协同组合物的制作方法

协同组合物
1.本发明涉及新型组合物，其包含两种不同的共混的海洋来源的组分的组合，所述混合海洋来源的组分包含至少两种组分，所述至少两种组分包括至少长尾鳕鱼子(hoki roe)(hr)粉末或油，并且优选与绿唇贻贝(green-lipped mussel)(glm)粉末或油组合。
2.本发明进一步涉及所述组合物在人和兽医应用中的用途，特别是在补充剂或营养保健品(nutraceuticals)中的用途，从而在健康且特别是关节健康中提供营养支持。
3.背景
4.营养保健品、食品和健康补充剂通常用于改善或支持哺乳动物(包括人和动物)的关节结构并维持关节活动性。
5.生物炎症途径与关节健康(包括例如关节活动性)直接相关。潜在地，包括促分解脂质介体的脂质和生物活性肽也可以具有作用，但可以通过不同的途径起作用。
6.已经显示效果源自必需脂肪酸(efa)。认为涉及生物炎性途径的几种酶受这些efa的存在或不存在的影响，并且还取决于efa的类型。
7.显著水平的奥米伽(ω)多不饱和脂肪酸，特别是ω-3可能支持身体的天然抗炎过程，因此可能是有用的。特别地，这些efa被代谢成抗炎类二十烷酸。ω-3的存在支持现有的抗炎途径，因为它们将在该过程中优先起作用，但在它们不存在的情况下，天然底物(包括其他efa，例如花生四烯酸)可以代谢以产生促炎剂。
8.尽管glm粉末可用于在补充剂组合物中提供ω-3来源的目的，但ω-3脂肪酸的质量和含量并不总是可靠的，并且可能并不总是足以用于维持人或动物关节健康的产品。
9.然而，仍然期望提供用于支持关节健康的有效组合物，无论是作为长期维持产品，例如在食品或营养补充剂中，还是作为短期膳食解决方案。特别地，提供与足以满足这些应用的期望技术规格相关的glm粉末的高规格来源的能力越来越具有挑战性。
10.因此，本发明源于对提供可用于上述商业应用的新组合物的持续需求。
11.发明概述
12.本发明涉及包含两种粉末或油组分的组合的组合物，所述两种粉末或油组分包括：绿唇贻贝(glm)粉末或油组分；和至少5％(w/w)的长尾鳕鱼子(hr)粉末或油组分。
13.本发明还涉及一种组合物，其包含：至少两种不同的粉末或油组分的共混物，所述至少两种不同的粉末或油组分各自包含ω-3脂肪酸，其中所述至少两种不同的粉末或油组分中的第一种包含5％(w/w)或更多的hr粉末或油，并且其中所述至少两种不同的粉末或油组分的共混物一起在所述组合物中提供至少3.3％(w/w)总ω-3脂肪酸。优选地，所述至少两种粉末组分中的第二种为glm粉末或油。
14.在第一种情况下，申请人观察到，当提供用于前述申请的组合物时，ω-3脂肪酸来源的选择是非常重要的。市场上任何给定粉末来源中的ω-3脂肪酸变化很大。申请人的初步调查证实，与市场上稀有且不易获得的较高规格产品相比，一些glm粉末规格没有提供足够的ω-3以满足预期目的的技术标准。
15.然而，即使在低时，glm仍然是ω-3脂肪酸的重要基础来源，并且本发明人进一步研究了基于glm的组合物仍然提供解决方案的其他方式。在这样进行时，确定包括最小量的
不同的、特别选择的ω-3脂肪酸源与较低规格glm粉末组合将ω-3含量提高到可接受的水平。通过测试阐明，使用至少5％的hr粉末与较低规格的glm粉末共混实现了该解决方案。
16.通过体外测定测试进一步阐明，通过引入ω-3含量的特定选择或组合来源，可以在组合物中观察到意想不到的增强水平的抑制或调节活性。这种活性与支持炎症反应途径和维持最佳关节健康高度相关。优选地，hr粉末和glm粉末的共混物的抗炎活性测量为0.05至0.25的系数，根据下文所述的方法测定。
