一种基于指纹光谱特征的大麦叶斑病显症前诊断方法

1.本发明涉及植物病害早期识别技术领域，特别涉及一种基于指纹光谱特征的大麦叶斑病 显症前诊断方法。


背景技术：

2.植物病原菌常干扰作物正常的生理生化功能，使其在生理和组织结构上出现种种 病理变化，严重危害作物的生长、产量和质量。真菌病原菌bipolaris sorokiniana 广泛分布在亚洲、非洲、美洲和欧洲大陆的温暖潮湿地区，侵害小麦、大麦、水稻、 玉米等多种农作物，引起叶斑病、根腐病和籽粒黑点病，直接导致农作物减产2-30％。 在这些病害中，叶斑病是小麦和大麦粮食作物上最为常见的病害，主要发生在叶片部 位，其典型症状是被萎黄的褪绿组织晕轮包围的暗褐色坏死组织，发病初期叶片上出 现病斑，之后病斑之间逐渐联合，后期密布全叶，形成大面积组织坏死，最终导致叶 片枯萎死亡。叶斑病不仅危害很大，并且具有高度传染性，因此，在显症前阶段诊断 出叶斑病，对于防止大规模叶斑病暴发和确保全球粮食安全至关重要。
3.对于作物病害的早期诊断，目前主要有以下几种方法，一是人工肉眼检测，这是 目前农作物和园艺作物栽培过程中最常用的病害检测方式，但由于肉眼无法直接观测 到早期的植物-病原菌相互作用过程，当肉眼观察到病斑时，症状已经十分明显；二是 pcr(聚合酶链式反应)诊断方法，这是目前被认为最有效的诊断方法，但操作过程繁 琐且对植株产生破坏，无法实现时序监测，而且染病早期叶片内病原菌的不均匀分布 会影响检测精度；三是基于光学传感技术的早期病害快速无损诊断，其中hsi(高光 谱成像)技术得益于其谱图融合特性，含有丰富连续的光谱和图像信息，在早期病害 诊断方面得到大量的关注，其原理是植物叶片受到病原菌感染后，其生理生化特性会 发生变化，进而叶片染病组织的可见-近红外光谱反射特性及其空间分布会发生相应改 变，结合化学计量学方法可以实现病害的早期诊断。例如基于hsi技术和人工智能算 法，在不同病害发展阶段(无症状、早期、中期、晚期)区分出健康和受白粉病感染 的西葫芦叶片；基于hsi技术对番茄叶片的目标斑点和细菌性斑点进行检测，人工确 定病害的发展阶段(无症状、早期、晚期)，并在不同阶段实现病害检测。目前大部分 研究采用基于人工打标数据的有监督分类方法，但由于显症前病害肉眼不可见，对显 症前病害的人工数据打标并非可靠，无法真正实现显症前病害诊断，而且这些研究没 有开展像素级分析以可视化病斑发生发展的动态进程。基于hsi像素级分析的无监督 方法在病害发展过程可视化和显症前染病区域检测方面有一些报道，例如，基于hsi 技术结合sivm(简单体积最大化)方法和llrs(似然比)计算，能够在离体大麦叶片 上接种白粉病菌两天后，对植物与白粉病菌相互作用的监测结果可视化。基于hsi技 术，在稻瘟病菌侵染大麦叶片的原位监测研究中，利用光谱解混分析，最早在接种后 24h观察到病斑出现。虽然这些研究实现了病害从显症前到显症后阶段的可视化分析， 但均未提取出特异的、代表性的、稳健的、适用于不同检测时间点的病害fss(指纹 光谱特征)，大大降低了hsi检测显症前病害的鲁棒性和适用性，更缺乏针对大麦叶斑 病的fss提
取以可视化叶斑病的发生发展过程，实现显症前诊断。
4.综上所述，现有技术存在的问题是：
5.(1)基于人工肉眼诊断早期病害的方法有滞后性、准确率低的缺点；基于pcr的 诊断方法操作过程复杂，对植株产生破坏，而且检测精度受到病害早期病原菌在叶片 内不均匀分布的影响，无法实现快速无损的病害早期诊断；
