多型干扰素通路活化的多重定量检测方法和试剂盒

1.本发明涉及精准检测领域，具体涉及多型干扰素通路活化的检测引物组及其应用。


背景技术：

2.干扰素是重要的免疫调节分子，其中包括i型(包括ifn-α和ifn-β)和ii型(ifn-γ)，在多种免疫系统参与的疾病中起着关键作用：在病毒感染的疾病中，干扰素应答构成了机体抵御病毒感染的第一道防线，可以调节几乎所有的固有和适应性免疫应答的效应细胞。在多个病毒感染引起的疾病中，如艾滋病、肝炎等，干扰素可用于激活自身免疫反应，帮助清除病毒。在包括由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)引起的疾病在内的各种疾病中，干扰素可用于监测疾病发生发展及预后评估。
3.在癌症中，干扰素通常起着促进抗肿瘤免疫反应的有益作用，同时也被用来评估免疫系统的活性，对药物的反应和疗效预测等等。在脓毒症，covid-19等病症中，病人的死因往往是炎症风暴引起的器官衰竭。而这其中ifn-γ是诱导细胞凋亡的关键细胞因子，其大规模过度表达被认为是导致免疫系统过分激活，引起免疫风暴的主要原因，最终导致器官衰竭。在系统性红斑狼疮(sle)、皮肌炎、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的发生发展中，干扰素相关通路的异常活化起着关键作用。在不同自身免疫性疾病中，干扰素通路活化的类型和程度不同，例如sle中存在i型干扰素通路的异常活化。目前，自身免疫病治疗的主要手段还是用激素、免疫抑制剂等药物抑制身体的免疫反应。然而，这些药物并不能解决发病的根本原因，且长期用药有严重的副作用。目前国外已有针对不同干扰素通路的靶向药物获批或进入临床末期，用于治疗自身免疫性疾病。因此，对患者的干扰素活化的通路进行鉴定和分型是未来的发展方向，能够精确的指导用药，实现更精准有效、副作用更低的治疗。同时，对干扰素通路活化的程度进行定量分析，能够实现对自身免疫性疾病病人更有效的诊断，对病情发展做出更准确的评估。然而，目前市场上还缺少相应的诊断产品。
4.对干扰素通路的活化状况进行定量分析能帮助多种疾病实现有效的病情分析，预后评估，用药指导，疗效监测等等。目前临床上对包括自身免疫性疾病在内的这类疾病的诊断主要依靠临床症状和表现，高度依赖于医生的临床经验并难以实现准确的定量评估。血液中产生的特定抗体也常被用来辅助诊断，但这些抗体与病情发展存在脱节，往往病人症状已经缓解而抗体依然存在。对干扰素本身的直接检测是目前正在大力发展的临床诊断技术。干扰素在血液中含量很低，它们的微小波动就会产生很大效应，造成检测困难，且难以直接用于病情评估。另一方面，干扰素依靠与免疫细胞上的受体结合并激活细胞内相关通路来实现其作用；这些通路的激活会造成免疫细胞(如pbmc，外周血单个核细胞)中一系列下游isg基因(ifn-stimulated genes，干扰素诱导基因)的激活和表达上调；对这些基因表达的监测，是更直接的评估干扰素通路活化状况的手段。
5.另一方面，文献中报导较多的是i型干扰素激活相关的特征基因，并且用来测量i型干扰素通路的活化。ii型干扰素相关基因也有报导，然而这些基因存在的问题包括：本身
表达量低，检测困难；由ii型干扰素通路活化引起的表达变化太小，难以对通路活化进行鉴定和定量；特异性差，同时也能被i型干扰素激活。市面上没有能够可靠、特异、定量检测ii型干扰素通路活化的方法或产品。
6.目前在分子层面检测干扰素通路活化的方法包括针对蛋白的酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，elisa)以及针对基因表达的转录组分析(rna-sequencing和微阵列芯片(microarray))和定量逆转录聚合酶链式反应(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，即rt-qpcr)等。
