降血糖天然提取物及其制备糖尿病和代谢综合症药产品的应用的制作方法

1.本技术涉及降血糖天然提取物技术领域，尤其涉及降血糖天然提取物及其制备糖尿病和代谢综合症药产品的应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种由于胰岛素分泌，胰岛素作用或两者一起作用引起的高血糖症。糖尿病者体内的胰岛素对靶组织的作用不足，其胰岛素作用不足是由于在激素作用的复杂途径中，一个或多个点上胰岛素分泌不足或者组织对胰岛素的反应减弱所致。在二型糖尿病患者中，高血糖症(本身是肝葡萄糖输出的强效抑制剂)的发作，以及正常胰岛素血症或高胰岛素血症，表明存在肝脏胰岛素不敏感性。在整个生理范围内，所有血浆胰岛素浓度下均观察到肝脏对胰岛素的严重不敏感性。除了减少对肝葡萄糖输出的抑制作用外，肝胰岛素不敏感性还表现为肝葡萄糖摄取的减少。
3.而二型糖尿病患者往往伴随着肝脏胰岛素不敏感性发生。肝脏胰岛素不敏感性发展机制复杂。据推测，由于肝脏相对于其他组织对胰岛素的高度敏感性，在糖尿病发病早期，p细胞应答受损导致肝葡萄糖输出升高，同时可能导致葡萄糖中毒引起的外周胰岛素不敏感性和代偿性高胰岛素血症，由此引起患者代谢功能紊乱，使得患者患上相关的代谢综合症。
4.在应对这些情况发生时，现有技术希望从药食同源的天然原料中获得作为改善或治疗药物的材料，比如黄芪、三七等。


技术实现要素：

5.为提供更为广泛的药食同源材料以将其应用降血糖相关制品中，本技术的目的至少提供一种降血糖天然提取物，以一定程度上使发掘具有的降血糖和缓解相关代谢综合症作用。
6.第一方面，本技术实施例公开了一种降血糖天然提取物的制备方法，包括以下步骤：
7.取山茱成熟果肉，经水和醇浸泡过夜后，过滤，滤渣干燥得到固体料；
8.将所述固体料加入至提取溶剂中进行冷凝回流提取，得浸膏；
9.将所述浸膏用乙醇混悬后，用萃取溶剂进行萃取，去除上层油相和下层沉淀物，得提取液；
10.将所述提取液用填充有超高交联吸附树脂的层析柱进行纯化处理，用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥，即可得到所述降血糖天然提取物。
11.在本技术实施例中，所述超高交联吸附树脂选自羟基环氧基超高交联吸附树脂、酯基超高交联吸附树脂、氨基超高交联吸附树脂和胺基修饰超高交联吸附树脂中的一种。
12.在本技术实施例中，所述提取溶剂为体积比为12:88的乙醇和甲醇的混合溶剂，体
积比为17:83的dmf和甲醇的混合溶剂，体积比为17:83的dmso和甲醇的混合溶剂，体积比依次为15:5:80的dmf、乙醇和甲醇的混合溶剂，或体积比依次为17:5:78的dmso、乙醇和甲醇的混合溶剂。
13.在本技术实施例中，所述萃取溶剂为体积比为75:25的乙酸乙酯和四氢呋喃的混合溶剂。
14.在本技术实施例中，所述固体料与所述提取溶剂的重量比为1:(15～18)。
15.在本技术实施例中，在对层析柱洗脱时，先水洗2～3倍柱体积，再用60～75％的乙醇水溶液进行梯度洗脱3-4倍柱体积。
16.在本技术实施例中，在对层析洗脱液进行收集时，从开始用60～75％的乙醇水溶液进行梯度洗脱的0.5倍柱体积收集，收集直至2倍柱体积的洗脱液。
17.第二方面，本技术实施例公开了所述的制备方法制得的降血糖天然提取物，包含5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚、β-谷甾醇、取没食子酸、原儿茶酸、取莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和山茱萸新苷；其中，5-羟甲基糠醛含量不低于150mg/g，5,5-二甲基糠醛醚含量不低于230mg/g，β-谷甾醇含量不低于190mg/g。
18.在本技术实施例中，所述取没食子酸含量不高于20mg/g，所述原儿茶酸含量不高于20mg/g，莫诺苷含量不高于15mg/g、獐牙菜苷20mg/g、马钱苷15mg/g和山茱萸新苷15mg/g。
19.第三方面，本技术实施例公里了第一方面所述的制备方法制备的降血糖天然提取物、或第二方面所述的制备方法的应用，所述应用包括在制备预防或治疗糖尿病制品中的应用、在制备预防或治疗糖尿病肝功能损伤制品中的应用以及在制备预防或治疗糖尿病相关代谢综合症制品中的应用中的至少一种。
