皂角刺中药饮片标准汤剂的特征图谱的构建方法与流程

1.本发明涉及药物分析的技术领域，特别涉及皂角刺中药饮片标准汤剂的特征图谱的构建方法。


背景技术：

2.皂角刺又称皂角针，为豆科落叶乔木植物树的棘刺。皂角刺含有黄酮类、酚类、氨基酸和香豆素等成分，具有消肿托毒，排脓，杀虫之功效。关于皂角刺质量标准的研究并不多，2020年版《中国药典》皂角刺药材和饮片的质量标准项下仅有性状、显微鉴别和薄层鉴别项，质量标准仍不完善。
3.中药饮片标准汤剂是以中医理论为指导，临床应用为基础，参考现代提取方法，经标准化工艺制备而成的单味中药饮片水煎剂，作为一种标准物质和标准体系，能够用于标化临床用药，规范目前临床广泛使用的包括配方颗粒在内的新型饮片形式，保障用药的准确性和剂量的一致性。因此，采用现代分析技术，建立中药饮片标准汤剂的质量标准，能够为相应的配方颗粒以及经典名方等现代中药制剂质量标准的建立提供重要参考。
4.中药化学成分为多组分复杂体系，传统的化学药品质量控制模式难以评价中药的内在质量，指纹图谱和特征图谱因其整体控制理念，能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价，在中药的化学成分和质量控制研究领域应用越来越多。
5.然而皂角刺的物质基础研究薄弱，化学成分复杂且含量较低，研究难度较大。且关于皂角刺的研究主要在药材和配方颗粒上，基本集中在对皂角刺黄酮和酚酸类成分的研究，对其他成分研究较少。例如，有研究采用hplc法建立皂角刺配方颗粒hplc指纹图谱，标识出9个共有峰，但标识出的共有峰均未得到明确指认，且各特征峰的分离效果较差。还有研究采用hplc法建立皂角刺药材指纹图谱，识别出29个共有峰，其中5个色谱峰经指认分别为黄酮类和酚酸类，且指纹图谱峰型较小，整体分离效果欠佳。


技术实现要素：

6.基于此，本发明提供一种皂角刺中药饮片标准汤剂的特征图谱的构建方法。其技术方案如下：
7.一种皂角刺中药饮片标准汤剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤：
8.混合皂角刺中药饮片标准汤剂和提取溶剂，进行提取处理，将所得提取物溶解进行萃取处理，将所得萃取物溶解，制备供试品溶液；
9.对所述供试品溶液进行超高效液相色谱测定；
10.所述超高效液相色谱的色谱条件包括：
11.流动相包括流动性a和流动相b，所述流动相a包括乙腈和甲醇，所述流动相b包括甲酸的水溶液，洗脱方式为梯度洗脱；
12.所述梯度洗脱具体为：
13.0～11min，所述流动相a的体积分数由5％升高至15％，所述流动相b的体积分数由95％降低至85％；
14.11min～26min，所述流动相a的体积分数由15％升高至18％，所述流动相b的体积分数由85％降低至82％；
15.26min～45min，所述流动相a的体积分数由18％升高至22％，所述流动相b的体积分数由82％降低至78％；
16.45min～50min，所述流动相a的体积分数由22％升高至90％，所述流动相b的体积分数由78％降低至10％；
17.50min～55min，所述流动相a的体积分数保持90％，所述流动相b的体积分数保持10％。
18.在一些实施例中，所述乙腈和甲醇的体积比为1:(0.5～2)。优选地，所述乙腈和甲醇的体积比为1:1。
19.在一些实施例中，所述甲酸的水溶液中，所述甲酸的体积分数为0.02～0.2％。优选地，所述甲酸的水溶液中，所述甲酸的体积分数为0.1％。
20.在一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：固定相为以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。
21.可选的色谱柱包括但不限于：thermo acclaim c18(2.1mm
×
150mm，2.2μm)、waters hss t3 c18(2.1mm
×
150mm，1.8μm)、agilent sb c18(2.1mm
×
150mm，1.8μm)、shimadzu c18(2.1mm
×
150mm，1.9μm)色谱柱
22.在一些实施例中，所述超高效液相色谱的色谱条件还包括：流速为每分钟0.34ml～0.36ml，和/或柱温为40～44℃，和/或检测波长为320-360nm。优选地，流速为每分钟0.35ml，和/或柱温为42℃，和/或检测波长为340nm。
23.在一些实施例中，所述提取溶剂为甲醇、甲醇的水溶液、乙醇或乙醇的水溶液。可选地，甲醇的水溶液中，甲醇的体积分数可以为20％～80％，乙醇的水溶液中，乙醇的体积分数可以为20％～80％。
24.在一些实施例中，所述提取处理为超声处理或加热回流处理。
25.可选地，所述提取处理为超声处理，所述超声处理的时间不少于25min。优选地，所述超声处理的时间不少于30min。
26.可选地，所述提取处理为超声处理，所述提取溶剂的用量满足：每0.5g所述皂角刺中药饮片标准汤剂对应10ml～20ml所述提取溶剂。优选地，每0.5g所述皂角刺中药饮片标准汤剂对应14ml～16ml所述提取溶剂。
27.可选地，所述提取处理为超声处理，所述超声处理的功率为400w～600w，频率30khz～50khz。
28.可选地，所述提取处理为加热回流处理，所述加热回流处理的温度为70～80℃，时间不少于25min，优选地时间不少于30min。
29.可以理解地，提取处理后，上清液为提取液，将提取液干燥得到提取物。
30.可以理解地，将所得提取物溶解的溶剂可以为水，将所得提取物溶解后，还可以包括洗涤的步骤。
