理作用主要集中在抗氧化、抑制炎症方面。橙皮苷的抗新型冠状病毒omicron变异株的作用尚未见报道。


技术实现要素：

5.本技术的发明人通过深入研究，发现橙皮苷能够抑制新型冠状病毒omicron变异株s蛋白和ace2结合，从而可以用来预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染，进而
用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物。
6.本技术第一方面提供了橙皮苷在制备预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物中的用途。
7.在本技术的一些实施方式中，所述新型冠状病毒omicron变异株感染包括由新型冠状病毒omicron变异株感染引起的肺炎和急性呼吸窘迫综合征中的至少一种。
8.在本技术的一些实施方式中，所述橙皮苷通过抑制新型冠状病毒omicron变异株的s蛋白和宿主ace2结合，预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染。
9.本技术第二方面提供了一种用于预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物组合物，其包含橙皮苷。
10.在本技术的一些实施方式中，所述橙皮苷是以单体的形式提供，或以包含其的植物提取物的形式提供。
11.在本技术的一些实施方式中，所述植物提取物选自麻黄提取物、陈皮提取物、佛手提取物、枸橼提取物、酸橙提取物、甜橙提取物或柠檬提取物中的至少一种。
12.在本技术的一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
13.在本技术的一些实施方式中，所述药学上可接受的载体或赋形剂选自溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂或抗氧化剂中的至少一种。
14.在本技术的一些实施方式中，所述药物组合物配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。
15.橙皮苷能够抑制新型冠状病毒omicron变异株的s蛋白和ace2结合，从而能够用于预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染，进而用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物。进一步地，包含橙皮苷的药物组合物，同样能够用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物。
16.当然，实施本技术的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
17.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
18.图1a为不同浓度橙皮苷对新型冠状病毒omicron变异株的s蛋白与ace2受体结合的抑制率结果图；
19.图1b为橙皮苷抑制新型冠状病毒omicron变异株的s蛋白与ace2受体结合的抑制率曲线图；
20.图2为橙皮苷与新型冠状病毒omicron变异株s蛋白的亲和力作用的表面等离子共振(spr)传感图谱；其中，a-e分别代表浓度为20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm的橙皮苷的单
体溶液；
21.图3为橙皮苷与ace2受体的亲和力作用的spr传感图谱；其中，a-e分别代表浓度为20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm的橙皮苷的单体溶液；
22.图4a为橙皮苷抑制omicron假病毒感染opti-hek293/ace2细胞的荧光素酶活性结果图；
23.图4b为橙皮苷抑制omicron假病毒感染opti-hek293/ace2细胞的抑制率曲线图。
具体实施方式
24.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员基于本技术所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
25.本技术的第一方面提供了橙皮苷在制备预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物中的用途。
26.申请人在研究中发现，橙皮苷能抑制新型冠状病毒omicron变异株的s蛋白和宿主ace2结合，从而能够预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染，进而可以用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物。
27.本技术中，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本技术中特别地是指对已经罹患新型冠状病毒omicron变异株感染的哺乳动物个体(优选为人)采用本技术的药物进行处理，以期望对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本技术使用的术语“预防”具有其一般含义，并且在本技术中特别地是指对可能罹患新型冠状病毒omicron变异株感染或者对新型冠状病毒omicron变异株感染具有罹患风险的哺乳动物个体采用本技术的药物进行处理，以期望对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。
28.在本技术的一些实施方式中，所述新型冠状病毒omicron变异株感染包括由新型冠状病毒omicron变异株感染引起的肺炎和急性呼吸窘迫综合征中的至少一种。
