一种从发酵液中提取唾液酸的工艺及该工艺的应用的制作方法

1.本发明涉及发酵法制备唾液酸领域，尤其涉及一种从发酵液中提取唾液酸的工艺及该工艺的应用。


背景技术：

2.唾液酸通过参与细胞表面的生理功能能够对人体生理功能调节起到重要作用，其是母乳组分之一，有助于婴幼儿成长期的大脑发育。唾液酸在自然界广泛分布，除了上述提到的母乳，还有燕窝、牛奶、鸡蛋等，其中燕窝中唾液酸的含量高达7～12％，因此，燕窝成为了提取唾液酸的重压原料，但燕窝的产量极少，无法满足唾液酸的生产需求，因此通过化工工艺制备唾液酸成了较为可行的选择。经过多年的发展，目前已经能够通过化学合成法、酶合成法和微生物发酵法等制备唾液酸，相对于其他方法，微生物发酵法具有生产周期短、产量高、方法简单、原料来源丰富、价格低廉，经济效益高等优势。但微生物发酵法制备出来是聚唾液酸，即唾液酸单体的多聚物，因此还需要从发酵液中提取出聚唾液酸进行后处理以得到唾液酸，然而，在提取聚唾液酸的过程中，目前普遍使用的醇沉法存在部分聚唾液酸残留在发酵液中无法被提取的问题，因此有必要研究提取效果更好的方法。


技术实现要素：

3.针对上述问题，本发明提供一种从发酵液中提取唾液酸的工艺及该工艺的应用，该工艺以四氧化三铁磁性粉末为辅助提取剂，在其提供的微磁场和异质形核界面的共同作用下实现了对发酵液中聚唾液酸更好的提取。为实现上述发明目的，本发明公开以下技术方案：
4.在本发明的第一方面，公开一种从发酵液中提取唾液酸的工艺，其包括：
5.s1、将微生物发酵法得到的含有聚唾液酸的发酵液进行固液分离，然后在得到的液相中加入四氧化三铁磁性粉末，然后搅拌使所述粉末分散在液相中。再在搅拌条件下加入乙醇，完成后继续搅拌一段时间。最后静置待结晶物沉淀后分离出该沉淀物，即得聚唾液酸。
6.s2、将所述聚唾液酸溶解在水中形成聚唾液酸溶液，然后在该溶液中加入盐酸进行聚唾液酸的水解，完成后加四氧化三铁中和掉多余盐酸，得水解液。
7.s3、在所述水解液中加入吸附性脱色剂进行脱色处理，完成后将得到的脱色液进行浓缩，然后在得到的浓缩液中加入乙醇搅拌均匀，完成后静置使结晶物沉淀，然后分离出该沉淀物洗涤后干燥，即得唾液酸。
8.s4、将步骤s3中分离所述沉淀物后的液相进行加热分离出其中的乙醇并冷凝收集，然后在剩余的液相中加入三水乙酸钠、乙二醇，然后进行水热反应，完成后分离出反应液中的固体产物，即得四氧化三铁粒子，将其用于上述步骤s1的液相中。
9.优选地，步骤s1中，所述液相中四氧化三铁磁性粉末的加入量为0.17～0.22g/l。更优选地，所述四氧化三铁磁性为微米级粉末，其分散在含有聚唾液酸的液相中与乙醇配
合能够有效提高聚唾液酸的提取效果。
10.优选地，步骤s1中，所述乙醇与液相的体积比为1：3.35～4.7，所述静置时间为30～55min。
11.优选地，步骤s2中，加入所述盐酸后聚唾液酸溶液的ph保持在1～3.2之间，所述水解时间为2～3h，且所述水解的温度为75～85℃。在酸性条件下可使聚唾液酸发生水解分解成唾液酸。更优选地，所述盐酸的浓度为20～25wt.％。
12.优选地，步骤s3中，所述吸附性脱色剂包括吸附树脂、活性炭、硅藻土等中的任意一种。更优选地，所述水解液中脱色剂含量为3～5g/l，脱色时间为40～55min，温度为50～65℃。
13.优选地，步骤s3中，将所述脱色液加热浓缩至原体积的55％以下，优选为45～50％。
14.优选地，步骤s3中，所述乙醇与浓缩液的体积比为1：3.35～4.7，所述静置时间为40～55min。
15.优选地，步骤s3中，采用乙醇对所述沉淀物进行洗涤，然后采用真空干燥或冻干等方式中的任意一种进行干燥。
16.优选地，步骤s4中，所述加热温度为80～85℃。
17.优选地，步骤s4中，所述液相中的铁离子和亚铁离子的总摩尔量与三水乙酸钠的摩尔量比为5.8～6.3：50～54，其中，所述铁离子和亚铁离子的摩尔比为1.75～2.1。
