一种聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛迁移率的检测方法与流程

1.本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种用柱前衍生高效液相反相色谱二极管阵列检测器法检测食品模拟液中甲醛迁移率的方法。


背景技术：

2.当前，在餐食打包、外卖订餐服务中，一次性餐具的消费呈现猛增的势头。这些一次性餐具多为一次性不可降解塑料制品，造成了能源的过度消耗和巨额的社会处理成本。为此，餐饮行业的堂食服务和外卖领域开始逐渐禁止使用不可降解一次性塑料餐具，并要求积极采用新型绿色环保功能材料，有效增加绿色产品的供给。聚乳酸（pla）是一种新型绿色环保生物基材料，其单体乳酸是由植物中的淀粉通过厌氧发酵产生，在自然条件下可以实现完全生物降解。目前，聚乳酸材料在中国正获得备受瞩目的市场关注和政府支持。禁塑令之下，由可生物降解的聚乳酸合成的餐具成为了替代一次性传统塑料餐具的主要选择。
3.已有的研究表明，食品接触材料中的甲醛会通过扩散、溶解的方式迁移到食品中。甲醛对人类健康有害，并已被国际癌症研究机构（iarc）列为ⅰ类致癌物、致肿瘤和致畸化合物。目前，我国规定的食品接触材料中甲醛迁移量的测定方法为乙酰丙酮分光光度法和变色酸分光光度法。高效液相色谱分析法因为与分光光度法相比具有更高的灵敏度，更常被选择用于醛类的测定，最常用的方法为甲醛与 2,4-二硝基苯肼（dnph）的酸性溶液衍生形成相应的腙，然后进行高效液相色谱分离和检测。此外，也有用高效液相色谱串联质谱法检测食品接触材料模拟液中的甲醛，但是仪器设备价格昂贵、维护成本高、且操作过程较为繁琐。
4.当前，专门针对柱前衍生高效液相反相色谱二极管阵列检测器法检测聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛迁移率的研究国内外报道较少。聚乳酸餐具属于生物来源，为了达到与石油基相同的使用性能，需要添加一些加工助剂和添加剂，因此，基质较为复杂，杂质干扰较多，需要优化色谱条件实现对衍生化产物有效分离并准确定量。已有的研究发现，在甲醛的衍生化过程中，反应温度、反应时间、2,4二硝基苯肼衍生化试剂的用量及ph值都会对衍生化结果产生一定的影响。反应温度不够、反应时间不够、2,4二硝基苯肼衍生化试剂的用量不足，2,4二硝基苯肼衍生化试剂ph范围不合适，甲醛的衍生化反应率达不到100%，影响检测结果的灵敏度。但是，反应温度过高，时间过长，2,4二硝基苯肼衍生化试剂的用量过量， 衍生化产物甲醛-2,4二硝基苯腙会发生一定程度沉淀、甚至分解，不仅影响检测结果的灵敏度，还易堵塞色谱柱，影响色谱柱的使用性能和使用寿命。因此，有必要优化色谱条件和衍生化反应条件，建立一种准确、高效的聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛迁移率的检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种聚乳酸吸管水基及酸性食品模
拟液中甲醛迁移率的检测方法，使其检测灵敏、准确、高效。
