ESI-09在防治GCRV感染中的应用

esi-09在防治gcrv感染中的应用
技术领域
1.本发明属于水产养殖技术领域，具体涉及esi-09的用途，可用于制备预防和治疗gcrv感染的药物或添加剂。


背景技术：

2.esi-09，一种新型环腺苷酸结合蛋白(exchange protein directly activated bycamp，epac)拮抗剂，通过特异性阻断细胞内epac介导的rap1活化和akt 磷酸化发挥功能。epac是由camp直接激活的鸟嘌呤核苷酸交换因子，包括epac1和epac2两种亚型，具有调控细胞间连接，稳定内皮屏障，促进癌细胞迁移及黏附等生理功能。研究表明，在癌细胞中，esi-09通过降低细胞粘附功能从而抑制癌细胞迁移和侵袭；同时，esi-09具有抗菌功能，被发现能够显著降低人脐静脉内皮细胞中的总细菌数。在小鼠体内的研究显示，使用esi-09对epac1 进行药理抑制，能够保护小鼠免受sfg立克次氏体造成的致死性损伤。尽管 esi-09的生理功能多有研究，但多集中于抗癌及抗细菌功能，esi-09在抗病毒方面的功能尚未见报道，更未有见将esi-09应用于水生病毒防治的实例。
3.草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，gcrv)，属呼肠孤病毒科，水生呼肠孤病毒属，是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒。gcrv引起的草鱼出血病是危害草鱼养殖产业的主要病毒性疾病。gcrv能够在多种草鱼细胞系中进行体外培养，如草鱼肾细胞(cik)、草鱼鳍条细胞(cf)、草鱼卵巢细胞(gco)和草鱼囊胚细胞(gcb)等，并使其产生显著的细胞病变效应。
4.目前，针对gcrv的防治方式主要聚焦于疫苗研究。随着基因工程疫苗研制的发展，以亚单位疫苗和核酸疫苗为代表的各类草鱼出血病疫苗相继出现。目前各类疫苗主要通过注射、口服或浸浴的方式来使用。但是疫苗的大规模生产应用仍然受到制约，主要是因为疫苗专一性强的特性使其无法应用于易于变异的病毒。基于此，找寻具有良好抗病毒效果的抗gcrv药物在给药方式，针对不同毒株维持抗病毒效果等方面相比于鱼用疫苗具有显著的优势。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供esi-09在防治gcrv感染中的应用，esi-09能够显著抑制离体培养草鱼细胞中病毒相关基因(gcrv相关基因，包括s6、s9)的转录，抗病毒实验证实esi-09对于gcrv感染起到保护作用，esi-09能够用于制备防治gcrv感染的药物或添加剂。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.esi-09在防治gcrv感染中的应用：在本发明的具体实施例中，感染gcrv 的cik细胞系在加入20μm esi-09处理后，病毒造成的细胞病变效应被显著抑制。进一步检测细胞中病毒相关基因扩增情况显示，esi-09处理之后，cik细胞中病毒相关基因(gcrv相关基因，包括s6、s9)的表达量被显著抑制，同时细胞系中抗病毒免疫相关基因(包括gcifn、gcvig1)表达量基本恢复正常水平。
8.本发明实施例中选取的鱼类细胞系是来源于gcrv病毒重要宿主草鱼的细胞系，因此通过建立细胞感染病毒的疾病模型，以及对病毒相关基因表达的检测，可知esi-09适用于gcrv的病毒防治。
9.esi-09作为预防或治疗gcrv感染的药物或添加剂，药物可以以注射剂或口服剂形式使用，具有给药剂量低，成分单一，针对性强，效果佳的优点。esi-09 的结构式如下：
10.附图说明
11.图1为esi-09对gcrv 873感染细胞的影响。
12.图2为esi-09对细胞中gcrv 873病毒基因转录水平的影响。
13.图3为esi-09对感染gcrv 873的细胞中抗病毒免疫相关因子转录水平的影响。
具体实施方式
14.实施例1：esi-09对gcrv 873感染细胞的影响
15.抗病毒实验用于检测grcv 873病毒(由实验室保存)在细胞中的滴度。在 24孔细胞培养板及96孔细胞培养板中进行。cik细胞用于检测gcrv 873病毒滴度。取生长状态良好的细胞传代接入24孔板，28℃培养过夜；接种moi＝1 的gcrv 873于cik细胞，同时加入20μm esi-09处理；接种后继续培养72h，将贴壁细胞使用4％细胞组织固定液固定1h，1％结晶紫染色过夜，次日对染色完成的细胞进行拍照，观察病变效应。固定细胞前收集上清，保存于4℃备测病毒滴度。使用tcid
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方法检测病毒滴度：取生长状态良好的cik细胞传代接入 96孔板，28℃培养过夜；接种收集的上清后，根据细胞空斑计算esi-09未处理组和处理组病毒滴度。结果如图1所示，20μm esi-09处理后的感染病毒细胞中，细胞病变效应明显被抑制，gcrv 873病毒滴度明显降低。
16.实施例2：esi-09对gcrv 873病毒基因转录的影响
17.检测感染gcrv 873之后的cik细胞用20μm esi-09处理后，细胞中病毒相关基因的转录水平。取生长状态良好的细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，吸尽细胞培养基，用trizol(invitrogen)裂解贴壁细胞后提取细胞总rna，由goscript 逆转录试剂盒(promega)逆转录得到cdna。通过qpcr检测病毒相关基因的转录水平(包括s6，s9)，相关方法参照文献
1.。结果表明：如图2所示，20μm esi-09处理后，细胞中gcrv 873病毒相关基因(包括s6，s9)的转录水平显著下降。
18.实施例3：esi-09对宿主抗病毒免疫相关因子表达水平的影响
19.感染gcrv 873之后的cik细胞用20μm esi-09处理后，检测细胞中抗病毒免疫相关基因的表达情况。取生长状态良好的cik细胞传代接入6孔板，28℃培养过夜；按照实施例1中描述的方法接种病毒及药物处理；继续培养24h后，用trizol(invitrogen)裂解贴壁细胞后提取细胞总rna，由goscript逆转录试剂盒(promega)逆转录得到cdna。使用qpcr检测抗病毒免疫相关因子的转录水平(包括gcvig1，gcifn)，相关方法参照文献
2.。实验结果表明，
如图3所示，细胞中抗病毒免疫相关基因(包括gcvig1，gcifn)的转录水平被gcrv 873 病毒刺激后上调，经20μm esi-09处理后转录水平显著恢复。
20.参考文献
21.[1]zhou x y,lu l f,li z c,et al.temperature effects on svcv propagation and the related ifn response in zebrafish[j].aquaculture,2021,533.
[0022]
[2]zhou y,lu l f,zhang c,et al.grass carp cgasl negatively regulates interferon activation through autophagic degradation of mavs[j].dev comp immunol,2021,115:103876。