用于处理细胞的改进的处理室的制作方法

用于处理细胞的改进的处理室
1.本发明涉及一种用于医疗、环境、食品应用和基于生物的工业(包括酵母、乳酸杆菌、藻类和细胞组织生产系统，特别是包括靶向失活、生物活性化合物的提取，和细胞生长和/或细胞化合物的刺激)的装置的处理单元。
2.众所周知，原核和真核细胞受电场作用的影响。取决于所施加的电场强度，细胞生长的刺激以及细胞死亡、微生物的失活或细胞成分的特定提取可能发生(例如buchmann l和mathys a(2019),perspective on pulsed electric field treatment in the bio-based industry,front.bioeng.biotechnol.7:265,doi:10.3389/fbioe.2019.00265)。
3.ep-2 308 969 b1描述一种pef(脉冲电场)方法，其中细胞材料悬浮在导电液体中，该细胞材料通过暴露于1至100个电场强度脉冲而位于两个电极之间，使得在0.1至100纳秒的时间段内，在两个电极之间发生电场强度脉冲的目标电压的10％至90％的电压增加，电场强度脉冲具有5纳秒至5000纳秒的脉冲持续时间，并且当达到目标电压时，电场强度脉冲具有0.5kv/cm至50kv/cm的电场强度，显示出加速的细胞增殖和/或增加的细胞成分。
4.在ep 2 308 969 b1中使用的用于处理细胞材料的装置中，将具有上述细胞材料悬浮液的电穿孔比色皿连续泵送通过两个电极的排列，并暴露于导电液体中的电场(ep-2 308 969 b1的第[0020]段)。
[0005]
在这些条件下，在容器的壁和中心之间形成流动分布，这可能导致相对于容器直径上的工艺条件的偏差。这是一个问题，因为如上所述影响细胞增殖取决于工艺条件的精确维持。使用ep-2 308 969 b1的装置，不可能在整个反应容器中获得均匀的工艺条件，因此也不可能获得均匀地影响的细胞材料。
[0006]
本发明的目的是克服现有技术的上述问题，并提供一种装置，该装置克服目前可用的pef设备所涉及的困难，以便获得均匀且可控的流动和电场分布。
[0007]
上述目的通过权利要求中限定的本发明实现。
[0008]
详细地，本发明涉及一种处理单元，其具有入口和出口，以及形成在处理单元内部的处理空间，使得电脉冲和由其产生的电场可以穿透该处理空间，所述处理空间与入口和出口流体连接，其特征在于，处理空间的内侧面的至少一部分是非平面的，优选为弯曲的，并且其中入口形成在处理单元的顶面中，出口形成在处理单元的底面中。
[0009]
本发明还涉及包括用于产生和发射电脉冲的单元的装置，其中所述装置还包括根据本发明的处理单元。
[0010]
根据本发明，已经发现，在其至少一部分为非平面的内侧面的处理空间中，更均匀的处理是可能的。例如，所述内侧面的所述部分可以是弯曲的、三角形的、偏转的(buffled)或者可以具有锯齿形。所述内侧面的弯曲部分是优选的。由此，突出通过所述处理空间的流体的流动由此在施加电场的区域中显著均匀化，并且结果，借助于电脉冲对流过所述处理空间的材料的处理比在具有平坦(即，非弯曲)侧面的处理空间中显著更加均匀。
[0011]
根据本发明，处理空间的内部部分，即不是其与所述内侧面(多个内侧面)的非平面部分(多个非平面部分)直接相邻的部分，经受电脉冲和由此产生的电场。
[0012]
