可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层及其制备方法与流程

1.本技术涉及生物医学材料领域，具体而言，涉及一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层及其制备方法。


背景技术：

2.血管支架植入术已成为治疗冠状动脉硬化性心脏病(冠心病)的主要手段，然而早期的金属裸支架(bare metal stent,bms)植入后易引发新生内膜过度增生，从而导致支架内再狭窄(in-stent restenosis,isr)发生概率较高(20％～30％)；而药物洗脱支架(drug-eluting stent,des)虽可以通过抗增生药物(如雷帕霉素、依维莫司等)的原位释放，有效抑制isr的发生概率。然而，des释放药物后，支架本体材料长期暴露于血管之中，容易诱导血管内皮细胞(vascular endothelial cells,ecs)的炎症反应，导致其正常功能失调，例如发生迁移及黏附能力下调，从而导致再内皮化(re-endothelialization)延迟，最终导致晚期血栓(late stent thrombosis,lst)。


技术实现要素：

3.本技术提供了一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层及其制备方法，该支架涂层能够降低炎症反应对血管内皮细胞正常功能的影响。
4.本技术实施例是这样实现的：
5.第一方面，本技术实施例提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层的制备方法，包括：
6.在基底材料的表面形成具有氨基官能团的薄膜层；将表面具有薄膜层的基底材料置于混合溶液中，在4～40℃温度下进行反应，反应后进行干燥以在基底材料表面形成涂层；混合溶液中含有yap抑制剂和用于活化yap抑制剂的羧基的活化液。
7.第二方面，本技术实施例提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层，其由第一方面实施例的可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层的制备方法制得。
8.本技术实施例的可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层及其制备方法的有益效果包括：
9.在基底材料的表面形成具有氨基官能团的薄膜层，氨基官能团能够固定yap抑制剂，由于混合溶液中含有yap抑制剂和活化液，则活化液能够活化yap抑制剂的羧基，使得yap抑制剂可以与氨基形成较好的脱水缩合变成酰胺键。在4～40℃温度下，在活化液的作用下，yap抑制剂与薄膜层的氨基脱水缩合形成酰胺键，干燥后在基底材料的表面形成稳定的涂层，该涂层可抑制血管内皮细胞炎症反应，降低炎症反应对血管内皮细胞迁移黏附等功能的影响。
附图说明
10.以上所述仅为本技术的具体实施例而已，只是为了更清楚地说明本技术实施例的
技术方案，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。
11.图1为实施例4制得的支架涂层材料的xps分析图；
12.图2为实施例4提供的涂层的亲疏水性评判图；
13.图3为实施例4提供的涂层的微纳拓扑结构图；
14.图4为实施例3提供的涂层的血管内皮细胞il-10mrna表达情况图；
15.图5为实施例3提供的涂层的血管内皮细胞yap mrna表达情况图；
16.图6为实施例3提供的涂层的血管内皮细胞il-10蛋白表达情况图；
17.图7为实施例3提供的涂层的血管内皮细胞yap蛋白表达情况图。
具体实施方式
18.下面将结合实施例对本技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本技术，而不应视为限制本技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
19.血管支架植入术已成为治疗冠状动脉硬化性心脏病(冠心病)的主要手段，然而，现有的血管支架容易诱导血管内皮细胞炎症反应。
20.基于此，本技术提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层及其制备方法。
21.以下针对本技术实施例的可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层及其制备方法进行具体说明：
22.本技术实施例提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层的制备方法，包括：
23.在基底材料的表面形成具有氨基官能团的薄膜层；将表面具有薄膜层的所述基底材料置于混合溶液中，在4～40℃温度下进行反应，反应后进行干燥以在基底材料表面形成涂层；混合溶液中含有yap抑制剂和用于活化yap抑制剂的羧基的活化液。