31.在一些实施例中，所述萃取处理的次数不少于2次。优选地，所述萃取处理的次数
不少于3次。
32.可选地，萃取剂为正丁醇。
33.可以理解地，萃取处理后，正丁醇液为萃取液，将萃取液干燥得到萃取物。
34.可以理解地，将所述萃取物溶解的溶剂可以是甲醇。
35.与传统方案相比，本发明具有以下有益效果：
36.本发明构建的皂角刺饮片标准汤剂的uplc特征图谱，能尽可能多地将皂角刺饮片标准汤剂的特征成分同时表征，例如，现代药理研究表明，以东莨菪碱为代表的香豆素类成分是皂角刺具有抗癌抑癌及抑菌等活性的物质基础，本发明构建的皂角刺饮片标准汤剂的uplc特征图谱不仅可以对皂角刺饮片标准汤剂中的黄酮、酚酸类成分表征，还可以同时对水溶性较好的香豆素类成分(东莨菪苷、东莨菪内酯)表征。且各成分特征峰之间分离度好。本发明构建的皂角刺饮片标准汤剂的uplc特征图谱不仅对皂角刺饮片标准汤剂质量标准的建立提供依据，也能为皂角刺配方颗粒及其经典名方等现代中药制剂质量标准的建立提供重要参考。
附图说明
37.图1为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱全波长扫描3d图谱；
38.图2为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同检测波长的对比色谱图；
39.图3为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱采用不同色谱柱的对比色谱图；
40.图4为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱采用不同流动相的对比色谱图；
41.图5为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同萃取次数的对比色谱图；
42.图6为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同超声提取时间的对比色谱图；
43.图7为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同超声提取溶剂用量的对比色谱图；
44.图8为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同提取方式的对比色谱图；
45.图9为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同提取溶剂的对比色谱图；
46.图10为18批皂角刺饮片标准汤剂特征图谱共有模式；
47.图11为皂角刺饮片标准汤剂对照特征图谱；
48.图12为皂角刺对照药材特征图谱；
49.图13为皂角刺饮片标准汤剂供试品溶液总离子流图及紫外吸收色谱图；
50.图14为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱特征峰的对照品确证图。
具体实施方式
51.以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
52.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
53.1仪器与试剂
54.仪器：旋转蒸发仪(re-3000a，上海亚荣生化仪器厂)，陶瓷保健壶(3l，深圳一枚王
有限公司)，循环水真空泵(shz-dш，巩义市予华仪器有限公司)，低温冷却液循环水泵(dlsb-5/20，郑州长城科工贸有限公司)，真空冷冻干燥机(trl-0.5，大连双瑞科技有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(dhg-9626a，上海精宏实验设备有限公司)、thermo超高效液相色谱仪(vanquish，赛默飞世尔科技有限公司)；agilent超高效液相色谱仪(1290型，安捷伦有限公司)；thermo acclaim c18(2.1mm
×
150mm，2.2μm)色谱柱；agilent sb c18(2.1mm
×
150mm，1.8μm)色谱柱；waters hss t3 c18(2.1mm
×
150mm，1.8μm)色谱柱；shimadzu c18(2.1mm
×
150mm，1.9μm)色谱柱。百分之一电子分析天平(jj600，常熟市双杰测试仪器厂)；万分之一电子分析天平(me204e，梅特勒-托利多公司)；百万分之一电子分析天平(xp26，梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(kq-500de，昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(hws28，上海一恒科技有限公司)；超纯水系统(milli-q direct，默克股份有限公司)。
55.2试药
56.2.1皂角刺饮片的制备
57.按照《中国药典》2020版皂角刺项下炮制规定制成皂角刺饮片。具体炮制方法为：皂角刺药材去除杂质，剪成适合的段，放置清洗筐内，快速洗净，用干净的湿毛巾覆盖在净药材上，闷润，润透，切成厚片，规格为2～4mm，在50℃下干燥4～5小时，取出，放凉。
58.2.2皂角刺饮片标准汤剂的制备