根据本发明，该装置适用于医疗、环境、食品应用和基于生物的工业(包括酵母、乳酸杆菌、藻类和细胞组织生产系统，特别是包括靶向失活、生物活性化合物的提取，和细胞生长和/或细胞化合物的刺激)。这些应用描述于buchmann l和mathys a(2019),perspective on pulsed electric field treatment in the bio-based industry,front.bioeng.biotechnol.7:265,doi:10.3389/fbioe.2019.00265中。根据本发明，当细胞材料通过处理空间时，电脉冲被施加至位于处理单元的处理空间中的细胞材料。结果，细胞材料经受电脉冲并被处理。
[0013]
根据本发明，由至少一种细胞(即真核细胞和原核细胞两者)组成的基本上任何材料都可以用作待处理的细胞材料。细胞材料可以是单细胞或多细胞生物体。实例有细菌、酵母、微藻、植物细胞和真菌细胞或它们的孢子、菌丝体、种子或幼苗和动物体细胞。此外，可以处理多细胞组织，诸如植物中的分生组织和人或动物中的上皮或结缔组织。
[0014]
在根据本发明进行处理之前，细胞材料通常(但不是必须)以已知的方式被分离、纯化和/或灭菌。优选地，在根据本发明的处理之前，细胞材料已经可以在合适的和已知的培养基中以已知的方式繁殖到期望的程度。
[0015]
在根据本发明的处理之前，细胞材料优选悬浮在导电液体中。导电液体是公知的。根据本发明，有必要使用对细胞活力没有不利影响，即特别是无毒的导电液体。根据本发明，水优选用作导电液体，其中水可以借助于合适的和已知的添加剂调节至期望的ph值。根据本发明，优选范围为6.0至14.0，优选7至12的ph值。
[0016]
根据本发明，上述悬浮液可以常规方式制备并储存直至处理。然而，也可以在根据本发明的处理之前立即提供悬浮液。
[0017]
细胞材料或包含细胞材料的悬浮液通过处理单元的入口进入位于处理单元内部的处理空间。
[0018]
处理单元的入口优选连接至细胞材料或包含细胞材料的悬浮液位于其中的装置。例如，可以为此连接提供常规的管道。
[0019]
优选地，在入口中或在入口处或供选择地在上述连接中提供关闭单元诸如阀或锁，以便能够控制将细胞材料或包含细胞材料的悬浮液引入处理单元。
20.根据本发明的优选实施方案，入口包括喷嘴或者入口构成喷嘴。可以使用常规地用于将介质引入容器或限定空间的喷嘴。这种喷嘴是已知的。
[0021]
利用该实施方案，可以以有针对性的方式调节细胞材料或包含细胞材料的悬浮液引入处理单元的速度。因此，可以调节细胞材料在施加至处理单元的处理空间的电场中的停留时间。
[0022]
通过上述入口引入待处理的细胞材料的处理单元在其形状、结构和尺寸方面受到限制，这仅由于施加的电脉冲和由此产生的电场能够充分穿透处理单元以在处理单元中实现细胞材料的期望处理。根据本发明，处理单元优选是由金属材料或塑料材料(诸如聚对苯二甲酸乙二醇酯)制成的容器。
[0023]
处理单元可以具有任何几何形状。优选地，处理单元是长方体或圆柱体。
[0024]
在处理单元内提供处理空间，细胞材料通过该处理空间，并由此被电脉冲处理。
[0025]
处理空间可以具有任何几何形状，但是优选具有长方体形状。根据本发明的一个非常优选的实施方案，所述处理空间位于处理单元的中心。特别优选的是，处理单元是实心
体，并且处理空间是所述处理单元内的空腔，优选是处理单元中心的空腔。
[0026]
如上所述，处理单元包括入口和出口。处理单元内的处理空间与处理单元的入口和出口流体连接。
[0027]
根据本发明，入口形成在处理单元的顶面，出口形成在处理单元的底面。因此，材料借助于重力向下流过本发明的装置。
[0028]
入口、处理空间和出口的流体连接可以通过提供从入口突出到处理空间以及从处理空间突出到出口的导管诸如管道来实现。根据本发明的优选实施方案，其中处理单元是实心体，并且处理空间是处理单元内的空腔，入口、处理空间和出口的流体连接通过处理单元中从入口突出到处理空间以及从处理空间突出到出口的相应空腔来实现。