29.在本技术的一些实施方式中，所述橙皮苷通过抑制新型冠状病毒omicron变异株的s蛋白和宿主ace2结合，预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染。
30.本技术的第二方面提供了一种用于预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物组合物，其包含橙皮苷。
31.在本技术的一些实施方式中，所述橙皮苷是以单体的形式提供，或以包含其的植物提取物的形式提供。
32.在本技术的一些实施方式中，所述植物提取物选自麻黄提取物、陈皮提取物、佛手提取物、枸橼提取物、酸橙提取物、甜橙提取物或柠檬提取物中的至少一种。
33.本技术对麻黄提取物、陈皮提取物、佛手提取物、枸橼提取物、酸橙提取物、甜橙提取物或柠檬提取物的提取方式没有特别限制，本领域技术人员可以通过现有技术提取。
34.在一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
35.在本技术中，“药学上可接受的”表示以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。
36.本技术药物组合物中可用的“药学上可接受的载体或赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的载体或赋形剂包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。
37.如本技术使用的术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本技术的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本技术的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体或赋形剂混合，然后形成所需的剂型，来制备本技术的药物组合物。根据本技术的药物组合物，其为可以适用于口服给药的药物制剂、适用于胃肠外注射(例如静脉注射、皮下注射)的药物制剂(例如溶液剂)、适用于表面给药的药物制剂(例如软膏剂、贴剂或乳膏剂)或适用于直肠给药的药物制剂(例如栓剂)等。用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、滴丸剂、硬胶囊剂或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、酊剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。
38.本技术药物组合物以橙皮苷的药学可接受的剂量，即施用剂量，可以根据待治疗对象的年龄、性别和体重、待治疗的具体疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、施用途径和诊断者的判断而改变。考虑这些因素确定施用剂量在本领域技术人员的水平范围内。一般的剂量可以是0.01-1000mg/kg/日，具体地1-100mg/kg/日。然而，本技术的范围不以任何方式受限于所述施用剂量。
39.以下结合具体实施例对本技术进行详细说明。
40.橙皮苷信息
41.橙皮苷(hesperidin，cas号：520-26-3，来源：麻黄)购自上海源叶生物科技有限公司，结构式如下：
[0042][0043]
下述实施例中所用实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。
[0044]
实验试剂
[0045]
实验所用试剂及耗材见表1。
[0046]
表1实验试剂及耗材
[0047][0048]
实验仪器
[0049]
实验所用仪器见表2。
[0050]
表2实验所用仪器
[0051][0052][0053]
实施例1
[0054]
采用sars-cov-2(b.1.1.529)中和性抗体试剂盒进行新型冠状病毒omicron变异株s蛋白与ace2受体结合实验。
[0055]
(1)单体成分的溶解：用二甲基亚砜(dmso)溶解橙皮苷并配成浓度为5mm、2.5mm、1.25mm、0.625mm、0.3125mm的单体溶液；
[0056]
(2)将sars-cov-2(b.1.1.529)中和性抗体检测试剂盒恢复至室温；
[0057]
(3)在酶标板对应孔中添加准备好的单体溶液、试剂盒内的阴性对照和阳性对照，然后分别按照1:1体积加入hrp(辣根过氧化物)-rbd工作液，分别得到各单体给药组、阴性对照组和阳性对照组，用盖板膜盖板，37℃孵育1小时；
[0058]
(4)取下盖板膜，并用300μl 1
×
洗液洗板4次；
[0059]
(5)每孔中加入100μl底物溶液，在37℃避光孵育20分钟；
[0060]
(6)每孔中添加50μl终止液终止反应；
[0061]
(7)终止后立即用酶标仪在450nm处测量吸光值。
[0062]
根据吸光值，通过公式：抑制率＝1-单体给药组的吸光度值/阴性对照组的吸光值
×
100％，计算得到橙皮苷对新型冠状病毒omicron变异株s蛋白与ace2受体结合的抑制率；其中，不同浓度的橙皮苷对新型冠状病毒omicron变异株s蛋白与ace2受体结合的抑制率结果如图1a所示；以lg(橙皮苷的浓度(mm))为横坐标，抑制率为纵坐标，得到抑制率曲线结果如图1b所示；图1a和图1b结果显示橙皮苷可以通过浓度依赖的方式抑制新型冠状病毒omicron变异株s蛋白与ace2受体的结合作用，其中5mm时的抑制率为61.07％；进一步计算半抑制浓度(ic
50
)数值，结果显示橙皮苷的ic
50
值为3.837mm。结果表明，橙皮苷以浓度依赖的方式抑制新型冠状病毒omicron变异株s蛋白与ace2受体的结合，橙皮苷抑制s蛋白与ace2受体结合的ic
50
值为3.837mm。
[0063]
实施例2
[0064]
采用氨基偶联试剂盒在biacoret200分析系统中进行spr实验。
[0065]