7.rna-sequencing和microarray具有数据量大，覆盖基因组范围广，数据的灵活度高，并能用于基因组结构分析的强大优势。但较elisa和rt-pcr相比，转录组分析的价格过高，所耗时间过长，地区覆盖范围不广。
8.同时，i型干扰素在血浆中难以测量，使得elisa技术通常无法充分发挥作用。血浆蛋白水平的检测存在着以下几个缺陷：1)包括干扰素在内的大多数细胞因子在其作用部位附近产生，不一定会释放到血液循环中；2)干扰素分子，尤其是ifn-γ本身的血清浓度通常非常低且难以检测。大部分sle患者中存在抗ifn-α的抗体，该抗体可以中和ifn-α的生物活性；3)某些情况下，干扰素的网络交互作用导致isg在没有胞外直接ifn刺激/较低浓度刺激下也能持续表达；4)在应用ifn受体相关单抗时，直接检测血清中ifn水平不能反映下游通路活化情况。
9.rt-qpcr技术是对基因表达进行定量分析的通用方法，首先将基因表达的产物rna逆转录成为dna，再对dna用荧光定量pcr技术进行扩增和定量检测。pcr是一种常用分子生物学技术，可用于将微量目标核酸序列(例如待测基因序列)扩增至可检测的量。其原理是利用能识别目标序列的dna引物与目标特异性结合，并在dna聚合酶的作用下对目标序列进行指数级复制和扩增。在分子诊断中常用的荧光定量pcr则在普通pcr的基础上引入荧光标记的探针，利用在扩增过程中产生的荧光信号对目标序列进行实时检测和定量。在多重定量pcr技术中，针对不同的靶标采用各自特异的荧光探针并携带不同颜色的荧光标记，使得多个靶标可以被同时检测。
10.目前较多的是i型干扰素相关基因的检测，并且往往一次只能检测一个基因的表达，也就是单重检测。多个目标基因需要多个反应来检测，造成消耗的人力物力成倍的增长，而一次能检测的样品数量(检测通量)成倍的下降。多重rt-qpcr技术可以解决这个问题，在一个反应里同时检测多个目标基因的表达。另一方面，多重检测技术能实现更准确的定量。在多个基因靶标中可以包括一个通常在细胞内表达很稳定的内参基因，这样待测基因相对于内参基因表达的比例就能准确反映出待测基因在细胞内的表达变化。而且这种相对表达量不会随着反应中核酸样品的总量多少而变化，使得检测结果受细胞处理，核酸提取以及加样多少的影响极小，保证了每次结果的可重复性。尽管如此，多重rt-qpcr的设计有相当难度，随着目标基因的增加，多个基因所需要的引物(primer)探针之间越容易互相干扰互相竞争，给各个基因的定量带来较大误差，严重影响临床结果的可靠性。
11.另一方面，文献中报导的跟ii型干扰素通路活化相关的基因比i型相关基因明显要少，用于ii型干扰素定量检测的例子更少，同时也未见对这些基因针对ii型干扰素的特异性的系统性研究。通过测试，我们发现这些ii型相关基因对ii型干扰素通路活化的特异性普遍不高，往往i型干扰素的刺激也能让此类基因表达上调。在这种情况下，用这些基因
作为ii型干扰素通路活化的标志物是不可靠的。
12.快速准确的对病人的发病机制进行鉴别才能提供真正有效和有针对性的治疗，实现每个病人的精准诊疗，取代目前对所有病人的无差别治疗方案。一个精准诊疗重要性的例子是阿斯利康的新药saphnelo。该药是10年来美国fda批准的第一个针对i型干扰素的sle药物。然而在该药的临床试验中，仍有过半数sle病人的症状没有明显改善。原因可能就是大量病人也存在ii型干扰素通路的激活，造成仅仅阻断i型干扰素的效果不理想。更加突出了对不同干扰素通路活化进行分型和定量，以及建立相应分子诊断工具的关键性。


技术实现要素：

13.现有技术存在各种问题的原因可能在于，首先，没有针对性的利用定量pcr对ii型相关基因进行系统性筛选来找到特异性高、表达量足够的基因。因此也无法对ii型通路活化进行准确可靠的检测和定量。另外，多重pcr设计的复杂性，在多重检测的同时实现精确定量的挑战性，也导致了市场上相应产品的缺失。
14.本发明通过系统性筛选，发现irf1基因对ii型干扰素通路活化高度特异，同时又具有较高的表达量和显著的表达量变化。而经过验证，其只在ii型干扰素刺激的情况下上调，而受i型干扰素影响极小。因此，非常适合用来对ii型通路的活化情况进行监测。另外，筛选得到受ii型干扰素显著激活但特异性稍差的基因如gbp1和stat1。