6.(2)基于hsi的有监督分类方法无法真正实现显症前病害诊断，也无法可视化作 物病害的发生发展过程；基于hsi像素级可视化分析的无监督方法尚未提出具有代表 性、稳健性和可解释性的病害fss，大大降低了hsi检测显症前病害的鲁棒性和适用 性，更缺乏针对大麦叶斑病的fss提取以可视化叶斑病的发生发展过程，实现显症前 诊断。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于fss(指纹光谱特征)的大麦叶斑病显 症前诊断方法。其具体技术方案如下：
8.一种基于指纹光谱特征的大麦叶斑病显症前诊断方法，包括以下步骤：
9.s1：样本制备及时序数据采集。选取大麦作为实验样本，对活体大麦叶片接种真菌 bipolaris sorokiniana，分别在病菌接种后0、24、36、48、60和72小时采集健康 和染病叶片的高光谱图像，并化学测定样本的生理生化指标含量。对于染病大麦叶片样本， 在接种后0、12、24、36、48、60和72小时采用pcr方法对病害侵染程度进行定量。
10.获取3类时序数据集；
11.s2：对s1采集到的60hai染病叶片的高光谱图像采用vca(顶点成分分析)方法进行 光谱解混分析，提取大麦叶片健康组织、褪绿组织、坏死组织的fss；
12.s3：对s1所述时序高光谱图像数据集，利用s2所提取的fss计算活体叶片上健康组织、 褪绿组织、坏死组织的空间分布，可视化跟踪大麦叶片叶斑病的发展过程，捕捉大麦叶 斑病微小病斑的出现；
13.s4:统计图像中坏死组织像素点个数并计算其面积比例，统计分析发现在24hai出现显 著性差异，早于pcr检测中显著性差异出现的36hai，实现大麦叶斑病显症前诊断；
14.s5:建立平均光谱与植物生理生化指标的回归模型，解释了基于高光谱图像和fss进 行大麦叶斑病显症前诊断的机理。
15.作为优选，s1所述大麦实验样本在光照周期为24h(昼12h/夜12h)、温度为 25℃、相对湿度为60％的温室条件下培养；
16.s1所述真菌在温度为25℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中培养一周；
17.s1所述病菌接种将含有真菌的液体喷洒在活体大麦叶片上，并将实验样本遮盖， 以保证大麦实验样本处于高湿度(80％)和高温度(25℃)的环境中；
18.s1所述在不同接种后时间点健康和染病叶片的高光谱图像采集针对的是活体大麦 叶片，即对叶斑病胁迫生长下的活体大麦叶片分别在接种后0、24、36、48、60和72 小时采集高光谱图像，以跟踪染病大麦叶片上病害发生发展的时序变化。共17个染病 和5个健康叶片样本。
19.s1所述的高光谱图像，图像空间分辨率为1024
×
472，光谱范围为400-1000nm， 共512个波段，采集时的曝光时间为0.06s，所有原始高光谱图像均采用黑、白参考 图像进行
校正并计算得到反射率；
20.s1所述在不同接种后时间点健康和染病叶片的生理生化指标含量测定针对的是高光 谱图像采集叶片的同时间同处理同植株叶片样本，对同时间同处理同植株的叶片样本分别 在接种后0、24、36、48、60和72小时进行生理生化指标含量的测定，以跟踪染病 大麦叶片生理生化指标含量的时序变化；
21.s1所述生理生化指标包括：叶绿素a(chlorophyll-a，chl-a)、叶绿素b (chlorophyll-b，chl-b)、类胡萝卜素(carotenoid，car)、丙二醛 (malondialdehyde，mda)、抗坏血酸(ascorbic acid，asa)、还原型谷胱甘肽 (glutathione，gsh)，所述生理生化指标可以反映大麦叶片内组织成分的变化；
22.s1所述对于染病大麦叶片样本，在接种后0、12、24、36、48、60和72小时采用 pcr方法对病害侵染程度进行定量，针对的是高光谱图像采集叶片的同时间同处理同植 株叶片样本；