24.需要说明的是，yap抑制剂也叫做共转录因子(yes-associated protein)抑制剂。共转录因子(yap)在调控血管内皮细胞各类生物学行为过程中起到关键作用。申请人在研究中发现，yap蛋白在炎性血管内皮细胞中时呈现高表达的，则抑制yap蛋白可显著抑制血管内皮细胞的炎症反应。在基底材料的表面形成具有氨基官能团的薄膜层，氨基官能团能够固定yap抑制剂，由于混合溶液中含有yap抑制剂和活化液，则活化液能够活化yap抑制剂的羧基，使得yap抑制剂可以与薄膜层的氨基形成较好的脱水缩合变成酰胺键。在4～40℃温度下，在活化液的作用下，yap抑制剂与薄膜层的氨基脱水缩合形成酰胺键，干燥后在基底材料的表面形成稳定的涂层，涂层不易从基底材料上脱落，涂层中的yap抑制剂能够抑制yap蛋白，则该涂层可有效抑制血管内皮细胞炎症反应，降低炎症反应对血管内皮细胞迁移黏附等功能的影响。
25.示例性地，基底材料包括金属材料、聚合物材料或者金属/聚合物复合材料。
26.可选地，反应温度为4℃、8℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃中的任一者或者任意两者之间的范围。
27.可选地，反应时间为60～600min，例如为60min、90min、120min、150min、200min、
240min、300min、360min、400min、480min、500min、540min和600min中的任一者或者任意两者之间的范围。
28.在一种可能的实施方案中，yap抑制剂包括verteporfin(维替泊芬)；示例性地，verteporfin的质量浓度为0.1～2wt％，例如为0.1wt％、0.3wt％、0.5wt％、0.8wt％、1wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.8wt％和2wt％中的任一者或者任意两者之间的范围。
29.示例性地，活化液包括碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺。通过碳二亚胺能够有效降低yap抑制剂上的羧基反应活化能，使得其与基底材料表面的氨基发生脱水缩合反应，形成酰胺键，以在基底材料表面形成稳定的涂层。可选地，碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺的摩尔浓度比为1:0.3～3，例如为1:0.3、1:0.5、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5或1:3。
30.其中，混合溶液中含有yap抑制剂和用于活化yap抑制剂的羧基的活化液，示例性地，混合溶液的制备步骤包括：将yap抑制剂在溶剂中进行分散，然后加入活化液活化。
31.示例性地，溶剂选自水、二甲基亚砜、甲醇、乙醇和六氟异丙醇中的一种或多种。yap抑制剂在这些溶剂不仅能够很好地分散，而且在加入活化液后也能使得活化液与yap抑制剂分散地比较均匀，从而有利于活化yap抑制剂的羧基。
32.可选地，活化时间为10～30min，例如为10min、15min、20min、25min、或30min。该时间能够保证yap抑制剂的羧基被充分活化。
33.在一种可能的实施方案中，具有氨基官能团的薄膜层为多巴胺与碱性氨基酸共聚合生成。
34.多巴胺能够通过自己分子结构中的氨基与酚/醌基形成共价聚合，碱性氨基酸中一个氨基酸有两个氨基，碱性氨基酸的氨基可以和多巴胺的氨基竞争与多巴胺的酚/醌基聚合，从而引入更多的氨基，实现氨基放大，使得薄膜层有更多的反应性氨基官能团来固定yap抑制剂。
35.示例性地，在基底材料的表面形成具有氨基官能团的薄膜层的制备步骤包括：
36.将基底材料置于含有多巴胺和碱性氨基酸的反应溶液中，反应后进行干燥。
37.示例性地，碱性氨基酸包括精氨酸和/或赖氨酸。即是说，碱性氨基酸可以只含有精氨酸或者赖氨酸，也可以同时含有精氨酸和赖氨酸。示例性地，在反应溶液中的反应时间为0.5～12h，例如为0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h和12h中的任一者或者任意两者之间的范围。
38.可选地，反应溶液中含有磷酸盐缓冲液或者三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
39.磷酸盐缓冲液或者三羟甲基氨基甲烷缓冲液能够控制反应速度，使得薄膜层的氨基官能团能够均匀存在。
40.本技术的发明人在研究中发现，反应溶液的ph以及多巴胺和碱性氨基酸的摩尔配比会影响薄膜层中氨基的密度，从而影响涂层的生成效率和涂层的稳定性。
41.在一种可能的实施方案中，反应溶液的ph为8～10。该ph能够使得薄膜层中具有较多的氨基官能团，从而提高涂层的生成效率和涂层的稳定性。示例性地，反应溶液的ph为8、8.3、8.5、8.8、9、9.2、9.5、9.8和10中的任一者或者任意两者之间的范围。
42.在一种可能的实施方案中，反应溶液中的多巴胺和碱性氨基酸的摩尔浓度之比为1:0.5～10。该摩尔浓度的配比能够使得薄膜层中具有较多的活性氨基官能团，从而提高涂层的生成效率和涂层的稳定性。示例性地，反应溶液中的多巴胺和碱性氨基酸的摩尔浓度
之比为1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9和1:10中的任一者或者任意两者之间的范围。
43.另外，本技术的发明人在研究中发现，多巴胺的质量浓度对涂层的形成也有影响，如果多巴胺的质量浓度太低，则涂层不容易稳定地形成在基底材料，如果多巴胺的质量浓度太高，则不能形成氨基放大。本技术实施例的反应溶液中的多巴胺的质量浓度为0.01～0.05wt％，既能够形成氨基放大，又能够形成稳定的涂层。示例性地，反应溶液中的多巴胺的质量浓度为0.01wt％、0.02wt％、0.03wt％、0.04wt％和0.05wt％中的任一者或者任意两者之间的范围。