20.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果：
21.本技术通过初步提取、再次提取、层析和精制的步骤，制得降血糖天然提取物主要含有5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇，而进一步通过动物实验证实了其降血糖、降脂肪以及对肝脏的保护作用，并且验证了其对胰岛素敏感性信号通路irs-1/pi3k/akt的调节作用，为其作为糖尿病及其代谢综合症的相关制品原料提供了一种重要潜在应用。
附图说明
22.图1为本技术提供的实施例1-4的液相色谱图。
23.图2为本技术提供的实施例5-8的液相色谱图。
24.图3为本技术提供的对比例1-4的液相色谱图。
25.图4为本技术提供的对比例5的液相色谱图。
26.图5为本技术提供的实施例1的柱层析洗脱曲线图。
27.图6为本技术提供的实施例2的柱层析洗脱曲线图。
28.图7为本技术实施例提供的ms、egthp、lg、cs的标准曲线和标准方程图。
29.图8为本技术实施例提供的ga、pca的标准曲线和标准方程图。
30.图9为本技术实施例提供的hmf、dmfe和ss的标准曲线和标准方程图。
具体实施方式
31.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
32.本技术发明人以山茱萸为原料，采用独特的提取工艺对其进行提取，得到一种特殊的降血糖提取物，其中主要含有5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇，而进一步通过动物实验证实了其降血糖、降脂肪以及对肝脏的保护作用，并且验证了其对胰岛素敏感性信号通路irs-1/pi3k/akt的调节作用，为其作为糖尿病及其代谢综合症的相关制品原料提供了一种重要潜在应用。
33.为对本技术的发明过程进行详细说明，下方将分别对该降血糖天然提取物的制备过程以及其动物实验过程进行详细说明，其中涉及未特别说明的试剂和仪器均可从商业途径获得。
34.降血糖天然提取物的制备
35.本技术实施例公开的降血糖天然提取物主要以山茱萸为原材料，从其中提取得到，具体的提取过程如下。
36.一、材料与方法
37.1、提取过程
38.一个实施例1的制备过程为：
39.1.1、原材料的选取及预处理
40.山茱萸(北京同仁堂)成熟果实10.00g，人工去核，得到山茱萸果肉，碾碎，用于3倍水浸泡过夜，过滤，得滤渣用纯乙醇浸泡过夜，过滤，得滤渣，干燥后得到固体料6.23g。
41.1.2、初步提取
42.精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为12(乙醇):88(甲醇)的混合溶剂，可于30～45℃条件(优选为35℃)下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
43.1.3、再次提取
44.将上述浸膏，加入3倍重量的色谱纯乙醇混悬后，在向溶液中加入萃取溶剂进行萃取，萃取溶剂为体积比为75(乙酸乙酯)：25(四氢呋喃)充分混合后静置，去除上层油相和下层沉淀物即可得到提取液。
45.1.4、层析和精制
46.将上述步骤得到的提取液，用填充有羟基环氧基超高交联吸附树脂(西安蓝晓科技新材料股份有限公司)的层析柱进行纯化处理。层析柱的填充高径比为8:1，将上述提取液上样于层析柱吸附后，先用水洗2倍柱体积，再用65～75％的乙醇水溶液进行梯度洗脱4倍柱体积，按照图中的洗脱曲线进行收集，合并洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，即可得到最终的提取物2.65g。
47.实施例2的制备过程为：
48.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料5.72g。
49.2)初步提取：与实施例1相同。
50.3)再次提取：与实施例1相同。