15.本发明公开了多型干扰素通路活化的检测引物组，包括：
16.1)扩增ifi44基因的引物；和
17.2)任选的扩增mx1基因的引物、扩增irf1基因的引物以及扩增gbp1的引物；其特征在于，扩增ifi44基因的引物序列分别如seq id no:1-2所示，扩增mx1基因的引物分别如seq id no:4-5所示，扩增irf1基因的引物分别如seq id no:7-8所示，扩增gbp1基因的引物分别如seq id no:17-18所示。
18.优选的，所述引物组包括：
19.1)扩增ifi44基因的引物；和
20.2)扩增mx1基因的引物和扩增irf1基因的引物。
21.优选的，所述引物组包括：1)扩增ifi44基因的引物；和2)扩增irf1基因的引物和扩增gbp1的引物。更优选的，还包括探针。
22.优选的，所述结合ifi44基因的探针如seq id no:3所示，所述结合mx1基因的探针如seq id no:6所示，所述结合irf1基因的探针如seq id no:9所示，所述结合gbp1基因的探针如seq id no:19所示。
23.优选的，所述探针采用荧光基团标记。
24.优选的，还包括扩增内参基因的引物。更优选的，所述内参基因为hprt1基因，所述扩增内参基因的引物序列分别如seq id no:10-11所示。
25.优选的，还包括结合内参基因hprt1的探针。
26.优选的，所述结合内参基因hprt1的探针序列如seq id no:12所示。
27.本发明公开了一种组合物，包括所述的引物组。
28.本发明公开了一种检测多型干扰素通路活化的试剂盒，包括所述的引物组或所述的组合物。
29.本发明公开了所述的引物组和/或所述的组合物在制备检测患者干扰素分型的试剂中的用途。
30.优选的，所述的患者为系统性红斑狼疮患者。
31.本发明公开了所述引物组的rt-qpcr的扩增方法，包括：
32.(1)将权利要求1-8所述的引物组中的引物添加到rt-qpcr反应混合液，建立rt-qpcr反应体系；
33.(2)按照如下条件进行反应：55℃，10分钟；95℃，1分钟；45个循环“95℃，5秒钟，60℃，10秒钟”。
34.优选的，所述反应体系中的各引物的浓度分别为0.1-0.06μm，更优选为0.08μm。
35.优选的，所述rt-qpcr反应体系为：12.5μl的2倍rt-qpcr反应混合液，1μl逆转录酶，0.16μl的10μm浓度的权利要求1-8所述的引物组中的各个引物，0.16μl的10μm浓度的权利要求1-8所述的各基因的探针，1μl待测rna样品，加适量纯水到总反应体积20μl。
36.优选的，所述方法是非疾病诊断和/或非治疗目的的。
37.更进一步，将irf1和其它ii型干扰素相关基因与两个i型相关特征基因(ifi44和mx1)联合，结合内参基因hprt1开发了新的多重检测方法，可以对病人样品中这几个基因同时进行精准定量分析，从而实现用一个反应就对i/ii型干扰素通路进行分型，并对各自的活化程度进行定量。
38.本发明的多重检测方法中包括内参在内的四个基因，相应的四组引物探针的序列，以及它们所靶向的各自基因的转录子的rna序列(涵盖全部及部分序列)。
39.本发明开发的四重检测方法同时检测四个目标基因，经过临床样品的验证，其定量结果与四个基因分开来单独检测的结果高度吻合，从而能在保证定量结果可靠性的同时大大提高检测效率。
40.结合筛选到的基因的特异性和四重定量检测的可靠性，本发明能够更精确的鉴别引发自身免疫性疾病的分子机制和评估病情的发展，为临床诊断和精准治疗提供有效的指导。
附图说明
41.图1为各基因的筛选结果图。
42.图2为扩增引物设计原则示意图。
43.图3为isg相对表达量扩增曲线图。
44.图4为sle病例1中两种不同slg组合的表达情况。
45.图5为sle病例2中两种不同slg组合的表达情况。
46.图6为sle病例3中两种不同slg组合的表达情况。
47.图7为各基因在不同rna稀释浓度的定量检测结果。
