一种毛细管检测板及其制备与应用的制作方法

1.本发明涉及溶液中组分检测领域，具体的涉及到体外诊断检测及分子诊断检测技术领域，尤其是涉及到一种毛细管检测板及其制备与应用。


背景技术：

2.生物芯片(biochip)，早期文献中与基因芯片的概念是一致的，随着技术的深入研究，生物芯片广义上是指根据生物分子间特异相互作用的原理，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对dna、rna、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。根据芯片表面固定的探针类型的不同，生物芯片分为基因芯片、蛋白芯片、组织芯片和细胞芯片等。中国生物芯片研究始于1997-1998年间，但发展迅速，2011年，博奥生物研发的遗传性致聋基因芯片上市，这是我国生物芯片产业化道路上第一个自主研制的商业化产品。生物芯片尤其适合在感染性疾病检测、疫情监控、肿瘤标志物检测和药物滥用等多因素筛查中，其中，中低密度生物芯片的探针数目在几十到几千之间，区别于探针几万至上百万的专业性更高、成本更高、操作更复杂的高密度生物芯片，更适合用于采样现场、icu监护室、手术室、急诊室等现场检测或病人床边的即时检测(point-of-caretesting，poct)领域。
3.蛋白质芯片可以直接用粗生物样品(血清、尿、体液)进行分析，能够同时快速发现多个生物标记物，能够进行低低丰度蛋白质检测，能够实现高通量的验证，还可以实现相对定量的分析检测，在即时检测poct领域有广泛的应用前景。但蛋白芯片有以下不足：(1)蛋白检测芯片主要依赖于抗体和其他大分子，建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体尤其是规模生产会存在很多实际问题。(2)蛋白质芯片制作需要提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性，制作要求高。(3)需要解决通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。
4.自20世纪90年代适配体的概念被提出以来，适配体研究取得调整发展，适配体具有检测限低、高亲和力、强特异性的优势，且易于体外大量合成、重复性好、稳定性高、易于贮存；使得适配体取得广泛应用，包括农药、组织、细胞、病毒、蛋白质、毒素、维生素和过敏原等检测。由于适配体易于标记荧光且活性不受影响，因此易于与多种其他检测技术结合而广泛应用于细胞成像、新药研发、疾病治疗与微生物检测等众多方面。。
5.毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，包含电泳、色谱及其交叉内容，使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。ce技术的研究和应用，给药物分析领域和药品检验工作带来了生机与活力，尤其以对基因工程药物、中成药复方制剂的分析和中药材种属的鉴定，令人瞩目。但毛细管电泳技术也有弱点和不足，最关键的是ce仪器昂贵，很难普遍推广等等。
6.如何把生物芯片技术与毛细管检测技术结合，避免使用大型仪器(如：液相色谱、质谱、毛细管电泳仪)，减少对人力资源与设备资源占用，有效达到方便快捷的poct产品开发与使用要求，是生命过程中相关物质检测的核心关键技术。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种结构简单，操作简单、低成本、适用于溶液中蛋白质、天然产物(含代谢物)、合成化合物、残留农药等多种靶标组分检测的poct产品。