59.取皂角刺饮片200g，加水煎煮两次，第一次煎煮加10倍量水，浸泡30分钟，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸30分钟，用350目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却；第二次加8倍量水，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸25分钟，350目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，合并两次滤液。将煎液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.08～-0.1mpa)至100ml；在磁力搅拌下，分装至10ml西林瓶中，每瓶分装体积为2ml，分装完毕后转移至真空冷冻干燥机中冻干，取出，轧铝盖，即得标准汤剂冻干粉，18批不同产地皂角刺饮片制备的标准汤剂冻干粉批号见表1所示。
60.表1
61.62.2.3参照物溶液的制备
63.取皂角刺对照药材约1.5g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流30分钟，离心，蒸干，残渣加入甲醇15ml，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，离心，取上清液蒸干，残渣加水10ml使溶解，另加氨水10ml洗涤，转移至分液漏斗中，用正丁醇振摇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得对照药材参照物溶液。
64.精密称取花旗松素对照品适量，置25ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含花旗松素40μg的对照品溶液。即得花旗松素对照品参照物溶液。
65.2.4供试品溶液的制备
66.取皂角刺饮片标准汤剂(批次gt1611181)适量，研细，取约0.5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇15ml，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，离心，取上清液蒸干，残渣加水10ml使溶解，另加氨水10ml洗涤，转移至分液漏斗中，用正丁醇振摇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
67.3色谱条件
68.3.1检测波长的选择
69.取“2.4”项下的供试品溶液，分别选择210nm、254nm、340nm作为供试品溶液的检测波长，并进行全波扫描，其他色谱条件如下：选择thermo acclaim c18(2.1mm
×
150mm，2.2μm)色谱柱，以乙腈-甲醇(1:1,v/v)为流动相a，以体积分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相b，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.35ml；柱温为42℃；进样量为2μl。进样测定，记录供试品溶液在210nm～400nm范围内的吸收光谱，结果见图1和图2。
70.结果表明：检测波长在340nm下，色谱峰信息较多且基线更为平稳，因此，选择340nm作为特征图谱的检测波长。
71.3.2色谱柱的选择
72.取“2.4”项下的供试品溶液，分别以waters hss t3 c18(2.1mm
×
150mm，1.8μm)、shimadzu c18(2.1mm
×
150mm，1.9μm)和thermo acclaim c18(2.1mm
×
150mm，2.2μm)作为色谱柱，其他色谱条件如下：以乙腈-甲醇(1:1,v/v)为流动相a，以体积分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相b，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.35ml；柱温为42℃；进样量为2μl；检测波长为340nm。进样测定，记录供试品溶液的色谱图，结果见图3。
73.结果表明：使用thermo acclaim(2.1mm
×
150mm，2.2μm)时，峰型较好，分离度较高。因此，选择thermo acclaim(2.1mm
×
150mm，2.2μm)作为色谱柱。
74.3.3流动相的选择
75.取“2.4”项下的供试品溶液，分别以体积分数为0.1％的甲酸水溶液和体积分数为0.1％的磷酸水溶液作为流动性b，其他色谱条件如下：选择thermo acclaim c18(2.1mm
×
150mm，2.2μm)色谱柱，以乙腈-甲醇(1:1,v/v)为流动相a，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.35ml；柱温为42℃；进样量为2μl；检测波长为340nm。进样测定，记录供试品溶液的色谱图，结果见图4。
76.结果表明：使用甲酸时，主要特征色谱峰型较好。因此，选择体积分数为0.1％的甲酸水溶液作为流动相b。
77.3.4色谱条件的确认
78.综上所述，皂角刺饮片标准汤剂特征图谱色谱条件确认为：选择thermo acclaim c18(2.1mm
×
150mm，2.2μm)色谱柱，以乙腈-甲醇(1:1,v/v)为流动相a，以体积分数为0.1％的甲酸水溶液为流动相b，按表2中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.35ml；柱温为42℃；进样量为2μl；检测波长为340nm。
