CDK7靶向抑制剂在制备治疗胃肠间质瘤的药物中的应用

cdk7靶向抑制剂在制备治疗胃肠间质瘤的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种cdk7靶向抑制剂在制备治疗胃肠间质瘤的药物中的应用。


背景技术：

2.胃肠间质瘤(gastrointestinal-stromal-tumor,gist)仅约占消化道恶性肿瘤的1-2％，但其发病早期往往不伴随临床症状，超过20％的患者诊断时已出现远处转移。胃肠间质瘤危险度根据肿瘤部位、大小、核分裂像及是否破裂划分。胃肠间质瘤危险度越高，其复发预后也越差。虽然目前内镜早期诊断、手术切除及酪氨酸激酶抑制剂的应用显著降低了胃肠间质瘤患者的术后复发率。但对于高危或远处转移胃肠间质瘤患者，其预后仍然较差，报道其10年无复发生存率及总生存率分别约为7-9％和19.4-23％。酪氨酸激酶受体抑制剂(tki)伊马替尼(imatinib,im)将晚期gist患者19个月的中位生存时间延长至57个月，伊马替尼也成为靶向药物治疗实体瘤的典范。然而随着临床实践的开展，我们发现靶向治疗存在局限性：首先是伊马替尼临床总获益率可达84％，但约50％患者在接受im治疗后2年内出现继发性耐药；其次，虽然针对二次突变的后线药物如舒尼替尼、瑞戈非尼以及最新的四线药物瑞派替尼相继问世，但仅能分别带来5.6月、4.8月以及6.3个月的无进展生存；此外，tki作为靶向药物，其对肿瘤细胞的活性抑制作用大于细胞毒性作用。因此，寻找新的药物靶点和用于治疗胃肠间质瘤的有效药物迫在眉睫。
3.细胞周期是细胞增殖的基本过程，其调控细胞从静止期转向细胞分裂增殖期，而细胞周期失控是恶性肿瘤发生进展的重要原因之一。周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,cdk)属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族成员之一，为细胞周期调控机制中的核心分子。cdk家族蛋白在细胞周期的启动和各个时期的转换调节中发挥重要作用，其机制主要为cdk与细胞周期蛋白(cyclin)结合形成复合物，调控下游基因磷酸化。其中，cdk7为一特殊的cdk家族分子，其不仅可通过磷酸化其他cdk家族成员调控细胞周期，同时其也参与细胞内基因转录调控。cdk7为转录因子iih(transcription factor ii h)的催化亚基，其通过磷酸化rna聚合酶ii(rna polymerase ii)的c端ser2、ser5和ser7位点，最终调节基因转录起始。然而，cdk7在胃肠间质瘤中的作用机制和治疗效果尚未见报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种cdk7靶向抑制剂在制备治疗gist的药物中的应用。
5.为达到上述目的，本发明的解决方案是：
6.一种cdk7靶向抑制剂在制备治疗gist的药物中的应用，cdk7靶向抑制剂为thz1，其结构式如下：
[0007][0008]
作为本发明的一种优选实施例，thz1通过转录调控信号通路抑制gist细胞的增殖，诱导细胞周期停滞并促进细胞凋亡。
[0009]
作为本发明的一种优选实施例，thz1随着浓度的增加显著抑制gist细胞的增殖。
[0010]
作为本发明的一种优选实施例，thz1的浓度为50-100nmol/l，优选为50nmol/l，平板克隆实验证实50nmol/l浓度对gist的两种细胞gist-t1和gist-882增殖具有显著抑制效果，而在50nmol/l和100nmol/l的比较中，发现两个浓度均显著增加了gist细胞的凋亡，但是两个浓度处理的细胞之间的细胞凋亡没有显著差异，结合thz1潜在的剂量毒性反应，因此50nmol/l作为优选浓度。
[0011]
作为本发明的一种优选实施例，thz1随着作用时间的延长显著抑制gist细胞的增殖。
[0012]
作为本发明的一种优选实施例，thz1的作用时间为24-72h，优选为72h，thz1的治疗效果随着时间延长而明显，在72h时，gist的两种细胞gist-t1和gist-882的增殖受到明显抑制且具有统计学差异。
[0013]
作为本发明的一种优选实施例，thz1通过抑制gist的rna聚合酶ii的转录调控，抑制基因的转录表达。
[0014]
作为本发明的一种优选实施例，药物是以thz1为主要有效成分制备的药物。
[0015]
作为本发明的一种优选实施例，药物还包括药学上可接受的载体。
[0016]
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
[0017]
本发明的cdk7靶向抑制剂thz1能特异性地抑制gist细胞的增殖，诱导细胞周期停滞并促进细胞凋亡；thz1可显著抑制gist荷瘤裸鼠的生长，转录组测序及后续生化实验验证表明：cdk7靶向抑制剂thz1通过转录调控信号通路抑制gist细胞增殖活性，具有生物安全性。
附图说明