8.为达到上述目的或目的之一，本发明提供了如下技术方案：
9.用于检测靶标物的适配体固定在毛细管检测板的毛细管中，在没有靶标物时，适配体上的荧光基团受到淬灭基团作用无荧光发射；当待测样品溶液中的靶标物与适配体结合后，靶标物促使淬灭基团从适配体上解离，适配体上的荧光基团受到激发光作用形成阳性信号被芯片阅读仪识别。具体为：
10.一种毛细管检测板及其制备与应用，其特征在于，包括：生物芯片、芯片支架及两者围成的毛细管检测板；
11.其中，生物芯片由基片及基片上按布局要求锚定的适配体构成，适配体通过锚定基团与基片结合，适配体的荧光基团受到淬灭基团抑制不能在芯片阅读仪上形成阳性信号；
12.芯片支架有许多平行的凹槽，凹槽之间由间隔嵴分隔，间隔嵴与生物芯片连接组合形成平行排布的两端开口的一组毛细管，称为毛细管检测板；芯片支架的底部延伸形成贮液槽用于承载待测样品溶液，毛细管检测板底部位于贮液槽中并利用毛细现象自动从贮液槽吸取待测样品溶液进入平行排布的毛细管中，促使待测样品与各种适配体进行识别。
13.优选地，利用生物芯片与芯片支架组合围成平行排布的两端开口的一组毛细管。
14.优选地，生物芯片使用适配体探针从而可以同时检测蛋白质、天然产物(含代谢物)、合成化合物(药物、环境污染物等)。
15.优选地，利用毛细现象实现待测样品溶液的自动进样而无需动力设备。
16.优选地，生物芯片由适配体按布局要求在基片上锚定形成，适配体的两个末端分别带有荧光基团和锚定基团，适配体锚定基团完成适配体在基片上的固定，适配体荧光基团与淬灭基团相互作用形成靶标物检测的报告系统；其中，淬灭基团带有寡核苷酸链修饰，该寡核苷酸链能够保证淬灭基因在没有靶标物时与适配体结合并阻止适配体的荧光基团在激发光作用下发荧光；当适配体与靶标物结合时，淬灭基团从适配体上解离，适配体的荧光基团能够在芯片阅读仪中发出荧光信号，报告待测样品溶液中存在靶标物。
17.优选地，先将适配体探针锚定在基片上再与芯片支架组合围成毛细胞管能够有效克服毛细管内探针定位锚定修饰难题。
18.优选地，芯片支架由间隔嵴、凹槽、贮液槽组成，间隔嵴用于连接与固定生物芯片，凹槽能够与生物芯片组合形成大量的、两端开口的、平行排列的毛细管，贮液槽内设置有毛细现象的吸液通道用于保障加入贮液槽内的待测样品溶液能够通过毛细现象自动进入毛细管并与毛细管内的适配体探针进行识别与结合。
19.优选地，生物芯片利用透光的固相片状结构为基片，既可以保证激发光线能够通过基片照射到基片上锚定的适配体修饰的荧光基团，又能够保证荧光基团激发后形成荧光信号可以通过透光的基片直接被识别。
20.优选地，毛细管检测板中每个毛细管内有两条以上的适配体检测带用于检测不同的靶标物。
21.保护一种毛细管检测板及其制备在溶液组分检测领域的应用。
22.一种毛细管检测板的制备方法，包括以下步骤：1)对与靶标物特异结合的适配体核酸链的两个末端分别进行荧光基团修饰与锚定基团修饰，将寡核苷酸链修饰的淬灭基团结合到适配体上，确保适配体的荧光基团不能受激发而形成阳性信号；2)利用适配体上的锚定基团将适配体按预先布局要求锚定在基片表面特定的位置上，形成适配体检测带；3)将基片带有锚定适配体的一面朝向芯片支架，芯片支架的间隔嵴上涂有粘合胶并完成生物芯片基片与芯片支架的组装，基片与芯片支架紧密连接形成大量平行排布的两端开口的毛细管；4)生物芯片与芯片支架组合后形成平行的毛细管即完成一种毛细管检测板的制备。
