一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法

1.本发明涉及甘蔗种植研究技术领域，尤其涉及一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法。


背景技术：

2.甘蔗为禾本科植物，为我国南方各地常见有栽培植物。具有清热生津，润燥和中，解毒之功效。根瘤菌在根内定居，植物供给根瘤菌以矿物养料和能源，根瘤菌固定大气中游离氮气，为植物提供氮素养料，两者在拮抗寄生关系中处于均衡状态而表现共生现象。根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，与豆科植物共生，通过侵染豆科植物根部形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。根瘤菌与豆科植物的共生是生物固氮体系中作用最强的体系，所固定的氮约占生物固氮总量的65％。在农业生产和固氮生态体系中起着极其重要的作用。
3.甘蔗的生长发育，大致可分为幼苗期、发糵期、茎节伸长期3个阶段；甘蔗在幼苗期以前，主要依靠甘蔗种贮藏的营养，不用向外吸收养分；甘蔗到了发蘖期，会不断地分蘖发枝，而枝叶生长，正需要氮肥；甘蔗到了茎节伸长期，茎杆会长高长粗，叶片会长得宽厚，底下的根系也会长得粗壮。这时是甘蔗生长发育的关键时期，需要大量的氮元素；纵观甘蔗的生长全期，需要氮肥最多。
4.根瘤菌具备优异的固氮功效，而甘蔗生长周期中对氮肥的需求量也较高，但是在现有技术中，根瘤菌接种技术在豆科作物种植中应用较为广泛，却鲜有根瘤菌在甘蔗(禾本科植物)中应用的详细研究方案，让非豆科作物通过生物固氮满足作物生长发育的氮素营养需求是生物学研究和农业科技的一个重要目标。鉴于此，我们提出一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对背景技术中存在的现有技术中根瘤菌在甘蔗中应用的详细研究方案欠缺等的问题，提出一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法。
6.本发明的技术方案：一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法，包括以下研究处理步骤：
7.步骤一：采样；取野外旱坡地割手密的根，存放在塑封袋中，目的用于分离根瘤菌菌；
8.步骤二：分离细菌；取步骤一中割手密根冲洗清除附着的泥土，取每株割手密植株的鲜根5g，经由处理后研磨成匀浆，匀浆液稀释处理后铺在无氮的yma培养基上，经由特定的培养环境长出迗单菌落在yma培养基上划线培养3次纯化菌株；
9.步骤三：鉴定细菌；用引物799f/1492r(agagtttgatcctggctcag/ggttaccttgttacgactt)扩增各固氮菌的16srdna片段(约735bp),测序鉴定细菌的归属；
10.步骤四：根瘤菌内生性检测；筛选出的根瘤菌以约每毫升培养基含约1*105活细菌
的量与甘蔗组培苗在无植物激素和维生素的1/10ms基本培养液中培养，并对培养后的蔗苗处理后分离蔗苗的根和地上苗，浸入无菌磷酸缓冲盐液中研磨匀浆；匀浆液用磷酸缓冲盐液10倍系列稀释，各取100μl铺在培养基上；待菌落长成，计数根瘤菌在蔗苗内的数量，评估根瘤菌的内生定殖能力；
11.步骤五：研究根瘤菌czgrd1在不同基因型甘蔗体内的定殖组织模式；将甘蔗组培苗的整条根切成几段制备观察样本，结合共聚焦显微镜和透射电镜观察扫描；
12.步骤六：利用
15
n同位素稀释技术检测联合固氮；选用新台糖22号rb928064组培苗作为试验种苗，用
15
n稀释法计算蔗苗中来源于n2的固氮率。
13.优选的，所述步骤二中割手密研磨成匀浆之前，将获取的每株割手密植株的鲜根在氯氨t溶液中搅拌，搅拌时间为15min，并取出后通过无菌水冲洗根样6次；匀浆液稀释处理采用磷酸缓冲盐液10倍系列稀释，稀释后的匀浆液取100μl铺在无氮的yma培养基上。
14.优选的，所述步骤二中特定的培养环境为：培养温度条件为28℃，培养周期时间为5-15天。