79.表2
[0080][0081]
4供试品溶液制备方法考察
[0082]
4.1萃取次数考察
[0083]
取皂角饮片标准汤剂(gt1611181)适量，研细，取约0.5g，精密称定，参照“2.4”项下的供试品溶液的制备方法，分别萃取1次、2次、3次及4次，通过暂时确定的8个特征峰的“总峰面积/称样量”值比较不同萃取次数对皂角刺标准汤剂特征图谱特征峰的“总峰面积/称样量”的影响，选择最佳萃取次数。
[0084]
具体地：制备供试品溶液后，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。记录色谱图和各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”值，色谱图见图5，皂角刺饮片标准汤剂特征图谱萃取次数考察结果见表3。
[0085]
表3
[0086][0087]
结果显示：比较不同萃取次数处理的供试品溶液的特征图谱的特征峰的“总峰面积/称样量”值发现，采用萃取3次和4次时，8个特征峰的“总峰面积/称样量”值较大，且两者无显著差异，考虑操作简便及节约试剂，选择萃取次数为3次。
[0088]
4.2超声提取时间考察
[0089]
取皂角饮片标准汤剂(gt1611181)适量，研细，取约0.5g，精密称定，参照“2.4”项下的供试品溶液的制备方法，分别超声提取15分钟、30分钟、45分钟，通过暂时确定的8个特征峰的“总峰面积/称样量”值比较不同超声提取的时间对皂角刺标准汤剂特征图谱特征峰的“总峰面积/称样量”的影响，选择最佳超声提取的时间。
[0090]
具体地：制备供试品溶液后，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。记录色谱图和各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”值，色谱图见图6，皂角刺饮片标准汤剂特征图谱超声提取时间考察结果见表4。
[0091]
表4
[0092][0093]
结果显示，当超声提取30分钟时，8个特征峰的“总峰面积/称样量”值较大，说明30分钟已提取充分。因此，选择超声处理的时间为30分钟。
[0094]
4.3超声提取溶剂用量考察
[0095]
取皂角饮片标准汤剂(gt1611181)适量，研细，取约0.5g，精密称定，参照“2.4”项下的供试品溶液的制备方法，分别加入提取溶剂(甲醇)10ml、15ml、20ml，通过暂时确定的8个特征峰的“总峰面积/称样量”值比较不同超声提取溶剂用量对皂角刺标准汤剂特征图谱特征峰的“总峰面积/称样量”的影响，选择最佳超声提取溶剂用量。
[0096]
具体地：制备供试品溶液后，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。记录色谱图和各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”值，色谱图见图7，皂角刺饮片标准汤剂特征图谱超声提取溶剂用量考察结果见表5。
[0097]
表5
[0098][0099]
结果显示，三种超声提取溶剂用量下，各特征峰的峰型、分离效果无明显差异，其中，超声提取溶剂用量为15ml时，各特征峰的“总峰面积/称样量”值较大。因此，选择超声提取溶剂用量为15ml。
[0100]
4.4提取方式考察
[0101]
取皂角刺饮片标准汤剂(gt1704004)适量，研细，取约0.5g，精密称定，参照“2.4”项下的供试品溶液的制备方法，分别采用超声提取和加热回流两种提取方式进行处理，其中，超声提取(功率500w，频率40khz)30分钟，加热回流(水浴锅温度为70～80℃)30分钟。通过暂时确定的8个特征峰的“总峰面积/称样量”值比较不同提取方式对皂角刺标准汤剂特征图谱特征峰的“总峰面积/称样量”的影响，选择最佳提取方式。
[0102]
具体地：制备供试品溶液后，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。记录色谱图和各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”值，色谱图见图8，皂角刺饮片标准汤剂特征图谱提取方式考察结果见表6。
[0103]
表6
[0104][0105]
结果显示，采用两种不同提取方式，各特征峰的峰型、分离效果、各特征峰的“总峰面积/称样量”值无明显差异，考虑到操作简便，选择提取方式为超声处理。
[0106]
4.5提取溶剂考察
[0107]
取皂角刺饮片标准汤剂(gt1704004)适量，研细，取约0.5g，精密称定，参照“2.4”项下的供试品溶液的制备方法，分别以甲醇、体积分数为70％的甲醇水溶液、体积分数为50％的甲醇水溶液、乙醇、体积分数为50％的乙醇水溶液为提取溶剂。通过暂时确定的8个特征峰的“总峰面积/称样量”值比较不同提取溶剂对皂角刺标准汤剂特征图谱特征峰的“总峰面积/称样量”的影响，选择最佳提取溶剂。
[0108]
具体地：制备供试品溶液后，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。记录色谱图和各特征峰的峰面积，并计算“总峰面积/称样量”值，色谱图见图9，皂角刺饮片标准汤剂特征图谱提取溶剂考察结果见表7。
[0109]
表7
[0110][0111]
结果显示，采用不同的提取溶剂，各特征峰的峰型及分离效果无明显差异，其中，以甲醇为提取溶剂，8个特征峰的“总峰面积/称样量”最大。因此，选择甲醇作为提取溶剂。
[0112]
