肉食替代组合物的制作方法

1.本发明涉及肉食替代组合物。


背景技术：

2.近年来，以应对食品问题和提供素食(vegan)等为目的，正在积极地开发可人工再现真肉的味道和口感的肉食替代组合物。作为肉食替代组合物，例如，已知有通过培养从动物采集的细胞而制作的培养肉、使用大豆、豌豆和小麦等的植物蛋白的替代肉(例如专利文献1～3)等。
3.现有技术文献
4.专利文献
5.专利文献1：日本特开2014-520554号公报
6.专利文献2：日本特开2017-517273号公报
7.专利文献3：日本特开2009-537177号公报


技术实现要素：

8.发明所要解决的问题
9.目前，一些使用植物蛋白的替代肉正被实用化。但是，尚不能充分再现真肉般的质感(外观等)和感官特性(香味和口感等)。
10.本发明的目的在于提供一种肉食替代组合物，该组合物与以往的肉食替代组合物相比，具有更接近真肉的质感和感官特性。
11.用于解决问题的方法
12.本发明人等发现，对于以往的使用植物蛋白的肉食替代组合物，通过使其含有具有特定氨基酸残基组成的多肽(例如，结构蛋白质)，能够再现更接近真肉的质感和感官特性。本发明以该发现为基础。
13.即，本发明涉及例如以下各发明。[1]一种肉食替代组合物，其包含满足下述(1)或(2)的多肽。(1)氨基酸残基数为150以上，丙氨酸残基含量为12～40％，且甘氨酸残基含量为11～55％；(2)选自由丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸构成的组中的至少1种的氨基酸残基含量、丙氨酸残基含量及甘氨酸残基含量的合计为56％以上。[2]根据[1]所述的肉食替代组合物，其中，上述多肽满足上述(1)和(2)这两者。[3]根据[1]或[2]所述的肉食替代组合物，其中，上述多肽为重组多肽。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的肉食替代组合物，其中，上述多肽具有多个重复序列单元，上述重复序列单元的氨基酸残基数为6～200。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的肉食替代组合物，其中，上述多肽包含(a)n基序。[6]根据[1]～[5]中任一项所述的肉食替代组合物，其中，上述多肽为结构蛋白质。[7]根据[1]～[6]中任一项所述的肉食替代组合物，其中，上述多肽为丝心蛋白。[8]根据[1]～[7]中任一项所述的肉食替代组合物，其中，上述多肽为纤维的形态。[9]根据[1]～[8]中任一项所述的肉食替代组合物，其中，进一步包含植物蛋白。[10]一种人造肉制品，其包含[1]～[9]中任一项所述的肉
食替代组合物或其加工物。[11]一种人造肉菜肴的制造方法，其具备：对[1]～[9]中任一项所述的肉食替代组合物或[10]所述的人造肉制品进行烹调的工序。
[0014]
发明效果
[0015]
根据本发明，可以提供一种肉食替代组合物，该组合物与以往的肉食替代组合物相比，具有更接近真肉的质感和感官特性。
附图说明
[0016]
图1是表示使用在试验例1中制备的肉食替代组合物的汉堡肉的外观的照片。
[0017]
图2是表示使用在试验例1中制备的肉食替代组合物的汉堡肉的外观的照片。
[0018]
图3是表示使用在试验例1中制备的肉食替代组合物的汉堡肉的外观的照片。
[0019]
图4是示意性地表示用于制造多肽纤维的纺丝装置的一例的说明图。
[0020]
图5是表示使用在试验例2中制备的肉食替代组合物的汉堡肉的外观的照片。
[0021]
图6是表示使用在试验例2中制备的肉食替代组合物的汉堡肉的外观的照片。
[0022]
图7是表示使用在试验例3中制备的肉食或肉食替代组合物的汉堡肉在烹调时发生的外观(汉堡肉的直径)变化的图表。
[0023]
图8是表示在试验例4中实施的质地剖面的数据处理内容的概略图。
[0024]
图9是表示使用在试验例4中制备的肉食或肉食替代组合物的汉堡肉的“硬度”的图表。
[0025]
图10是表示使用在试验例4中制备的肉食或肉食替代组合物的汉堡肉的“凝聚性”的图表。
[0026]
图11是表示使用在试验例4中制备的肉食或肉食替代组合物的汉堡肉的“弹性”的图表。
[0027]
图12是表示使用在试验例4中制备的肉食或肉食替代组合物的汉堡肉的“咀嚼性”的图表。
[0028]
图13是表示使用在试验例5中制备的肉食的汉堡肉的外观的照片。
[0029]
图14是表示使用在试验例5中制备的肉食替代组合物的汉堡肉的外观的照片。
[0030]
图15是表示使用在试验例6中制备的肉食或肉食替代组合物的汉堡肉在烹调时发生的外观(汉堡肉的直径)变化的图表。
具体实施方式
[0031]
以下，对本发明具体实施方式详细进行说明。但是，本发明并不限于以下实施方式。
[0032]
〔肉食替代组合物〕本实施方式所涉及的肉食替代组合物包含具有特定氨基酸残基组成的多肽。
[0033]
在本说明书中，“肉食替代组合物”是指不依赖家畜来源的肉食、而是人为再现肉食的化学特性(营养组成等)或品质(味道、风味、口感、外观等)的肉类替代品(meat substitute)。肉食替代组合物还包含所谓的培养肉和替代肉。从动物提取组织或细胞、培养该细胞并在实验室生产的“培养肉”也被称为“实验室肉(lab-meat)”、“体外肉(in vitro meat)”、“清洁肉(clean meat)”等。以植物等非动物来源的原料为材料的“替代肉”也被称
为“仿制肉”、“假肉”、“素肉”、“植物肉”、“人造肉”等。
[0034]
本实施方式所涉及的多肽可以满足下述(1)或(2)中的任意一项。(1)氨基酸残基数为150以上，丙氨酸残基含量为12～40％，且甘氨酸残基含量为11～55％；(2)选自由丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸构成的组中的至少1种的氨基酸残基含量、丙氨酸残基含量及甘氨酸残基含量的合计为56％以上。
[0035]
需要说明的是，在本说明书中，“丙氨酸残基含量”是指由下述式表示的值。丙氨酸残基含量＝(多肽中所含的丙氨酸残基的个数/多肽的全部氨基酸残基的个数)
×
100(％)，此外，甘氨酸残基含量、丝氨酸残基含量、苏氨酸残基含量、酪氨酸残基、谷氨酰胺残基以及赖氨酸残基含量在上述式中，与将丙氨酸残基分别替换为甘氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、酪氨酸残基、谷氨酰胺残基以及赖氨酸残基的含义相同。
[0036]
满足(1)的多肽只要氨基酸残基数为150以上即可。该氨基酸残基数例如可以为200以上或250以上，优选为300以上、350以上、400以上、450以上或500以上。
[0037]
满足(1)的多肽只要丙氨酸残基含量为12～40％即可。该丙氨酸残基含量例如可以为15～40％，还可以为18～40％，也可以为20～40％，还可以为22～40％。
[0038]
满足(1)的多肽只要甘氨酸残基含量为11～55％即可。该甘氨酸残基含量例如可以为11％～55％，还可以为13％～55％，也可以为15％～55％，还可以为18％～55％，也可以为20％～55％，还可以为22％～55％，也可以为25％～55％。
[0039]
满足(1)的多肽含有较多的丙氨酸残基及甘氨酸残基。由于丙氨酸残基和甘氨酸残基是侧链为非极性的氨基酸，因此在多肽生成的折叠过程中朝向内侧地配置，容易形成α螺旋结构或β片层结构。因此，通过肉食替代组合物含有满足(1)的多肽，肉食替代组合物在烹调中和烹调后不易走形，而且嚼劲增加，因此能够提高质感(外观)和感官特性(口感)。进一步地，当将满足(1)的多肽制成例如纤维、海绵、凝胶或薄膜的形态时，利用这些二级结构能够发挥高的强度和韧度，因此可以更显著地发挥上述效果。
[0040]