23.s1所述pcr检测，是一种用于放大扩增特定dna片段的分子生物学技术。
24.s1所述3类时序数据集，分别是时序高光谱图像数据集，时序生理生化指标含量数据 集，时序pcr数据集。
25.作为优选，s2所述hai表示活体大麦叶片在感染叶斑病后的病害胁迫的时间，单 位是小时；
26.s2所述hsi数据是选取60hai的大麦叶片高光谱图像；
27.s2所述vca为顶点成分分析方法，是一种经典光谱解混方法，起源于遥感领域，基于 凸几何理论，常用于从遥感高光谱图像中提取纯物质的端元(endmember，em)，并计算端元 光谱的丰度图分布。本发明采用vca方法从大麦叶片高光谱图像中提取fss，包括em1(健 康组织代表性光谱)、em2(褪绿组织代表性光谱)和em3(坏死组织代表性光谱)；
28.s2所述em1光谱特征在可见绿光区450-680nm出现明显的反射峰，在红边区域680
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750nm处反射率急剧上升，在近红外区域780-950nm反射率保持较高水平，表明大麦 叶片中叶绿素对光吸收强烈，且叶片组织结构致密、完整，证实em1与大麦叶片中健康组织 有关；
29.s2所述em2光谱特征在可见光绿光区是一条相对平缓的反射曲线，且红边效应显著减 弱，表明叶片中的叶绿素受到了显著的破坏。与所述em1相比，em2光谱在近红外区的反射 强度略有下降，表明叶片组织的致密结构受到一定程度的破坏，证实em2与大麦叶片中褪绿 组织有关；
30.s2所述em3光谱特征在450-550nm范围反射率缓慢上升，在550-650nm范围内 的典型叶片绿光反射峰消失，被平坦的低反射率曲线代替，这是叶片组织内部色素严 重降解，发展成为暗褐色的坏死组织，对光有强烈吸收导致。与所述em1相比，em3曲 线在红边区域680-750nm呈半弧形，这在文献中鲜有报道。em3曲线在780-950nm的近 红外波段反射率明显降低，表明病变叶片组织内致密的有序结构被完全破坏，这证实 em3光谱与大麦叶片坏死组织的结构相对应，是叶斑病坏死性病变具有代表性的光谱 特征。
31.作为优选，s3所述三种组织的空间分布是利用s2所提取的fss计算大麦活体叶片上的 健康组织、褪绿组织、坏死组织的丰度图得到；
32.s3所述可视化跟踪大麦叶片叶斑病的发展过程，是对24、36、48、60、72hai的 高光谱图像计算fss的空间分布，清晰地分辨出健康组织、褪绿组织、坏死组织，直观 显示出叶
斑病病害发生发展过程；
33.s3所述叶斑病微小病斑是人类肉眼难以直接观测的。
34.作为优选，s4所述统计坏死组织像素点的个数，是在像素级别上完成的；
35.s4所述感染面积比例，是计算坏死组织像素点个数与叶片面积像素点个数的比值；
36.s4所述统计结果，是通过分析坏死组织的面积比例对感染时间的响应图，发现在 24hai开始出现显著性差异，早于pcr检测中显著性差异出现的36hai，实现大麦叶斑病显 症前诊断；
37.作为优选，s5建立平均光谱与植物生理指标的回归模型，是通过偏最小二乘法来建立；
38.s5所述偏最小二乘法是建立在主成分分析和主成分回归基础上的一种多元数据分析方 法；
39.s5所述的回归模型在六项生理指标中均取得较好的预测结果；
40.s5所述的预测结果，解释了基于高光谱图像和fss进行大麦叶斑病显症前诊断的机理。
41.本发明的有益效果是：
42.(1)本发明针对大麦叶斑病人工肉眼诊断及pcr诊断方法的缺点，提出了一种基于 fss针对活体大麦叶片叶斑病快速、无损、原位的显症前诊断方法；