18.优选地，步骤s4中，所述三水乙酸钠与乙二醇质量体积比为7～7.5g：50～70ml。
19.优选地，步骤s4中，所述水热反应的温度为160～200℃，时间为3～5h。
20.在本发明的第二方面，公开所述从发酵液中提取唾液酸的工艺在生物、医药、化工等领域中的应用。
21.现有技术相比，本发明取得的有益效果至少包括以下部分：本发明工艺以四氧化三铁磁性粉末为辅助提取剂，在其提供的微磁场和异质形核界面的共同作用下实现了对发酵液中聚唾液酸更好的提取。具体如下：
22.(1)本发明在发酵液中加入了四氧化三铁磁性粉末，在加入乙醇后溶解在发酵液中的聚唾液酸逐渐结晶析出，而在结晶析出的初始阶段，分散在含有聚唾液酸的所述发酵液中的四氧化三铁磁性粉末作为异质界面可加速聚唾液酸的形核、结晶，降低聚唾液酸从发酵液中分离出来的难度，使聚唾液酸更容易分离出来。同时，每粒所述四氧化三铁磁性微粒相当于一个微磁场，产生的磁力能够有效削弱聚唾液酸与水分子之间的氢键，从而使聚唾液酸能够更容易地从发酵液中脱离出来进行形核、结晶长大、析出，提高了聚唾液酸的提取率。
23.(2)在对得到的含有四氧化三铁的聚唾液酸进一步水解后，所述四氧化三铁在盐酸作用下转换为氯化铁和氯化亚铁，在进一步地醇沉过程中，水解液中的唾液酸析出沉淀，而氯化铁和氯化亚铁由于能够在水中和乙醇中溶解，则不会随唾液酸析出，从而实现了与唾液酸的分离。
24.(3)本发明还利用四氧化三铁在盐酸作用下转换为氯化铁和氯化亚铁得到的铁离子与亚铁离子的摩尔比为2:1的特点，可在无需进行调节的情况下直接将其在三水乙酸钠、乙二醇的作用下再次转换成四氧化三铁，实现了四氧化三铁的循环利用。
具体实施方式
25.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。现通过具体实施对本发明进一步说明。
26.实施例1
27.一种从发酵液中提取唾液酸的工艺，包括如下的步骤：
28.s1、对微生物发酵法得到的含有聚唾液酸的发酵液在过滤器中进行过滤，去除发酵液中的固体物，然后静置并取上清液。按照上清液体积与四氧化三铁质量为1l：0.2g的比例，在所述上清液中加入微米四氧化三铁磁性粉末，然后进行高速搅拌使四氧化三铁磁性粉末分散在上清液中，然后继续在搅拌作用下加入上清液体积4倍的乙醇(质量分数95％)，待所述乙醇添加完毕后缓慢搅拌20min。然后静置45min待结晶物沉淀后进行离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得聚唾液酸。
29.s2、将所述聚唾液酸溶解在水中形成质量分数为2％的聚唾液酸溶液，然后在该溶液中加入浓度为20wt.％的盐酸，并将所述聚唾液酸溶液的ph调节至2.5，并在80℃下进行所述聚唾液酸的水解，时间为3小时。完成后在得到的水解液中继续加入四氧化三铁中和掉多余盐酸，得中性水解液。
30.s3、按照4g/l的比例在所述中性水解液中加入活性炭，并在60℃下保持50min进行脱色处理。完成后过滤去除中性水解液中的活性炭，即得脱色液。然后将所述脱色液加热浓缩至原体积的50％，即得浓缩液。待所述浓缩液降至室温后加入其体积4.5倍的乙醇(质量分数95％)搅拌，完成后静置50min使结晶物沉淀，然后离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得唾液酸。
31.s4、将步骤s3中分离所述沉淀物后的液相在80℃下进行加热分离出其中的乙醇并冷凝收集，以重复利用。然后按照7.2g：55ml的比例将三水乙酸钠溶解在乙二醇中，将得到的溶液加入分离出所述乙醇后剩余的液相中，且剩余的液相中铁离子和亚铁离子的总摩尔量与三水乙酸钠的摩尔量比为6：52。完成后在反应釜中进行水热反应，温度为185℃，时间为4h。完成后离心(速率9500r/min，时间10min)分离出水热反应液中的黑色固体产物，得四氧化三铁粒子。
