小儿消食片的指纹图谱构建方法及其成分含量的测定方法与流程

1.本发明属于中药质量分析领域，涉及小儿消食片的指纹图谱构建方法及其成分含量的测定方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.小儿消食片(xiao’er xiaoshi pian)由山楂、炒麦芽、六神曲(炒)、炒鸡内金、槟榔、陈皮六味中药组成。收载于《中国药典》一部。在现行2020年版《中国药典》的质量标准中含量测定指标仅有熊果酸，且缺乏整体的质量表征方法。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供小儿消食片的指纹图谱构建方法及其成分含量的测定方法，通过本发明的方法能够保证小儿消食片的稳定性、一致性和可控性。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
6.一方面，一种小儿消食片的指纹图谱构建方法，对若干批次的小儿消食片分别进行溶剂提取获得供试品溶液，以熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、橙皮苷、柚皮苷、槲皮素作为对照品，对供试品溶液和对照品溶液进行超高效液相色谱检测获得色谱图，对色谱图进行分析处理，即得；
7.超高效液相色谱检测过程中采用电雾式(cad)检测器进行检测。
8.超高效液相色谱比高效液相及液相色谱具有更高的检测灵敏度和分辨率。小儿消食片体系复杂，含有大量性质相近的成分，高效液相及液相色谱难以实现完全区分，影响定量准确性。
9.超高效液相色谱的检测器包括紫外检测器、二极管阵列(dad)检测器、示差折光检测器、elsd检测器、电雾式(cad)检测器，这些检测器中dad检测器能够实现全波长检测，可以实现三维谱图分析，更适于指纹图谱的构建，因而在指纹图谱的构建中优先选择dad检测器进行检测。
10.然而，本发明经过实验发现，采用dad检测器，在不同紫外检测波长下，各成分出峰高度不同，而小儿消食片中化学成分类型复杂多样，且存在大量在紫外区只有末端吸收的成分，尤其是对于齐墩果酸和峰熊果酸等五环三萜类化合物dad出峰高度较低，难以分辨，导致色谱峰信息较少，难以获得稳定的标准小儿消食片的指纹图谱。电雾式检测器，又称荷电气溶胶检测器(charged aerosol detection，cad)是一种新型的高灵敏度通用检测器，其检测信号不依赖于被检测物质的化学结构，对不同结构的化合物有统一的响应。与传统的dad检测器比较，其检测灵敏度高于uv的末端波长检测。本发明经过进一步实验意外发
现，采用cad检测器检测的色谱峰信息较全面，指纹特征性更强，更能反映制剂中化合物含量，且基线更平稳，从而能够稳定的获得小儿消食片的标准指纹图谱。
11.小儿消食片中含有熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、橙皮苷、柚皮苷、槲皮素、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、枸橼酸、绿原酸、儿茶素、表儿茶素、槟榔碱、川陈皮素、色氨酸、5-羟甲基糠醛等成分，研究发现，超高效液相色谱中，熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、橙皮苷、柚皮苷、槲皮素6种代表性活性成分具有更好的峰型、分离度，因而选择其作为对照品，有利于提高检测小儿消食片的稳定性、一致性和可控性。
12.超高效液相色谱检测中，流动相的选择方面，本发明前期选择的流动相包括乙腈-水(含0.1％pa)，乙腈-水(含0.04％tfa)，乙腈-水(含0.05％tfa)，乙腈-水(含0.1％tfa)，乙腈-水(含1％甲酸)，乙腈-水(含0.2％甲酸)，乙腈-水(含0.05mol/l甲酸铵)，乙腈(含0.2％甲酸)-水(含0.05mol/l甲酸铵)，乙腈-水(含50mm甲酸铵 甲酸调节ph3-4)，乙腈-水(含50mm甲酸铵 甲酸调节ph2-3)，乙腈-水(含10mm甲酸铵 0.2％甲酸)，乙腈-水(含50mm甲酸铵 nh4oh，ph8-9)，乙腈-水(含2mm甲酸铵 0.1％甲酸，ph3)，乙腈-水(含10mm甲酸铵 1％甲酸，ph3)，乙腈-水(含2mm甲酸铵 0.6％甲酸，ph2)，乙腈-水(含2.5mm甲酸铵 0.1％氨水，ph8-9)，乙腈-水(含2.5mm甲酸铵 0.05％甲酸)，乙腈(含0.05％三乙胺)-水(含0.05％三乙胺)，乙腈-水(含10mm甲酸铵)，乙腈-水(含8mm甲酸铵)，乙腈-水(含5mm甲酸铵)，乙腈-水(含12mm甲酸铵)，甲醇-水(含10mm甲酸铵)，甲醇-水(含8mm甲酸铵)，甲醇-水(含5mm甲酸铵)，甲醇-水(含12mm甲酸铵)溶液等。