一种利用SSR标记鉴定红姜花与白姜花种间杂交F1杂种真实性的方法

一种利用ssr标记鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种真实性的方法
技术领域
1.本发明属于分子标记技术领域。更具体地，涉及一种利用ssr标记鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种真实性的方法。


背景技术：

2.姜花属(hedychium)是指姜科姜花族中的一个属，为多年生草本植物。全世界分布约50种，我国分布约30种。姜花属内植物种类繁多、色彩丰富、香气浓郁，主要应用在园林观赏和观赏切花。其中白姜花(h.coronarium)是目前国内唯一的主栽品种，是岭南特色花卉，因花大、洁白且香气浓郁而受人们喜爱，常作切花生产销售，但其花色单一，难以满足人们对丰富色彩的要求。红姜花(h.coccineum)主要为野生分布的品种，其花瓣色彩鲜艳，但基本无香气。目前，培育花色独特且具有香味的花卉品种成为现在花卉杂交育种目标之一，从而丰富我国姜花属的种质资源。通过远缘杂交可利用杂种优势快速培育出性状变异较大、综合性状良好、适应产业化发展的植物新品种。
3.目前，对优良性状的杂交育种的关键在于对杂种f1代真实性的鉴定。传统的鉴定工作一般是根据父、母本的形态学特征进行判断，但由于高产育种中父母本的趋同性越来越强，通过形态学鉴定存在周期长而且可靠性差，准确率低以及效率差等问题。而现有技中有采用分子标记辅助鉴定的方法来鉴定杂交育种的杂种f1代的遗传性状，不必等到f1代长成植株再作判断，能够准确、方便、快捷地鉴定杂种后代的遗传性状。如现有技术中公开采用ssr分子用于白姜花和金姜花的杂交f1代花色遗传分析(周熠玮,许国宇,王琴,严福龙,玉云祎,余让才,范燕萍.
‘
白姜花
’ב
金姜花’杂交f1代花色遗传分析及其相关ssr分子标记开发[j].园艺学报,2021,48(10):1921-1933.)，但目前尚未有利用ssr分子标记技术来鉴定姜花种间杂种的相关报道。


