一种干细胞外泌体生发因子的制备方法与流程

1.本发明涉及生发技术领域，具体为一种干细胞外泌体生发因子的制备方法。


背景技术：

2.随着社会压力的不断增加，脱发的现象越来越多，一般对于脱发的解释具有多种理由，但归根结底，最终都导致毛囊的萎缩与退化，使得萎缩退化的毛囊不参与机体循环，无法吸收养分，最终便导致了毛发不再自然生长。研究发现，脱发区域的毛囊干细胞数量上没有损失，只是相比正常人来说，脱发区域的毛囊祖细胞数量表现的更为稀少，因此脱发的原因也可以解释为身体因素导致毛囊干细胞向毛囊祖细胞分化过程出现障碍，导致毛囊干细胞不能正常的分化为毛囊祖细胞，以至于毛囊重建受到抑制，从而导致脱发，如果能够刺激毛囊干细胞进行分化，那么就可以在脱发区域生出头发来，而现有研究发现年轻脂肪组织的外泌体，携带大量的复合生长因子，可以直接进入受体细胞，可刺激毛囊干细胞，进行分化迁移，促使处于休止期的提前毛囊进入新的生长周期。申请号为“2019110 35068.2”，名为“一种具有生发功效的外泌体制备及其应用”的发明专利提出了“选用人脐带间充质干细胞作为外泌体来源，经培养后收集细胞培养液，梯度离心提取而来，富含多种生理活性物质，如rna和各种蛋白质等，患部皮下注射使用，能有效改善患者脱发情况”的技术方案，然而在进行皮下注射特别是头部位置生发位置使用此方式，会给患者额外的带来痛苦。