在一些实施例中，超高效液相色谱检测中，流动相中，流动相a为甲醇，流动相b为7.9～8.1mm甲酸铵的水溶液。实验发现，采用该流动相能够使得峰熊果酸和齐墩果酸能得到完全分离。
13.超高效液相色谱检测中，色谱柱方面，可以选择的色谱柱包括cortecs t3柱(150
×
4.6mm，1.6μm)，xcelect hss t3柱(250
×
4.6mm，5μm)，xbridge amide柱(250
×
4.6mm，5μm)，waters uplc beh c18柱(150
×
4.6mm，1.7μm)，fortis c18柱(250
×
4.6mm，5μm)，ymc triart c18柱(250
×
4.6mm，5μm)。在一些实施例中，超高效液相色谱检测中，采用的色谱柱为waters uplc beh c18(150
×
4.6mm，1.7μm)色谱柱。实验发现，该色谱柱对样品的分离度好。
14.在一些实施例中，超高效液相色谱检测中，柱温为29.0～30.0℃。实验发现，该柱温条件下，熊果酸及齐墩果酸的分离效果更好。
15.在一些实施例中，超高效液相色谱检测中，洗脱程序为：0-5min，5％甲醇；5-20min，5％-20％甲醇；20-40min，20％-33％甲醇；40-70min，33％-55％甲醇；70-80min，55-65％甲醇；80-95min，65-65％甲醇；95-100min，65-76％甲醇；100-145min，76％甲醇；145-148min，76-85％甲醇；148-210min，85-100％甲醇；体积流量0.25～0.35ml/min。实验发现，该色谱条件下，能够使熊果酸及齐墩果酸的分离效果更好、峰型更好。
16.在一些实施例中，分析处理过程中，以一个批次小儿消食片的色谱图作为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，再进行全谱峰匹配获得；利用对照品色谱指认共有峰并进行相似度评价。相似度评价中，相似度为0.971～0.999之间时，相似度良好，色谱条件稳定。
17.溶剂提取的方法可以为加热回流，也可以为超声提取，在一些实施例中，溶剂提取获得供试品溶液的方法为超声提取。研究表明，两种方法提取的效果相同，采用超声提取的
方法，操作简便、效率更快。
18.在一些实施例中，溶剂提取采用甲醇作为溶剂。研究表明，相比其他溶剂(例如体积分数70％甲醇、体积分数50％甲醇、水等)，甲醇作为溶剂提取的供试品溶液，色谱峰较多，色谱峰信号较强，且基线较平稳，所测成分响应值较大，同时杂质干扰少。
19.另一方面，一种小儿消食片指纹图谱，由上述指纹图谱构建方法获得。
20.在一些实施例中，包括44个共有特征峰。
21.在一些实施例中，以齐墩果酸所在的特征峰为参照峰。
22.第三方面，一种小儿消食片成分含量的测定方法，根据上述指纹图谱构建方法获得小儿消食片指纹图谱，根据小儿消食片标准指纹图谱计算得到柚皮苷、橙皮苷、槲皮素、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸含量。
23.第四方面，一种存储介质，所述存储介质存储有小儿消食片指纹图谱，所述小儿消食片指纹图谱由上述指纹图谱构建方法获得。
24.本发明所述的存储介质可以为硬盘、u盘、磁盘、光盘等。能够直接利用已经建立好的小儿消食片指纹图谱直接对待测小儿消食片的指纹图谱进行相似性比较。
25.第五方面，一种小儿消食片指纹图谱在小儿消食片的质量控制中的应用，所述小儿消食片指纹图谱由上述指纹图谱构建方法获得。