43.(2)本发明针对以往hsi诊断方法的缺陷，提取具有代表性、稳定性和可解释性的 fss，可视化跟踪大麦叶片叶斑病病害的发展过程，实现显症前诊断；
44.(3)本发明提出的一种基于fss的大麦叶斑病显症前诊断方法，诊断准确率高，适应 性好，鲁棒性好，可推广应用于作物病害识别技术领域，在作物病害的早期控制中具有很 大的潜力。
附图说明
45.图1为基于fss的大麦叶斑病显症前诊断方法流程图；
46.图2为大麦叶片高光谱图像采集过程示意图；
47.图3a-图3f分别为大麦叶片生理生化指标对叶斑病感染时间的响应图；
48.图4为染病大麦叶片样本的pcr结果示意图；
49.图5a-图5c为针对60hai的大麦叶片高光谱图像(图5a为对应的rgb图像)，图5b和5c分别为基于vca光谱解混方法提取的大麦叶斑病的fss及其对应丰度图；
50.图6a-图6d为基于提取的fss对不同感染时间的大麦叶片高光谱图像计算健康、褪绿、 坏死组织的空间分布，以可视化大麦叶斑病的发生发展过程；
51.图7为大麦叶片坏死组织面积比例对感染时间的响应图；
52.图8a-图8d为对比例，针对60hai的大麦叶片高光谱图像(图8a为对应的rgb图像)， 图8b为基于k-means(k均值聚类)的聚类结果，图8c和8d分别为基于fcm(模糊c均值 聚类)提取的4种类别光谱曲线及其对应空间分布图。
具体实施方式
53.下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对 本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
54.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于指纹光谱特征的大麦叶斑病显症前诊 断方法，下面结合附图对本发明作详细的描述：
55.一种基于指纹光谱特征的大麦叶斑病显症前诊断方法，流程图如图1所示，具体包括以 下步骤：
56.s1：样本制备及时序数据采集。选取大麦作为实验样本，对活体大麦叶片接种真菌 bipolaris sorokiniana，分别在病菌接种后0、24、36、48、60和72小时采集健康 和染病叶片的高光谱图像，并化学测定样本的生理生化指标含量。对于染病大麦叶片样本， 在接种后0、12、24、36、48、60和72小时采用pcr方法对病害侵染程度进行定量。 获取3类时序数据集；
57.s1所述大麦实验样本在光照周期为24h(昼12h/夜12h)、温度为25℃、相对湿 度为60％的温室条件下培养；
58.s1所述真菌在温度为25℃的马铃薯葡萄糖琼脂培养基中培养一周；
59.s1所述病菌接种是将含有真菌的液体喷洒在活体大麦叶片上，并将实验样本遮盖， 以保证大麦实验样本处于高湿度(80％)和高温度(25℃)的环境中；
60.s1所述在不同接种后时间点健康和染病叶片的高光谱图像采集针对的是活体大麦 叶片，即对叶斑病胁迫生长下的活体大麦叶片分别在接种后0、24、36、48、60和72 小时采集高光谱图像，以跟踪染病大麦叶片上病害发生发展的时序变化。共17个染病 和5个健康叶片样本。
61.s1所述的高光谱图像，图像空间分辨率为1024
×
472，光谱范围为400-1000nm， 共512个波段，采集时的曝光时间为0.06s，所有原始高光谱图像均采用黑、白参考 图像进行校正并计算得到反射率；
62.s1所述在不同接种后时间点健康和染病叶片的生理生化指标含量测定针对的是高光 谱图像采集叶片的同时间同处理同植株叶片样本，考虑到化学测定为有损方式，不能对高光 谱图像采集叶片进行化学测定，因此对同时间同处理同植株的叶片样本分别在接种后0、 24、36、48、60和72小时进行生理生化指标含量的测定，以跟踪染病大麦叶片生理 生化指标含量的时序变化；