15.优选的，所述步骤四中采用lin等(2012)的方法进行根瘤菌的内生性检测；根瘤菌与甘蔗组培苗在基本培养基中培养时间为7天；培养后的甘蔗苗处理包括以下处理步骤：a、蔗苗用70％的乙醇浸泡1min；b、1％(w/v)氯铵t溶液浸泡15min；c、无菌水冲洗6次。
16.优选的，所述步骤五中共聚焦显微镜和透射电镜观察扫描过程为以下程序：
①
、将观察样本用0.25％的琼脂糖封在两层盖玻片间，所述盖玻片的尺寸为24mm*60mm；
②
、采用leica tcs sp5 lscm配置的倒置leica dmi 6000显微镜的i3滤镜(bp450－490，dm510，lp515)通光照射根样，用10*0.40、20*0.70和40*0.60物镜观察；
③
、对选定位点用488nm激光激发，用500nm-530nm带检测gfp荧光，在600nm-800nm间调整带宽检测根的自发荧光；
④
、用lasaf程序控制xy平面扫描以1μm步距沿z轴从根表向根内逐层进行，依需要和激光扫描深度的限制及可采集根自发荧光的限制，扫描距离在50μm到150μm间。
17.优选的，所述步骤六中新台糖22号rb928064经由以下处理步骤后再进行固氮率的计算，具体包括以下处理步骤：s1、组培苗移入基质中炼苗2周,再移入均匀混有稳定同位素
15
n(10.11atom％)硫酸铵(10mg/kg)的基质；s2、选用不接种组培苗为对照；s3、移栽5天后，通过添加无糖的1/10ms基本盐溶液的量控制基质氮含量；s4、过70天检测接种蔗苗与s2中不接种对照蔗苗的干重、氮含量和各种酶活性；s5、将蔗苗烘干后采用研磨机充分研细，取10mg干粉用delta plusad ea-irms质谱仪测定
15
n同位素含量；s6、采用
15
n稀释法计算蔗苗中来源于n2的固氮率。
18.优选的，所述s1中的基质为沙和珍珠岩，所述沙与珍珠岩的质量比为1:1。
19.优选的，所述s6中固氮率的计算公式为：ndfa＝100*[1-(接种蔗苗
15
natom％/不接种对照蔗苗
15
natom％)]。
[0020]
优选的，所述步骤五中czgrd1的平均尺寸为1.1-1.5μm*0.8-1.0μm。
[0021]
与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
[0022]
1、本发明中通过从割手密中分离根瘤菌，并将根瘤菌进行鉴定，确定根瘤菌的归属，评估筛选到的根瘤菌czgrd1在甘蔗苗中的内生定殖特性，并对czgrd1在不同基因型的甘蔗体内的定殖组织模式进行研究，最终确定根瘤菌czgrd1与不同基因型甘蔗苗的固氮效率，从而明确根瘤菌能与甘蔗联合固氮的特性；
[0023]
2、本发明通过对一株从割手密中分离得到的根瘤菌与不同基因型甘蔗定殖能力和固定效率的研究，提出根瘤菌能够和甘蔗联合固氮，根瘤菌从根部进入甘蔗体内，在固氮酶的作用下，可以把空气中的分子态氮转变为植物可以利用的氨态氮，源源不断地把氮输送给植株利用，能够促进甘蔗生长，减少甘蔗生产上的化肥施用量。
[0024]
3、综上所述，本发明提出的根瘤菌促进甘蔗生长和与甘蔗联合固氮的研究，为根瘤菌与非豆科植物的联合固氮提供了一个新的模式，为甘蔗生产上建立减肥高效开辟新途径。
附图说明
[0025]
图1是接种czgrd1对新台糖22号和rb928064甘蔗组培苗生物量、n含量和
15
n稀释的作用的结果柱状图；
[0026]
图2是接种czgrd1对新台糖22号和rb928064甘蔗种茎苗生物量、n含量和
15
n稀释的作用的结果柱状图；
[0027]
图3是接种czgrd1对不同品种甘蔗组培苗叶片中酶活性的影响的结果柱状图；
[0028]
图4是接种czgrd1对不同品种甘蔗种茎苗叶片中酶活性的影响的结果柱状图。
具体实施方式
[0029]
下文结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
[0030]
实施例
[0031]
如图1-4所示，本发明提出的一株根瘤菌的分离鉴定和促进甘蔗生长的研究方法，包括以下研究处理步骤：