[0018]
图1为本发明的实施例1中cdk7在gist患者中表达示意图。
[0019]
图2为本发明的实施例2中组织芯片cdk7蛋白表达以及对生存影响示意图。
[0020]
图3为本发明的实施例3中干扰cdk7表达后，gist细胞增殖受抑制的示意图。
[0021]
图4为本发明的实施例4中随thz1药物浓度逐渐增加和作用时间延长，抑制gist细胞增殖活性情况图。
[0022]
图5为本发明的实施例4中gist蛋白随thz1药物浓度增加的情况图。
[0023]
图6为本发明的实施例5中thz1显著抑制皮下gist肿瘤的增长以及安全性情况图。
[0024]
图7为本发明的实施例7中thz1靶向抑制剂cdk7调控gist细胞转录组水平变化示意图。
[0025]
图8为本发明的实施例7中thz1靶向抑制剂cdk7调控相关蛋白差异化表达示意图。
具体实施方式
[0026]
本发明提供了一种cdk7靶向抑制剂在制备治疗gist的药物中的应用。
[0027]
公共数据库以及我院患者临床样本中均显示，高危患者的cdk7表达显著高于低危gist患者；随后利用小干扰rna敲低cdk7后发现gist细胞株的克隆形成能力下降、细胞周期停滞于s期；通过采用cdk7靶点的抑制剂thz1处理gist细胞，发现thz1可显著促进细胞凋亡、抑制gist增殖。体内实验发现，cdk7抑制剂thz1可显著缩小gist肿瘤体积且不影响小鼠体重。从细胞水平，通过时间和药物浓度梯度，初步确定了thz1对于gist细胞较佳的处理浓度为50nmol/l；以及动物水平，通过裸鼠gist荷瘤实验，造模两周后连续两周每2天予10mg/kg的thz1处理可使gist肿瘤生长受到显著抑制，证实了cdk7抑制thz1使用时，可以抑制gist增殖并且安全性具有一定保证，说明thz1用于胃肠间质瘤治疗是可行的。
[0028]
下面将结合实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029]
实施例1 cdk7在高危和转移gist患者中显著高表达
[0030]
通过对geo公共数据库中数据集gse136755进行分析，发现cdk家族中cdk4、cdk7和cdk9在gist组织中表达高于cdk家族其他分子(图1中a图)；cdk7在高危及转移gist中表达显著高于极低危、低危和中危险gist(图1中b图)。
[0031]
实施例2在gist组织中，核分裂相高以及高危患者cdk7高表达比例显著高于低表达
[0032]
收集我院2008年1月至2012年12月共223例gist患者制作组织芯片，免疫组织化学染色评分显示，134例(60.1％)患者为低表达和89(39.9％)例为高表达(图2中a图)；cdk7表达水平与患者肿瘤核分裂像(p＝0.005)及危险度(p＝0.014)具有显著相关性，核分裂像高组(大于5/50hpfs)患者和高危组gist患者中，cdk7高表达比例显著大于低表达比例，而cdk7表达水平与患者性别、年龄、肿瘤部位及大小无显著相关性(表1)。
[0033]
生存分析显示，总体患者3年、5年和10年无复发生存率分别为90.9％、86.4％和70.9％。其中cdk7高表达组3年、5年和10年无复发生存率分别为86.4％、81.5％和59.9％。
而cdk7低表达组分别为92.7％、89.8％和79.8％。cdk7高表达组患者rfs显著小于低表达组，预后更差，log-rank检验示具有统计学差异(图2中b图，p＝0.031,hr＝2.024,ci＝1.046-3.917)。
[0034]
表1组织芯片中cdk7表达水平与患者临床病理特点的相关性分析
[0035][0036][0037]
实施例3干扰cdk7表达后，gist细胞凋亡增加、阻滞于s期、增殖得到显著抑制
[0038]
本实施例采用3个不同序列cdk7-sirna转染gist-t1和gist-882细胞。选取其中2个敲低效率显著sirna序列(如表2)进行后续研究，cck-8实验结果表明，gist-t1和gist-882细胞在转染cdk7的sirna后，72h时细胞吸光度显著小于对照组具有统计学差异，则cck-8检测示cdk7敲低显著抑制gist-t1和gist-882细胞增殖活性(图3中a图，p《0.05)，提示细胞增殖活性显著受到抑制。细胞平板克隆形成实验结果表明，gist-t1和gist-882细胞在转染cdk7的sirna后，其对应细胞克隆形成数量显著小于对照组，具有统计学差异，cdk7敲低显著抑制gist-t1和gist-882细胞克隆形成(图3中b图，p《0.05)。细胞周期结果显示，gist-t1和gist-882细胞在cdk7的sirna敲低后，s期细胞比例显著高于对照组(p《0.05)，而g0/g1期细胞数量显著小于对照组(p《0.05)，提示细胞周期停滞于s期，则cdk7敲低促使gist-t1和gist-882细胞周期停滞于s期(图3中c图)。
[0039]
表2cdk7小干扰rna序列
[0040][0041]