4.6供试品溶液制备方法的确认
[0113]
综上所述，皂角刺饮片标准汤剂特征图谱的供试品溶液制备方法确认为：取本品适量，研细，精密称取0.5g，置锥形瓶中，精密加入甲醇15ml，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，离心，取上清液蒸干，残渣加水10ml使溶解，另加氨水10ml洗涤，转移至分液漏斗中，用正丁醇振摇萃取3次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
[0114]
5特征峰的确认
[0115]
取18批皂角刺饮片标准汤剂冻干粉样品，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，分别精密吸取上述供试品溶液和“2.3”项下的参照物溶液各2μl，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对18批皂角刺标准汤剂特征图谱进行共有峰标识，选择其中成分已知、峰型和分离度较好、纯度较高的8个共有峰作为皂角刺标准汤剂的特征峰，如图10所示，以其中保留时间较为居中、对照品易得的花旗松素色谱峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，并计算18批皂
角刺饮片标准汤剂特征图谱各特征峰的相对保留时间均值，利用各特征峰的相对保留时间均值对特征峰进行定位。
[0116]
对18批皂角刺饮片标准汤剂特征图谱进行分析，以花旗松素参照物峰相对应的峰为s峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7、峰8与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.34(峰1)、0.50(峰2)、0.86(峰3)、1.11(峰5)、1.28(峰6)、1.42(峰7)、1.56(峰8)。
[0117]
6特征图谱的拟定
[0118]
将18批皂角刺饮片标准汤剂uplc特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行匹配，按平均数法生成对照图谱，建立皂角刺饮片标准汤剂对照特征图谱，如图11，该特征图谱共有8个特征峰，并与皂角刺对照药材参照物色谱中8个特征峰相对应(皂角刺对照药材特征图谱见图12)。以花旗松素参照物峰相对应的峰为s峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7、峰8与s峰的相对保留时间，其相对保留时间应该在规定值的
±
10％范围之内，规定值为：0.34(峰1)、0.50(峰2)、0.86(峰3)、1.11(峰5)、1.28(峰6)、1.42(峰7)、1.56(峰8)。
[0119]
7特征峰的高分辨率质谱确认
[0120]
7.1超高效液相色谱-质谱条件
[0121]
超高效液相色谱的色谱条件按“3.4”项进行。
[0122]
质谱条件如表8所示。
[0123]
表8
[0124][0125]
7.2供试品溶液的制备
[0126]
取皂角刺饮片标准汤剂(gt1702118)，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液。
[0127]
7.3供试品测定
[0128]
精密吸取供试品溶液2μl，注入超高效液相色谱-质谱联用仪，采用上述超高效液相色谱条件和质谱条件对供试品溶液进行检测，供试品溶液总离子流图及紫外吸收色谱图见图13。
[0129]
7.4结果分析
[0130]
通过质谱精确分子量、碎片离子对比分析，并与赛默飞mzvault标准数据库进行匹配，确认了皂角刺饮片标汤剂特征图谱中原儿茶酸(峰1)、东莨菪苷(峰2)、东莨菪内酯(峰3)、花旗松素(峰4)、牡荆素(峰6)和异牡荆苷(峰7)6个成分，化合物信息见表9。
[0131]
表9
[0132][0133][0134]
8特征峰的对照品确认
[0135]
8.1色谱条件按“3.4”项进行。
[0136]
8.2对照品溶液的制备
[0137]
精密称取原儿茶醛对照品1.049mg、东莨菪苷对照品2.159mg、东莨菪内酯2.142mg、花旗松素1.023mg、牡荆素1.124mg和异牡荆苷1.205mg，分别置25ml量瓶中，加甲醇制成每1ml各含原儿茶醛41.792μg、东莨菪苷84.633μg、东莨菪内酯85.423μg、花旗松素40.470μg、牡荆素42.667μg、异牡荆苷47.236μg的对照品溶液。
[0138]
8.3供试品溶液的制备
[0139]
取皂角刺饮片标准汤剂(gt1702118)，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液。
[0140]
8.4测定
[0141]
分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各2μl，进行超高效液相色谱测定，色谱图见图14。
[0142]
结果显示，供试品溶液的色谱在与对照品色谱相应的保留时间处显相同的色谱峰，从而证实特征峰1为儿茶酸、特征峰2为东莨菪苷、特征峰3为东莨菪内酯、特征峰4为花旗松素、特征峰6为牡荆素，特征峰7为异牡荆苷。
[0143]
9方法学验证
[0144]
9.1精密度考察
[0145]