[0032]
步骤一：采样；取野外旱坡地多株割手密的根，存放在塑封袋中，目的用于分离固氮菌；
[0033]
步骤二：分离根瘤菌；取步骤一中割手密根冲洗清除附着的泥土，取每株割手密植株的鲜根5g，经由处理后研磨成匀浆，匀浆液稀释处理后铺在无氮的yma培养基上，经由特定的培养环境(特定的培养环境为：培养温度条件为28℃，培养周期时间为5-15天)长出迗单菌落在yma培养基上划线培养3次纯化菌株；割手密研磨成匀浆之前，将获取的每株割手密植株的鲜根在氯氨t溶液中搅拌，搅拌时间为15min，并取出后通过无菌水冲洗根样6次；匀浆液稀释处理采用磷酸缓冲盐液10倍系列稀释，稀释后的匀浆液取100μl铺在无氮的yma培养基上；
[0034]
步骤三：鉴定根瘤菌；用引物799f/1492r(agagtttgatcctggctcag/ggttaccttgttacgactt)扩增各固氮菌的16srdna片段(约735bp),测序鉴定根瘤菌的归属；
[0035]
步骤四：根瘤菌内生性检测；采用lin等(2012)的方法，筛选出的根瘤菌以约每毫升培养基含约1*105活细菌的量与甘蔗组培苗在无植物激素和维生素的1/10ms基本培养液中培养，根瘤菌与甘蔗组培苗在基本培养基中培养时间为7天；并对培养后的蔗苗处理后(蔗苗处理包括以下处理步骤：a、蔗苗用70％的乙醇浸泡1min；b、1％(w/v)氯铵t溶液浸泡15min；c、无菌水冲洗6次)分离蔗苗的根和地上苗，浸入无菌磷酸缓冲盐液中研磨匀浆；匀浆液用磷酸缓冲盐液10倍系列稀释，各取100μl铺在培养基上；待菌落长成，计数根瘤菌在蔗苗内的数量，评估根瘤菌的内生定殖能力；
[0036]
步骤五：研究根瘤菌czgrd1在不同基因型甘蔗体内的定殖组织模式；czgrd1的平均尺寸为1.1-1.5μm*0.8-1.0μm；将甘蔗组培苗的整条根切成几段制备观察样本，结合共聚焦显微镜和透射电镜观察扫描；
[0037]
共聚焦显微镜和透射电镜观察扫描过程为以下程序：
①
、将观察样本用0.25％的琼脂糖封在两层盖玻片间，所述盖玻片的尺寸为24mm*60mm；
②
、采用leica tcs sp5 lscm配置的倒置leica dmi 6000显微镜的i3滤镜(bp450－490，dm510，lp515)通光照射根样，用10*0.40、20*0.70和40*0.60物镜观察；
③
、对选定位点用488nm激光激发，用500nm-530nm带检测gfp荧光，在600nm-800nm间调整带宽检测根的自发荧光；
④
、用lasaf程序控制xy平面扫描以1μm步距沿z轴从根表向根内逐层进行，依需要和激光扫描深度的限制及可采集根自发荧光的限制，扫描距离在50μm到150μm间；
[0038]
步骤六：利用
15
n同位素稀释技术检测联合固氮；选用新台糖22号rb928064组培苗作为试验种苗，用
15
n稀释法计算蔗苗中来源于n2的固氮率；新台糖22号rb928064经由以下处理步骤后再进行固氮率的计算，具体包括以下处理步骤：s1、组培苗移入基质中炼苗2周,再移入均匀混有稳定同位素
15
n(10.11atom％)硫酸铵(10mg/kg)的基质，基质为沙和珍珠岩，所述沙与珍珠岩的质量比为1:1；s2、选用不接种组培苗为对照；s3、移栽5天后，通过添加无糖的1/10ms基本盐溶液的量控制基质氮含量；s4、过70天检测接种蔗苗与s2中不接种对照蔗苗的干重、氮含量和各种酶活性；s5、将蔗苗烘干后采用研磨机充分研细，取10mg干粉用deltaplusadea-irms质谱仪测定
15
n同位素含量；s6、采用
15
n稀释法计算蔗苗中来源于n2的固氮率，固氮率ndfa＝100*[1-(接种蔗苗
15
natom％/不接种对照蔗苗
15
natom％)]。
[0039]
本实施例中选用新台糖22号和rb928064甘蔗作为实验目标；
[0040]
测定内容为：czgrd1促进甘蔗组培苗的生长、czgrd1促进甘蔗种茎苗的生长、接种czgrd1对甘蔗组培苗的影响、接种czgrd1对甘蔗种茎苗的影响；
[0041]
具体包括以下实验方案和实验数据：