51.4)层析和精制：采用填充酯基超高交联吸附树脂(amberlite xad7hp罗门哈斯树脂)的层析柱进行纯化处理，层析柱的填充高径比为8:1，将上述提取液上样于层析柱吸附后，先用水洗3倍柱体积，再用60～70％的乙醇水溶液进行梯度洗脱3倍柱体积，按照图中的洗脱曲线进行收集，合并洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，即可得到最终的提取物2.54g。
52.实施例3的制备过程为：
53.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.18g。
54.2)初步提取：与实施例1相同。
55.3)再次提取：与实施例1相同。
56.4)层析和精制：采用填充氨基超高交联吸附树脂(氨基羧酸基螯合树脂，邦凯)的层析柱进行纯化处理，层析柱的填充高径比为8:1，后续与实施例1相同，最终得到的提取物2.65g。
57.实施例4的制备过程为：
58.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料5.98g。
59.2)初步提取：与实施例1相同。
60.3)再次提取：与实施例1相同。
61.4)层析和精制：采用填充胺基修饰超高交联吸附树脂(nda-99，南京戈德环保科技有限公司)的层析柱进行纯化处理，层析柱的填充高径比为8:1，后续与实施例1相同，最终得到的提取物2.73g。
62.实施例5的制备过程为：
63.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.24g。
64.2)初步提取：精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为15dmf(n,n-二甲基甲酰胺):75(甲醇)的混合溶剂，可于35℃条件下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
65.3)再次提取、层析和精制的步骤与实施例1相同，最终得到的提取物2.65g。
66.实施例6的制备过程为：
67.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.32g。
68.2)初步提取：精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为17dmso(二甲基亚砜):83(甲醇)的混合溶剂，可于35℃条件下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
69.3)再次提取、层析和精制的步骤与实施例1相同，最终得到的提取物2.78g。
70.实施例7的制备过程为：
71.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.21g。
72.2)初步提取：精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为15dmf(二甲基亚砜):5(乙醇):80(甲醇)的混合溶剂，可于35℃条件下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
73.3)再次提取、层析和精制的步骤与实施例1相同，最终得到的提取物2.69g。
74.实施例8的制备过程为：
75.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.17g。
76.2)初步提取：精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固
体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为17dmso(二甲基亚砜):5(乙醇):78(甲醇)的混合溶剂，可于35℃条件下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
77.3)再次提取、层析和精制的步骤与实施例1相同，最终得到的提取物2.71g。
78.对比例1的制备过程为：
79.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.23g。