32.实施例2
33.一种从发酵液中提取唾液酸的工艺，包括如下的步骤：
34.s1、对微生物发酵法得到的含有聚唾液酸的发酵液在过滤器中进行过滤，去除发酵液中的固体物，然后静置并取上清液。按照上清液体积与四氧化三铁质量为1l：0.17g的比例，在所述上清液中加入微米四氧化三铁磁性粉末，然后进行高速搅拌使四氧化三铁磁性粉末分散在上清液中，然后继续在搅拌作用下加入上清液体积4.7倍的乙醇(质量分数95％)，待所述乙醇添加完毕后缓慢搅拌25min。然后静置30min待结晶物沉淀后进行离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得聚唾液酸。
35.s2、将所述聚唾液酸溶解在水中形成质量分数为2％的聚唾液酸溶液，然后在该溶液中加入浓度为20wt.％的盐酸，并将所述聚唾液酸溶液的ph调节至3.2，并在85℃下进行所述聚唾液酸的水解，时间为2小时。完成后在得到的水解液中继续加入四氧化三铁中和掉
多余盐酸，得中性水解液。
36.s3、按照5g/l的比例在所述中性水解液中加入硅藻土，并在50℃下保持55min进行脱色处理。完成后过滤去除中性水解液中的硅藻土，即得脱色液。然后将所述脱色液加热浓缩至原体积的55％，即得浓缩液。待所述浓缩液降至室温后加入其体积3.35倍的乙醇(质量分数95％)搅拌，完成后静置40min使结晶物沉淀，然后离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得唾液酸。
37.s4、将步骤s3中分离所述沉淀物后的液相在85℃下进行加热分离出其中的乙醇并冷凝收集，以重复利用。然后按照7.0g：50ml的比例将三水乙酸钠溶解在乙二醇中，将得到的溶液加入分离出所述乙醇后剩余的液相中，然后通过加入氯化铁和氯化亚铁调节铁离子和亚铁离子的摩尔比为1.75：1，且所述铁离子和亚铁离子的总摩尔量与三水乙酸钠的摩尔量比为5.8：50。完成后在反应釜中进行水热反应，温度为160℃，时间为5h。完成后离心(速率9500r/min，时间10min)分离出水热反应液中的黑色固体产物，得四氧化三铁粒子。
38.实施例3
39.一种从发酵液中提取唾液酸的工艺，包括如下的步骤：
40.s1、对微生物发酵法得到的含有聚唾液酸的发酵液在过滤器中进行过滤，去除发酵液中的固体物，然后静置并取上清液。按照上清液体积与四氧化三铁质量为1l：0.22g的比例，在所述上清液中加入微米四氧化三铁磁性粉末，然后进行高速搅拌使四氧化三铁磁性粉末分散在上清液中，然后继续在搅拌作用下加入上清液体积3.35倍的乙醇(质量分数95％)，待所述乙醇添加完毕后缓慢搅拌25min。然后静置55min待结晶物沉淀后进行离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得聚唾液酸。
41.s2、将所述聚唾液酸溶解在水中形成质量分数为2％的聚唾液酸溶液，然后在该溶液中加入浓度为25wt.％的盐酸，并将所述聚唾液酸溶液的ph调节至1，并在75℃下进行所述聚唾液酸的水解，时间为3小时。完成后在得到的水解液中继续加入四氧化三铁中和掉多余盐酸，得中性水解液。
42.s3、按照3g/l的比例在所述中性水解液中加入硅藻土，并在65℃下保持40min进行脱色处理。完成后过滤去除中性水解液中的硅藻土，即得脱色液。然后将所述脱色液加热浓缩至原体积的45％，即得浓缩液。待所述浓缩液降至室温后加入其体积4.7倍的乙醇(质量分数95％)搅拌，完成后静置40min使结晶物沉淀，然后离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得唾液酸。