[0042]
czgrd1促进甘蔗组培苗的生长
[0043]
将根瘤菌czgrd1接种新台糖22号和rb928064甘蔗组培苗，接种7天后将组培苗移栽到沙中练苗，炼苗15天后移栽于未灭菌土壤中，移栽70天后检测根和地上部的干重和n含量；结果如附图1所示；
[0044]
相比不接种的对照，接种czgrd1使rb928064甘蔗苗高，根系发达，使根、地上苗和整株的干重分别提高了12.7％、11.9％和12.2％，n含量分别提高了24.4％、26.2％和25.6％(差异在5％置信水平显著)；使根、地上苗和整株苗从空气中获得的n素分别为11.21％、13.53％和12.36％。
[0045]
相比不接种的对照，接种czgrd1使roc22甘蔗苗高，使根、地上苗和整株的干重分别提高了9.1％、1.1％和4.5％，n含量分别提高了14.1％、5.1％和7.9％(差异在5％置信水平显著)。使根、地上苗和整株苗从空气中获得的n素分别为7.56％、9.02％和8.29％。
[0046]
czgrd1促进甘蔗种茎苗的生长
[0047]
将根瘤菌czgrd1接种新台糖22号和rb928064甘蔗单芽种茎，待种茎发芽后后移栽于未灭菌土壤中，移栽60天后检测根和地上部的干重和n含量；结果如附图2所示；
[0048]
相比不接种的对照，接种czgrd1使rb928064甘蔗苗高，根系发达，使根、地上苗和整株的干重分别提高了12.7％、12.1％和12.4％，n含量分别提高了20.06％、17.09％和
18.13％(差异在5％置信水平显著)；使根、地上苗和整株苗从空气中获得的n素分别为15.26％、10.23％和12.74％。
[0049]
相比不接种的对照，接种czgrd1使roc22甘蔗苗高，使根、地上苗和整株的干重分别提高了13.11％、9.55％和11.01％，n含量分别提高了19.72％、9.38％和12.78％(差异在5％置信水平显著)；使根、地上苗和整株苗从空气中获得的n素分别为9.22％、10.82％和10.41％。
[0050]
接种czgrd1对甘蔗组培苗的影响
[0051]
用根瘤菌czgrd1接种新台糖22号和rb928064甘蔗组培苗，取生长70天后的叶片进行酶活性分析。研究表明接种czgrd1能显著提高新台糖22号甘蔗组培苗叶片的硝酸还原酶活性(nr)和可溶性糖含量；对谷氨酰胺合成酶活性(gs)和氨基酸含量没有显著影响；参照附图3所示；
[0052]
接种czgrd1能显著提高rb928064甘蔗组培苗叶片的硝酸还原酶活性(nr)和谷氨酰胺合成酶活性(gs)，分别提高8.67％和13.05％；对可溶性糖含量和氨基酸含量没有显著影响。
[0053]
接种czgrd1对甘蔗种茎苗的影响
[0054]
用根瘤菌czgrd1接种新台糖22号和rb928064甘蔗种茎苗，取生长70天后的叶片进行酶活性分析；研究表明接种czgrd1能显著提高新台糖22号甘蔗种茎苗叶片的可溶性糖含量，提高了21.28％；对硝酸还原酶活性(nr)和谷氨酰胺合成酶活性(gs)和氨基酸含量没有显著影响；参照附图4所示；
[0055]
接种czgrd1能显著提高rb928064甘蔗种茎苗叶片的可溶性糖含量、硝酸还原酶活性(nr)和谷氨酰胺合成酶活性(gs)，分别提高了11.21％、3.35％和8.88％；对氨基酸含量没有显著影响。
[0056]
本实施例获得如下结论：根瘤菌czgrd1能提高新台糖22号甘蔗种茎叶片的可溶性糖含量和rb928064甘蔗种茎苗叶片的硝酸还原酶活性(nr)和谷氨酰胺合成酶活性(gs)；czgrd1能显著提高新台糖22号甘蔗组培苗叶片的硝酸还原酶活性(nr)和可溶性糖含量，显著提高rb928064甘蔗组培苗叶片的硝酸还原酶活性(nr)和谷氨酰胺合成酶活性(gs)。根瘤菌与甘蔗联合固氮能有效的促进植株生长和提高植株的生物量，根瘤菌对不同的甘蔗叶片的生理生化特性有不同的影响。
[0057]
上述具体实施例仅仅是本发明的一种优选的实施例，基于本发明的技术方案和上述实施例的相关启示，本领域技术人员可以对上述具体实施例做出多种替代性的改进和组合。