80.2)初步提取：精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为100％甲醇，可于35℃条件下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
81.3)再次提取、层析和精制的步骤与实施例1相同，最终得到的提取物2.42g。
82.对比例2的制备过程为：
83.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.19g。
84.2)初步提取：精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为100％乙醇，可于35℃条件下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
85.3)再次提取、层析和精制的步骤与实施例1相同，最终得到的提取物2.23g。
86.对比例3的制备过程为：
87.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.43g。
88.2)初步提取：精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为100％dmf，可于35℃条件下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
89.3)再次提取、层析和精制的步骤与实施例1相同，最终得到的提取物2.16g。
90.对比例4的制备过程为：
91.1)原材料的选取及预处理，与实施例1相同，得到固体料6.28g。
92.2)初步提取：精密称量上述步骤制备的固体料，按照料液重量比1:18的比例将固体料混入至提取溶剂中，提取溶剂为体积比为100％dmso，可于35℃条件下冷凝回流提取3次，每次2h，合并滤液，旋转蒸发仪蒸干，得到浸膏。
93.3)再次提取、层析和精制的步骤与实施例1相同，最终得到的提取物2.36g。
94.将按照实施例1步骤中选取的山茱萸经过预处理后得到的固体料作为对比例5。
95.1.5、绘制洗脱曲线
96.以开始洗脱后0.2bv(柱体积)收集第1管洗脱液，并每隔0.2bv收集一管洗脱液，以洗脱液的260nm处的紫外吸收值为纵坐标，以洗脱液体积为横坐标绘制洗脱曲线，最终合并从开始乙醇水溶液进行梯度洗脱的0.5倍柱体积收集，收集直至2倍柱体积的洗脱液，作为最后进行浓缩和干燥制备提取物的原液。如图5、6所示分别为实施例1和实施例2的洗脱曲线。其他实施例和对比例可分别参照实施例1和实施例2进行收集洗脱液。
97.1.6、提取物成分分析
98.采用hplc分析提取物或者洗脱液中的成分。
99.色谱柱：agilent zorbax xdb-phenyl(100mm
×
2.1mm
×
1.6mm，安捷伦)；以乙睛为流动相a，pbs溶液为流动相b进行梯度洗脱，洗脱程序为0～2min，1％～10％a；2～8min，10
～15％a；8～12min，15％～25％a；12～15min，25％～100％a；15～20min，100％a；20～25min，2％a；柱温：35℃；流速：0.25ml/min；检测波长：260nm；进样量：1μl。
100.取莫诺苷(简称为ms，维克奇公司)标准品、獐牙菜苷(简称为egthp，维克奇公司)、马钱苷(简称为lg，维克奇公司)和山茱萸新苷标准品(简称为cs，维克奇公司)，分别精密称定溶于80％v/v甲醇溶液，配制成每1ml各含0.5mg的第一标准混合溶液。将第一标准混合溶液分别稀释2倍、4倍、6倍和8倍，按照上述方法进行hplc检测，根据获得的色谱图中的峰面积和对应浓度制作第一标准曲线，分别得到ms、egthp、lg和cs的标准方程，结果如图7所示。
101.取没食子酸(简称为ga，默克sigma-aldrich)、原儿茶酸标准品(简称为pca，默克sigma-aldrich)精密称定溶于70％v/v甲醇溶液，配制成每1ml含0.5mg的第二标准混合溶液。将第二标准混合溶液分别稀释2倍、4倍、6倍和8倍，按照上述方法进行hplc检测，根据获得的色谱图中峰面积和对应的浓度制作第二标准曲线，分别得到ga和pca的标准方法，结果如图8所示。