26.具体地，方法为：取多个批次的小儿消食片按照上述构建方法得到小儿消食片样品指纹图谱，将该多个批次小儿消食片样品指纹图谱按照均值法生成得到对照指纹图谱；取待检测样品制备供试品溶液，按照上述构建方法的步骤进行操作，获得待检测样品指纹图谱；将待检测样品指纹图谱与小儿消食片对照指纹图谱进行相似性比较，以完成受试品质量一致性评价。
27.本发明的有益效果在于：
28.1、本发明通过改变洗脱体系，选择合适的色谱柱、柱温等获得了分离度好、基准线较平稳，出峰较多且更能反映小儿消食片质量的标准指纹图谱。
29.2、本发明的采用cad检测方法显著优于其它检测方法，通过本发明的检测方法能够获得出峰更好的小儿消食片的标准指纹图谱；
30.3、本发明可以对结构差异较小的成分进行有效的分离，可以更好的标准产品的质量，更准确地测定产品有效成分的含量。
附图说明
31.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
32.图1是本发明实施例1中小儿消食片的指纹图谱；
33.图2是本发明实施例1中对照品的高效液相色谱图；
34.图3是本发明对比例1的uplc-dad图谱；
35.图4是本发明对比例2的uplc-dad图谱；
36.图5是本发明对比例3的uplc-dad图谱；
37.图6是本发明对比例4的uplc-dad图谱；
38.图7是本发明对比例5的uplc-dad图谱；
39.图8是本发明对比例6的uplc-dad图谱；
40.图9是本发明对比例7的uplc-dad图谱；
41.图10是本发明对比例8的uplc-dad图谱；
42.图11是本发明对比例0的uplc-dad图谱；
43.图12是本发明对比例10的uplc-dad图谱；
44.图13是本发明对比例11的uplc-dad图谱；
45.图14是本发明对比例12的uplc-dad图谱；
46.图15是本发明对比例13的uplc-dad图谱；
47.图16是本发明对比例14的uplc-dad图谱；
48.图17是本发明对比例15的uplc-dad图谱；
49.图18是本发明对比例16的uplc图谱。
具体实施方式
50.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
51.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
52.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
53.实施例1
54.小儿消食片标准指纹图谱的建立
55.1、色谱条件
56.色谱柱为waters uplc beh c18柱150
×
4.6mm，1.7μm。流动相为甲醇-8mm甲酸铵水溶液，梯度洗脱：0-5min，5％甲醇；5-20min，5％-20％甲醇；20-40min，20％-33％甲醇；40-70min，33％-55％甲醇；70-80min，55-65％甲醇；80-95min，65-65％甲醇；95-100min，65-76％甲醇；100-145min，76％甲醇；145-148min，76-85％甲醇；148-210min，85-100％甲醇；体积流量0.3ml/min；柱温30℃；进样量10μl。电雾式检测器(cad)条件：雾化器温度35℃，气体源为n2，压力61.2psi，filter 5.0sec。
57.2、供试品溶液的制备
58.小儿消食片(素片，0.3g/片)20片，研细，过50目筛，精密称定，取3.0g，精密加入甲醇溶液25ml，称定质量，超声处理(功率300w、频率50khz)20min，放冷，再称定质量，用甲醇溶液补足减失的质量，0.22μm微孔滤膜滤过，即得。为使样品有足够的代表性，收集不同批次共10批次药品。
59.3、对照品溶液的制备
60.精密称取熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、橙皮苷、柚皮苷、槲皮素对照品适量，加甲醇溶解并定容，得到一定浓度的混合对照品储备液。精密量取一定量所述对照品储备液加溶
剂稀释，得到熊果酸0.125mg/ml、齐墩果酸0.25mg/ml、山楂酸0.1mg/ml、橙皮苷0.050mg/ml、柚皮苷0.05mg/ml、槲皮素0.05mg/ml的混合对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜。