44.需要说明的是，在其他实施方案中，也可以是将含有多巴胺和碱性氨基酸的反应溶液喷涂在基底材料的表面以形成具有氨基官能团的薄膜层。其中，喷涂时需保持材料表面湿润，以保证各基团之间反应充分。
45.本技术实施例还提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层，其由上述的可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层的制备方法制得。
46.该制备方法制得的支架涂层，涂层稳定地存在于基底层材料上，使得涂层能够稳定地发挥作用，涂层中的yap抑制剂能够抑制yap蛋白，该涂层可有效抑制血管内皮细胞炎症反应。
47.以下结合实施例对本技术的可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层及其制备方法作进一步的详细描述。
48.实施例1
49.本实施例提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层，其制备方法包括：
50.将铜基底材料置于ph为8的反应溶液中反应3h，该反应溶液含有多巴胺、精氨酸和磷酸盐缓冲液，其中，反应溶液中的多巴胺的质量浓度为0.03wt％，精氨酸的质量浓度为0.2wt％，反应溶液中的多巴胺和精氨酸共聚合，干燥后在铜基底材料的表面形成具有氨基官能团的薄膜层。
51.将verteporfin分散在水中，然后加入摩尔浓度比为1:1的碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺活化20min得到混合溶液。
52.将表面具有薄膜层的基底材料置于混合溶液中，在30℃温度下反应2h，反应后进行干燥以在基底材料表面形成涂层，从而得到支架涂层。
53.实施例2
54.本实施例提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层，其制备方法包括：
55.将镁基底材料置于ph为10的反应溶液中反应5h，该反应溶液含有多巴胺、赖氨酸和三羟甲基氨基甲烷缓冲液，其中，反应溶液中的多巴胺的质量浓度为0.01wt％，赖氨酸的质量浓度为0.2wt％，反应溶液中的多巴胺和赖氨酸共聚合，干燥后在镁基底材料的表面形成具有氨基官能团的薄膜层。
56.将verteporfin分散在水中，然后加入摩尔浓度比为1:3的碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺活化10min得到混合溶液。
57.将表面具有薄膜层的基底材料置于混合溶液中，在20℃温度下反应3h，反应后进行干燥以在基底材料表面形成涂层，从而得到支架涂层。
58.实施例3
59.本实施例提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层，其制备方法包括：
60.将铜基底材料置于ph为8的反应溶液中反应5h，该反应溶液含有多巴胺、精氨酸和磷酸盐缓冲液，其中，反应溶液中的多巴胺的质量浓度为0.05wt％，精氨酸的质量浓度为0.2wt％，反应溶液中的多巴胺和精氨酸共聚合，干燥后在铜基底材料的表面形成具有氨基官能团的薄膜层。
61.将verteporfin分散在水中，然后加入摩尔浓度比为1:0.3的碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺活化10min得到混合溶液。
62.将表面具有薄膜层的基底材料置于混合溶液中，在40℃温度下反应3h，反应后进行干燥以在基底材料表面形成涂层，从而得到支架涂层。
63.实施例4
64.本实施例提供一种可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层的制备方法，其与实施例3的可抑制血管内皮细胞炎症的支架涂层的制备方法的不同之处仅在于本实施例以镁合金为基底材料。
65.试验例1
66.对实施例4制得的支架涂层材料进行xps分析，其结果如图1所示，从图1可以看出(c、n、o的高分辨解谱图)，该支架涂层材料表面含有氨基、酚羟基、醌基等多种基团。如图2所示，该涂层具有很好的亲水性能，且涂层表面具有显著的维纳拓扑结构(如图3所示)。
67.试验例2
68.种植血管内皮细胞(1
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107个)于实施例3中所得涂层，48h后对其促炎基因il-10及yap表达进行检测，收集血管内皮细胞。血管内皮细胞黏附48h后，采用qrt-pcr分析血管内皮细胞上述基因的表达水平(以正常培养细胞为对照)，并收集细胞提取总蛋白，采用western blotting方法检测目标蛋白表达。
69.如图4及图5所示，种植于功能涂层表面的血管内皮细胞具有较低的炎症基因il-10mrna表达水平，而yap mrna表达水平也降低，其蛋白表达与mrna一致(图6，图7)，说明相关活化液可以很好的活化yap抑制剂，使其低表达，而该涂层可有效通过抑制yap表达实现血管内皮细胞炎症基因il-10的低表达。