6.为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛迁移率的检测方法，包括如下步骤：（1）甲醛-2,4二硝基苯腙标准工作溶液和2,4二硝基苯肼衍生化试剂的配制：吸取甲醛-2,4二硝基苯腙标准溶液，加色谱纯乙腈定容，配得甲醛-2,4二硝基苯腙系列标准工作溶液；称取一定量的2,4二硝基苯肼，用含冰乙酸的乙腈溶液溶解、稀释并定容，配得2,4二硝基苯肼衍生化试剂贮备液，并根据试验需要用含冰乙酸的乙腈溶液进行进一步的稀释；（2）样品的制备：将称重后的聚乳酸吸管完全浸没于食品模拟液中，分别于一定的温度条件下浸泡数小时；（3）柱前衍生化反应：对于酸性食品模拟液的浸泡液，将其与同体积的2,4二硝基苯肼衍生化试剂进行反应，反应后冷却至室温，经过滤器过滤后待上机分析；对于水基食品模拟液的浸泡液，先加入一定体积的冰乙酸，然后再与同体积的2,4二硝基苯肼衍生化试剂进行反应，反应后冷却至室温，经过滤器过滤后待上机分析；（4）分离及定性、定量分析：吸取一定体积的甲醛衍生化反应液注入反向高效液相色谱进行分析，经c18反向色谱柱分离，二极管阵列检测器采集信号，以衍生化产物甲醛-2,4二硝基苯腙色谱峰的保留时间和光谱图进行定性分析，外标法进行定量分析，计算聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛迁移率。
7.进一步地，液相色谱检测用流动相为：水和甲醇按体积比20:80至80:20，或者水和乙腈按体积比20:80至80:20；柱温为20℃至50℃；流速为1.0ml/min。c18色谱柱柱规格为：250mm
×
4.6mm，5μm，或者，150mm
×
4.6mm，3.5μm；检测波长为355nm、356nm、357nm。
8.进一步地，所述步骤（1）中甲醛-2,4二硝基苯腙系列标准工作溶液浓度范围为1.008μg/ml至100.8μg/ml；含冰乙酸的乙腈溶液，冰乙酸的含量为：1%、1.5%、2%、3%、4%。
9.进一步地，所述步骤（2）中的食品模拟液用量是40ml-60ml；优选50ml。
10.进一步地，所述步骤（2）中浸泡是模拟冷饮、温饮、热饮的温度条件下进行的，分别为5℃、40℃、100℃，其中，40℃、100℃条件下，食品模拟液浸泡时间0.5-3小时，5℃条件下，浸泡时间为0.5小时至15小时。
11.进一步地，所述步骤（3）中2,4二硝基苯肼衍生化试剂，其物质的量浓度为反应底物甲醛的1至50倍摩尔比倍数；反应温度条件为25℃至85℃；反应时间是指10-60分钟；针头过滤器孔径0.45μm；加入冰乙酸进行调酸，使水基模拟液中冰乙酸体积含量达到3%。在反应温度45℃-75℃时，反应时间10-60分钟；在反应温度85℃时，反应时间10-40分钟。
12.进一步地，所述步骤（4）中吸取一定体积的甲醛衍生化反应液，用量10μl至30μl，优选20μl。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1、本发明采用的色谱条件和衍生化条件，甲醛衍生化反应率能达到100%，灵敏度
高，定量分析结合定性分析，结果准确性高。同时，杂质干扰少，甲醛-2,4二硝基苯腙保留时间短，分析时效高。
14.2、采用的色谱条件和衍生化条件相对温和，不会影响色谱柱性能，不会影响色谱柱使用寿命。
15.3、与分光光度法相比，杂质干扰少，且定量限和检测限更低，灵敏度更高。为聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛迁移率的监测和安全性评估提供了一种更加精准的检测方法。
附图说明
16.图1：甲醛-2,4二硝基苯腙标准品光谱图。
17.图2：甲醛-2,4二硝基苯腙标准品标准曲线图。
18.图3：甲醛-2,4二硝基苯腙从反应完成到放置13.5小时期间的质量浓度的变化趋势。
19.图4：甲醛-2,4二硝基苯腙标准品及食品模拟液、聚乳酸吸管食品模拟液、加标的聚乳酸吸管食品模拟液与2,4二硝基苯肼衍生化反应物的色谱图，食品模拟液a为水基模拟液。