48.图8为各基因在不同rna浓度下相对表达量的变化。
49.图9为检测特异性。
50.图10为临床病人样品的多重定量检测和干扰素通路活化情况分析。
具体实施方式
51.以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
52.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
53.实施例1用于i、ii型干扰素通路活化同时定量检测的基因选择
54.常用内参基因包括rps18，actb，b2m，gusb，gapdh，hprt1，mt-atp6，rps17，rpl13a，sdha，ube2d2等等。它们在细胞中的表达量通常很稳定，因此其它基因相对它们的表达量变化可以用来进行相对定量。同时，相对于其它内参基因，hprt1在pbmc细胞中的表达更稳定，并且表达量接近常见i、ii型干扰素相关基因的正常表达量，有利于建立更精确的四重检测。多重基因检测中，表达量过高的基因往往会占用扩增反应中过多的原料，造成其它基因得不到正常扩增和定量结果的偏差。而内参基因的过高或过低，尤其会严重影响到定量结果的准确性。其它潜在可用内参基因也可以包括rpl13a，sdha，ube2d2，gapdh等。
55.确立了内参基因之后，目标基因相对于内参基因的表达量就可以通过两个基因在rt-pcr扩增反应里的ct值(循环数阈值，越小代表浓度越高)计算出来。由两个基因的ct值的差异可以得到样品中目标基因与内参基因的浓度比值(t/r)，也就是目标基因的相对表达量如下：t/r＝2
(内参基因ct
–
目标基因ct)
。根据t/r值在不同样品中的变化可以判断目标基因在样品中的表达变化。
56.首先对i、ii型干扰素通路活化相关基因进行了初步的筛选，目的是找到对相应干扰素通路高度特异同时表达量足够高有利于提高分子检测灵敏度的基因。i型基因的初筛包括文献报导中最常见的i型干扰素相关特征基因：ifi44，mx1，ifit1，oas1，oas3，rsad2，usp18。为了筛选得到对ii型干扰素通路活化高度特异的基因，文献已有报导一些跟ii型干扰素相关的基因，然而它们针对ii型干扰素通路活化的特异性还未见有系统性研究。我们收集了一组主要的ii型干扰素相关基因，包括c4bpa，cxcl9，cxcl10，gbp1，icam1，irf1，stat1，gabbr1等来进行筛选。初筛的方式是挑选不同的自身免疫性疾病病人，检测他们的pbmc细胞中各个基因的表达量以及相对于健康对照的变化幅度。挑选的人群包括一组系统性红斑狼疮(sle)病人，一组类风湿性关节炎(ra)病人，和健康对照。筛选的标准如下：
57.1)i型干扰素通路活化的特异基因应在sle病人中普遍表达上调而在ra病人中应保持不变或变化较小。这是因为文献中普遍认为i型干扰素通路活化是sle的常见引发机制，而ii型干扰素通路活化是ra的引发机制。
58.2)同样，ii型干扰素通路活化的特异基因应在ra病人中普遍表达上调而在sle病人中应保持不变或变化较小。
59.3)特异性类似的情况下，选择表达量和表达量上调幅度都更高的基因。在健康人pbmc细胞里通过rt-qpcr检测得到的ct值应不高于35。
60.按上述标准初筛得到候选i型干扰素相关基因为ifi44和mx1，以及ii型干扰素候选基因irf1，gbp1和stat1。对这些候选基因进一步进行了干扰素激活实验验证。在这个实验中，将健康人血液中的pbmc细胞分成相等的四份，分别加入1)i型干扰素(ifnα )；2)ii型干扰素(ifnγ )；3)i，ii型混合(ifnα ifnγ )；4)无干扰素对照(ifnα-ifnγ-)进行培养。各基因在四种情况下相对表达量t/r的变化见图1。
61.由图可见，ifi44和mx1受i型干扰素激活的影响最大，相对于无干扰素对照表达量有明显上调。同时二者受ii型干扰素激活影响较小，表达量有一定上调。与之对照的是gbp1和stat1对ii型干扰素激活有强烈的反应，表达量大幅上调。同时i型干扰素对其表达量也有影响但上调幅度远小于ii型干扰素造成的上调。