技术实现要素：

[0004]
本发明要解决的技术问题是克服传统的形态性状鉴定法的缺陷和不足，提供一种利用ssr标记鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种真实性的方法，具有特异性强、重复性好、鉴定快速，在早期就能筛选出真实杂种，能够替代传统使用形态学的杂种鉴定方法，有效提升了姜花种间杂种鉴定效率。
[0005]
本发明的目的是提供一种利用ssr标记鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种真实性的方法。
[0006]
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0007]
本发明通过申请人课题组团队前期在姜花
‘
zs’基因组中鉴定出的22对扩增效果好的ssr标记引物(hcgssr102～104、hcgssr107、hcgssr110～113、hcgssr115～119、hcgssr538、hcgssr641、hcgssr948、hcgssr1166、hcgssr1420、hcgssr1501、hcgssr1508、hcgssr1751、hcgssr1951)中经过筛选分析，仅有标记hcgssr115和hcgssr1951能很好地区
分亲本与杂交种，具有明显多态性，并具有特异性好的扩增片段特征峰。采用标记hcgssr115或hcgssr1951能鉴定出60％以上的真实杂种，同时采用标记hcgssr115和hcgssr1951能进一步提高准确率，可以鉴定84.21％的真实杂种。本发明方法与传统形态学性状观察的鉴定方法相比，具有方便快捷、鉴定时间短、准确率高、可靠性强的优点，能有效提高姜花种间杂种鉴定效率，降低传统形态学性状观察的鉴定方法的错误率。
[0008]
本发明提供一种利用ssr标记鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种真实性的方法，包括以下步骤：
[0009]
s1.分别提取亲本红姜花、白姜花及其种间杂交f1代杂种的基因组dna；
[0010]
s2.ssr毛细管电泳分析：分别以步骤s1提取的基因组dna为模板，采用ssr标记引物hcgssr115和/或hcgssr1951进行ssr-pcr扩增检测，采集扩增产物的特征峰；所述hcgssr115的引物序列如seq id no.1～2所示，hcgssr1951的引物序列如seq id no.3～4所示；
[0011]
s3.杂种真实性的鉴定：将步骤s2中种间杂交f1代杂种的特征峰与亲本的特征峰进行比对，若同时具有亲本特征峰则为真实杂交种。
[0012]
优选地，步骤s1中提取亲本和种间杂交f1代杂种的幼嫩叶片，再采用1％的琼脂糖凝胶电泳进行dna纯度检测。
[0013]
优选地，所述标记的上游引物5’尾端接有fam荧光标记。
[0014]
优选地，步骤s2中ssr-pcr扩增的体系(25μl)：50ng
·
μl-1
模板dna 1.0μl，10μm dntp(mix)0.5μl，10
×
taq buffer(with mgcl2)2.5μl，10mm上游引物和下游引物各1.0μl，5u
·
μl taq酶0.2μl，超纯水19.8μl。
[0015]
优选地，步骤s2中ssr-pcr反应在veriti
tm 96well pcr仪上进行，反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃修复延伸10min。
[0016]
本发明提供seq id no.1～4所示的ssr标记引物hcgssr115和/或hcgssr1951在鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种真实性中的应用。
[0017]
本发明提供一种鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种真实性的试剂盒，含有ssr标记引物hcgssr115和/或hcgssr1951，所述引物序列依次如seq id no.1～4所示。
[0018]
优选地，所述试剂盒还包含ssr-pcr扩增所需试剂。
[0019]
优选地，所述试剂盒还包含提取样本dna所需的试剂。
[0020]
本发明具有以下有益效果：
[0021]
本发明利用ssr分子标记对白姜花和红姜花种间杂种进行了有效鉴定，可以快速准确的鉴定出白姜花和红姜花的真实杂种f1代。本发明显示采用标记引物hcgssr115和/或hcgssr1951能很好地区分亲本与杂交种，并具有特异性好的扩增片段特征峰，两个标记具有较好的互补性。采用标记引物hcgssr115或hcgssr1951能鉴定出60％以上的真实杂种，而同时采用标记引物hcgssr115和hcgssr1951能进一步提高准确率，可以鉴定84.21％的真实杂种。本发明方法与传统形态学性状观察的鉴定方法相比，使用的ssr标记特异性强、重复性好、鉴定快速，在早期就能筛选出真实杂种，具有鉴定时间短、准确率高、可靠性强的优点，能够替代传统使用形态学的杂种鉴定方法，有效提升了姜花种间杂种鉴定效率，降低传统形态学性状观察的鉴定方法的错误率。
附图说明
[0022]
图1为白姜花、红姜花及部分杂交后代花序的对比；
[0023]
图2为白姜花、红姜花与部分杂交后代基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图；
[0024]
图3为亲本及部分杂交后代在标记hcgssr115的目标产物特征峰对比；
[0025]
图4为亲本及部分杂交后代在标记hcgssr1951的目标产物特征峰对比。
具体实施方式
[0026]
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0027]
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0028]
实施例1传统形态学性状观测的鉴定方法
[0029]
本发明采用的亲本姜花分别为：红姜花和白姜花于2007年分别从昆明植物园和广州市茂源花场引进，目前均作为资源保存于华南农业大学花卉基地。红姜花为野生种，花色鲜艳，花朵较小，但缺乏香味；白姜花为栽培种，花色白色，花朵较大，香气浓郁。形态学性状的观测方法参照中华人民共和国农业农村部发布的《植物品种特异性(可区别性)、一致性和稳定性测试指南
‑‑
姜花属》，对亲本及其f1杂交后代盛花期花部的主要观赏性状进行观测，主要观测指标主要包括唇瓣颜色、唇瓣长度、唇瓣宽度、侧生退化雄蕊颜色、侧生退化雄蕊长度、侧生退化雄蕊宽度、花丝颜色、花丝长度、花药颜色、花药长度等。本发明采用的亲本白姜花与红姜花以及进行正反交获得的f1杂种均种植在华南农业大学花卉研究中心种植基地。
[0030]
在栽培过程中，将白姜花
♀×
红姜花
♂
的杂交f1带编号记为bh，将红姜花
♀×
白姜花
♂
的杂交f1带编号记为hb，同时统计亲本和杂交f1代的上述主要观测指标。在植株生长至盛花期时，f1代植株的主要形态性状表现出双亲的主要形态性状不同。
[0031]