[0029]
入口、处理空间和出口的流体连接可以具有统一的形状，诸如具有统一直径的圆柱形管或空腔。入口、处理空间和出口的流体连接的形状也可能在其长度上变化。例如，流体连接的至少一部分可以具有漏斗形形式。例如，从入口到处理空间的流体连接可以部分地具有漏斗形形式，其开口尺寸从入口到处理空间减小，使得材料可以有利地被引导到处理空间中。同样，从处理空间到出口的流体连接可以部分地具有漏斗形形式，其开口尺寸从处理空间到出口增大，使得材料可以有利地被引导到出口。
[0030]
本发明的重要特征是处理空间的内侧面的至少一部分是弯曲的。换句话说，处理空间不呈现完全平面的内侧面，而是呈现影响突出通过处理空间的材料的流动特性的至少部分侧面。
[0031]
优选的是，处理空间的内侧面的所述至少一部分具有规则的表面形状。特别优选的是，处理空间的所述内侧面至少在其一部分上具有正弦形状。
[0032]
根据本发明，处理空间的优选设计是这样的，即处理空间的彼此相对的两个侧表面是弯曲的，并且优选地在它们各自高度的至少50％，优选地至少75％，最优选地100％上具有正弦形状。特别优选的是正弦形状，其振幅范围为处理空间的宽度的5至20％，优选10至15％，波长范围为处理空间的高度的50至80％，优选60至70％。因此，例如，对于尺寸为24
×5×
5mm的处理空间，优选的曲率将具有13mm的波长(即，处理空间的高度的约66.67％)和0.67mm的振幅(即，处理空间的宽度的约13.4％)。
[0033]
根据本发明的另一个优选实施方案，提供处理空间的两个侧表面，这两个侧表面彼此相对并且具有正弦形状，使得在这两个侧表面之间存在180
°
的相移。
[0034]
根据本发明的特别优选的实施方案，长方体处理空间的至少一个、优选两个侧面在整个高度上具有弯曲的、优选正弦曲线形状。特别优选的是，长方体处理空间的这两个侧面彼此相对。
[0035]
利用处理空间的上述设计，由于在施加电脉冲的处理区的区域之外的流动改变，材料通过处理空间的流动变得更加均匀。因此，在处理空间中部的材料流动(停留时间)和在处理空间侧表面附近的材料流动之间的差异较小。因此，通过处理空间发射的电脉冲以及由此产生的电场接触具有更均匀特性的材料，且因此导致所述材料的更均匀处理。
[0036]
穿透处理空间的电脉冲由电极产生和发射，优选地由两个电极产生和发射，所述电极位于处理单元处，使得由所述电极发射的电脉冲和因此由此产生的电场可以充分穿透处理空间，且因此能够对处理空间中的材料进行充分处理。供选择地，电容器的两个板可用于此目的。
[0037]
根据本发明的优选实施方案，在处理空间的区域中，提供用于定位电极或电容器板的装置，用于向处理空间提供所述电脉冲。那些装置可以是能够将电极或板充分且牢固地固定在处理单元上的任何已知部件。例如，固定工具诸如夹紧工具可以设置在处理单元的侧面，优选相对的侧面，使得电极或板可以牢固地固定在处理单元的侧表面。
[0038]
根据本发明的非常优选的实施方案，用于定位电极的装置是电极可以插入其中的处理单元的侧面中的，优选地相对的侧面中的开口。这些开口具有允许常规电极插入并将插入的电极固定在适当位置的尺寸。这些开口优选位于处理单元中的处理空间附近。
[0039]
例如，该装置可以是处理单元的侧面中的盲孔，该处理单元优选为实心体。在优选实施方案中，盲孔设置在处理单元的彼此相对的两个侧面中。优选地，这些盲孔位于处理单元中的处理空间附近。非常优选的是，盲孔具有这样的深度，使得它们的相对于处理空间的近端面靠近处理空间的侧面。特别优选的是，处理空间的侧面形成盲孔的端面。