此外，据说甘氨酸具有降低血中胆固醇、从体内排出有害物质的解毒作用。据说丙氨酸具有转化为能源、促进醇代谢的作用。因此，可以期待通过本实施方式所涉及的肉食替代组合物含有满足(1)的多肽，来发挥这些营养方面的功能。
[0041]
满足(2)的多肽只要选自由丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸构成的组中的至少1种的氨基酸残基含量(即丝氨酸残基含量、苏氨酸残基含量、酪氨酸残基含量、丝氨酸残基含量及苏氨酸残基含量的合计、丝氨酸残基含量及酪氨酸残基含量的合计、苏氨酸残基含量及酪氨酸残基含量的合计、丝氨酸残基含量、苏氨酸残基含量及酪氨酸残基含量的合计中的任一个)、丙氨酸残基含量和甘氨酸残基含量合计而得的含量(合计含量)为56％以上即可。该合计含量例如可以为57％以上，还可以为58％以上，也可以为59％以上，还可以为60％以上。该合计含量的上限并没有特别限制，例如可以为90％以下，还可以为85％以下，也可以为80％以下。
[0042]
在一个实施方式中，满足(2)的多肽的丝氨酸残基含量、苏氨酸残基含量及酪氨酸残基含量的合计可以为4％以上，可以为4.5％以上，可以为5％以上，可以为5.5％以上，可以为6％以上，可以为6.5％以上，可以为7％以上。丝氨酸残基含量、苏氨酸残基含量及酪氨酸残基含量的合计例如可以为35％以下，可以为33％以下，可以为30％以下，可以为25％以下，可以为20％以下。
[0043]
满足(2)的多肽含有较多的选自由丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸构成的组中的一种氨基酸残基、丙氨酸残基和甘氨酸残基。丝氨酸残基、苏氨酸残基和酪氨酸残基是相对亲水性的氨基酸残基，丙氨酸残基和甘氨酸残基是相对疏水性的氨基酸残基。因此，满足(2)的多肽可以通过改变选自由丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸构成的组中的一种氨基酸残基的含量与丙氨酸残基和甘氨酸残基的含量的比率，来任意操控多肽的保水性和/或吸油性。通过多肽具有保水性和/或吸油性，可以提高与水性成分和/或油性成分的亲和性，并且能够改善肉食替代组合物的质感(外观)和感官特性(香味、口感)。
[0044]
此外，据说丝氨酸具有降低血中胆固醇、从体内排出有害物质的解毒作用。有报道称，转变为神经递质(多巴)的酪氨酸具有预防痴呆症和帕金森病的效果。因此，可以期待通过本实施方式所涉及的肉食替代组合物含有满足(2)的多肽，来发挥这些营养方面的功能。
[0045]
本实施方式所涉及的多肽优选为满足上述(1)及(2)这两者的多肽。由此，更显著地发挥出本发明的效果。
[0046]
本实施方式所涉及的多肽的丝氨酸残基、苏氨酸残基或酪氨酸残基的分布是平均的，在任意连续的20个氨基酸残基中，丝氨酸残基、苏氨酸残基及酪氨酸残基的合计含量可以为5％以上、10％以上或15％以上，也可以为50％以下、40％以下、30％以下或20％以下。
[0047]
一个实施方式所涉及的多肽可以具有重复序列。即，本实施方式所涉及的多肽可以在多肽内存在多个序列一致性高的氨基酸序列(重复序列单元)。重复序列单元的氨基酸序列并没有特别限制，只要以多肽整体计满足上述(1)或(2)即可。重复序列单元的氨基酸残基数优选为6～200。此外，重复序列单元间的序列一致性例如可以为85％以上，还可以为90％以上，也可以为95％以上，还可以为96％以上，也可以为97％以上，还可以为98％以上，也可以为99％以上。
[0048]
一个实施方式所涉及的多肽可以包含谷氨酰胺残基或/和赖氨酸残基。通过包含谷氨酰胺残基或/和赖氨酸残基，在存在转谷氨酰胺酶等食用交联粘合剂的情况下，多肽在分子内或分子间形成交联键。谷氨酰胺残基的含量例如可以为0％～30％，还可以为0％～25％，也可以为0％～20％，还可以为5％～20％，也可以为10％～20％，还可以为15％～20％。赖氨酸残基的含量例如可以为5％以上，还可以为10％以上，也可以为25％以下，还可以为20％以下，也可以为15％以下，还可以为10％以下。
[0049]
一个实施方式所涉及的多肽可以是包含(a)n基序的多肽。在本说明书中，(a)n基序是指以丙氨酸残基为主的氨基酸序列。(a)n基序的氨基酸残基数可以为2～27，还可以为2～20、2～16或2～12的整数。此外，只要(a)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数的比例为40％以上即可，可以为60％以上、70％以上、80％以上、83％以上、85％以上、86％以上、90％以上、95％以上或100％(意味着仅由丙氨酸残基构成)。
[0050]
在一个实施方式中，(a)n基序可以包含在重复序列单元中。(a)n基序主要包含丙氨酸残基，因此容易获得α螺旋结构或β片层结构。通过使(a)n基序包含在重复序列单元中，本实施方式所涉及的多肽重复地具有这些二级结构，因此肉食替代组合物在烹调中和烹调后不易走形，而且嚼劲增加，因此能够提高质感(外观)和感官特性(口感)。进一步地，当将该多肽制成例如纤维、海绵、凝胶或薄膜的形态时，利用这些二级结构能够发挥高的强度和韧度，因此可以更显著地发挥上述效果。
[0051]
本实施方式所涉及的多肽可以是例如结构蛋白质。所谓结构蛋白质，是指与生物
体的结构相关的蛋白质、或构成生物体所产生的结构体的蛋白质、或来源于它们的蛋白质。作为结构蛋白质，例如可以列举出丝心蛋白、角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白以及节肢弹性蛋白。
[0052]
作为结构蛋白质，只要满足上述(1)或(2)即可，并没有特别限制，但优选为丝心蛋白。作为丝心蛋白，例如可以列举出蚕丝丝心蛋白、蛛丝丝心蛋白、蜂丝丝心蛋白以及来源于它们的蛋白质。
[0053]
作为丝心蛋白，例如可以列举出天然来源的丝心蛋白。天然来源的丝心蛋白例如可以列举出昆虫或蜘蛛类产生的丝心蛋白。
[0054]
作为昆虫产生的丝心蛋白，可以列举例如家蚕(bombyx mori)、野桑蚕(bombyx mandarina)、天蚕(antheraea yamamai)、柞蚕(anteraea pernyi)、枫蚕(eriogyna pyretorum)、蓖麻蚕(pilosamia cynthia ricini)、樗蚕(samia cynthia)、樟蚕(caligura japonica)、印度柞蚕(antheraea mylitta)、琥珀蚕(antheraea assama)等蚕产生的蚕丝丝心蛋白及雀蜂(vesp simillima xanthoptera)幼虫吐出的蜂丝丝心蛋白。
[0055]
作为昆虫产生的丝心蛋白的更具体示例，可以列举例如蚕丝心蛋白l链(genbank登录号m76430(碱基序列)及aaa27840.1(氨基酸序列))。
[0056]
作为蜘蛛类产生的丝心蛋白，例如，可以列举出属于蜘蛛目(araneae)的蜘蛛产生的蛛丝蛋白。更具体而言，可以列举大腹园蛛、十字园蛛、肥胖园蛛、五纹园蛛和野岛园蛛等属于园蛛属(araneus属)的蜘蛛、青新园蛛、嗜水新园蛛、灌木新园蛛和类青新园蛛等属于新园蛛属(neoscona属)的蜘蛛、小岬蛛等属于岬蛛属(pronus属)的蜘蛛、蟾蜍曲腹蛛和对称曲腹蛛等属于曲腹蛛属(cyrtarachne属)的蜘蛛、库氏棘腹蛛和乳突棘腹蛛等属于棘腹蛛属(gasteracantha属)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛和六刺瘤腹蛛等属于瘤腹蛛属(ordgarius属)的蜘蛛、悦目金蛛、小悦目金蛛和横纹金蛛等属于金蛛属(argiope属)的蜘蛛、双峰尾园蛛等属于尾园蛛属(arachnura属)的蜘蛛、褐吊叶蛛等属于吊叶蛛属(acusilas属)的蜘蛛、红云斑蛛、花云斑蛛和全色云斑蛛等属于云斑蛛属(cytophora属)的蜘蛛、丑锥头蛛等属于锥头蛛属(poltys属)的蜘蛛、八瘤艾蛛、四突艾蛛、圆腹艾蛛和黑尾艾蛛等属于艾蛛属(cyclosa属)的蜘蛛和日本壮头蛛等属于壮头蛛属(chorizopes属)的蜘蛛产生的蛛丝蛋白、以及前齿肖蛸、锥腹肖蛸、直伸肖蛸和鳞纹肖蛸等属于肖蛸属(tetragnatha属)的蜘蛛、纵条银鳞蛛、肩斑银鳞蛛和小肩斑银鳞蛛等属于银鳞蛛属(leucauge属)的蜘蛛、棒络新妇和斑络新妇等属于络新妇属(nephila属)的蜘蛛、美丽麦蛛等属于麦蛛属(menosira属)的蜘蛛、柔弱粗螯蛛等属于锯螯蛛属(dyschiriognatha属)的蜘蛛、红斑寇蛛、哈氏寇蛛、几何寇蛛和间斑寇蛛等属于寇蛛属(latrodectus属)的蜘蛛、以及属于育儿网蛛属(euprosthenops属)的蜘蛛等属于肖蛸科(tetragnathidae科)的蜘蛛产生的蛛丝丝心蛋白。作为蛛丝丝心蛋白，可以列举例如masp(masp1和masp2)、adf(adf3和adf4)等牵引丝蛋白、misp(misp1和misp2)、acsp、pysp、flag等。