20.图5：甲醛-2,4二硝基苯腙标准品及食品模拟液、聚乳酸吸管食品模拟液、加标的聚乳酸吸管食品模拟液与2,4二硝基苯肼衍生化反应物的色谱图，食品模拟液b为体积含量3%冰乙酸水溶液。
21.图6：甲醛-2,4二硝基苯腙标准品及食品模拟液、聚乳酸吸管食品模拟液、加标的聚乳酸吸管食品模拟液与2,4二硝基苯肼衍生化反应物的色谱图，食品模拟液c为体积含量4%冰乙酸水溶液。
22.图7：甲醛衍生化反应形成甲醛-2,4二硝基苯腙的时间-反应率趋势图。
23.图8：2,4二硝基苯肼试剂中冰乙酸含量（ph值）对甲醛衍生化反应率的影响。
24.图9：2,4二硝基苯肼试剂的摩尔浓度对甲醛衍生化反应率的影响。
25.图10：不同衍生化反应条件下的甲醛衍生化反应率柱状图。
具体实施方式
26.仪器与试剂：agilent 1260高效液相色谱仪（配置二极管阵列检测器）；色谱柱：agilent eclipse plus c18，4.6
×
150mm，5μm；预柱：agilent ep-c18柱；流动相为：水：甲醇=47.5:52.5；流速：1ml/min，柱温：35℃，进样量：20μl；吸收波长：355nm；甲醛标准物质溶液：1002mg/l（溶剂：水），色谱级，02si；甲醛-2,4二硝基苯腙（甲醛-dnph）标准溶液：1008mg/l（溶剂：乙腈），色谱级，02si；2,4二硝基苯肼：纯度98%（色谱纯），麦克林；甲醇（色谱纯），默克；乙腈（色谱纯），默克；冰乙酸（分析纯），国药；超纯水（milli-q reference）。
27.实施例1：一种聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛迁移率的检测方法， 包括如下步骤：（1）甲醛-2,4二硝基苯腙标准工作溶液和2,4二硝基苯肼衍生化试剂的配制：
吸取甲醛-2,4二硝基苯腙标准溶液，加色谱纯乙腈定容，配得甲醛-2,4二硝基苯腙系列标准工作溶液；称取一定量的2,4二硝基苯肼，用含冰乙酸的乙腈溶液溶解、稀释并定容，配得2,4二硝基苯肼衍生化试剂贮备液，并根据试验需要用含冰乙酸的乙腈溶液进行进一步的稀释。
28.甲醛-2,4二硝基苯腙系列标准工作溶液浓度范围为1.008μg/ml至100.8μg/ml；含冰乙酸的乙腈溶液，冰乙酸的含量为：1%、1.5%、2%、3%、4%。
29.（2）样品的制备：将称重后的聚乳酸吸管完全浸没于食品模拟液中，分别于一定的温度条件下浸泡数小时；食品模拟液用量是40ml-60ml；优选50ml。浸泡是模拟冷饮、温饮、热饮的温度条件下进行的，分别为5℃、40℃、100℃，其中，40℃、100℃条件下，在食品模拟液反应时间0.5-3小时，5℃条件下，浸泡时间为0.5小时至15小时。
30.（3）柱前衍生化反应：对于酸性食品模拟液的浸泡液，将其与同体积的2,4二硝基苯肼衍生化试剂进行反应，反应后冷却至室温，经过滤器过滤后待上机分析；对于水基食品模拟液的浸泡液，先加入一定体积的冰乙酸，然后再与同体积的2,4二硝基苯肼衍生化试剂进行反应，反应后冷却至室温，经过滤器过滤后待上机分析；2,4二硝基苯肼衍生化试剂，其物质的量浓度为反应底物甲醛的1至50倍摩尔比倍数；反应温度条件为25℃至85℃；反应时间是指10-60分钟；针头过滤器孔径0.45μm；加入冰乙酸进行调酸，使水基模拟液中冰乙酸体积含量达到3%。在反应温度45℃-75℃时，反应时间10-60分钟；在反应温度85℃时，反应时间10-40分钟。