102.取5-羟甲基糠醛(简称为hmf，默克sigma-aldrich)、5,5-二甲基糠醛醚(简称为dmfe，默克sigma-aldrich)和β-谷甾醇标准品(简称为ss，默克sigma-aldrich)精密称定溶于70％甲醇溶液，配制成每1ml含0.1mg的第三标准品溶液。将第三标准混合溶液分别稀释2倍、4倍、6倍和8倍，按照上述方法进行hplc检测，根据获得的色谱图中峰面积和对应的浓度制作第三标准曲线，分别得到hmf、dmfe和ss的标准方法，结果如图9所示。
103.供试品溶液的制备：取上述各实施例和对比例得到的提取物精密称定0.5g，溶于65％v/v甲醇中，配制成每1ml含0.1mg的供试品溶液。密塞，震荡，充分溶解后，离心，过滤，取滤液即得。
104.供试品的检测，将供试品溶液按照上述方法进行hplc检测，根据获得的特征峰面积，以及上述得到各个标准方程，计算得到供试品溶液中ms、egthp、lg、cs、ga、pca、hmf、dmfe和ss的浓度，进而分别计算各实施例和对比例提取物中对应的含量，并将结果列入表1中。
105.实验数据采用excel 2013和spss 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以spss 22.0分别进行单因素方差分析(one-way anova)和duncan’s多重比较。
106.二、结果
107.表1
[0108][0109]
表2
[0110][0111][0112]
表1和表2列出了实施例1-8和对比例1-4分别制得的提取物中各种成分的分析结果，实施例1-8和对比例1-4样品的色谱图分别如图1-5所示。由表1可知，莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和山茱萸新苷在实施例1-8制备的提取物中的含量显著高于对比例1-5，并且实施例5-8对应这四种物质含量进一步低于实施例1-5。表1中，没食子酸和原儿茶酸在提取物中的含量显著高于对比例1-5，并且上实施例5-8对应这两种酸含量也进一步低于实施例1-5。由此说明，经过本技术实施例对山茱萸的提取过程，其中莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷、山茱萸新苷、没食子酸和原儿茶酸均含量得到显著提升。
[0113]
一般而言，山茱萸中的莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷和山茱萸新苷属于环烯醚萜总苷类物质，这类物质已经通过一些实验验证了能够抑制糖尿病大鼠肾皮质糖基化终产物(简
称为ages)的形成，比如马钱干能够有效地控制ages诱导的gmc增殖，通过下调ages/rage/sphkl信号通路，缓解ages诱导的gmcs损伤，从而改善糖尿病肾病(dn)；莫诺普可使ages诱导的huvecs中代谢物水平有不同程度的恢复，其保护作用可能与某些相关代谢通路的调节有关。而没食子酸和原儿茶酸在抑制肿瘤的血管生成、肿瘤细胞的侵袭和转移等方面发挥作用。但是此二类物质在实施例1-8中的含量却不及对比例1-5高。
[0114]
由表2可知，5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇在实施例1-8制备的提取物中的含量均显著高于对比例1-5，并且实施例5-8对应此三种物质在提取物中含量进一步高于对比例1-5，而且实施例1-8制备的提取物中此三种物质含量是对比例1-5的20倍以上，远远大于对比例1-5。由此说明，经过本技术实施例对山茱萸的提取过程，其中莫诺苷、獐牙菜苷、马钱苷、山茱萸新苷、没食子酸和原儿茶酸均含量得到显著提升。此三种物质是分子量较小的物质，一般而言在山茱萸中含量0.15wt％，而本技术实施例通过上述的提取过程，使得最终的提取中含量显著提升，含量均达到200mg/g，重量百分比超过了20％，相对于原材料山茱萸均远远得以提升。而此三种物质并无现有技术验证其具有明显的药理作用。
[0115]