62.与上面基因都不同的是irf1，它在ii型干扰素激活下显著上调，而对i型干扰素几乎没有反应，显示出了针对ii型干扰素的优秀的特异性。
63.综合以上结果，ifi44和mx1主要是i型干扰素诱导基因(isg)，对ii型干扰素诱导也有一定反应；gbp1和stat1主要是ii型干扰素诱导基因，对i型干扰素诱导也有一定反应；而irf1是对ii型干扰素非常特异的干扰素诱导基因，受i型干扰素影响极小。
64.为了对i、ii型干扰素通路活化状况进行同时检测定量，我们选取了以上基因中的三个进行多种组合，并基于以下原则：1)至少有一个i型特征基因；2)必须包含irf1以实现对ii型的高度特异性。选取的最优组合如下：
65.1)ifi44，mx1，irf1；
66.2)ifi44，gbp1，irf1。
67.这两种组合在临床样品中的验证见实施例3。本文件所举其它例子主要使用了第一组组合，但第二组组合也同样适用。
68.实施例2扩增引物及探针的设计以及反应体系的建立和优化
69.引物的设计遵循以下原则：使用公开免费引物设计工具如primer3plus并使用针对性优化过的参数；上下游引物必须横跨信使rna序列中的多个外显子(exon)区域，避免放大样品中的dna杂质从而无需样品处理中去除dna的步骤。这是因为这些基因的dna序列中不同exon之间常有长段内含子(intron)，这样即使引物能识别dna上外显子的序列，但中间的大段内含子序列会使扩增效率大大降低，从而避免放大dna背景，而只放大基因的表达产物rna。(设计原则示意图参见图2)。
70.具体设计思路如下：1)引物放大的靶标区域经过blast比对不和人类或其他物种的基因组、转录组的非靶标区域有明显重合，同时四个基因的靶标区域也互相不存在序列重合，从而减少非特异扩增和放大的可能性。2)四个基因的四组引物和探针序列之间不存在明显重叠，避免互相干扰和产生引物探针内扩增和放大。3)引物长度不少于20个碱基，引物序列的溶解温度(tm)在60摄氏度左右而探针序列的溶解温度(tm)在70摄氏度左右。太短的引物容易产生非特异性扩增。4)引物的扩增产物尽可能短，因为短片段的扩增效率更高。
71.根据上述条件得到以下引物探针序列，其中irf1的上下游引物横跨irf1基因的exon 7和8，扩增产物长度为62个碱基对；ifi44的上下游引物横跨其基因的exon 2，3和4，扩增产物长度为76个碱基对；mx1的上下游引物横跨其基因的exon 18和19，扩增产物长度为74个碱基对；gbp1的上下游引物横跨其基因的exon 1和2，扩增产物长度为81个碱基对；hprt1的上下游引物横跨其基因的exon6和7，扩增产物长度为72个碱基对；stat1的上下游引物横跨其基因的exon 10和11，扩增产物长度为97个碱基对。
72.针对各个基因设计的引物和探针(按从5’端到3’端顺序；探针的5’端带有不同荧光基团，而3’端带有荧光淬灭基团)：
73.1)ifi44：
74.引物f：5
’‑
ttcgatgcgaagattcactg-3’(seq id no:1)。
75.引物r：5
’‑
aaggcagacagtaagctctt-3’(seq id no:2)。
76.探针：5
’‑
/texas red/-tgaaagaaagataaaaggggtcattgagctcagg-/bhq-2/-3’(seq id no:3)。
77.2)mx1：
78.引物f：5
’‑
gatctttcagcacctgatgg-3’(seq id no:4)。
79.引物r：5
’‑
ggatgatcaaagggatgtgg-3’(seq id no:5)。
80.探针：5
’‑
/cy5/-caccaggaggccagcaagcg-/bhq-3/-3’(seq id no:6)。
81.3)irf1：
82.引物f：5
’‑
accagtgatctgtacaacttc-3’(seq id no:7)。
83.引物r：5
’‑
tctgttgtagcttcagaggt-3’(seq id no:8)。
84.探针：5