31.（4）分离及定性、定量分析：吸取甲醛衍生化反应液10μl至30μl，优选20μl，注入反向高效液相色谱进行分析，经c18反向色谱柱分离，二极管阵列检测器采集信号，以衍生化产物甲醛-2,4二硝基苯腙色谱峰的保留时间和光谱图进行定性分析，外标法进行定量分析，计算聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛迁移率。
32.液相色谱检测用流动相为：水和甲醇按体积比20:80至80:20，或者水和乙腈按体积比20:80至80:20；柱温为20℃至50℃；流速为1.0ml/min。c18色谱柱柱规格为：250mm
×
4.6mm，5μm，或者，150mm
×
4.6mm，3.5μm；检测波长为355nm、356nm、357nm。
33.具体而言，上述步骤展开如下：1、甲醛-2,4二硝基苯腙标准工作溶液的配制：分别准确吸取1008mg/l甲醛-2,4二硝基苯腙标准溶液0.01ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.7ml、1.0ml于10ml棕色容量瓶中，加色谱纯乙腈定容至刻度，配得浓度为1.008μg/ml、10.08μg/ml、20.16μg/ml、30.24μg/ml、40.32μg/ml、50.40μg/ml、70.56μg/ml、100.8μg/ml的甲醛-2,4二硝基苯腙标准工作溶液。此系列标准溶液每次临用前现配。
34.2、2,4二硝基苯肼衍生化试剂的配制：准确称取0.6733g 2,4二硝基苯肼于100ml棕色容量瓶中，用1.5%冰乙酸的乙腈溶液溶解、稀释并定容至刻度。2,4二硝基苯肼溶液的摩尔浓度为20μg/ml甲醛标准溶液的摩尔浓度的50倍 。分别从此浓度的2,4二硝基苯肼溶液中吸取9ml、7ml、5ml、3ml、2ml、1.8ml、1.6ml、1.4ml、1.2ml、1ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml于10ml棕色容量瓶中，加1.5%冰乙酸的乙腈溶液稀释并定容至刻度，配得45倍、35倍、25倍、15倍、10倍、9倍、8倍、7倍、6倍、5倍、4
倍、3倍、2倍、1倍摩尔比倍数的2,4二硝基苯肼1.5%冰乙酸的乙腈溶液。
35.不同摩尔比倍数2,4二硝基苯肼1.0%冰乙酸的乙腈溶液、2,4二硝基苯肼2.0%冰乙酸的乙腈溶液、2,4二硝基苯肼3.0%冰乙酸的乙腈溶液、2,4二硝基苯肼4.0%冰乙酸的乙腈溶液的配制：准确称取0.6733g 2,4二硝基苯肼于100ml棕色容量瓶中，分别用1.0%冰乙酸的乙腈溶液、2.0%冰乙酸的乙腈溶液、3.0%冰乙酸的乙腈溶液、4.0%冰乙酸的乙腈溶液溶解、稀释并定容至刻度。余下步骤按2,4二硝基苯肼1.5%冰乙酸的乙腈溶液配制方法配制。
36.3、检测：以甲醛-2,4二硝基苯腙标准品的保留时间和光谱图为对照进行定性分析，确认是甲醛-2,4二硝基苯腙后，依据标准曲线进行外法定量，计算甲醛的含量。
37.如下表所示，甲醛-2,4二硝基苯腙标准溶液在1.008-100.8μg/ml的范围内线性方程为y=55.2470x-3.8494，相关系数为0.99953，符合gb/t 27404检测方法确认的技术要求。该线性方程范围对应的甲醛的质量浓度范围为0.288-28.8μg/ml，当样品质量为2.2g时，甲醛检出限为0.0013mg/kg，定量限为0.0043mg/kg。
38.将20.04μg/ml甲醛与4倍摩尔比倍数、1.5%冰乙酸乙腈（ph3.07）稀释的2,4二硝基苯肼溶液在45℃反应40min进行衍生化反应，其衍生化产物在常温条件下放置4.5小时、9小时、13.5小时的稳定性见图3。用ibm spss statistics 26进行数据分析，结果显示，衍生化产物甲醛-2,4二硝基苯腙的质量浓度从反应完成开始到放置4.5小时、9小时、13.5小时均没有产生显著的差异，说明此检测方法具有一定的稳定性。