取皂角刺饮片标准汤剂(批号：gt1710002)，研细，取约0.5g，精密称定，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定，重复进样6次，进样分析。以花旗松素峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间与相对峰面积，并计算rsd值，结果见表10、表11。其中，表10为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱精密度考察结果(相对保留时间)，表11为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱精密度考察结果(相对峰面积)。
[0146]
表10
[0147][0148]
表11
[0149][0150]
结果显示，同一份供试品溶液连续进样6次，以花旗松素色谱峰为参照峰s，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在0.13％～0.79％范围内，相对峰面积rsd值在1.34％～2.70％范围内，均小于3.0％，表明仪器精密度良好。
[0151]
9.2重复性考察
[0152]
取皂角刺饮片标准汤剂(批号：gt1710002)，研细，取约0.5g，精密称定，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备6份供试品溶液，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。以花旗松素峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间与相对峰面积，并计算rsd值，结果见表12、表13。其中，表12为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱重复性考察结果(相对保留时间)，表13为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱重复性考察结果(相对峰面积)。
[0153]
表12
[0154]
[0155]
表13
[0156][0157]
结果显示，同一批样品重复测定6次，以花旗松素色谱峰为参照峰s，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在0.01％～0.03％范围内，相对峰面积rsd值在2.42％～4.94％范围内，均小于5.0％，表明该方法重复性良好。
[0158]
9.3稳定性考察
[0159]
取皂角刺饮片标准汤剂(批号：gt1710002)，研细，取约0.5g，精密称定，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按“3.4”项下确认的色谱条件，分别在0，2，4，8，12，24小时进样测定。以花旗松素峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间与相对峰面积，并计算rsd值，结果见表14、表15。其中，表14为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱稳定性考察结果(相对保留时间)，表15为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱稳定性考察结果(相对峰面积)。
[0160]
表14
[0161][0162]
表15
[0163][0164]
结果显示，同一份供试品溶液分别在0，2，4，8，12，24小时进行分析，以花旗松素峰为参照峰s，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在0.01％～0.05％范围内，相对峰面积rsd值在0.33％～0.65％范围内，均小于3.0％，表明供试品溶液在24小时内相对稳定性良好。
[0165]
9.4中间精密度考察
[0166]
由本项目组其他分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，取同一批皂角刺饮片标准汤剂(批号：gt1710002)适量，研细，取约0.5g，精密称定，按“4.6”项下确认的供试品溶
液制备方法，制备6份供试品溶液，按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定，以花旗松素峰为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间与相对峰面积，并计算rsd值，结果见表16、表17。其中，表16为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱中间精密度考察结果(相对保留时间)，表17为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱中间精密度考察结果(相对峰面积)。
[0167]
表16
[0168][0169][0170]
表17
[0171][0172]
结果显示，由不同的分析人员在不同时间于不同的仪器上操作，同一批样品重复测定6次，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在0.01％～0.04％范围内，相对峰面积rsd值在1.74％～4.86％范围内，均小于5.0％。相对保留时间与重复性试验6个数据的rsd值在0.05％～0.55％范围内，相对峰面积与重复性试验6个数据的rsd值在4.59％～7.34％范围内，说明各特征峰的相对保留时间在不同仪器上中间精密度良好，而相对峰面积rsd较大，