由此综合表1和2可知，本技术实施例1-8制备的提取物中糖苷类物质、有机酸类物质以及5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇含量均相对于山茱萸(对比例5)的含量有显著提升，但是各实施例和对比例制备的提取物中，实施例1-8制备的提取物种糖苷类物质和有机酸物质远低于其含有的5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇，而对比例1-5中的这几类成分含量差异则相反分布。
[0116]
降血糖及对代谢综合症的功能
[0117]
为进一步得知上述实施例制备的提取物的功能，明确其中各类物质含量分布的显著变化，下方将对这些制备的提取物进行相关动物实验。
[0118]
1、材料与方法
[0119]
1.1、实验动物
[0120]
清洁级sprague-dawlay大鼠(南通特洛菲饲料科技有限公司)，在恒温22℃、相对湿度65％～70％、光照周期12h:12h，自由进食标准颗粒型动物饲料，饮自来水，适应饲养1周后开始实验。
[0121]
1.2、造模
[0122]
随机抽取15只大鼠给予普通饲料喂养以作为正常对照组；剩余大鼠给予高脂饲料(曹县蓝昆生物饲料厂)喂养以作为高脂组。3周后，正常对照组的大鼠给予柠檬酸缓冲液(ph＝7.4)10m1/kg体重进行灌胃。高脂组的大鼠给予脂肪乳剂灌胃每天10m1/kg。
[0123]
按照上述方法喂食2个月后，正常对照组和高脂组进行高胰岛素正常血糖钳夹实验(参照血糖钳技术评价两种胰岛素抵抗动物模型，中国糖尿病杂志，2001年9月公开)，确定存在胰岛素抵抗后，将剩余高脂组大鼠腹腔注射链脉佐菌素溶液，按照12mg/kg大鼠体重的剂量进行注射，次日腹腔注射cfa(福氏完全佐剂，美迪西生物医药公司)0.5m1/kg体重，7天后尾静脉采血，用血糖仪(美国强生)测定随机血糖，随机血糖大于11.1mmol/l，说明造模成功。
[0124]
1.3、给药
[0125]
将上述造模成功的大鼠随机分为给药组和给药对照组。给药组大鼠给予每天
10mg/kg体重的样品液进行灌胃，样品液为上述实施例1-8和对比例1-4制备的提取物，以及对比例5制备的固体料，分别用柠檬酸缓冲液(ph＝7.4)配置溶液。给药对照组大鼠给予每天10mg/kg体重的盐酸吡格列酮片(上海朝晖药业有限公司)。并且在给药期间，给药组合给药对照组同时给予高脂饲料灌胃。
[0126]
1.4、血糖检测
[0127]
给药4周后，本实验在大鼠禁食不禁水12小时后测定空腹血糖。采血针安装在采血笔内，根据大鼠尾部皮肤厚薄程度调好采血针的深度，反复揉搓大鼠尾巴，直至血运丰富；用75％的酒精消毒大鼠尾巴，待干；取血糖试纸注意手指不可触及试纸测试区，取出后随手将盖筒盖紧；采血笔紧挨大鼠尾巴，按动弹簧开关，针刺鼠尾；将一滴饱满的血滴到试纸测试区域后将试纸插入血糖仪内进行检测；用棉棒按压鼠尾数秒至不出血为止；记录血糖仪的读数。
[0128]
1.5、血清测定
[0129]
在给药4周后，将所有大鼠禁食6小时以上，眼眶取大鼠全身血液后断颈法处死大鼠，取大鼠肝脏部分组织使用10％福尔马林溶液浸泡并保存在4℃冰箱待后续实验使用。大鼠血液3000rpm离心15min后，分装血清保存在-80℃以备后续实验操作使用。取大鼠的心脏，肝脏，脾脏，肺脏，肾脏，大脑和结肠称量后冷冻保存在-80℃以备后续实验使用。
[0130]
分别用tc试剂盒、tg试剂盒、ldl-c试剂盒、hdl-c试剂盒、ri试剂盒分别检测大鼠血清中总胆固醇(简称tc)、甘油三酯(简称为tg)和胰岛素(简称为ri)含量，试剂盒均购自日本和光纯药工业株式会社。
[0131]
将每组大鼠肝脏分别用生理盐水匀浆，在4℃以12,000rpm离心15分钟，收集上清液在新的ep管中并保存在-80℃直至使用，使用alt和ast试剂盒检测大鼠肝脏中alt(谷丙转氨酶)和ast(谷草转氨酶)酶含量，试剂盒购自上海mlbio公司。
[0132]
1.6、蛋白质免疫印迹分析法
[0133]
(1)提取小鼠肝脏组织中的总蛋白。使用液氮研磨小鼠肝脏组织后，加入ripa裂解液。使其在冰上充分裂解30分钟，然后将裂解(12000rpm,4℃离心20min，收集上清液，加入蛋白质上样缓冲液煮沸8分钟，并保存在-20℃以备后续实验使用。使用bca检测试剂盒(美国glpbio)测量上清液总蛋白浓度。
[0134]
(2)提取的总蛋白用于sds-page电泳。用微量移液枪将各样品20μg加入样品槽内，sds-page电泳分离蛋白质，首先将电泳仪调至80v恒压30分钟使样品过浓缩胶，接着调至100v，60分钟使样品过分离胶。