63.s1所述生理生化指标包括：叶绿素a(chlorophyll-a，chl-a)、叶绿素b (chlorophyll-b，chl-b)、类胡萝卜素(carotenoid，car)、丙二醛 (malondialdehyde，mda)、抗坏血酸(ascorbic acid，asa)、还原型谷胱甘肽 (glutathione，gsh)；
64.s1所述生理生化指标可以反映大麦叶片内组织成分的变化；
65.s1所述对于染病大麦叶片样本，在接种后0、12、24、36、48、60和72小时采用 pcr方法对病害侵染程度进行定量，针对的是高光谱图像采集叶片的同时间同处理同植 株叶片样本；
66.s1所述3类时序数据集，分别是时序高光谱图像数据集，时序生理生化指标含量数
据 集，时序pcr数据集；
67.s1所述pcr检测，是一种用于放大扩增特定dna片段的分子生物学技术；
68.s1所述时序高光谱图像数据如图2所示，表示采集到的时序高光谱图像，分别是 病菌接种后0、24、36、48、60和72小时采集到的高光谱图像、表示感兴趣区域对 应的光谱反射率曲线、表示一条穿越健康和染病组织的线段的光谱曲线、表示不同时 间下感染组和健康组的平均光谱反射率曲线；
69.s1所述时序生理生化指标含量数据集如图3a-图3f所示，图表的横坐标表示活体大麦 叶片在感染叶斑病后的病害胁迫的时间，纵坐标是健康和染病叶片的各项生理生化指标， 图3a-图3f结果表明，在接种后36小时染病叶片与健康叶片的色素含量开始出现显著 性差异；
70.s1所述时序pcr数据分析如图4所示，对于染病大麦叶片样本，在接种后0、12、 24、36、48、60和72小时采用pcr方法对病害感染程度进行定量分析，针对的是高 光谱图像采集叶片的同时间同处理同植株叶片样本，pcr结果表明在接种后的0、12和24 小时，样品间无显著差异，当接种后时间到达36小时，病菌的生物量显著增加；
71.s2：对s1采集到的60hai染病叶片的高光谱图像采用vca方法进行光谱解混分析， 提取大麦叶片健康组织、褪绿组织、坏死组织的fss；
72.s2所述hai表示活体大麦叶片在感染叶斑病后的病害胁迫的时间，单位是小时；
73.s2所述hsi数据是选取60hai的大麦叶片高光谱图像；
74.s2所述vca为顶点成分分析方法，是一种经典光谱解混方法，起源于遥感领域，基于 凸几何理论，常用于从遥感高光谱图像中提取纯物质的端元(endmember，em)，并计算端元 光谱的丰度图分布；
75.s2所述利用vca方法从大麦叶片高光谱图像中提取的fss，包括em1(健康组织代表性 光谱)、em2(褪绿组织代表性光谱)和em3(坏死组织代表性光谱)；
76.s2所述fss为大麦叶斑病病害的指纹光谱特征，图5a-图5c为针对60hai的大麦叶片 高光谱图像，图5a为对应的rgb图像，图5b是基于vca光谱解混方法提取的大麦叶斑病的 fss，图5c是其对应丰度图；
77.s2所述em1光谱特征曲线，如图5b实线曲线所示，在可见绿光区450-680nm出现明 显的反射峰，在红边区域680-750nm处反射率急剧上升，在近红外区域780-950nm反射 率保持较高水平，表明大麦叶片中叶绿素对光吸收强烈，且叶片组织结构致密、完整，证 实em1与大麦叶片中健康组织有关；
78.s2所述em2光谱特征曲线，如图5b虚线曲线所示，在可见光绿光区是一条相对平缓的 反射曲线，且红边效应显著减弱，表明叶片中的叶绿素受到了显著的破坏。与所述em1相比， em2光谱在近红外区的反射强度略有下降，表明叶片组织的致密结构受到一定程度的破坏， 证实em2与大麦叶片中褪绿组织有关；