实施例4 cdk7抑制剂thz1显著抑制gist细胞生长
[0042]
随thz1药物浓度逐渐增加，gist-t1和gist-882细胞活性显著受到抑制，呈剂量相关性，则cdk7抑制剂thz1随剂量升高显著抑制gist-t1和gist-882细胞增殖活性。经过graphpad prism软件拟合ic50曲线后，gist-t1和gist-882的thz1 ic50值分别为41nmol/l和79nmol/l(图4中a图)；50nmol/l的thz1作用gist-t1和gist-882细胞后，细胞克隆形成数量均显著小于对照组，具有统计学差异，则50nmol/l作用显著抑制gist-t1和gist-882细胞克隆形成(图4中b图，p《0.05)，提示细胞增殖显著受到抑制；gist-t1在thz1 50nmol/l和100nmol/l分别作用72h后，其细胞活性均显著低于对照组细胞，则thz1随作用时间延长显著抑制gist-t1和gist-882细胞增殖活性(图4中c图，p《0.05)。而gist-882细胞在thz1的浓度100nmol/l作用72h后，细胞活性显著低于对照组细胞(p《0.05)。而thz1的浓度50nmol/l作用后，细胞活性与对照组细胞间无显著性差异(图4中c图，p》0.05)，表明thz1抑制呈时间相关性；对于gist-t1细胞，50nmol/和100nmol/l浓度的thz1作用后，凋亡细胞逐渐显著增多(图4中d图，p《0.05)。同样，100nmol/l和200nmol/l浓度的thz1作用于gist-882细胞后，凋亡细胞数量也显著增加，50nmol/l和100nmol/l浓度，100nmol/l和200nmol/l浓度thz1分别作用于gist-t1和gist-882细胞。流式细胞检测技术结果显示thz1显著促进gist-t1和gist-882细胞凋亡，并且药物浓度增加，凋亡细胞比例显著升高(p《0.05)；gist-t1和gist-882细胞随着thz1药物浓度梯度作用后，cleaved-caspase3、cleaved-parp和γh2ax蛋白表达均逐渐升高，呈浓度相关性，浓度越高，蛋白表达越显著(图5)。结合流式细胞检测结果表
明thz1可显著促进gist细胞凋亡。
[0043]
实施例5裸鼠体内，thz1可显著抑制皮下gist肿瘤的增长
[0044]
取处于对数生长期的gist-t1细胞，细胞密度为80-90％左右。胰酶消化细胞后用预冷的pbs洗两遍，用pbs重悬至密度为(3
×
106/100μl)，并用等量bd martrigel基质胶(1:1)混合，皮下注射于裸鼠背部平坦处(100μl)。待肿瘤细胞成瘤肉眼可见时，将裸鼠随机分为实验组和对照组2组(n＝5)。thz1用pbs溶解，实验组和对照组分别每2天腹腔注射等体积(10mg/kg)thz1溶液和pbs。连续观察20天，每3日测量小鼠体重，肿瘤体积。对照组小鼠相对thz1药物注射组小鼠皮下肿瘤体积随时间逐渐增大，则thz1处理组小鼠最终体积及重量显著小于对照pbs注射组小鼠(p《0.05，图6)。
[0045]
实施例6裸鼠体内，thz1治疗组与对照组体重相当，提示裸鼠对thz1耐受可
[0046]
在实施例5中，两组间小鼠体重变化无显著性差异(p》0.05，图6中d图)，则裸鼠对thz1的耐受度可，10mg/kg的量对于裸鼠属于安全剂量。
[0047]
实施例7 cdk7靶向抑制剂thz1调控gist细胞转录组水平变化，改变相关蛋白差异化表达
[0048]
为进一步确认thz1是如何促进干细胞亚群转化为非干细胞以及哪些基因起关键作用，用浓度为50nmol/l的thz1处理gist-t1细胞24h，收集细胞，裂解提rna对其进行转录组测序和差异表达分析。结果表明，thz1处理后，处理组和对照组相比，基因在转录组水平存在显著的改变，转录组测序表明，thz1促使gist-t1细胞内大量基因表达降低(图7中a图)；对每组比较的差异表达基因进行gene ontology(go)富集分析，观察到转录组的富集到的go改变，主要集中在dna转录组和rna polymerase ii启动子基因转录调控的生物过程，而这些变化和thz1的药物机制相吻合，即thz1靶向抑制剂cdk7通过阻止rna polymerase ii的磷酸化，抑制mrna转录，则thz1对gist-t1的主要生物学影响，其主要通过rna聚合酶ii的转录调控信号通路(图7)。
[0049]
wb蛋白检测结果显示，thz1作用gist-t1和gist-882细胞后，rna聚合酶ii的c端结构域(ctd)和其s2、s5和s7磷酸化位点表达随药物浓度增高显著受到抑制，呈剂量相关性(图8)。结合测序结果提示，thz1通过抑制rna聚合酶ii的转录调控功能，抑制基因的转录表达。
[0050]
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
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[0052]