61.4、方法学考察
62.精密度试验
63.精密吸取同小儿消食片(编号s1)供试品溶液，按色谱条件，连续进样检测6次。结果显示，以熊果酸峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰相对保留时间的rsd0.23％-0.44％，相对峰面积的rsd为0.59％～0.77％，表明仪器精密度良好。
64.稳定性试验
65.取同小儿消食片试品溶液(编号s1)，分别于室温下放置0、4、8、12、24、48h，按色谱条件进样检测。结果显示，以熊果酸峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰相对保留时间的rsd为0.27％％～0.43％，相对峰面积的rsd为0.78％～1.03％，表明48内供试品溶液较为稳定。
66.重复性试验
67.取同一批小儿消食片粉末6份(编号s1)，精密称定，制备供试品溶液，按色谱条件进样检测。结果显示，以熊果酸峰的保留时间和峰面积为参照，各共有峰相对保留时间的rsd为0.31％％～0.66％，相对峰面积的rsd为1.21％～1.72％，表明该测定方法具有良好的重复性。
68.5、指纹图谱的建立
69.将10批小儿消食片样品，精密称定，制备供试品溶液，按色谱条件分别进行测定，记录色谱图信息。将实验所得液相色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》进行分析。设置s1号样品色谱图为参照图谱，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，经全谱峰匹配后得到小儿消食片的指纹图谱叠加图及对照图谱(r)。28号峰分离度较好，峰面积也比较稳定，故选择此峰作为参照峰。
70.测量各共有峰的相对保留时间和相对峰面积见表1、2。
71.表1 10批小儿消食片uplc指纹图谱共有峰相对保留时间
72.[0073][0074]
表2 10批小儿消食片uplc指纹图谱共有峰相对峰面积
[0075]
[0076][0077]
6、共有峰的确定
[0078]
根据10批小儿消食片指纹图谱，通过相似度评价软件，分别匹配了44个共有峰，共有峰占总峰面积》89％。样品峰经与对照品比较分析，指认了其中6个共有峰。
[0079]
7、指纹图谱相似度评价
[0080]
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》对10批小儿消食片进行相似度评价。结果显示，10批样品与对照指纹图谱的相似度在0.971～0.999之间，表明10批样品的相似度良好，色谱条件稳定。
[0081]
实施例2
[0082]
样品含量测定
[0083]
1、线性关系考察
[0084]
精密吸取混合对照品溶液适量，用甲醇稀释制成系列浓度的混合对照品溶液。经0.22μm微孔滤膜滤过后，取续滤液10μl，按色谱条件进样分析，记录峰面积。以进样量x(μg)为横坐标，峰面积y为纵坐标，进行线性回归，结果，各待测成分均在其相应质量范围内与其峰面积的线性关系良好(r均不低于0.9993)，详见表3。
[0085]
表3各对照品线性回归方程
[0086][0087]
2、加样回收试验
[0088]
取药材细粉(s1)，3份，精密称定，置于50ml量瓶中，分别加入混合对照品溶液0.5、1.0、1.5ml，各平行3份，加甲醇定容，制备供试品溶液，进样，测定，计算熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、橙皮苷、柚皮苷、槲皮素回收率分别为98.8％，95.9％，101.5％，103.1％，102.4％，103.1％，rsd分别为2.44％，0.66％，0.99％，0.81％，1.33％，2.07％。结果表明本方法符合分析方法学要求。
[0089]
含量测定结果：在选定的色谱条件下，取各供试品溶液10μl注入高效液相色谱仪。计算各化合物含量。含量测定结果见表4。
[0090]
表4小儿消食片中6种化合物含量测定结果(n＝3)
[0091]
[0092][0093]
实施例3
[0094]
uplc色谱条件优化
[0095]
1、考察不同流动相系统及流动相梯度
[0096]