79.s2所述em3光谱特征曲线，如图5b中点划线曲线所示，在450-550nm范围反射率 缓慢上升，在550-650nm范围内的典型叶片绿光反射峰消失，被平坦的低反射率曲 线代替，这是叶片组织内部色素严重降解，发展成为暗褐色的坏死组织，对光有强烈 吸收导致。与所述em1相比，em3曲线在红边区域680-750nm呈半弧形，这在文献中鲜有 报道。em3曲线在780-950nm的近红外波段反射率明显降低，表明病变叶片组织内致 密的有序结构被完全破
坏，这证实em3光谱与大麦叶片坏死组织的结构相对应，是叶 斑病坏死性病变具有代表性的光谱特征。
80.s3：对s1所述时序高光谱图像数据集，利用s2所提取的fss计算活体叶片上健康组织、 褪绿组织、坏死组织的空间分布，可视化跟踪大麦叶片叶斑病的发展过程，捕捉大麦叶 斑病微小病斑的出现；
81.s3所述三种组织的空间分布是利用所提取的fss计算大麦活体叶片上的健康组织、褪 绿组织、坏死组织的丰度图得到；
82.s3所述可视化跟踪大麦叶片叶斑病的发展过程，是对24、36、48、60、72hai的 高光谱图像计算fss的空间分布，如图6a-图6d所示，图6a-图6d为基于提取的fss对 不同感染时间的大麦叶片高光谱图像计算健康、褪绿、坏死组织的空间分布，以可视化大麦 叶斑病的发生发展过程，图6a是染病大麦叶片原始rgb图片，图6b是健康组织丰度图、 图6c是褪绿组织丰度图、图6d是坏死组织丰度图；
83.s3所述叶斑病微小病斑是人类肉眼无法直接观测的。
84.s4:统计图像中坏死组织像素点个数并计算其面积比例，统计分析发现在24hai出现显 著性差异，早于pcr检测中显著性差异出现的36hai，实现大麦叶斑病显症前诊断；
85.s4所述统计坏死组织像素点的个数，是在像素级别上完成的；
86.s4所述感染面积比例，是计算坏死组织像素点个数与叶片面积像素点个数的比值；
87.s4所述统计结果，是大麦叶片坏死组织面积比例对感染时间的响应图，如图7所 示，统计结果表明在24hai出现显著性差异；
88.s4所述pcr检测结果如图4所示，结果表明在36hai出现显著性差异；通过对比图4 和图7，基于fss的大麦叶斑病诊断方法能够在24hai实现病害诊断，早于pcr诊断方法。
89.s5:建立平均光谱与植物生理生化指标的回归模型，解释基于高光谱图像进行大麦叶斑 病显症前诊断的机理。
90.s5所述建立平均光谱与植物生理指标的回归模型，通过偏最小二乘法来建立；
91.s5所述偏最小二乘法是建立在主成分分析和主成分回归基础上的一种多元数据分析方 法；
92.s5所述的模型在六项生理指标中均取得较好的预测结果，如表1所示，模型的r
2p
均大 于0.72；
93.表1叶斑病胁迫下叶片生理生化指标定量的全光谱偏最小二乘模型结果
94.[0095][0096]
所述表1中chl-a、chl-b、car的r
2p
均大于0.87，表明光谱特征可以定量反映大麦叶 片在病菌胁迫下的生理生化特性变化，解释了基于高光谱图像和fss进行大麦叶斑病显症前 诊断的机理。
[0097]
对比例：
[0098]
使用两种不同的聚类分析方法，一是采用k-means(k均值聚类)，能够识别叶尖附近褪 绿组织区域，但是不能够识别坏死组织区域，其聚类结果如图8b所示；二是利用fcm(模 糊c均值聚类)进行聚类分析，该方法会将一些健康组织错误地归类为病变区域，提取的4 种类别光谱曲线不具有代表性，光谱曲线如图8c所示，而且无法识别重度感染坏死组织区 域，其空间分布图如图8d所示。以上两种常见的无监督聚类方法都不能有效的分辨出病斑 区域，因此本发明提出的基于fss的大麦叶斑病显症前诊断方法效果更佳。