’‑
/fam/-caggtgtcacccatgccctcc-/bhq-1/-3’(seq id no:9)。
85.4)gbp1：
86.引物f：5
’‑
acagaagtgctagaagcca-3’(seq id no:17)。
87.引物r：5
’‑
tctctgatgccatgtcca-3’(seq id no:18)。
88.探针：5
’‑
/cy5/-aggagaaaaagaacagacaagggaacagc-/bhq-3/-3’(seq id no:19)。
89.5)hprt1：
90.引物f：5
’‑
aatccaaagatggtcaaggtcg-3’(seq id no:10)。
91.引物r：5
’‑
gtctggcttatatccaacacttcg-3’(seq id no:11)。
92.探针：5
’‑
/hex/-agcttgctggtgaaaaggacccca-/bhq-1/-3’(seq id no:12)。
93.6)stat1：
94.引物f：5
’‑
cgaacatgaccctatcacaa-3’(seq id no:21)。
95.引物r：5
’‑
tctttccaccacaaacgag-3’(seq id no:22)。
96.探针：5
’‑
/cy5/-tgggaccgcaccttcagtcttttcc-/bhq-3/-3’(seq id no:23)。
97.各组引物靶向的对应基因的转录子的rna序列(按从5’端到3’端顺序)：
98.1)ifi44：5
’‑
ucgaugcgaagauucacuggaugaaagaaagauaaaaggggucauugagcucaggaagagcuuacugucugccuu-3’(seq id no:13)。
99.2)mx1：5
’‑
gaucuuucagcaccugauggccuaucaccaggaggccagcaagcgcaucuccagccacaucccuuugaucaucc-3’(seq id no:14)。
100.3)irf1：5
’‑
accagugaucuguacaacuuccaggugucacccaugcccuccaccucugaagcuacaacaga-3’(seq id no:15)。
101.4)gbp1：5
’‑
acagaagugcuagaagccagugcucgugaacuaaggagaaaaagaacagacaagggaacagccuggacauggcaucagaga-3’(seq id no:20)。
102.5)hprt1：5
’‑
aauccaaagauggucaaggucgcaagcuugcuggugaaaaggaccccacgaaguguuggauauaagccagac-3’(seq id no:16)。
103.6)stat1：5
’‑
cgaacaugacccuaucacaaaaaacaaacaaguguuaugggaccgcaccuucagucuuuuccagcagcucauucagagcucguuugugguggaaaga-3’(seq id no:24)。
104.rt-qpcr反应的组成如下：12.5μl的2倍rt-qpcr反应混合液(neb luna universal probe one-step reaction mix)，1μl逆转录酶(neb lunart enzyme mix(20x))，0.16μl的10um浓度的各基因的引物(包括上游和下游引物)，0.16μl的10μm浓度的
各基因的探针，1μl待测rna样品，加适量纯水到总反应体积20μl。
105.rt-qpcr运行于罗氏lightcycler 480ii荧光定量pcr仪器，反应条件如下：
106.1)55℃，10分钟；2)95℃，1分钟；3)45个循环的(95℃，5秒钟；60℃，10秒钟)。