[0040]
根据优选实施方案，盲孔可以从外端至内端逐渐变细，即盲孔的开口尺寸从外至内减小。这允许插入到所述盲孔中的电极的牢固固定。
[0041]
为了不干扰由所述电极产生和发射的电脉冲的穿透，优选地，盲孔的内表面包括狭缝，该狭缝优选地布置在盲孔的内表面的中心。在狭缝的位置，盲孔与处理空间之间的分隔壁因此较薄。技术人员将选择狭缝的确切延伸，使得处理空间的剩余侧面在处理期间经受住流动条件。
[0042]
根据进一步的优选实施方案，盲孔(或者更一般地用于定位电极的装置)朝向处理空间的平坦侧面突出。换句话说，根据该实施方案，具有弯曲内部的处理空间的侧面不位于产生和发射电脉冲的电极附近。
[0043]
处理单元的出口优选连接到可以储存细胞材料或包含细胞材料的悬浮液的装置。例如，可以为该连接提供常规管道。
[0044]
优选地，在出口中或出口处，或者供选择地在上述连接中设置关闭单元诸如阀或锁，以便能够控制细胞材料或包含细胞材料的悬浮液流出处理单元。
[0045]
本发明的处理方法可以连续或分批进行。在后一种情况下，可以在另一个处理周期开始之前清空处理单元，任选地，可以在另一个处理周期开始之前进行杀菌/消毒步骤。根据本发明，可以使用已知的灭菌/消毒方法，诸如基于蒸汽的方法。
[0046]
本发明还涉及一种装置，其包括用于产生和发射电脉冲的单元和如上所述的处理单元。
[0047]
用于产生和发射电脉冲的单元是众所周知的。根据本发明，可以产生如下所述电脉冲的装置是优选的。这种装置是已知的。例如，可以提到电缆脉冲发生器、基于半导体的脉冲发生器或张弛振荡器。
[0048]
产生的电脉冲被发射到处理空间中。这优选地通过彼此平行布置的两个或更多个电极或电容器板实现，这些电极或电容器板彼此相对布置，具有适于产生电脉冲的距离。这种布置是众所周知的，无需在此详细解释。
[0049]
根据本发明的优选实施方案，两个电极或电容器板垂直于材料通过处理空间的移动方向布置。
[0050]
施加到处理空间的电场的特征必须使得它提供期望的效果，例如，它刺激被处理细胞的生长。相应的电场从现有技术中已知，例如从ep-2 308 969 b1中已知。根据本发明，
可以使用由这种电脉冲产生的电场，使得在0.1至1000纳秒的时间段内，在装置的两个电极或电容器板之间发生电脉冲的目标电压的10％至90％的电压增加，电脉冲具有5纳秒至50000纳秒的脉冲持续时间，并且在达到目标电压时，电脉冲具有0.5kv/cm至100kv/cm的电场强度。
[0051]
本发明还涉及一种在如本文所述的装置中执行的用于处理细胞以进行靶向失活、生物活性化合物的提取和细胞生长和/或细胞化合物的刺激的方法，所述方法包括以下步骤
[0052]
a)向处理单元中的处理空间施加电脉冲，
[0053]
b)通过处理单元的入口将细胞材料引入处理空间，
[0054]
c)使细胞材料通过处理空间和穿透处理空间的电脉冲到达处理单元的出口。
[0055]
该方法可以如上面已经描述的那样执行。
[0056]
如上所述，优选地，将细胞材料以导电液体中的悬浮液的形式提供。
[0057]
如上所述，进一步优选地，用这种电脉冲施加电场，使得在0.1至1000纳秒的时间段内，在装置的两个电极或电容器板之间发生电脉冲的目标电压的10％至90％的电压增加，电脉冲具有5纳秒至50000纳秒的脉冲持续时间，并且在达到目标电压时，电脉冲具有0.5kv/cm至100kv/cm的电场强度。
[0058]
如上所述，本发明的处理方法可以连续或分批进行。在后一种情况下，可以在另一个处理周期开始之前清空处理单元。任选地，可以在另一个处理周期开始之前进行杀菌/消毒步骤。根据本发明，可以使用已知的灭菌/消毒方法，诸如基于蒸汽的方法。