[0057]
作为蜘蛛类产生的蛛丝丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如丝心蛋白-3(fibroin-3，adf-3)[十字园蛛(araneus diadematus)来源](genbank登录号aac47010(氨基酸序列)、u47855(碱基序列))、丝心蛋白-4(fibroin-4，adf-4)[十字园蛛来源](genbank登录号aac47011(氨基酸序列)、u47856(碱基序列))、牵引丝蛋白蛛丝蛋白1(dragline silk protein spidroin 1)[金纺蜘蛛(nephila clavipes)来源](genbank登录号
aac04504(氨基酸序列)、u37520(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1(major ampullate spidroin 1)[黑寡妇蜘蛛(latrodectus hesperus)来源](genbank登录号abr68856(氨基酸序列)、ef595246(碱基序列))、牵引丝蛋白蛛丝蛋白2(dragline silk protein spidroin 2)[棒络新妇(nephila clavata)来源](genbank登录号aal32472(氨基酸序列)、af441245(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1[非洲育儿网蛛(euprosthenops australis)来源](genbank登录号caj00428(氨基酸序列)、aj973155(碱基序列))和大壶状腺蛛丝蛋白2(major ampullate spidroin 2)[非洲育儿网蛛](genbank登录号cam32249.1(氨基酸序列)、am490169(碱基序列))、小壶状腺丝蛋白1(minor ampullate silk protein 1)[金纺蜘蛛](genbank登录号aac14589.1(氨基酸序列))、小壶状腺丝蛋白2(minor ampullate silk protein 2)[金纺蜘蛛](genbank登录号aac14591.1(氨基酸序列))、小壶状腺蛛丝蛋白样蛋白质(minor ampullate spidroin-like protein)[nephilengys cruentata](genbank登录号abr37278.1(氨基酸序列)等。
[0058]
天然来源的丝心蛋白的更具体示例可以进一步列举出在ncbi genbank中登录有序列信息的丝心蛋白。例如，可以通过从ncbi genbank中登录的序列信息中包含inv作为分类码(division)的序列中提取出在定义(definition)中记载有蛛丝蛋白、壶状腺、丝心蛋白、“丝和多肽”或“丝和蛋白质”作为关键词的序列、从cds中提取出指定产物的字符串、从来源(source)中提取出在组织类型(tissue type)中记载有指定字符串的序列来确认。
[0059]
丝心蛋白可以是改造丝心蛋白。在本说明书中，“改造丝心蛋白”是指人工制造的丝心蛋白(人造丝心蛋白)。改造丝心蛋白可以是其结构域序列与天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列不同的丝心蛋白，也可以是与天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列相同的丝心蛋白。改造丝心蛋白是包含式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所表示的结构域序列的蛋白质。改造丝心蛋白可以在结构域序列的n末端侧及c末端侧中的任意一个末端侧或两个末端侧进一步添加有氨基酸序列(n末端序列及c末端序列)。n末端序列及c末端序列并不限定于此，典型地为不具有丝心蛋白中特征性的氨基酸基序的重复的区域，由100个残基左右的氨基酸构成。
[0060]
改造丝心蛋白可以是直接利用天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列的丝心蛋白，也可以是依据天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列来改造其氨基酸序列的丝心蛋白(例如，通过对克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列进行改造来改造氨基酸序列而得到的丝心蛋白)，此外也可以为不依赖天然来源的丝心蛋白而人工设计和合成的丝心蛋白(例如，通过对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成而具有期望的氨基酸序列的丝心蛋白)。
[0061]
在本说明书中，“结构域序列”为生成丝心蛋白特有的结晶区(典型地相当于氨基酸序列的(a)n基序)和非晶区(典型地相当于氨基酸序列的rep)的氨基酸序列，是指式1：[(a)n基序-rep]m或式2：[(a)n基序-rep]
m-(a)n基序所示的氨基酸序列。在此，(a)n基序表示以丙氨酸残基为主的氨基酸序列，氨基酸残基数为2～27。(a)n基序的氨基酸残基数可以为2～20、2～16或2～12的整数，也可以为4～27、4～20、8～20、10～20、4～16、8～16或10～16的整数。此外，只要(a)n基序中的丙氨酸残基数相对于全部氨基酸残基数的比例为40％以上即可，可以为60％以上、70％以上、80％以上、83％以上、85％以上、86％以上、90％以上、95％以上或100％(意味着仅由丙氨酸残基构成)。在结构域序列中多个存在的(a)n基序中
至少7个可以仅由丙氨酸残基构成。rep表示由2～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。rep可以是由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示2～300的整数，也可以为10～300的整数。多个存在的(a)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。多个存在的rep可以是彼此相同的氨基酸序列，也可以是不同的氨基酸序列。各rep中的丝氨酸残基含量、苏氨酸残基含量及酪氨酸残基含量的合计可以为5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、11％以上、12％以上、13％以上、14％以上、或者15％以上，也可以为50％以下、40％以下、30％以下、或者20％以下。此外，所有rep中的丝氨酸残基含量、苏氨酸残基含量及酪氨酸残基含量的合计(将所有rep视为一个多肽时的丝氨酸残基含量、苏氨酸残基含量及酪氨酸残基含量的合计)可以为5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、11％以上、12％以上、13％以上、14％以上、或者15％以上，也可以为50％以下、40％以下、30％以下、或者20％以下。所有rep中的谷氨酰胺残基的含量可以为5％以上、6％以上、7％以上、8％以上、9％以上、10％以上、11％以上、12％以上、13％以上、14％以上、或者15％以上，也可以为30％以下、或者20％以下。例如，结构域序列的氨基酸残基数可以为6～300，也可以为6～250，还可以为6～200。