在流动相选择方面，考察了乙腈-水(含0.1％pa)，乙腈-水(含0.04％tfa)，乙腈-水(含0.05％tfa)，乙腈-水(含0.1％tfa)，乙腈-水(含1％甲酸)，乙腈-水(含0.2％甲酸)，乙腈-水(含0.05mol/l甲酸铵)，乙腈(含0.2％甲酸)-水(含0.05mol/l甲酸铵)，乙腈-水(含50mm甲酸铵 甲酸调节ph3-4)，乙腈-水(含50mm甲酸铵 甲酸调节ph2-3)，乙腈-水(含10mm甲酸铵 0.2％甲酸)，乙腈-水(含50mm甲酸铵 nh4oh，ph8-9)，乙腈-水(含2mm甲酸铵 0.1％甲酸，ph3)，乙腈-水(含10mm甲酸铵 1％甲酸，ph3)，乙腈-水(含2mm甲酸铵 0.6％甲酸，ph2)，乙腈-水(含2.5mm甲酸铵 0.1％氨水，ph8-9)，乙腈-水(含2.5mm甲酸铵 0.05％甲酸)，乙腈(含0.05％三乙胺)-水(含0.05％三乙胺)，乙腈-水(含10mm甲酸铵)，乙腈-水(含8mm甲酸铵)，乙腈-水(含5mm甲酸铵)，乙腈-水(含12mm甲酸铵)，甲醇-水(含10mm甲酸铵)，甲醇-水(含8mm甲酸铵)，甲醇-水(含5mm甲酸铵)，甲醇-水(含12mm甲酸铵)溶液等几种不同流动相在不同比例等度、梯度洗脱程序下的色谱行为，结果表明，在甲醇-水(含8mm甲酸铵)溶液梯度洗脱程序下，主要色谱峰熊果酸和齐墩果酸能得到完全分离。
[0097]
2、考察不同色谱柱
[0098]
对不同品牌的色谱柱进行考察，分别为cortecs t3柱(150
×
4.6mm，1.6μm)，xcelect hss t3柱(250
×
4.6mm，5μm)，xbridge amide柱(250
×
4.6mm，5μm)，waters uplc beh c18柱(150
×
4.6mm，1.7μm)，fortis c18柱(250
×
4.6mm，5μm)，ymc triart c18柱(250
×
4.6mm，5μm)。结果显示，waters uplc beh c18柱(150
×
4.6mm，1.7μm)对样品的分离度较好。
[0099]
3、考察不同柱温
[0100]
分别对柱温20、25、30℃进行考察。发现熊果酸及齐墩果酸在柱温选择30℃时分离效果好。
[0101]
为了说明本技术构建方法的效果，试验了不同的对比例1-14。其色谱条件如下。
[0102]
对比例1与实施例1的区别仅在于柱温不同，对比例1采用柱温25度，所得色谱图参见图3，可以看出熊果酸没得到完全分离。
[0103]
对比例2与实施例1的区别仅在于流动相甲酸铵浓度为12mm，所得色谱图参见图4，可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0104]
对比例3的其他步骤同实施例1，梯度洗脱程序如表5，所得色谱图参见图5，可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0105]
表5对比例3梯度洗脱程序
[0106][0107]
对比例4的其他步骤同实施例1，梯度洗脱程序如表6，所得色谱图参见图6，可以看出齐墩果酸与熊果酸峰型不对称。
[0108]
表6对比例4梯度洗脱程序
[0109][0110][0111]
对比例5的其他步骤同实施例1，梯度洗脱程序如表7，所得色谱图参见图7，可以看出熊果酸峰型不对称。
[0112]
表7对比例5梯度洗脱程序
[0113][0114]
对比例6的洗脱条件，柱温25度，流动相甲酸铵浓度为5mm，其他步骤同实施例1，所得色谱图参见图8，可以看出齐墩果酸未得到完全分离。
[0115]
对比例7的洗脱条件，柱温30度，流动相甲酸铵浓度为5mm，其他步骤同实施例1，所得色谱图参见图9，可以看出齐墩果酸未得到完全分离。
[0116]
对比例8的洗脱条件，柱温25度，流动相甲酸铵浓度为5mm，其他步骤同实施例1，梯度洗脱程序如表8，所得色谱图参见图10，可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0117]
表8对比例8、9的洗脱程序表
[0118][0119]
对比例9的洗脱条件，柱温30度，流动相甲酸铵浓度为5mm，其他步骤同实施例1，梯度洗脱程序如表8，所得色谱图参见图11。可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0120]