[0059]
本发明还涉及根据本文所述的本发明的装置用于医疗、环境、食品应用和基于生物的工业(包括酵母、细菌、微藻以及植物或动物细胞和细胞组织生产系统，特别是靶向失活、生物活性化合物的提取，和/或细胞生长和/或细胞化合物的刺激)的用途。这些应用描述于buchmann l和mathys a(2019),perspective on pulsed electric field treatment in the bio-based industry,front.bioeng.biotechnol.7:265,doi:10.3389/fbioe.2019.00265中。
[0060]
下面通过非限制性实施例和附图解释本发明。示出的是：
[0061]
图1是本发明的装置的一个实施方案的示意图
[0062]
图2是根据图1的本发明的装置的实施方案的处理单元的示意图
[0063]
图3a是根据图1的本发明的装置的实施方案的处理单元的侧视图
[0064]
图3b是根据图1的本发明的装置的实施方案的处理单元的另一示意图
[0065]
图1示出了本发明的装置(1)的实施方案的示意图。
[0066]
该装置具有用于产生和发射电脉冲的单元(2)，例如脉冲发生器。单元(2)电连接至两个电极(2a，2b)。处理单元(3)位于电极(2a，2b)之间。在所述处理单元(3)内的处理空间(4)上(见图2)，施加由单元(2)产生的电脉冲。电极(2a，2b)被布置成垂直于移动通过处理单元(3)的材料的移动方向。材料通过处理单元(3)顶面中的入口(3a)进入处理单元(3)，并通过处理单元(3)底面中的出口(3b)离开处理单元(3)。
[0067]
在处理单元(3)的两个侧面中，设置有开口(5a，5b)，优选地盲孔形式的开口(5a，5b)，电极(2a，2b)可以插入并固定到该开口(5a，5b)中。
[0068]
图2是根据图1的本发明的装置(1)的实施方案的处理单元(3)的示意图。相同的附
图标记表示与图1中相同的部件。
[0069]
在图2的实施方案中，处理单元(3)是实心体，在其中心具有空腔形式的处理空间(4)。处理单元(3)的顶面中的入口(3a)借助于导管与处理空间(4)流体连接。在该实施方案中，流体连接在其下部呈漏斗形，排放到处理空间(4)中。处理单元(3)的底面中的出口(3b)也借助于导管与处理空间(4)流体连接。在该实施方案中，流体连接在其从处理空间(4)延伸的上部是漏斗形的。
[0070]
在处理单元(3)的两个侧面中，设置有用于插入电极的盲孔形式的开口(5a，5b)。这些开口在邻近处理空间(4)的区域中逐渐变细，即随着它们接近处理空间(4)它们变得更小。邻近开口(5a，5b)的处理空间(4)的侧面是平坦的，即它们不是弯曲的。
[0071]
图3a是根据图1的本发明的装置(1)的实施方案的处理单元(3)的侧视图。相同的附图标记表示与图1中相同的部件。
[0072]
在图3a中，显示了处理单元(3)的侧面，其中设置有盲孔形式的开口(5a)。所述盲孔在邻近处理空间(4，这里未示出)的区域中逐渐变细，即它随着深度的增加而变小。在开口(5a)的内表面中，优选地在内表面的中心，设置有狭缝(6)。
[0073]
图3b是根据图1的本发明的装置(1)的实施方案的处理单元(3)的另一示意图。相同的附图标记表示与图1中相同的部件。
[0074]
与图2相比，处理单元(3)转动90
°
。因此，在图3b中，处理空间(4)的侧面被示出为不与开口(5a，5b)相邻。这些侧面是弯曲的。在本文中，它们在其整个高度上具有正弦形状。