[0062]
本实施方式所涉及的改造丝心蛋白例如可以通过对克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列进行例如与置换、缺失、插入及/或添加一个或多个氨基酸残基相当的氨基酸序列的改造而得到。氨基酸残基的置换、缺失、插入及/或添加可以通过定点诱变法等本领域技术人员熟知的方法来进行。具体而言，可以根据nucleic acid res.10，6487(1982)、methods in enzymology，100，448(1983)等文献中记载的方法来进行。
[0063]
作为丝心蛋白，只要满足上述(1)或(2)即可，并没有特别限制。作为丝心蛋白的具体例子，例如，可以列举出下述表1所示的丝心蛋白(改造丝心蛋白)。
[0064]
[表1]
[0065][0066]
一个实施方式所涉及的多肽可以是纯化后的多肽。优选地，纯化后的多肽仅仅包含该多肽，但也可以包含不可避免地混入的杂质。
[0067]
一个实施方式所涉及的多肽可以是重组多肽。重组多肽是指使用基因重组技术制备的多肽。重组多肽可以是根据肉食替代组合物的用途等从非动物来源的基因重组生物中分离出来的多肽。
[0068]
一个实施方式所涉及的多肽可以是来源于非植物源的多肽。具体而言，例如，可以为从非植物中纯化的多肽，也可以为由从非植物中分离出来的基因使用基因重组技术来制造的多肽。
[0069]
一个实施方式所涉及的多肽可以是抗菌性的。具体而言，例如，可以为具有抗菌性
氨基酸序列的多肽，也可以为具有抗菌性蛋白质基序的多肽。与以往的肉食替代组合物相比，可以具有长的储存寿命，尤其是可以在常温下保存或运输。
[0070]
例如，根据本实施方式所涉及的多肽可以是包含该多肽或由该多肽构成的成型体(例如，纤维、凝胶、薄膜、多孔质体(海绵)、粒子、模塑成型体)的形态。与以往的肉食替代组合物相比，由于可以更显著地发挥具有更接近真肉的质感和感官特性的本发明的效果，因此本实施方式所涉及的多肽优选为纤维的形态(多肽纤维)。
[0071]
多肽纤维可以是长纤维，也可以是短纤维。短纤维的长度例如可以为1～20mm，可以为1～15mm，也可以为1～10mm，还可以为1～5mm。
[0072]
多肽纤维可以是长丝(复丝、单丝等)、纺丝、捻丝、假捻丝、加工丝、混纤丝、混纺丝等。
[0073]
多肽纤维可以通过公知的纺丝方法来制造。即，例如，首先将本实施方式所涉及的多肽与作为溶解促进剂的无机盐一起添加到二甲基亚砜(dmso)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、盐酸、甲酸或六氟异丙醇(hfip)等溶剂或溶液中，溶解，制成纺丝原液。接下来，使用该纺丝原液，通过湿式纺丝、干式纺丝、干湿式纺丝或熔融纺丝等公知的纺丝方法进行纺丝，可以得到目标多肽纤维。
[0074]
图4是示意性地表示用于制造多肽纤维的纺丝装置的一例的说明图。图4所示的纺丝装置10是干湿式纺丝用的纺丝装置的一例，具有挤出装置1、未拉伸丝制造装置2、湿热拉伸装置3和干燥装置4。
[0075]
对使用纺丝装置10的纺丝方法进行说明。首先，储存在储槽7中的纺丝原液6通过齿轮泵8从喷丝头9挤出。接下来，所挤出的纺丝原液6经过气隙19供给到凝固液槽20的凝固液11内，去除溶剂，多肽凝固，形成纤维状凝固体。接下来，将纤维状凝固体供给到拉伸浴槽21内的温水12中进行拉伸。拉伸倍率由供给夹持辊13与引离夹持辊14的速度比决定。然后，将拉伸后的纤维状凝固体供给到干燥装置4，在丝道22内干燥，以卷丝体5的形式获得多肽纤维36。18a～18g是导丝器。
[0076]
作为凝固液11，只要是能够脱溶剂的溶剂或溶液即可，可以列举例如甲醇、乙醇和2-丙醇等碳原子数1～5的低级醇、以及丙酮、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠等。凝固液11可以适当地包含水。凝固液11的温度优选为0～30℃。在使用具有直径0.1～0.6mm的喷嘴的注射泵作为喷丝头9的情况下，挤出速度优选为每孔0.2～6.0ml/小时，更优选为1.4～4.0ml/小时。凝固的多肽从凝固液11中通过的距离(实质上是从导丝器18a到导丝器18b的距离)只要是能够有效地进行脱溶剂的长度即可，例如可以为200～500mm。未拉伸丝的引离速度例如可以为1～20m/分钟，优选为1～3m/分钟。在凝固液11中的停留时间例如可以为0.01～3分钟，优选为0.05～0.15分钟。此外，可以在凝固液11中进行拉伸(预拉伸)。凝固液槽20可以设置多段，并且可以根据需要在各段或特定的段中进行拉伸。
[0077]
需要说明的是，关于得到多肽纤维时实施的拉伸，除了例如上述的在凝固液槽20内进行的预拉伸和在拉伸浴槽21内进行的湿热拉伸以外，还可以采用干热拉伸。
[0078]
湿热拉伸可以在温水中、在温水中加入有机溶剂等的溶液中、或蒸汽加热中进行。作为温度，例如可以为50～90℃，优选为75～85℃。在湿热拉伸中，可以将未拉伸丝(或预拉伸丝)拉伸例如1～10倍，优选拉伸2～8倍。
[0079]
干热拉伸可以使用管式电热炉、干热板等来进行。作为温度，例如可以为140℃～
270℃，优选为160℃～230℃。在干热拉伸中，可以将未拉伸丝(或预拉伸丝)拉伸例如0.5～8倍，优选拉伸1～4倍。
[0080]
湿热拉伸和干热拉伸可以分别单独进行，另外也可以将它们以多步或组合进行。即，可以以湿热拉伸进行第一步拉伸，以干热拉伸进行第二步拉伸；或者第一步拉伸进行湿热拉伸，第二步拉伸进行湿热拉伸，进一步以干热拉伸进行第三步拉伸等，可以将湿热拉伸和干热拉伸适当组合进行。
[0081]
关于最终拉伸倍率，其下限值相对于未拉伸丝(或预拉伸丝)优选为大于1倍、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上、7倍以上、8倍以上、9倍以上中的任一个，上限值优选为40倍以下、30倍以下、20倍以下、15倍以下、14倍以下、13倍以下、12倍以下、11倍以下、10倍以下。由于拉伸丝能够发挥更高的强度，因此能够更显著地发挥本发明的效果。
[0082]
本实施方式所涉及的多肽纤维的应力可以为0.5gf/d以上。应力优选为0.8gf/d以上，更优选为1gf/d以上。当应力在此范围内时，可获得进一步提高肉食替代组合物的制造中的成品率的效果。强度是指通过复丝的标准拉伸试验而求出的值。
[0083]
本实施方式所涉及的多肽纤维的直径可以小于50μm。例如，蛋白质纤维的直径优选小于45μm或小于40μm，更优选为35μm以下、32μm以下或30μm以下，进一步优选为15μm以下或者10μm以下。通过使用直径更小的蛋白质纤维，与真品的相似度更为优异，并可获得更接近真品的口感和质感。例如，蛋白质纤维的直径可以为5μm以上、10μm以上、15μm以上、18μm以上、20μm以上、22μm以上、25μm以上、30μm以上、32μm以上、35μm以上、40μm以上、或者45μm以上。例如，蛋白质纤维的直径可以为5～50μm、10～50μm、15～50μm、5～45μm、5～40μm、5～35μm、5～32μm、5～50μm、10～45μm、10～40μm、10～35μm、10～32μm、10～30μm。