技术实现要素：

3.鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种干细胞外泌体生发因子的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：步骤一：提取人腹部脂肪组织，将提取到的脂肪组织进行冲洗剪碎，而后将其加入至i型胶原酶溶液中，反应后入dmem培养基终止消化，细胞筛过滤得到脂肪细胞，将脂肪细胞加入培养液培养，待细胞生长达到80％-84％融合时进行消化，按1:4比例进行传代获得脂肪干细胞；步骤二：对培养好的脂肪干细胞间充质干细胞培养液进行超高速离心，转速13000g，4℃，50-55min，注射器抽出上清液，转移上清液，再次进行离心，转速20000g，4℃，110min，取出沉淀，将沉淀用缓冲液进行清洗，得到干细胞外泌体；步骤三：将干细胞外泌体加入微载体进行定容，加入辅助制剂，吹打混匀，获得外泌体生发因子；
4.作为本发明的一种优选技术方案，步骤一在对脂肪组织进行冲洗时采用含双抗的缓冲液进行清洗，步骤一中使用的i型胶原酶溶液的浓度百分比为0.13％，i型胶原酶含有比较均匀的各种酶活力(包括胶原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性)，通常用作上皮细胞、肝、肺、脂肪和肾上腺组织细胞的制备。
5.作为本发明的一种优选技术方案，步骤一中对脂肪细胞进行培养的培养液为用无血清培养液，无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，无血清培养液包括dmem、l-谷氨酰胺、纤连蛋白、转铁蛋白和胰岛素。
6.作为本发明的一种优选技术方案，步骤二中在进行离心操作时均采用密度梯度离心法，亦称平衡密度梯度离心法，用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在离心力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。
7.作为本发明的一种优选技术方案，步骤三中的微载体为藻酸盐凝胶微载体或脂质体，步骤三中的辅助制剂由何首乌制剂、氮酮与生理盐水混合而成，氮酮有助于生发因子的渗入。
8.本发明的有益效果：选用人腹部脂肪组织作为外泌体来源，首先对其进行干细胞收集，经培养后收集细胞培养液，对培养液进行超高速离心离心提取出干细胞外泌体，富含多种生理活性物质，配合何首乌制剂以及氮酮，对脱发患处进行涂抹，不用进行皮下注射，使得干细胞外泌体，携带大量的复合生长因子，可以直接进入受体细胞，可刺激毛囊干细胞，进行分化迁移，能有效改善患者脱发情况。
具体实施方式
9.实施例1
10.本发明公开了一种干细胞外泌体生发因子的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：步骤一：提取人腹部脂肪组织，将提取到的脂肪组织进行冲洗剪碎，而后将其加入至i型胶原酶溶液中，反应后入dmem培养基终止消化，细胞筛过滤得到脂肪细胞，将脂肪细胞加入无血清培养液培养，无血清培养液包括dmem、l-谷氨酰胺、纤连蛋白、转铁蛋白和胰岛素，待细胞生长达到80％融合时进行消化，按1:4比例进行传代获得脂肪干细胞；步骤二：对培养好的脂肪干细胞间充质干细胞培养液进行超高速离心，转速13000g，4℃，50min，注射器抽出上清液，转移上清液，再次进行离心，转速20000g，4℃，110min，取出沉淀，将沉淀用缓冲液进行清洗，得到干细胞外泌体；步骤三：将干细胞外泌体加入微载体进行定容，微载体为藻酸盐凝胶微载体或脂质体，加入辅助制剂(何首乌制剂与生理盐水混合而成)，吹打混匀，获得外泌体生发因子；
11.作为本发明的一种优选技术方案，步骤一在对脂肪组织进行冲洗时采用含双抗的缓冲液进行清洗，步骤一中使用的i型胶原酶溶液的浓度百分比为0.13％。
12.作为本发明的一种优选技术方案，步骤二中在进行离心操作时均采用密度梯度离心法。
13.实施例2
14.本发明公开了一种干细胞外泌体生发因子的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：步骤一：提取人腹部脂肪组织，将提取到的脂肪组织进行冲洗剪碎，而后将其加入
至i型胶原酶溶液中，反应后入dmem培养基终止消化，细胞筛过滤得到脂肪细胞，将脂肪细胞加入无血清培养液培养，无血清培养液包括dmem、l-谷氨酰胺、纤连蛋白、转铁蛋白和胰岛素，待细胞生长达到82％融合时进行消化，按1:4比例进行传代获得脂肪干细胞。步骤二：对培养好的脂肪干细胞间充质干细胞培养液进行超高速离心，转速10000g，4℃，55min，注射器抽出上清液，转移上清液，再次进行离心，转速15000g，4℃，110min，取出沉淀，将沉淀用缓冲液进行清洗，得到干细胞外泌体。步骤三：将干细胞外泌体加入微载体进行定容，微载体为藻酸盐凝胶微载体或脂质体，加入辅助制剂(何首乌制剂与生理盐水混合而成)，吹打混匀，获得外泌体生发因子。
15.作为本发明的一种优选技术方案，步骤一在对脂肪组织进行冲洗时采用含双抗的缓冲液进行清洗，步骤一中使用的i型胶原酶溶液的浓度百分比为0.13％。
16.实施例3
17.本发明公开了一种干细胞外泌体生发因子的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：步骤一：提取人腹部脂肪组织，将提取到的脂肪组织进行冲洗剪碎，而后将其加入至i型胶原酶溶液中，反应后入dmem培养基终止消化，细胞筛过滤得到脂肪细胞，将脂肪细胞加入无血清培养液培养，无血清培养液包括dmem、l-谷氨酰胺、纤连蛋白、转铁蛋白和胰岛素，待细胞生长达到84％融合时进行消化，按1:4比例进行传代获得脂肪干细胞；步骤二：对培养好的脂肪干细胞间充质干细胞培养液进行超高速离心，转速10000g，4℃，52min，注射器抽出上清液，转移上清液，再次进行离心，转速15000g，4℃，110min，取出沉淀，将沉淀用缓冲液进行清洗，得到干细胞外泌体；步骤三：将干细胞外泌体加入微载体进行定容，微载体为藻酸盐凝胶微载体或脂质体，加入辅助制剂(何首乌制剂与生理盐水混合而成)，吹打混匀，获得外泌体生发因子；
18.作为本发明的一种优选技术方案，步骤一在对脂肪组织进行冲洗时采用含双抗的缓冲液进行清洗，步骤一中使用的i型胶原酶溶液的浓度百分比为0.13％。
19.上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。