(1)新型冠状病毒omicron变异株s蛋白、ace2蛋白在spr传感器上的偶联：omicron变异株s蛋白、ace2蛋白用浓度为10mm醋酸钠溶液(ph＝5.0)稀释至终浓度为1mg/ml，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基-碳化二亚胺/n-羟基琥珀酰亚胺(edc/nhs)交联反应偶联至检测通道，用乙醇胺对cm5传感芯片上未反应的活性位点进行封闭；
[0066]
(2)橙皮苷与偶联蛋白的结合：用运行缓冲液(含5vol％dmso的pbs-p 1
×
)将橙皮苷配制成浓度为1.25μm、2.5μm、5μm、10μm、20μm的工作液，在30μl/min流速下注射120s工作液结合cm5传感芯片，随后解离180s；
[0067]
(3)传感图谱的分析：通过biacore仪器配带处理软件bia evalution software进行数据处理，应用稳态模型steady state进行分析，拟合计算各参数值，获得小分子与蛋白结合与解离反应信息。结果如图2-图3所示，图2为橙皮苷与新型冠状病毒omicron变异株s蛋白的亲和力作用的spr传感图谱；其中，a-e分别代表浓度为20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm的橙皮苷的单体溶液；图3为橙皮苷与ace2受体的亲和力作用的spr传感图谱；其中，a-e分别代表浓度为20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm的橙皮苷的单体溶液。
[0068]
图2结果显示橙皮苷可以通过浓度依赖的方式与新型冠状病毒omicron变异株s蛋白结合，显示平衡解离常数值为13.49μm；图3结果显示橙皮苷可以通过浓度依赖的方式与ace2蛋白的结合，显示平衡解离常数值为10.78μm。上述结果表明橙皮苷可以直接与新型冠状病毒omicron变异株s蛋白以及受体ace2的结合。
[0069]
实施例3
[0070]
采用sars-cov-2(b.1.1.529)假病毒中和检测试剂盒进行新型冠状病毒omicron变异株假病毒感染细胞实验。
[0071]
(1)单体溶液的配制：用dmso溶解橙皮苷并用opti-mem培养基配成浓度为1.25μm、2.5μm、5μm、10μm、20μm、40μm的单体溶液；
[0072]
(2)阳性抗体的配制：取20μl 1mg/ml的阳性抗体加入180μl opti-mem培养基配成100μg/ml的阳性抗体溶液；
[0073]
(3)将假病毒从液氮取出，置于37℃水浴快速复融，将1ml假病毒加到含有1500μlopti-mem的15ml离心管中混匀，得到假病毒溶液；
[0074]
(4)各单体给药组中，分别加入各浓度的单体溶液25μl/孔；阳性对照组中，加入阳性抗体溶液25μl/孔；阴性对照组、空白对照组分别加入25μl opti-mem培养基；单体给药组、阳性对照组、阴性对照组分别加入25μl/孔的假病毒溶液，空白对照孔加入25μl opti-mem培养基，室温孵育1小时；
[0075]
(5)从液氮中取出opti-hek293/ace2细胞(即过表达ace2的hek293细胞)，置于37℃水浴中快速复融细胞；
[0076]
(6)将复融后的细胞转移至15ml离心管，加入4ml预热的dmem完全培养基后，100
×
g，离心5分钟，弃上清；
[0077]
(7)用4ml预热的dmem完全培养基重悬细胞，充分混匀后细胞计数并调整细胞悬液的密度到600,000个细胞/ml；
[0078]
(8)待步骤(4)孵育结束后，每孔加入50μl细胞悬液；96孔板边缘孔用pbs封闭后，将96孔板放入细胞培养箱中；
[0079]
(9)24小时后每孔加入50μl预热的新鲜dmem完全培养基，继续放入培养箱中培养24小时；
[0080]
(10)用微孔板封底膜将白色壁、透明底的96孔细胞培养微孔板封底；小心吸弃96孔板的培养基，立即加入50μl新配的荧光素酶显色液，室温孵育3-5分钟；
[0081]
(11)酶标仪读取读数，即为荧光素酶活性结果。
[0082]
运用软件graphpad prism 8.0.1和excel对所得数据进行统计学分析，所有值均以均数
±
sd表示，统计学比较采用配对t检验，单因素方差分析(anova)。p＜0.05为具有显著性。
[0083]
统计各组荧光素酶活性，其结果如图4a所示，与阴性对照组相比，橙皮苷(如20μm给药组)能够降低过表达ace2后opti-hek293细胞的荧光素酶活性，说明橙皮苷可以有效阻止假病毒进入细胞(n＝3***p﹤0.01，与阴性对照组相比)；根据读取的信号值，通过公式：抑制率＝1-(单体给药组信号值-空白对照组信号值)/(阴性对照组信号值-空白对照组信号值)
×
100％，计算得到橙皮苷对假病毒感染细胞的抑制率，以lg(橙皮苷的浓度(μm))为横坐标，以橙皮苷对假病毒感染细胞的抑制率为纵坐标作图，得到抑制率曲线结果如图4b所示，进一步计算ic
50
数值，结果显示ic
50
值为39.04μm。结果表明，橙皮苷可以抑制含有新型冠状病毒omicron变异株s蛋白的假病毒感染opti-hek293/ace2细胞，橙皮苷抑制假病毒感染opti-hek293/ace2细胞的ic
50
值为39.04μm。
[0084]
综上，橙皮苷能够抑制新型冠状病毒omicron变异株s蛋白和ace2结合，抑制含有新型冠状病毒omicron变异株s蛋白的假病毒感染细胞，由此说明本技术的橙皮苷能够抑制新型冠状病毒omicron变异株的s蛋白与宿主ace2结合，从而能够用于预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染，进而用于制备预防和/或治疗新型冠状病毒omicron变异株感染的药物。
[0085]
以上所述仅为本技术的较佳实施例，并非用于限定本技术的保护范围。凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本技术的保护范围内。