107.将病人外周血单个核细胞(pbmc)中提取的rna物质加到预先配好的标准的rt-qpcr反应液中，再置于实时荧光pcr仪器中运行预先设定好的反应程序，一个小时左右即可得到各基因定量结果。其原理是：在合适的温度条件下，反应液中的逆转录酶会将rna转成dna分子。如果原来样品中存在某个目标基因的表达产物，针对该基因设计的引物就会选择性的与之结合并利用反应液中的dna聚合酶进行扩增。在这一过程中，该基因的探针会产生荧光信号用来指示靶标的存在。不同基因的探针产生不同颜色的荧光，从而实现多个靶标的同时检测。
108.在每个pcr循环，荧光定量pcr仪会对每个荧光通道的荧光信号进行读取，并以此绘制每个通道的扩增曲线。在反应结束后利用扩增曲线，仪器自动计算出每个通道对应基因的ct值(循环数阈值，越小代表浓度越高)。利用目标基因和内参基因(hprt1)的ct值的差异可以计算出样品中目标基因与内参基因的浓度比值(t/r)作为目标基因的相对表达量：t/r＝2
(内参基因ct
–
目标基因ct)
。根据t/r值在不同样品中的变化可以判断各基因在样品中的表达变化。
109.在下面这个实例中，以一位系统性红斑狼疮病人(sle)和一位健康人(hc)为例说明基因表达量的多重定量检测过程，同时演示病人和健康人之间isg表达量的区别。血样中pbmc细胞的rna经过多重rt-qpcr分析，同时得到四个扩增曲线，代表四个不同的荧光通道及其对应的基因。扩增曲线参见图3。
110.仪器根据扩增曲线得到的ct值，和依据前述计算公式t/r＝2
(内参基因ct
–
目标基因ct)
得到的各基因的相对表达量t/r如表1。由表可见，各基因相对hprt1内参基因的表达量(t/r)在病人和健康对照之间存在显著差异，其中狼疮病人的相对表达量的大幅上调，充分反映了干扰素通路的活化状况。
111.表1：ifi44，mx1，irf1组合在不同样本中的表达
[0112][0113]
多重定量检测条件的优化：
[0114]
多重rt-qpcr反应的条件和单重反应类似，都是适量引物探针和待测样品加入商业化的rt-qpcr反应液中混合进行反应。最主要差别在于单重反应中只有针对一个靶标的两条引物(上游和下游)及一条探针，一次只测一个靶标；而四重反应里总共有8条引物和4条探针，一次要准确测定四个靶标。实现多重检测的关键是：1.多组引物探针的序列之间不
会相互结合，没有互相干扰，这个通过引物探针设计来实现；2.引物探针的浓度要合适，这是因为反应液中扩增反应需要消耗的原料，比如酶，dntp，镁离子等是固定的，过多的引物会造成过量消耗原料，影响定量结果。
[0115]
多重定量检测的终极检验标准是多重反应得到的定量结果要与单重检测时的结果一致。我们在优化过程中，发现实现这一目标的关键因素是引物浓度。单重pcr反应的引物浓度一般推荐范围是0.1-1μm(micromolar)，而多重的引物浓度需要分别进行优化。传统推荐操作是设立一个所有引物的起始浓度(比如0.2μm)，得到的多重检测结果与单重比较，比单重结果偏高的靶标的引物要降低浓度，而偏低的靶标的引物要增加浓度，直到多重结果与单重一致。实践中我们发现这样的操作并不能实现多重单重一致，对某个靶标的引物的调整并不是只影响该靶标的检测结果，而是会影响所有靶标，而且对各个靶标的影响缺少规律，可增可减，难以预测，造成优化过于复杂。
[0116]
通过实验，我们找到所使用的商业rt-qpcr反应液的最佳引物浓度是0.08μm，当所有引物浓度不高于这个值的时候，得到的多重结果非常接近单重结果。同时各靶标的引物浓度无需再单独进行优化，大大简化了多重定量反应的优化。作为一个例子，表2显示了一位sle病人单重检测和不同引物浓度下多重检测得到的各基因相对表达量(t/r)的比较，可以明显看到，当引物浓度较高时(0.20μm)，多重检测的结果和单重检测产生了较大的偏差，且t/r值越高的基因这种偏差就越明显。当引物浓度只有0.08μm时，多重和单重结果非常接近，可以用来实现真正精确定量。
[0117]
表2：rt-pcr反应中采用的不同引物浓度的检测结果
[0118][0119]
实施例3两组isg组合的多重定量检测实例
[0120]