[0084]
本实施方式所涉及的多肽可以是模塑成型体的形态(多肽树脂)。通过使用多肽模塑成型体，可以再现真正的带骨肉。
[0085]
本实施方式所涉及的肉食替代组合物可以单独含有1种上述多肽，也可以含有2种以上的上述多肽。
[0086]
本实施方式所涉及的肉食替代组合物可以是包含上述多肽以外的蛋白质成分的组合物。作为该蛋白质成分，优选为以往的肉食替代组合物中使用的来源于非动物源的蛋白质成分，具体而言，例如，可以列举出来源于大豆、豌豆、小麦、燕麦、黑麦、大麦、芥花籽、葵花籽、高粱、大米、苋菜、马铃薯、木薯、葛根、美人蕉、羽扇豆、油菜籽、藻类、可食用丝状菌及它们的混合物等非动物源的蛋白质。
[0087]
本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的多肽的含量，以肉食替代组合物总量为基准，例如可以为0.1重量％以上、可以为0.2重量％以上、可以为0.3重量％以上、可以为0.4重量％以上、可以为0.5重量％以上、可以为0.6重量％以上、可以为0.7重量％以上、可以为0.8重量％以上、可以为0.9重量％以上、可以为1重量％以上、可以为1.5重量％以上、可以为2重量％以上、可以为2.5重量％以上、可以为3重量％以上、可以为3.5重量％以上、可以为4重量％以上、可以为4.5重量％以上、可以为5重量％以上、可以为10重量％以上、可以为15重量％以上、可以为20重量％以上、可以为30重量％以上、可以为40重量％以上、也可以为50重量％以上。本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的多肽的含量，以肉食替代组合物总量为基准，例如可以为90重量％以下、可以为80重量％以下、可以为70重量％以下、可以为60重量％以下、可以为50重量％以下、可以为40重量％以下、可以为30重量％以
下、可以为20重量％以下、可以为15重量％以下、可以为10重量％以下、可以为5重量％以下、可以为4.5重量％以下、可以为4重量％以下、可以为3.5重量％以下、可以为3重量％以下、可以为2.5重量％以下、可以为2重量％以下、可以为1.5重量％以下、可以为1重量％以下、可以为0.9重量％以下、可以为0.8重量％以下、可以为0.7重量％以下、可以为0.6重量％以下、可以为0.5重量％以下、可以为0.4重量％以下、可以为0.3重量％以下、也可以为0.2重量％以下。本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的多肽的含量，以肉食替代组合物总量为基准，例如可以为0.1～10重量％、可以为0.2～10重量％、可以为0.3～10重量％、可以为0.4～10重量％、可以为0.5～10重量％、可以为0.6～10重量％、可以为0.7～10重量％、可以为0.8～10重量％、可以为0.9～10重量％、可以为1～10重量％、可以为0.1～9重量％、可以为0.1～8重量％、可以为0.1～7重量％、可以为0.1～6重量％、可以为0.1～5重量％、可以为0.5～9重量％、可以为0.5～8重量％、可以为0.5～7重量％、可以为0.5～6重量％、可以为0.5～5重量％、可以为1～9重量％、可以为1～8重量％、可以为1～7重量％、可以为1～6重量％、可以为1～5重量％、可以为1～4重量％、可以为1.5～10重量％、可以为1.5～9重量％、可以为1.5～8重量％、可以为1.5～7重量％、可以为1.5～6重量％、可以为1.5～5重量％、可以为2～10重量％、可以为2～9重量％、可以为2～8重量％、可以为2～7重量％、可以为2～6重量％、可以为2～5重量％、可以为3～10重量％、可以为3～9重量％、可以为3～8重量％、可以为3～7重量％、可以为3～6重量％、也可以为3～5重量％。
[0088]
本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的多肽的含量，以肉食替代组合物总量为基准，例如可以为0.1体积％以上、可以为0.2体积％以上、可以为0.3体积％以上、可以为0.4体积％以上、可以为0.5体积％以上、可以为0.6体积％以上、可以为0.7体积％以上、可以为0.8体积％以上、可以为0.9体积％以上、可以为1体积％以上、可以为1.5体积％以上、可以为2体积％以上、可以为2.5体积％以上、可以为3体积％以上、可以为3.5体积％以上、可以为4体积％以上、可以为4.5体积％以上、可以为5体积％以上、可以为10体积％以上、可以为15体积％以上、可以为20体积％以上、可以为30体积％以上、可以为40体积％以上、也可以为50体积％以上。本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的多肽的含量，以肉食替代组合物总量为基准，例如可以为90体积％以下、可以为80体积％以下、可以为70体积％以下、可以为60体积％以下、可以为50体积％以下、可以为40体积％以下、可以为30体积％以下、可以为20体积％以下、可以为15体积％以下、可以为10体积％以下、可以为5体积％以下、可以为4.5体积％以下、可以为4体积％以下、可以为3.5体积％以下、可以为3体积％以下、可以为2.5体积％以下、可以为2体积％以下、可以为1.5体积％以下、可以为1体积％以下、也可以为0.5体积％以下。本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的多肽的含量，以肉食替代组合物总量为基准，例如可以为0.1～10体积％、可以为0.5～10体积％、可以为1～10体积％、可以为1.5～10体积％、可以为2.5～10体积％、可以为0.1～5体积％、可以为0.1～4体积％、可以为0.1～3体积％、可以为0.1～2.5体积％、可以为5～10体积％、可以为0.5～8体积％、可以为0.5～5体积％、可以为0.5～4体积％、可以为0.5～3.5体积％、可以为0.5～3体积％、可以为1～8体积％、可以为1～5体积％、可以为1.5～5体积％、可以为2.5～5体积％、可以为3～8体积％、也可以为0.5～2.5体积％。
[0089]
本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的多肽的含量，以肉食替代组合物中含有的蛋白质成分的总量为基准，例如可以为10重量％以上、可以为20重量％以上、可以为30重
量％以上、可以为40重量％以上、也可以为50重量％以上。本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的多肽的含量，以肉食替代组合物中含有的蛋白质成分的总量为基准，例如可以为90重量％以下、可以为80重量以下、可以为70重量％以下、可以为60重量％以下、可以为50重量％以下、可以为40重量％以下、可以为30重量％以下、也可以为20重量％以下。
[0090]
本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的蛋白质成分的含量，以肉食替代组合物总量为基准，例如可以为0.5重量％以上、可以为1重量％以上、可以为2重量％以上、可以为3重量％以上、可以为4重量％以上、可以为5重量％以上、可以为6重量％以上、可以为7重量％以上、可以为8重量％以上、可以为9重量％以上、可以为10重量％以上、可以为20重量％以上、可以为30重量％以上、可以为40重量％以上、也可以为50重量％以上。本实施方式所涉及的肉食替代组合物中的蛋白质成分的含量，以肉食替代组合物总量为基准，例如可以为90重量％以下、可以为80重量以下、可以为70重量％以下、可以为60重量％以下、可以为50重量％以下、可以为40重量％以下、可以为30重量％以下、可以为20重量％以下、也可以为10重量％以下。
[0091]
本实施方式所涉及的肉食替代组合物可以含有例如水、植物油、糖类、盐类、矿物质、着色剂、抗氧化剂、增稠稳定剂、膳食纤维、香料、食用交联粘合剂等。