23.一种毛细管检测板的应用。将待测样品溶液加入到芯片支架的贮液槽中，待测样品溶液将沿着毛细现象的吸液通道自动进入毛细管检测板内；每根毛细管都利用毛细现象自动吸取待测样品溶液进行检测，当待测样品溶液中的靶标物与相应的适配体识别与结合后，适配体释放淬灭基团并在芯片阅读仪发射荧光信号，芯片阅读仪根据荧光信号及适配体在生物芯片中的布局特点，自动形成待测样品溶液中相关靶标物的检测报告。本发明的有益效果：
24.根据本发明所述的一种毛细管检测板及其制备与应用，利用基片与芯片支架组合的方法制作毛细管，通过预先在基片上按布局锚定适配体的方式，有效克服了在毛细管中点样与加工的复杂性，保证制作工艺流程简单，生产效率高，制造成本低。
25.根据本发明所述的一种毛细管检测板及其制备与应用，利用毛细现象实现待测样品溶液自动进入毛细管进行检测，不需要外置的动力泵，简化检测过程的设备复杂度，提高生产效率高，制造成本低，检测过程简便快捷，适合于poct领域需求。
26.根据本发明所述的一种毛细管检测板及其制备与应用，在毛细管中分别锚定不同靶标物的适配体，能够同时检测多种靶标物，如：蛋白质、天然产物(含代谢物)、合成化合物、残留农药等，符合同时检测多种靶标组分的poct产品市场需求。
27.根据本发明所述的一种毛细管检测板及其制备与应用，提高了生物芯片检测的操作简便性，能够满足生物芯片进入poct领域的需求，能够促进生物芯片走近使用者，走入千家万户，有效为老百姓服务，扩大了生物芯片技术在大健康产业中的应用范围。
附图说明
28.图1为本发明的毛细管检测板结构示意图；a正视图，b侧视图，c芯片支架中用于组装毛细管部分的示意图图2为毛细管检测板适配体检测原理示意图；图3为生物芯片上适配体探针的点样示意图；图4为检测结果的荧光成像图；图中：1、生物芯片；2芯片支架；3、间隔嵴；4、凹槽；5、芯片安装卡位；6、贮液槽；7、毛细现象的吸液通道；8、适配体探针；9基片与间隔嵴连接部位；10、待测样品溶液；11、适配体核酸
链；12、荧光基团；13、淬灭基团；14、淬灭基团的修饰寡核苷酸链；15、靶标物1适配体的阳性结果；16、靶标物2适配体的阳性结果。
具体实施方式
29.下面结合附图详细描述本发明的示例性的实施例，其中相同或相似的标号表示相同或相似的元件。另外，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。在其他情况下，公知的结构和装置以图示的方式体现以简化附图。
30.图1示出了毛细管检测板结构示意图，其中：a正视图，b侧视图，c芯片支架中用于组装毛细管部分的示意图；图2为适配体检测原理示意图。本发明中，适配体上荧光基团受到淬灭基团作用不能发射荧光，将适配体与靶标物结合时会促使淬灭基团释放，适配体上的荧光基团在靶标物存在时能够在芯片阅读仪中形成阳性信号。
31.基于毛细管检测板结构示意图(图1与图2)，根据本发明的总体构思，提供了一种毛细管检测板，包括生物芯片1和芯片支架2，其中，带有荧光基团12的适配体探针8按条带状或点状通过锚定基团固定在生物芯片1的基片上，适配体探针8由基片与间隔嵴连接部位9分隔，见图3；淬灭基团13通过淬灭基团的修饰寡核苷酸链14与适配体核酸链11进行碱基配对结合而实现淬灭基团13对荧光基团12的荧光淬灭作用。
32.芯片支架2由间隔嵴3、凹槽4与贮液槽6构成，其中在最外侧的间隔嵴3上有芯片安装卡位5，用于生物芯片1在芯片支架2上的定位安装；在芯片支架2的间隔嵴3涂胶，将生物芯片1安装到芯片支架2上，生物芯片1的间隔嵴连接部位9与间隔嵴3紧密连接，保证由生物芯片1与芯片支架2的凹槽4组合围成半圆形的平行排列的毛细管组(毛细管检测板)。