为了验证实施例1中选取的两组isg组合都可以和内参hprt1构建多重定量检测反应用来对i、ii型干扰素通路的活化状况进行检测和分型，我们首先按实施例2中的标准构建了两个多重检测体系，分别包含ifi44/mx1/irf1/hprt1的引物探针，以及ifi44/gbp1/irf1/hprt1的引物探针。然后使用这两个体系在多个sle狼疮病人当中检测了这两组isg基因并与健康对照进行了比较，发现这两组基因对干扰素通路激活的检测和分型结果是一致的。
[0121]
sle病例1：irf1无明显上调，提示ii型干扰素激活不明显；ifi44,mx1,gbp1都有显著上调，鉴于它们都对i型干扰素激活敏感，两组isg组合都提示病例1主要是i型干扰素激活。(参见图4)。
[0122]
sle病例2：irf1显著上调，提示ii型干扰素激活；对i型干扰素敏感的ifi44，mx1未见明显上调，提示i型干扰素不活跃；gbp1主要对ii型干扰素敏感，它的上调和irf1上调吻合。两组isg组合都提示ii型干扰素激活为主。(参见图5)。
[0123]
sle病例3：irf1明显上调，提示ii型干扰素激活；ifi44稍有上调，提示i型干扰素有一定激活；gbp1对i，ii型干扰素都敏感，有可能在i，ii型干扰素的同时作用下发生大幅上调。两组isg组合都提示ii型干扰素激活为主但是可能有一定i型干扰素激活。(参见图6)。
[0124]
实施例4多重定量检测的检测限和相对表达量的变化
[0125]
为了研究多重定量检测反应的检测限，我们从一份约2毫升病人血液中提取到pbmc细胞中的rna物质总浓度约为39.4ng/μl，接着对该rna样品进行了连续4倍稀释并进行多重定量检测。得到的结果如图7。
[0126]
由图7可见，对ifi44，mx1，irf1基因的检测即使到1024倍稀释(约38pg/μl总rna)也保持了良好的线性关系而本身信号较低的hprt1在超过64倍稀释(约0.61ng/μl总rna)以后失去了线性关系。
[0127]
对于多重定量检测最重要的相对表达量t/r值，它们在不同稀释程度的值见下图。由图8可见，一直到64倍稀释(约0.61ng/μl总rna)，各基因的相对表达量t/r都基本保持不变。直到256倍稀释当内参的ct值不再可靠时各基因的t/r才出现了较大变化。
[0128]
这一结果表明，多重定量检测的检测限取决于表达量最低的基因；同时在这个检测限以上得到的相对表达量的定量结果都能保持良好的一致性。
[0129]
实施例5多重定量检测的特异性
[0130]
由于所有人体细胞都含有这四种基因以及很大可能它们的表达产物，为了验证多重定量检测的特异性，我们使用了其它物种中提取的核酸物质作为对照。在下面的例子里，人体pbmc细胞核酸提取物，真菌核酸提取物，以及水空白对照分别作为样品加入多重定量检测反应中。所获得的扩增曲线如图9所示。由图可见，只有人体细胞能检测到四种基因的表达产物，而不含这四种基因的核酸样品以及不含核酸的空白对照都未能产生任何扩增。
[0131]
实施例6系统性红斑狼疮(sle)病人的干扰素分型：
[0132]
运用多重定量检测技术对数十例sle病人的pbmc细胞进行了分析。根据ifi44，mx1和irf1三个基因的表达量相对健康对照(hc)的变化，发现可将病人分为四组不同类型：1)仅i型干扰素激活；2)仅ii型干扰素激活；3)i，ii型同时激活；4)无i，ii型激活，见下图10。
[0133]
由图可见，虽然都被临床诊断为sle，病人在分子层面和分子机制上有显著差异。一部分病人只表现出ifi44和mx1上调而irf1不变，提示仅有i型干扰素通路激活。一部分病人irf1上调而ifi44和mx1不变，提示仅有ii型干扰素通路激活。更多的病人三个基因都有上调，提示很可能i，ii型干扰素通路都被激活。也有少数病人三个基因都没有变化，提示可能存在其它发病机制。虽然通常认为sle主要是由i型干扰素引起的，但我们的结果显示ii型干扰素在其中也起到很重要的作用，打破了以往的认知。大量病人同时都有i，ii型干扰素通路激活，少数病人甚至只有ii型干扰素激活。
[0134]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。