[0092]
作为植物油，可以列举出例如玉米油、橄榄油、大豆油、花生油、杏仁油、芝麻油、棉籽油、菜籽油、芥花籽油、红花油、葵花籽油、亚麻籽油、棕榈油、核桃油、藻类油、椰子油、乳木果油、芒果脂、可可脂、小麦胚芽油、米糠油、或者由细菌、藻类、古细菌或真菌、或由经基因改造的细菌、藻类、古细菌或真菌产生的油等。作为糖类，可以列举出例如低聚糖、糖和葛根、玉米淀粉、片栗淀粉、马铃薯淀粉、西米、木薯等植物来源的淀粉。作为盐类，可以列举出例如氯化钠、氯化钾、谷氨酸盐(例如谷氨酸单钠)、甘氨酸盐、鸟苷酸盐、肌苷酸盐以及5
’‑
核糖核苷酸盐。作为矿物质，可以列举出例如铝、铵、钙、镁和钾盐。作为抗氧化剂，可以是天然的抗氧化剂，也可以是合成的抗氧化剂，可以列举出例如能够防止着色的植物蛋白的氧化所导致的变色的抗氧化剂。作为增稠稳定剂，可以列举出例如海藻酸及其盐、琼脂、卡拉胶及其盐、粗品卡拉胶、树胶(角豆胶、瓜尔胶、黄蓍胶和黄原胶)、果胶、以及羧甲基纤维素钠。作为膳食纤维，可以列举出例如大豆纤维和谷朊纤维。作为香料，可以列举出例如香辛料提取物、香辛料油、天然烟熏液、天然烟熏提取物、酵母提取物、香菇提取物、以及洋葱香料、大蒜香料和香草香料等香味剂。作为食用交联粘合剂，可以列举出例如能够促进纤维形成的物质，具体而言，可以列举出魔芋葡甘聚糖(kgm)粉、转谷氨酰胺酶等食用交联粘合剂、pureglucan(注册商标，takeda制)等β葡聚糖、钙盐及镁盐等。
[0093]
本实施方式所涉及的肉食替代组合物除了添加本发明所涉及的多肽以外，可以按照常规方法来获得。例如，本实施方式所涉及的肉食替代组合物可以通过将本发明所涉及的多肽和根据需要的上述各种成分混合均匀、成型为所希望的形状来获得。此外，例如，本实施方式所涉及的肉食替代组合物也可以通过将本发明所涉及的多肽以外的上述各种成分混合均匀后，在该混合物中添加本发明所涉及的多肽并混合均匀，成型为所希望的形状来获得。进一步地，例如，在本发明所涉及的多肽为纤维的形态的情况下，本实施方式所涉及的肉食替代组合物也可以通过将本发明所涉及的多肽以外的上述各种成分混合均匀后，对该混合物进行拼接、机织、编织、针织、针刺等处理，成型为所希望的形状来获得。
[0094]
本发明还涉及一种人造肉制品，其包括本发明所涉及的肉食替代组合物或其加工
物。作为肉食替代组合物的加工物，可以列举出例如经加热处理过的肉食替代组合物、调味后的肉食替代组合物、根据需要与其他食材一起烹调过的肉食替代组合物(包括烹调完毕的食品和半烹调食品)。肉食替代组合物可以加工成各种食品以作为人类或动物的食物。例如，最终制品可以是仿造肉馅制品、牛排制品、沙朗尖制品、烤肉制品、碎切制品、切块肉制品或炸肉块制品的作为人的食品的肉食替代组合物。上述制品均放置在托盘上，由包装物覆盖，或真空包装，或放入蒸煮用的罐或袋中，或者冷冻。
[0095]
本发明还涉及一种人造肉菜肴的制造方法，其具备对本发明所涉及的肉食替代组合物或人造肉制品进行烹调的工序。肉食替代组合物或人造肉制品的烹调可以按照常规方法来实施。
[0096]
实施例
[0097]
下面，基于试验例更具体地说明本发明。但是，本发明并不限于以下试验例。
[0098]
〔试验例1：肉食替代组合物的制备及评价〕
[0099]
《比较例1》在市售的组织化植物蛋白(tvp，bob’s red mill制造)中，以达到表2所示的重量百分比(相对于最终得到的比较例1的肉食替代组合物整体的重量百分比)的方式添加表2所记载的各种成分，混合均匀。混合后，使用家用微波炉，以700w加热2分钟。放冷至室温后，添加与蒸发液量相等的量的水(7g)。
[0100]
[表2]
[0101][0102]
接下来，在上述得到的混合物中，以达到表3所示的重量百分比(相对于最终得到的比较例1的肉食替代组合物整体的重量百分比)的方式添加表3所记载的各种成分，混合均匀。
[0103]
[表3]
[0104][0105]
在得到的混合物中，以达到表4所示的重量百分比(相对于最终得到的比较例1的肉食替代组合物整体的重量百分比)的方式添加表4所记载的各种成分，混合均匀。通过以上的工艺，得到比较例1的肉食替代组合物。
[0106]
[表4]
[0107]
成分制造商相对于整体的重量百分比(％)色拉油日清奥利友集团2.4％
橄榄油日清奥利友集团3.2％膳食纤维纤维素粉nutricology2.1％椰子油california gold nutrition7.5％
[0108]
将比较例1的肉食替代组合物60g拿在手上，成型为汉堡肉素材的形状，使用平底锅进行加热烹调，以供感官评价。
[0109]
《比较例2》将比较例1的肉食替代组合物60g与约3g的色拉油混合，得到比较例2的肉食替代组合物。将其拿在手上，并将其成型为汉堡肉素材的形状，使用平底锅进行加热烹调，以供感官评价。
[0110]
《实施例1》使用小型整经机(sw550，cci tech inc.制造)，通过丝绸线轴(来源于蚕)得到数百根长度为3.6m的长纤维。使用台式强力纤维切割机(np-300，intec co.ltd.制造)切割所得到的长纤维，得到长度为3mm的蚕丝短纤维(约100g)。
[0111]
将比较例1的肉食替代组合物60g和上述得到的蚕丝短纤维约3g混合，得到实施例1的肉食替代组合物。将其拿在手上，并将其成型为汉堡肉素材的形状，使用平底锅进行加热烹调，以供感官评价。
[0112]
《实施例2》将实施例1中得到的蚕丝短纤维约3g在超过80℃的热水中浸泡1分钟后过滤。过滤后，将约10g的色拉油加入到蚕丝短纤维中，使其均匀分散。将比较例1的肉食替代组合物60g与得到的蚕丝短纤维的分散液混合，得到实施例2的肉食替代组合物。将其拿在手上，并将其成型为汉堡肉素材的形状，使用平底锅进行加热烹调，以供感官评价。
[0113]
(感官评价)对通过烹调比较例1～2和实施例1～2的肉食替代组合物而得到的汉堡肉进行外观、味道、芳香(香味)和口感的感官评价。感官评价由1名评委实施，各项目均按照评分为1～4的4个等级(1：差，2：一般，3：稍好，4：好)来进行评价。将结果示于表5。
[0114]
[表5]
[0115][0116]
图1～3示出了比较例1～2和实施例1～2的汉堡肉的照片。
[0117]
比较例1和比较例2的汉堡肉的外观(包括质感)相似，但比较例2的汉堡肉通过添加色拉油，肉食的香味稍微有所增强。
[0118]
实施例1的汉堡肉通过添加蚕丝短纤维，可以保持肉的形状，并且外观得以改善。此外，能够感觉到“肉筋”的口感。另一方面，所添加的蚕丝短纤维露出到表面(图1等)。
[0119]
实施例2的汉堡肉能够在汉堡肉的形状不发生走形的情况下，带有适度的烘烤表面(图2等)，并且外观显著改善。此外，蚕丝短纤维起到结缔组织的作用，与比较例2和实施例1相比，肉更具粘聚性。其结果是，外观和口感相当地接近肉。此外，蚕丝短纤维吸油，整块肉都感觉很柔软。油的香味散发出肉味。
[0120]
〔试验例2：肉食替代组合物的制备及评价〕
[0121]
《实施例3》从genbank的网络数据库获得金纺蜘蛛(nephila clavipes)来源的丝心蛋白(genbank登录号：p46804.1、gi：1174415)的碱基序列及氨基酸序列后，出于提高生产率的目的，实施氨基酸残基的置换、插入及缺失，进而在n末端附加标签序列及铰链序列，设计出具有序列号1所示的氨基酸序列的重组丝心蛋白(以下也称为“prt799”)。
[0122]
分别合成编码所设计的重组丝心蛋白的核酸。该核酸中，在5’末端附加有ndei位点、在终止密码子下游附加有ecori位点。将该核酸克隆到克隆载体(puc118)中后，利用ndei及ecori对该核酸进行限制酶处理并切下后，重组到蛋白质表达载体pet-22b( )中，得到表达载体。
[0123]
用得到的表达载体转化大肠杆菌blr(de3)。将该转化大肠杆菌在含有氨苄青霉素的2ml的lb培养基中培养15小时。将该培养液添加到含有氨苄青霉素的100ml的种子培养用培养基(表6)中，以使od