33.将待测样品溶液10加入贮液槽6中，贮液槽6与毛细管检测板中的毛细现象的吸液通道7连通，待测样品溶液10通过毛细现象自动进入到毛细管检测板中的每一个毛细管中；进入毛细管中的待测样品溶液10中的靶标物与相应的适配体探针8识别与结合并促使原本结合在适配体核酸链11上的淬灭基团的修饰寡核苷酸链14与适配体核酸链11解离，造成淬灭基团13失去对荧光基团12的淬灭作用；基于图2所示的适配体检测原理，结合有靶标物的适配体探针8可以在芯片阅读仪中形成阳性信号，如图2所示的靶标物1适配体的阳性结果15与靶标物2适配体的阳性结果16，芯片阅读仪根据荧光信号及适配体在生物芯片中的布局特点，自动形成待测样品溶液10中靶标物1与靶标物2的检测报告。
34.待测样品溶液10中不同靶标物分别与相应适配体探针8作用，使相应适配体核酸链11上的淬灭基团13解离并分别激活相应的适配体探针8，适配体探针8上荧光基团12受到芯片阅读仪的激发而形成荧光信号(阳性信号)被芯片阅读仪识别与记录，进而通过芯片阅读仪实现多种靶标物的同步即时检测。
35.整个检测过程仅需要一次加样即可完成样品中多种靶标物的同时检测，操作简单、成本低，能够满足poct检测领域需求，具有显著的经济意义和社会效益。
36.实施例1：一种毛细管检测板及其制备与应用，用于蛋白质样品-牛血清白蛋白bsa的检测，具体流程如下：
37.1)bsa的适配体的选择：按文献中bsa适配体序列进行荧光标记适配体的设计，在适配体核酸链11的5
′
端设计6-fam荧光基团12，与适配体之间用3个腺苷酸间隔，在适配体
核酸链11的3
′
端连续腺苷酸的末端设计了氨基锚定基团。选择bhq1为淬灭基团13，淬灭基团的修饰寡核苷酸14的长度为7个核苷酸并与适配体核酸链11反向平行配对(参考文献：microchimaacta，2018，185(4):241-251)。
38.2)bsa的适配体探针8的委托合成：委托汉金开瑞生物工程有限公司进行合成。
39.3)适配体探针8锚定到基片上：醛基玻璃基片在北京博奥晶典生物技术有限公司订购(厂家：博奥晶典，类型：玻璃基片，规格：长75mm、宽25mm、厚1mm，)，点样仪(进口设备：gesimnano-plotternp2.1/e)，按位预定位置完成适配体探针8在基片上的定位锚定，阵列中点样的间隔为1.35毫米(对应的凹槽4半圆的直径为0.45毫米，间隔嵴3宽度为0.9毫米)。
40.4)芯片支架2的制备：委托加工北京三满科技有限公司完成，芯片支架2的凹槽4为半圆形且直径为0.45毫米，间隔嵴3宽度为0.9毫米。
41.5)在芯片支架2的间隔嵴3上涂布uv无影胶，将制备完成的生物芯片1按支架2的芯片安装卡位5将生物芯片1准确安装在芯片支架2上，使得生物芯片1与芯片支架2围成了一组由直径为0.45毫米的半圆形毛细管组成的毛细管检测板。
42.6)将试剂级别的bsa溶解于蛋白质提取液中，终浓度为0.1％，即为待测样品溶液10。将待测样品溶液10直接加入到芯片支架2的贮液槽6中，bsa溶液沿毛细现象的吸液通道7进入到毛细管检测板的各个毛细管中。
43.7)芯片阅读仪中完成待测样品溶液10的加样，bsa进入毛细管检测板的毛细管后将与适配体核酸链11结合，替换淬灭基团的修饰寡核苷酸链14从而使淬灭基团13从适配体核酸链11上解离，解除淬灭基团13对荧光基团12的淬灭作用，适配体探针8在芯片阅读仪中发出荧光形成阳性信号。
44.8)芯片阅读仪形成荧光检测信号报告，检测图见图4。
45.尽管具体实施方式中示出和描述了本发明所述的实施例为封装的基因芯片，但基于生物芯片领域的普通技术人员而言，可以容易的理解到本发明所述的生物芯片可以应用到蛋白质、天然产物(含代谢物)、合成化合物、残留农药相关检测领域。在不脱离本发明公开的原理和发明内容描述的情况下，可以对所述实施例进行变化，本公开的适用范围由所附权利要求及其等同物限定。