[0135]
(3)转模：按照所需蛋白分子量切开凝胶，将经过甲醇溶液活化后的pvdf膜与滤纸浸入转模缓冲液中浸泡5分钟。准备转模夹，阴极朝下，按照顺序分别放入海绵(转模缓冲液浸湿)，三层滤纸，凝胶，pvdf膜，三层滤纸和海绵(转模缓冲液浸湿)，注意滤纸、凝胶和pvdf膜之间不能有气泡。接着将装置好的转膜夹放入转模槽，槽内装满冰冷的转膜液。打开电源，设置条件为恒压100v进行转模操作，转模时间根据蛋白的分子量大小进行确定。
[0136]
(4)封闭和孵育：将pvdf膜取出后放入5％脱脂牛奶中，在摇床上封闭2小时。接着将pvdf膜取出，加入相应的一抗并在4℃下孵育过夜。其中一抗使用tbs稀释，akt、p-akt、pi3k、和p-irs-1稀释比例均为1:1500；irs-1稀释比例为1:2000；p-pi3k和β-actin(内参)稀释比例为1:2500。然后取出pvdf膜，使用tbst洗涤5次，分钟，每次10分钟。接着添加相应
的二抗孵育使用为1:20000。
[0137]
(5)显影。首先配置显影液，将显影试剂中的a液和b液等比例混合后避光保存备用。将pvdf膜取出，使用滤纸吸除多余的tbst溶液后放入显影液中孵育3秒，然后将湿润的pvdf膜放入全自动显影仪，通过ecl系统和image j软件分别分析蛋白质免疫印迹和蛋白质免疫印迹定量分析akt、p-akt、irs-1、p-irs-1、pi3k和p-pi3k相对于β-actin的表达水平。
[0138]
1.7、数据处理
[0139]
实验数据采用excel 2013和spss 22.0统计软件进行数据分析进行统计整理，每个数据均测量多次，并通过平均值与其标准偏差进行表示，并以spss 22.0分别进行单因素方差分析(one-way anova)和duncan’s多重比较。
[0140]
2、结果
[0141]
表3
[0142][0143]
表3列出了上述各组大鼠在实验4周后的血糖和胰岛素含量。由表3可知，模型组大鼠的血糖和胰岛素含量均显著高于正常对照组，并且模型组大鼠的血糖含量高于11.1mmol/l，说明造模成功。给药组和给药对照组大鼠的血糖和胰岛素含量均低于模型组，说明二者均对大鼠的胰岛素依赖的糖尿病具有改善作用。并且给药组大鼠的血糖和胰岛素含量显著低于给药对照组，说明本技术实施例提供的降血糖提取物具有更佳的效果。具体至给药组中，实施例1-8的降血糖效果优于对比例1-5，而实施例5-8的降血糖效果最优。
[0144]
表4
[0145][0146]
本实验进一步分析给药4周后大鼠血脂含量的变化，并将其列入表4。由表4可知，模型组相对于正常对照组，大鼠血清中相关血脂含量显著升高，进一步说明造模成功。给药组和给药对照组大鼠血清中相关脂类含量均低于模型组，说明二者均对大鼠的胰岛素依赖的糖尿病具有改善作用。并且给药组大鼠的血脂含量显著低于给药对照组，说明本技术实施例提供的降血糖提取物具有降血脂更佳的效果。具体至给药组中，实施例1-8的降血脂效果优于对比例1-5，而实施例5-8的降血脂效果最优。
[0147]
表5
[0148]
[0149][0150]
表5列出了各组大鼠血清和肝脏中的ast和alt含量结果。由表5可知，模型组大鼠的血清和肝脏中的ast和alt含量均显著高于正常对照组，说明造模后的大鼠肝脏功能受到了损伤，模型大鼠不仅患有糖尿病，其肝脏代谢功能还受到影响。给药组和给药对照组大鼠的血清和肝脏中的ast和alt含量均低于模型组，说明二者均对大鼠的胰岛素依赖的糖尿病具有改善作用。并且给药组血清和肝脏中的ast和alt含量显著低于给药对照组，说明本技术实施例提供的降血糖提取物具有更佳的改善大鼠代谢功能受损效果。具体至给药组中，实施例1-8的改善效果优于对比例1-5，而实施例5-8的改善效果最优。
[0151]
为进一步分析本技术提供的降血糖提取物对糖尿病大鼠改善作用的信号通路，本技术实施例采用了蛋白质免疫印迹分析评估了其对于irs-1/pi3k/akt信号通路的影响。
[0152]
表6相对表达水平
[0153]
[0154]
[0155][0156]