以部分杂交f1代样本bh04、bh10、hb17和hb47为例进行分析，白姜花、红姜花及进行正反交的部分杂交后代花序如图1所示，其形态性状比较结果如表1所示。其中，在以白姜花母本、红姜花为父本杂交获得的杂交f1代bh04和bh10，它们的唇瓣长度、宽度、侧生退化雄蕊长度、宽度和花药长度均介于亲本之间，唇瓣主色发生明显变化；以红姜花为母本、白姜花为父本杂交获得的杂交f1代hb17和hb47，它们的唇瓣长度、宽度和侧生退化雄蕊宽度均介于亲本之间，唇瓣主色和花药主色发生明显变化。可初步判定，bh04、bh10、hb17和hb47均为真实杂种。同时运用相同的形态学性状观测方法，对获得的86份f1杂交后代进行传统形态学性状观测鉴定，初步确定为真实杂种的有38份，包括bh01、bh02、bh04、bh06、bh07、bh08、bh10、bh11、hb01、hb02、hb04、hb05、hb07、hb10、hb11、hb12、hb16、hb17、hb18、hb19、hb20、hb30、hb46、hb47、hb52、hb54、hb56、hb57、hb58、hb61、hb63、hb64、hb65、hb66、hb68、hb69、hb70和hb71。
[0032]
表1白姜花与红姜花正反交部分f1杂种形态性状比较
[0033][0034]
实施例2 ssr标记的筛选
[0035]
本发明采用的ssr分子标记来自于本技术人课题组团队前期在姜花
‘
zs’基因组中鉴定得到的266825个ssr标记中筛选出的22对扩增效果好的ssr引物(hcgssr102～104、hcgssr107、hcgssr110～113、hcgssr115～119、hcgssr538、hcgssr641、hcgssr948、hcgssr1166、hcgssr1420、hcgssr1501、hcgssr1508、hcgssr1751、hcgssr1951)具体ssr标记详见：zhou yw,wei x,abbas f,et al.genome-wide identification of simple sequence repeats and assessment of genetic diversity in hedychium[j].journal of applied research on medicinal and aromatic plants,2021,24:100312。
[0036]
提取实施例1中亲本及其部分种间杂交f1代的基因组dna，在veriti
tm
96well pcr仪上进行进行ssr分析，反应体系(20μl)包含50ng
·
μl-1
模板dna 1.0μl，2
×
taq pcr starmix 10.0μl，10mm上游引物和下游引物各1.0μl，超纯水7.0μl。反应程序：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃修复延伸7min。将ssr-pcr产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。
[0037]
经过筛选分析，在采用上述22对ssr标记引物扩增后，仅有标记hcgssr115和hcgssr1951在亲本间的条带具有明显多态性，而且能鉴定所使用的部分种间杂交f1代的杂种真实性。进一步进行ssr毛细管电泳分析了所有种间杂交f1代个体，对上述2个ssr标记的上游引物5’尾端接入fam荧光标记，由生工生物工程(上海)股份有限限公司合成，大部分杂交后代具有特异性好的扩增片段特征峰。亲本白姜花和红姜花的特征峰统计结果如下表2所示，其中，在标记hcgssr115中，白姜花在308.0bp和313.5bp有特征峰，而红姜花在302.6bp和306.6bp有特征峰；在标记hcgssr1951中，白姜花在174.8bp和183.1bp有特征峰，而红姜花在151.0bp、169.9bp和196.7bp有特征峰。因此，亲本在两个标记中扩增出来的特征峰差异明显，具有很好的多态性，所以本发明选择标记hcgssr115和hcgssr1951作为鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种真实性的引物，其具体序列如表3所示。
[0038]
表2白姜花和红姜花的特征峰统计
[0039]
标记白姜花特征峰红姜花特征峰hcgssr115308.0bp、313.5bp302.6bp、306.6bp
hcgssr1951174.8bp、183.1bp151.0bp、169.9bp、196.7bp
[0040]
表3本发明的ssr标记hcgssr115和hcgssr1951的引物序列
[0041][0042]
实施例3基于ssr标记鉴定红姜花与白姜花种间杂交f1杂种的真实性
[0043]
1、基因组dna的提取：
[0044]
剪取实施例1中采用的亲本和确定为真实杂种的38份杂交f1代植株新鲜幼嫩的叶片，使用天根生化科技(北京)有限公司的快捷型植物基因组dna提取试剂盒(dp321)进行基因组dna的提取，具体步骤严格参照提取说明书；再采用1.0％琼脂糖凝胶电泳对提取得到的基因组dna进行检测。
[0045]
结果如图2所示，为红姜花、白姜花与部分杂交后代基因组dna的琼脂糖凝胶电泳图，电泳条带较为清晰，没有出现弥散或拖尾的现象，可认为dna满足后续ssr-pcr反应要求。
[0046]
2、ssr毛细管电泳分析：
[0047]
将实施例2中筛选得到的ssr标记hcgssr115和hcgssr1951的引物中5’尾端接入fam荧光标记，由生工生物工程(上海)股份有限限公司合成，进行ssr-pcr扩增，扩增条件和程序同实施例2；将扩增产物置于3730xl基因分析仪上进行检测分析。
[0048]
3、特征峰对比：将上述步骤中检测结果f1杂种ssr标记特征峰与亲本的ssr标记特征峰进行对比，确定种间杂种真实性。
[0049]
亲本白姜花和红姜花与部分杂交f1代经标记hcgssr115扩增的目标产物特征峰对比结果如图3所示，经标记hcgssr1951扩增的目标产物特征峰如图4所示，由图可知同时具有亲本特征峰则为真实杂交种。对比白姜花、红姜花和38份f1杂种杂种真实性的鉴定如表4所示，在标记hcgssr115中，有23份(60.53％)f1杂种同时具有父母本的特征峰；在标记hcgssr1951中，有24份(63.16％)f1杂种同时具有父母本的特征峰。而将两个标记一起鉴定时，在38份f1杂种中有32份(84.21％)可被鉴定为真实杂种，鉴定效率比使用单个标记时大大提升。
[0050]
表4使用两个ssr标记对38份f1杂种真实性的鉴定
[0051][0052][0053]
综上可知，对比传统的形态性状鉴定法，本发明利用ssr分子标记鉴定f1杂种真实性的方法具有以下优点：
[0054]
形态性状鉴定法鉴定具有周期长、易受环境条件影响、需要较大种植空间等缺点，本发明的ssr分子标记在鉴定杂种真实性的的同时能节省大量时间和空间，具有较高的准确性，在杂种苗期时即可进行杂种真实性鉴定，有利于加快姜花品种遗传改良的进程。
[0055]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。