对比例10的洗脱条件，色谱柱cortecs t3柱(150
×
4.6mm，1.6μm)，柱温25度，流速0.3ml/min，梯度洗脱程序如表9，所得色谱图参见图12。可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0121]
表9对比例10的洗脱程序表
[0122]
[0123]
对比例11的洗脱条件，色谱柱cortecs t3柱(150
×
4.6mm，1.6μm)，柱温25度，流速0.3ml/min，梯度洗脱程序如表10，所得色谱图参见图13。可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0124]
表10对比例11的洗脱程序表
[0125][0126]
对比例12的洗脱条件，色谱柱xcelect hss t3柱(250
×
4.6mm，5μm)柱温25度，流速1.0ml/min，梯度洗脱程序如表11，所得色谱图参见图14。可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0127]
表11对比例12的洗脱程序表
[0128][0129]
对比例13的洗脱条件，色谱柱xcelect hss t3柱(250
×
4.6mm，5μm)柱温25度，流
速1.0ml/min，梯度洗脱程序如表12，所得色谱图参见图15。可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0130]
表12对比例13的洗脱程序表
[0131][0132][0133]
对比例14的洗脱条件，色谱柱eclipse ddb c18柱(250
×
4.6mm，5μm)柱温25度，流速1.000ml/min，梯度洗脱程序如表13，所得色谱图参见图16。可以看出齐墩果酸与熊果酸没得到完全分离。
[0134]
表13对比例14的洗脱程序表
[0135][0136]
实施例4
[0137]
检测器的选择
[0138]
小儿消食片中山楂为君药，含有大量五环三萜类化合物等在紫外区只有末端吸收的成分。通过比较小儿消食片的cad与dad多个波长(210、230、270nm)下的色谱峰，发现cad条件下反映的色谱峰信息较全面，指纹特征性更强，更能反映制剂中个化合物含量，且基线更平稳，因此本研究选用cad检测器建立小儿消食片指纹图谱。对比例15为按照实施例1的构建方法，分别考察dad检测波长为210nm、230nm、270nm对色谱图的影响，所得谱图参见图17。由图17可以看出，不同紫外检测波长下，各峰的出峰高度不同，主要成分28，29号峰出峰高度较低，无法很好的区分辨。
[0139]
实施例5
[0140]
样品的前处理方法考察
[0141]
1、考察不同比例提取方式
[0142]
分别采用加热回流提取和超声提取2种方法提取小儿消食片中的主要化学成分，以色谱峰数量和峰面积作为评价指标。结果表明，二者提取效果相当，故选择操作简便、快速的超声提取法。
[0143]
2、考察不同比例的提取溶剂
[0144]
考察比较了不同提取溶剂的提取效果。对比例16为分别采用甲醇，体积分数70％甲醇，体积分数50％甲醇，水进行提取，考察过程中仅改变提取溶剂。结果见图18，提取总色谱峰面积见表12。把色谱峰、峰面积、基线等因素作为指标，采用体积分数甲醇作为提取溶剂时，色谱峰较多，色谱峰信号较强，且基线较平稳，所测成分响应值较大，同时杂质干扰少，故最终选择采用甲醇作为提取溶剂。
[0145]
表12不同提取溶剂提取色谱峰总面积
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3、考察不同超声时间
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进一步考察了提取时间(10、20、30min)的影响，结果发现，样品成分在20min时即可达到充分提取，为提高效率，选择20min作为最终提取时间。
[0149]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。