表6列举了大鼠肝脏中akt、p-akt、irs-1、p-irs-1、pi3k和p-pi3k的蛋白相对(β-actin)表达水平。由表6可知，模型组大鼠此六种蛋白表达水平限制低于正常对照组。给药组和给药对照组大鼠的六种蛋白表达水平均高于模型组，说明本技术实施例提供降血糖提取物具有促进大鼠肝脏中此六中蛋白表达的作用，而且实施例1-8的效果优于对比例1-5和给药对照组，而实施例6-8最优。
[0157]
综合上方结果可知，本技术通过构建胰岛素依赖的糖尿病大鼠，发现其血糖、血脂含量以及均具有胰岛素敏感性，而通过对大鼠给予本技术提供的降血糖提取物，能够显著降低大鼠血清中血糖、血脂含量，并且效果优于给药对照组。而在给药组中，实施例1-8提供降血糖提取物能够降血糖、降脂效果更明显，结合前方对实施例1-8和对比例1-5提供的提取物或固体料中活性成分发现，实施例1-8中的主要成分为5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇，而对比例1-5中的主要成分为糖苷类物质和有机酸类物质。由此表明，本技术提供的提取物能够发挥降血糖、降脂作用主要为5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇。
[0158]
进一步的，本技术进一步对大鼠肝脏中ast和alt酶含量进行了检测，结果表明实施例提供的降血糖提取物具有更佳的改善大鼠代谢功能受损效果，实施例1-8的改善效果优于对比例1-5，而实施例5-8的改善效果最优。而肝脏是机体维持能量平衡的代谢器官，当肝脏发生胰岛素敏感时会引起肝脂肪变性和肝功能受损，ast和alt两个重要的氨基转移酶会从受损的肝组织释放到血液中，进而使得机体产生糖尿病相关代谢综合症状，影响机体的代谢功能。通过上述结论表明了本技术实施例提供的降血糖提取物对对糖尿病引起的肝损伤的保护作用，尤其是实施例1-8的改善作用。结合上方对实施例1-8和对比例1-5的成分分析结果可知，该降血糖提取物中的5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇作为主要成分，起到主要的保护作用。
[0159]
为进一步探究这些降血糖提取物对大鼠肝脏的保护分子机制，上方结论表明本技术实施例提供的降血糖提取物能够显著促进大鼠肝脏中akt、p-akt、irs-1、p-irs-1、pi3k和p-pi3k蛋白的表达。
[0160]
一般而言，胰岛素是一种由胰腺p细胞分激素。在正常胰岛素敏感的条件下，胰岛素会抑制糖酵解和葡萄糖储存，促进肝细胞吸收血糖并将其转化为肝糖原，刺激蛋白质的
合成，达到控制血糖的作用。同时，肝脏胰岛素与胰岛素受体相结合，激活肝细胞中的酪氨酸激酶，刺激胰岛素受体底物1(irs-1)和胰岛素受体底物2(irs-2)，使二者磷酸化，即生成p-irs-1和p-irs-2，而p-irs-1可以激活磷脂酞肌醇3-激酶(pi3k)并与其结合。接着pi3k会激活丝氨酸/苏氨酸激酶akt。这是肝脏胰岛素促进肝细胞吸收血糖并维持葡萄糖稳态的一个过程。但是当机体当机体发生肝脏胰岛素敏感时，胰岛素敏感性就会降低，其中irs-1/p-irs-2、pi3k/p-pi3k和akt/p-akt的表达将受阻，肝脏胰岛素调节信号会发生缺陷，从而其抑制葡萄糖产生的功能就会受损，导致胰高血糖症。由此可知，本技术提供的降血糖提取物通过调节激活肝脏irs-1、akt和pi3k的蛋白水平表达，进而糖尿病小鼠的肝脏胰岛素敏感性，达到对大鼠肝脏由糖尿病引起的代谢综合症状。而同样结合上方对对实施例1-8和对比例1-5的成分分析结果可知，该降血糖提取物中的5-羟甲基糠醛、5,5-二甲基糠醛醚和β-谷甾醇作为主要成分能够起到这种调节激活作用。
[0161]
由此，本技术通过对山茱萸进行活性成分提取，得到一类降血糖提取物，并通过动物实验证明了其降血糖、降脂肪以及对肝脏的保护作用，还通过对其相关蛋白的表达研究证实了其对胰岛素敏感性信号通路irs-1/pi3k/akt的调节作用。由此表明，本技术提供的降血糖提取物不仅能够改善机体糖尿病的血糖和血脂，还能对由此引起的机体肝脏代谢综合症产生作用，为其作为糖尿病及其代谢综合症的相关制品原料提供了一种重要潜在应用。
[0162]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。