600
达到0.005。将培养液温度保持在30℃，进行烧瓶培养直至od
600
达
到5为止(约15小时)，得到种子培养液。
[0124]
[表6]
[0125]
种子培养用培养基
[0126][0127]
将该种子培养液添加到加有500ml的生产培养基(表7)的发酵罐中，以使od
600
达到0.05。将培养液温度保持在37℃，在ph6.9下恒定控制来进行培养。此外，将培养液中的溶解氧浓度维持在溶解氧饱和浓度的20％。
[0128]
[表7]
[0129]
生产培养基
[0130][0131]
在生产培养基中的葡萄糖被完全消耗后，立即以1ml/分钟的速度添加料液(葡萄糖455g/1l、酵母提取物120g/1l)。将培养液温度保持在37℃，在ph6.7下恒定控制来进行培养。此外，将培养液中的溶解氧浓度维持在溶解氧饱和浓度的20％，培养20小时。
[0132]
然后，向培养液中添加1m的异丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)水溶液以使其终浓度为1mm，表达诱导目标重组丝心蛋白。在添加iptg后经过20小时的时间点，对培养液进行离心分离，回收菌体。使用由添加iptg前和添加iptg后的培养液制备的菌体进行sds-page，根据依赖于iptg添加的相当于目标重组丝心蛋白的尺寸的条带的出现，确认目标重组丝心蛋白的表达。
[0133]
将添加iptg后经过24小时后回收的菌体用20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)清洗。使清洗后的菌体悬浊于含有约1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)的20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)中，
使用高压匀浆器(panda plus 2000，gea niro saovi公司制造)对菌体反复进行3次破碎。用离心分离机(“model7000”，久保田公司制造)对破碎后的细胞进行离心分离(11000g、10分钟、室温)，获得沉淀物。用20mm tris-hcl缓冲液(ph7.4)或3％sds缓冲液(ph3.0)清洗所得沉淀物，直至达到高纯度为止。将清洗后的沉淀物以达到100mg/ml的浓度的方式用8m胍缓冲液(8m胍盐酸盐、10mm磷酸二氢钠、20mm nacl、1mm tris-hcl、ph7.0)悬浊，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)用水进行透析。将透析后得到的白色凝集蛋白质通过离心分离来回收，用冻干机除去水分后，得到重组丝心蛋白的冻干粉。
[0134]
使用上述得到的重组丝心蛋白的冻干粉，制备纺丝液(纺丝原液)。在冻干粉中添加99％甲酸，以使冻干粉的浓度达到24质量％。用旋转器溶解14小时后，去除异物和气泡。将其作为纺丝液(纺丝原液)。
[0135]
使用图4所示的纺丝装置，通过氮气泵将纺丝原液喷出到凝固液(甲醇)中。湿式纺丝的条件如下所示。由此，得到重组丝心蛋白纤维。《湿式纺丝条件》纺丝原液温度：25℃、凝固液(甲醇)1温度：5℃、凝固液(甲醇)2温度：25℃、水浴拉伸槽温度：25℃、热辊(hr)温度：60℃
[0136]
使用小型整经机(sw550，cci tech inc.制造)，从线轴(来源于重组丝心蛋白)得到数百根长度为3.6m的长纤维。使用台式强力纤维切割机(np-300，intec co.ltd.制造)切割所得到的长纤维，得到长度为2mm的重组丝心蛋白短纤维(约100g)。
[0137]
将得到的重组丝心蛋白短纤维在碳酸氢钠水溶液中分散处理10分钟后，过滤。然后，用离子交换水洗涤数次重组丝心蛋白短纤维。
[0138]
将比较例1的肉食替代组合物60g、色拉油约3g与洗涤后的重组丝心蛋白短纤维0.6g混合，得到实施例3的肉食替代组合物。将其拿在手上，并将其成型为汉堡肉素材的形状，使用平底锅进行加热烹调，以供感官评价。
[0139]
《实施例4》除了将洗涤后的重组丝心蛋白短纤维的混合量从0.6g变更为3g以外，通过与实施例3相同的方法，得到实施例4的肉食替代组合物。将其拿在手上，并将其成型为汉堡肉素材的形状，使用平底锅进行加热烹调，以供感官评价。
[0140]
《比较例3》通过与试验例1的比较例2相同的方法，得到比较例3的肉食替代组合物。将其拿在手上，并将其成型为汉堡肉素材的形状，使用平底锅进行加热烹调，以供感官评价。
[0141]
《比较例4》将比较例3的肉食替代组合物拿在手上，成型为汉堡肉素材的形状，使用平底锅进行比实施例3～4和比较例3更长时间(2倍的时间)的加热烹调，以供感官评价。
[0142]
(感官评价)对比较例3～4和实施例3～4的汉堡肉进行外观、味道、芳香、口感和综合评价(综合性肉味)的感官评价。感官评价由2名评委实施，各项目均按照评分为1～4的4个等级(1：差，2：一般，3：稍好，4：好)来进行评价。结果如表8所示。
[0143]
[表8]
[0144]
2名评委评分的平均值外观味道芳香口感综合评价比较例32.02.02.01.52.0比较例42.02.52.52.02.5实施例33.03.03.03.03.0
实施例43.04.03.53.53.5
[0145]
图5～6示出了比较例3～4和实施例3～4的汉堡肉的照片。
[0146]
实施例3～4的汉堡肉通过添加重组丝心蛋白纤维，来保持外观和整体形状，并且没有烤痕裂纹。此外，令人惊奇的是，比较例3和实施例3～4的汉堡肉尽管加热烹调时间相同，但观察到表面的烤痕差异(图5)。比较例4的汉堡肉与比较例3和实施例3～4的汉堡肉相比，尽管花费了2倍的烹调时间，但也无法形成实施例4的汉堡肉那样的烤痕(图6)。实施例3～4的汉堡肉与比较例3～4的汉堡肉相比，口感改善，并且烹调时也不容易走形。
[0147]
对于实施例3～4的汉堡肉的味道，在比较例3的汉堡肉中感受到的原料的粉末感消失，进而感觉到“肉筋”，但另一方面，没有感觉到最后的纤维感。此外，实施例3～4的汉堡肉感觉到与比较例3的汉堡肉不同的肉味。实施例3～4的汉堡肉与实施例3的汉堡肉的评价相似，但在表面没有发现重组丝心蛋白短纤维的露出。
[0148]
添加了5重量％的重组丝心蛋白短纤维的实施例4的汉堡肉风味更丰富，无损伤(表面无裂纹)，并且粉末那样的口感少。
[0149]
〔试验例3：肉食替代组合物的制备和评价〕《材料》(肉食原料和肉食替代组合物原料)作为肉食原料或肉食替代组合物原料，准备猪肉的肉馅和omnipork(omnifoods公司制造)这2种。omnipork配料表：水、蛋白质混合物(大豆蛋白浓缩物、大豆蛋白分离物、香菇发酵豌豆&大米蛋白)、增稠剂(甲基纤维素、麦芽糊精)、酵母提取物、棕榈油、马铃薯淀粉、甘蔗糖、食盐、天然香料(芥花籽油和葵花籽油)、大麦麦芽提取物、着色剂(甜菜红)、葡萄糖、抗结剂(二氧化硅)。
[0150]
(多肽纤维)将实施例3中得到的人造丝心蛋白prt799的冻干粉添加到甲酸(株式会社朝日化学公司制造)中以使其浓度达到31质量％，然后在80℃下溶解。之后，去除异物和气泡，制成纺丝液1(纺丝原液1)。
[0151]
以提高疏水度为目的，设计出将序列号1所示的氨基酸序列中的qq全部置换为vf并将其余的q置换为i的氨基酸序列(序列号2所示的氨基酸序列prt966)。
[0152]
使用与实施例3同样地得到的重组丝心蛋白prt966的冻干粉，制备纺丝液。向冻干粉中加入99％甲酸，以使冻干粉的浓度达到26质量％。在40℃溶解后，去除异物和气泡。将其作为纺丝液2(纺丝原液2)。
[0153]
同样地，将上述得到的重组丝心蛋白prt966的冻干粉添加到甲酸中以使其浓度达到30质量％，然后在40℃下溶解。之后，去除异物和气泡，制成纺丝液3(纺丝原液3)。