39.4、加标回收试验和精密度：分别向水、3%冰乙酸水溶液、4%冰乙酸水溶液三种食品模拟液中加入2.0μg/ml、20.0μg/ml、40.1μg/ml的甲醛标准品，与4倍摩尔比倍数、1.5%冰乙酸乙腈（ph3.07）稀释的2,4二硝基苯肼溶液于45℃反应40min，相关图谱见图4、5、6。由图4、5、6可知，样品及基质空白在甲醛-2,4二硝基苯腙色谱峰前后的杂质峰较多，但是在保留时间附近杂质干扰较少，灵敏度高，水、3%冰乙酸的水溶液及4%冰乙酸的水溶液作为样品空白的基质均含有微量的甲醛，在结果的计算中需要扣除。加标回收试验和精密度结果见下表。由下表可知，甲醛加标的平均回收率在92.6%-104.1%，rsd在0.4%-3.3%。符合gb/t 27404标准规定的检测方法确认的技术要求。
40.5、聚乳酸吸管水基和酸性食品模拟液中甲醛的迁移率：将称重后的聚乳酸吸管完全浸没于50ml食品模拟液中，分别于5℃、40℃、100℃浸泡3小时。对于酸性食品模拟液的浸泡液，取5ml于10ml玻璃试管中，加入5ml2,4二硝基苯肼衍生化试剂于45℃反应40min，迅速冷却至室温，经0.45μm尼龙针头过滤器过滤后待上机分析。对于水基食品模拟液的浸泡液，先取4.85ml于10ml玻璃试管中，再加入150μl冰乙酸，然后加入5ml2,4二硝基苯肼衍生化试剂于45℃反应40min，迅速冷却至室温，经0.45μm尼龙针头过滤器过滤后进行色谱分析。
41.由下表可知，随着迁移温度的升高，食品模拟液中的甲醛迁移率有不同程度的增加，且100℃高温组酸性食品模拟液中的甲醛迁移率高于100℃水基食品模拟液中甲醛的迁移率。在本次迁移模型试验中，聚乳酸吸管在100℃、3%冰乙酸水溶液的食品模拟液中的甲醛迁移率最高，为1.346μg/g，远小于食品接触用塑料树脂中甲醛特定迁移总量15mg/kg的限量要求，说明，本次试验中的聚乳酸吸管无论是用于低温饮品、常温饮品、热饮或是水、酸性饮品，其中的甲醛迁移率并不是一个显著的能引起安全问题的因素。但是，客观上仍然需要更多来源的聚乳酸吸管进行迁移试验，才能准确评价聚乳酸吸管水基及酸性食品模拟液中甲醛的迁移率水平及是否会成为安全问题，这也是将来研究工作的重点。
42.本发明中，由于甲醛自身没有紫外、可见光或者荧光吸收，在用高效液相色谱法分析甲醛含量时，需要通过衍生化反应，将发色基团结合到甲醛分子上。在酸性条件下，甲醛与2,4二硝基苯肼反应，生成红棕色的甲醛-2,4二硝基苯腙，通过检测反应产物甲醛-2,4二硝基苯腙的含量即可计算出反应物甲醛的含量。
43.本发明的优化条件通过如下条件筛选获得：首先，甲醛-2,4二硝基苯腙作为一种苯腙类化合物，在c18色谱柱上容易保留，需要较强极性的流动相洗脱。c18色谱柱规格、流动相种类和比例、柱温会对甲醛-2,4二硝基苯腙的保留时间和分离效果产生协同作用，高的有有机相比例和柱温会使峰保留时间提前，但是容易出现前伸峰，色谱峰对称性降低，降低有机相比例和柱温，峰保留时间延后，但是容易出现拖尾峰，色谱峰对称性亦降低。考虑到色谱峰的出峰时间太靠前易受杂质的干扰，而比较靠后的出峰时间则影响检验检测的时效，同时还需满足色谱分析对色谱峰对称性的要求，因此，选择保留时间在5至20min，且峰拖尾因子在0.95至1.05的色谱进行分析，其分析条件如下表：