故暂不对相对峰面积作规定。
[0173]
9.5耐用性考察
[0174]
9.5.1不同色谱柱的耐用性考察
[0175]
取皂角刺饮片标准汤剂(批号：gt1710002)，研细，取约0.5g，精密称定，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，除色谱柱分别为thermo acclaim c18色谱柱(2.1mm
×
150mm，2.2μm)、waters hss t3 c18(2.1mm
×
150mm，1.8μm)、agilent sb c18色谱柱(2.1mm
×
150mm，1.8μm)外，其他色谱条件按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。以花旗松素为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值。结果见表18、表19。其中，表18为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同色谱柱耐用性考察结果(相对保留时间)，表19为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同色谱柱耐用性考察结果(相对峰面积)。
[0176]
表18
[0177][0178]
表19
[0179][0180]
结果显示，不同色谱柱品牌下，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在1.15％～3.53％范围内，相对峰面积rsd值在1.20％～4.8％范围，均小于5％，说明不同品牌色谱柱对各特征峰的相对保留时间和相对峰面积影响较小，表明不同色谱柱耐用性良好。
[0181]
9.5.2不同柱温的耐用性考察
[0182]
取皂角刺饮片标准汤剂(批号：gt1710002)，研细，取约0.5g，精密称定，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，除柱温分别为40℃、42℃和44℃外，其他色谱条件按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。以花旗松素为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值。结果见表20、表21。其中，表20为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同柱温耐用性考察结果(相对保留时间)，表21为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同柱温耐用性考察结果(相对峰面积)。
[0183]
表20
[0184][0185]
表21
[0186][0187]
结果显示，在不同的柱温下，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在0.22％～1.76％范围内，小于3％，相对峰面积rsd值在1.68％～5.31％范围内，均小于8.0％，表明当柱温
±
2℃时，柱温的改变对各特征峰的相对保留时间影响较小，对各特征峰的相对峰面积具有一定影响。
[0188]
9.5.3不同流速的耐用性考察
[0189]
取皂角刺饮片标准汤剂(批号：gt1710002)，研细，取约0.5g，精密称定，按“4.6”项下确认的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，除流速分别为0.34ml/min、0.35ml/min和0.36ml/min外，其他色谱条件按“3.4”项下确认的色谱条件进样测定。以花旗松素为参照峰s，计算各特征峰与s峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值。结果见表22、表23。其中，表22为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同色谱柱谱耐用性考察结果(相对保留时间)，表23为皂角刺饮片标准汤剂特征图谱不同色谱柱谱耐用性考察结果(相对峰面积)。
[0190]
表22
[0191][0192]
表23
[0193][0194][0195]
结果显示，在不同的流速下，各特征峰与s峰的相对保留时间rsd值在0.03％～0.66％范围内，相对峰面积rsd值在1.93％～2.74％范围内，表明当流速
±
0.01ml/min时，流速的改变对相对保留时间和相对峰面积影响均较小。
[0196]
本发明结合超高效液相色谱-质谱联用法(uplc ms/ms)，构建的皂角刺饮片标准汤剂uplc特征图谱，首先实现对皂角刺饮片标准汤中的黄酮、酚酸和香豆素类成分的同时表征，该特征图谱方法各特征峰分离度较好，方法精密度、重复性和耐用性较好，能较全面地反映皂角刺饮片标准汤剂的化学成分特征，为皂角刺饮片标准汤剂质量标准的建立提供重要参考。
[0197]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0198]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来
说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。