[0154]
将制备好的纺丝原液1、纺丝原液2或纺丝原液3填充到储罐中。使用不活泼气体(氮气)，从内径为0.20mm的孔径的针头喷出纺丝液，并使其喷出至凝固液(甲醇)槽中。蛋白质凝固后，在甲醇洗涤浴、水洗涤浴中依次洗涤和拉伸后，使用干热板使其干燥，得到重组丝心蛋白纤维(原丝)1～3。湿式纺丝的条件如下。喷出压力：0.5bar、拉伸倍率：5～7倍、凝固浴液温度：5～20℃、干燥温度：60℃
[0155]
使用物性测定光学显微镜来求出纤维的直径。在温度：20℃、相对湿度：60％rh的气氛温度下，使用拉伸试验机(岛津公司制造小型台式试验机ez-s)，测定蛋白质纤维的应力和伸度，并计算韧度。将样品粘贴于用厚纸制作的模框上，夹具间距为20mm，拉伸速度为10mm/分钟。称重传感器的容量为1n，夹具采用夹式。根据下式计算韧度。[e/(r2
×
π
×
l)
×
1000](单位：mj/m3)。其中，e为断裂能(单位：j)，r为纤维的半径(单位：mm)，π为圆周率，l为
拉伸试验测定时的夹具间距为20mm。对得到的各重组丝心蛋白纤维的应力、伸度和纤维直径进行评价，将重组丝心蛋白纤维1的物性值设为100％，对各个测定值进行换算，将结果示于表9。同样地，对市售的大豆纤维和天然来源的蚕丝纤维的应力、伸度和纤维直径也进行评价，将结果示于表9。
[0156]
[表9]
[0157][0158]
对于上述长纤维，使用台式强力纤维切割机(np-300，intec co.ltd.制造)，将长纤维切割成3mm的长度，得到约20g的3mm重组丝心蛋白短纤维1～3。
[0159]
(汉堡肉素材的制备)如表10所示，将得到的短纤维分别添加在肉食原料或肉食替代组合物中(实施例5～8、比较例5～8)，揉捻数分钟，使纤维分散均匀。取100g的肉食替代组合物，放入直径为9cm、厚度为1.8cm的圆形模具中，成型为汉堡肉素材的形状，盖上盖子，在4℃下保存。
[0160]
(汉堡肉的烹调和评价)16小时后，将电烤架设定为180℃，使用耐油纸对汉堡肉素材进行单面各7分钟的加热烹调。
[0161]
[表10]
[0162][0163]
评价在烹调过程中产生的外观(汉堡肉的直径)的变化，将比较例6的变化率设定为100％，对各个测定值进行换算，将结果示于图7。烹调前后的汉堡肉的直径的变化通过下式来计算。直径的减少率(％)＝[(生素材的直径)-(烹调后的直径)]/(生素材的直径)
×
100％
[0164]
当使用肉食原料时(比较例5)，在烹调中，动物肉的蛋白质变性，并急剧收缩。由于肉食替代组合物中的质地化后的植物蛋白是已经变性的蛋白质，因此当使用肉食替代组合物时(比较例6)，在烹调过程中收缩的现象并不明显。即使在肉食替代组合物中添加1重量％的蛋白质纤维，也未发现直径的减少，但通过添加5重量％的重组丝心蛋白纤维2(实施例8)，汉堡肉的直径的减少率增加，在烹调时，显示出更像真品的外观变化。
[0165]
〔试验例4：肉食替代组合物的制备及评价〕(汉堡肉素材的制备、烹调及评价)如表
11所示，将上述中分别得到的短纤维添加在肉食原料或肉食替代组合物中(实施例9～13、比较例9～12)，如上述试验例3那样制成汉堡肉素材，进行加热烹调，在4℃、相对湿度60％下保存，以供质地剖面分析。
[0166]
[表11]
[0167][0168]
对于实施例9～13和比较例9～12，烹调后的汉堡肉的质地评价使用万能测试仪ez test(岛津制作所)来实施质地剖面分析。将烹调后的汉堡肉的样品切成原始高度
×
2.5cm
×
2.5cm，用500n的称重传感器压缩到原始高度的50％。将十字头速度设定为300mm/分钟，将2次压缩的时间间隔设定为2秒。对各样品反复进行9次测定，进行包括“硬度”、“凝聚性”、“弹性”和“咀嚼性”在内的综合性质地剖面评价。“硬度”、“凝聚性”、“弹性”和“咀嚼性”根据图8和下式来计算。将未添加短纤维的比较例10的测定值设为100％，对各个测定值进行换算，将评价结果示于表12和图9～12。
[0169]
硬度：hardness(h)
[0170]
使用柱塞对食物施加负荷时的最大试验力
[0171]
凝聚性(cohesiveness)：a2/a1
[0172]
当对食品施加负荷时，该食物会变形或破损。
[0173]
连续施加2次负荷，第1次和第2次的负荷面积(能量)之比
[0174]
弹性(spriginess)：t2/t1
[0175]
使用柱塞对食物连续施加2次负荷，其“凹陷、位移”之比
[0176]
咀嚼性(chewiness)：h
×
a2/a1
×
t2/t1
[0177]
硬度
×
弹性
×
凝聚性
…
固体食品
[0178]
[表12]
[0179][0180]
当肉食替代组合物中添加1.5体积％的纤维的情况下，添加大豆纤维(比较例11)和天然来源的蚕丝纤维(比较例12)，虽然增加了汉堡肉的硬度(图9)，但却大幅度降低了汉堡肉的弹性和凝聚力(图10和图11)。另一方面，添加重组丝心蛋白纤维(实施例9、实施例11和实施例13)，可以在不会大幅降低汉堡肉的弹性和凝聚力(图10和图11)的前提下，提高硬度(图9)。
[0181]
在使用疏水性不同的2种蛋白质并使用疏水度高的重组丝心蛋白纤维(实施例10～12)的情况下，与疏水度低的重组丝心蛋白纤维(实施例9)相比，可以进一步增加硬度，并且可以带来更高的咀嚼性。
[0182]
在使用机械特性不同的2种蛋白质并使用纤维的直径为约30μm的重组丝心蛋白纤维3的情况下(实施例13)，与使用直径为约10μm的重组丝心蛋白纤维2的情况(实施例11)相比，显示出更像真品的质地。
[0183]
在使重组蛋白质的添加量在0.5～2.5体积％的范围内增加的情况下(实施例10～12)，可以在不大幅降低汉堡肉的弹性和凝聚力的前提下提高硬度，并显示出更像真品的质地。
[0184]
〔试验例5：肉食替代组合物的制备及评价〕(汉堡肉素材的制备、烹调及评价)如表13所示，将上述中分别得到的短纤维添加在肉食原料或肉食替代组合物中(实施例14、比较例13～15)，如上述试验例3那样制成汉堡肉素材，进行加热烹调。将对最初的单面进行加热烹调时的外观变化示于图13和图14。
[0185]
[表13]
[0186][0187]
在使用肉食原料的情况下(比较例13)，在烹调中，水分和脂肪向下流动、排出，但在使用肉食替代组合物的情况下(比较例14)，水分的一部分排出到上表面，并直接在表面形成水滴。通过在肉食替代组合物中添加重组丝心蛋白纤维(实施例14)，与使用肉食原料的情况相同，没有发现水滴的形成，在烹调时，显示出更像真品的外观变化。
[0188]
〔试验例6：肉食替代组合物的制备及评价〕(汉堡肉素材的制备、烹调及评价)如表
14所示，将上述中分别得到的短纤维添加在肉食原料或肉食替代组合物中(实施例15～13、比较例15～12)，如上述试验例3那样制成汉堡肉素材，进行加热烹调。
[0189]
[表14]
[0190][0191]
评价在烹调过程中产生的外观(汉堡肉的直径)的变化，将比较例16的变化率设定为100％，对各个测定值进行换算，将结果示于图15。烹调前后的汉堡肉的直径的变化通过下式来计算。直径的减少率(％)＝[(生素材的直径)-(烹调后的直径)]/(生素材的直径)
×
100％
[0192]
当使用肉食原料时(比较例15)，在烹调中，动物肉的蛋白质变性，并急剧收缩。当使用肉食替代组合物时(比较例16)，在烹调过程中收缩的现象并不明显。即使在肉食替代组合物中添加大豆纤维(比较例17)或天然来源的蚕丝纤维(比较例18)，也未发现直径的减少，但通过添加5重量％的各个重组丝心蛋白纤维1～3(实施例15～17)，汉堡肉的直径的减少率增加，在烹调时，显示出更像真品的外观变化。
[0193]
符号说明
[0194]1…
挤出装置、2
…
未拉伸丝制造装置、3
…
湿热拉伸装置、4
…
干燥装置、6
…
纺丝原液、10
…
纺丝装置、20
…
凝固液槽、21
…
拉伸浴槽、36
…
多肽纤维