其次，综合考虑了反应温度、反应时间对衍生化反应的影响，如图7所示，在25℃、35℃的反应温度下，甲醛衍生化反应形成甲醛-2,4二硝基苯腙的反应率达不到90%，随着温度进一步的升高，即在45℃及以上的反应温度下，甲醛的衍生化反应率能达到100%附近，但是在85℃反应40min以后，甲醛的衍生化反应率则迅速下降，并且在60min时大幅降低至70%，同时可观察到大量的红棕色沉淀的形成，说明反应产物发生了一定程度的分解。反应时间也能一定程度上促进衍生化反应。甲醛与2,4二硝基苯肼初始反应时的衍生化反应率不足70%，10min以后，25℃组、35℃组甲醛的衍生化反应率分别达到了76%和85%，其他温度
组的甲醛的衍生化反应率则迅速升高至接近100%。在40min时，除了25℃组、35℃组甲醛的衍生化反应率稳定在83%和86%，其他温度组的甲醛的衍生化反应率则基本稳定在了100%。因此，甲醛的衍生化温度和时间条件为：在45℃至75℃，反应10分钟至60分钟，在85℃，反应10分钟至40分钟。
44.另外，根据甲醛衍生化反应原理，酸度是衍生化进程的重要因素，酸度不够，影响2,4二硝基苯肼的溶解度，致使衍生化反应不完全，影响检测结果的灵敏度，但是，酸度值过低，超过色谱柱的使用范围，会影响色谱峰峰型、色谱柱柱效和使用寿命。衍生化试剂2,4二硝基苯肼与甲醛等摩尔比反应时，平均衍生化反应率为72.6%，检测灵敏度低，当2,4二硝基苯肼的摩尔浓度逐渐增加至4倍摩尔比倍数时，平均衍生化反应率也随之增加至100%，检测灵敏度明显提高，但是2,4二硝基苯肼摩尔浓度过高，易产生红棕色的沉淀，堵塞色谱柱。统计分析软件ibm spss statistics 26的分析结果显示，衍生化试剂2,4二硝基苯肼的酸度和摩尔浓度这两个因素的交互作用显著性为0.000，说明2,4二硝基苯肼的酸度和摩尔浓度对衍生化结果有显著的协同作用，由图8和图9的统计分析结果可见，2,4二硝基苯肼中冰乙酸的含量（ph值）对反应率的影响并不是单向的促进或者降低，而是有所变化，即，在1%（ph4.02）、1.5%（ph3.07）、2%（ph2.75）、3%（ph2.48）、4%（ph2.05）这四种酸度条件下，1%（ph4.02）和3%（ph2.48）冰乙酸的2,4二硝基苯肼产生甲醛-2,4二硝基苯腙的平均反应率最低，分别为94.9%和92.8%，而1.5%（ph3.07）和4%（ph2.05）冰乙酸的2,4二硝基苯肼产生甲醛-2,4二硝基苯腙的平均反应率最高，均达到了100%，说明了有一定的协同作用的存在，因此，为使衍生化反应率达到100%，应综合考虑2,4二硝基苯肼试剂的酸度和摩尔浓度。如图10所示，在下列条件下，甲醛衍生化反应率能达到100%。2,4二硝基苯肼的4%冰乙酸乙腈（ph2.05）溶液，摩尔浓度为2至10倍摩尔比倍数2,4二硝基苯肼的3%冰乙酸乙腈（ph2.4）溶液，摩尔浓度为8倍的摩尔比倍数；2,4二硝基苯肼的2%冰乙酸乙腈（ph2.75）溶液，摩尔浓度为7倍的摩尔比倍数；2,4二硝基苯肼的1.5%冰乙酸乙腈（ph3.07）溶液，摩尔浓度为2至10倍摩尔比倍数；2,4二硝基苯肼的1%冰乙酸乙腈（ph4.02）溶液，摩尔浓度为7至10倍摩尔比倍数。
45.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，且描述较为详尽，但并不能因此理解为对本发明专利范围的限制。在本发明所述的选取范围内，色谱柱规格、柱温、流动相种类、比例、进样量、吸收波长等色谱条件均是可以调整的。衍生化反应温度、反应时间、2,4二硝基苯肼的酸度和用量等亦可以调整。
46.应当指出的是，对于本领域的普通检验人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。