43.s4、将步骤s3中分离所述沉淀物后的液相在85℃下进行加热分离出其中的乙醇并冷凝收集，以重复利用。然后按照7.5g：70ml的比例将三水乙酸钠溶解在乙二醇中，将得到的溶液加入分离出所述乙醇后剩余的液相中，然后通过加入氯化铁和氯化亚铁调节铁离子和亚铁离子的摩尔比为2.1：1，且所述铁离子和亚铁离子的总摩尔量与三水乙酸钠的摩尔量比为6.3：54。完成后在反应釜中进行水热反应，温度为200℃，时间为3h。完成后离心(速率9500r/min，时间10min)分离出水热反应液中的黑色固体产物，得四氧化三铁粒子。
44.实施例4
45.一种从发酵液中提取聚唾液酸的工艺，包括如下步骤：对微生物发酵法得到的含有聚唾液酸的发酵液在过滤器中进行过滤，去除发酵液中的固体物，然后静置并取上清液。
然后在搅拌作用下加入上清液体积4倍的乙醇(质量分数95％)，待所述乙醇添加完毕后缓慢搅拌20min。然后静置45min待结晶物沉淀后进行离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得聚唾液酸。
46.实施例5
47.一种从发酵液中提取唾液酸的工艺，包括如下的步骤：
48.s1、对微生物发酵法得到的含有聚唾液酸的发酵液在过滤器中进行过滤，去除发酵液中的固体物，然后静置并取上清液。按照上清液体积与四氧化三铁质量为1l：0.17g的比例，在所述上清液中加入消磁后的微米四氧化三铁粉末，然后进行高速搅拌使四氧化三铁粉末分散在上清液中，然后继续在搅拌作用下加入上清液体积4.7倍的乙醇(质量分数95％)，待所述乙醇添加完毕后缓慢搅拌25min。然后静置30min待结晶物沉淀后进行离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得聚唾液酸。
49.s2、将所述聚唾液酸溶解在水中形成质量分数为2％的聚唾液酸溶液，然后在该溶液中加入浓度为20wt.％的盐酸，并将所述聚唾液酸溶液的ph调节至3.2，并在85℃下进行所述聚唾液酸的水解，时间为2小时。完成后在得到的水解液中继续加入四氧化三铁中和掉多余盐酸，得中性水解液。
50.s3、按照5g/l的比例在所述中性水解液中加入硅藻土，并在50℃下保持55min进行脱色处理。完成后过滤去除中性水解液中的硅藻土，即得脱色液。然后将所述脱色液加热浓缩至原体积的55％，即得浓缩液。待所述浓缩液降至室温后加入其体积3.35倍的乙醇(质量分数95％)搅拌，完成后静置40min使结晶物沉淀，然后离心(速率9500r/min，时间10min)分离出该沉淀物，并用乙醇洗涤后在80℃下真空干燥1小时，即得唾液酸。
51.s4、将步骤s3中分离所述沉淀物后的液相在85℃下进行加热分离出其中的乙醇并冷凝收集，以重复利用。然后按照7.0g：50ml的比例将三水乙酸钠溶解在乙二醇中，将得到的溶液加入分离出所述乙醇后剩余的液相中，然后通过加入氯化铁和氯化亚铁调节铁离子和亚铁离子的摩尔比为1.75：1，且所述铁离子和亚铁离子的总摩尔量与三水乙酸钠的摩尔量比为5.8：50。完成后在反应釜中进行水热反应，温度为160℃，时间为5h。完成后离心(速率9500r/min，时间10min)分离出水热反应液中的黑色固体产物，得四氧化三铁粒子。
52.测试上述实施例1～5中聚唾液酸提取率和唾液酸的纯度，测试结果如下。
[0053][0054]
从上述实施例1～3和实施例4～5的测试结果可以看出，当在聚唾液酸的提取过程中未添加四氧化三铁粉末或者添加的是消磁后的四氧化三铁粉末时，聚唾液酸的提取率明显相抵。而且可以看出得到的唾液酸的纯度较高，说明本发明的工艺还能够有效实现四氧化三铁在盐酸作用下形成的氯化铁和氯化亚铁与唾液酸的分离，确保了唾液酸的纯度。
[0055]
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。