17.申请人还能够证明，如果来源保持相同，hr组分和/或glm组分可以以油形式使用，以产生具有等同技术效果的组合物，从而提供基于基本发明构思的问题的另外的解决方案。
18.在类似的测定中，如对粉末组分所进行的，这种特定的两种油组分组合对炎性途径的作用大于根据各个组分部分的总和预期的作用。
19.因此，如通过相对cox 2活性所测量的，这两种组分的组合(无论是粉末还是油形式)在抑制或调节炎症水平方面比根据本领域公开的水平预测的更好。换句话说，本技术人已经证明，当组分组合选自粉末或油形式时，存在协同效应，其可用于维持对抗炎系统的更好的支持水平。
20.本技术人观察到的体外抑制或调节活性被视为远大于从单独的ω-3efa水平组合预期的累加效应。因此，本技术人已经确定最意想不到的协同效应可以通过本发明实现。也就是说，以最低水平特异性引入hr和/或进一步特异性选择具有较低规格glm提取物的这种粉末或油组分维持了比纯粹基于ω-3efa含量预期的更高水平的竞争性酶活性。因此，在实施方案中，本发明涉及包含具有如权利要求中所述和如本文所述的组分的组合物的食品、补充剂或营养保健品。
21.这样的组合物在含量和/或活性方面可以满足或超过所需的技术标准，并且因此能够实现基于glm的产品的一致和改善的功效，以用于支持关节健康的目的。本发明可用于提供包含如本文所述的组合物的食品或补充剂。食品或补充剂还可包含一种或多种使补充剂更可口或可提供其他益处所需的有用赋形剂。赋形剂可以包括以下赋形剂中的一种或多种，包括但不限于：葡糖胺、透明质酸和硫酸软骨素。
22.在本发明任一方面的优选实施方案中，hr粉末或油在总组合物质量的5％至95％(w/w)范围内。在实施方案中，hr粉末或油组分包含14％至40％(w/w)的总脂肪含量，但重要的是可以包含2％至20％(w/w)的总ω-3脂肪酸含量。
23.关于glm含量，glm粉末或油包含7％至13％(w/w)的总脂肪含量。设想在实施方案中，glm粉末或油包含2.0％至7.0％(w/w)，理想地2.0％至5.0％(w/w)的总ω-3脂肪酸含量。
24.本发明的组合物特别可用作人或兽医产品的补充剂，并且可用于预防炎症、维持低水平的炎症和/或治疗炎症。组合物本身和/或包含所述组合物的食品或补充剂可用于治疗和/或维持人或动物的健康，优选关节健康。此外，治疗和/或维持涉及支持人或动物中的抗炎途径。
25.本发明进一步涉及一种维持关节健康的方法，所述方法包括向有此需要的动物施用本文公开的组合物。在实施方案中，维持健康涉及支持动物的抗炎途径，包括预防炎症。
26.本发明涉及一种治疗受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用如本文所公
开的组合物，其中所述受试者为人或动物。在实施方案中，所述方法在受试者中治疗炎症或维持低水平的炎症，其中受试者为动物。在实施方案中，所述方法维持受试者的健康或关节健康。
27.简述
28.图1为说明glm的金标准规格的剂量响应曲线的示意图；
29.图2为说明变化的glm质量样品工作的示意图；
30.图3为说明ω-3/cox2比率数据的示意图；
31.图4为说明比较glm、鲍鱼、蓝贻贝和hr的海洋样品筛选工作的示意图；
32.图5为说明是在特定％组合下的效果的示意图，其显示了对炎症过程的预测效果和实际效果；
33.图6为说明3种不同采样粉末的cox2的浓度依赖性抑制或调节的示意图；
34.图7为说明相对于％粉末共混物并且与h粉末和x粉末预期趋势线相比表现出的抗炎活性的示意图；
35.图8为说明与h粉末和x粉末预期趋势线相比，x h共混物的抗炎活性与总ω-3脂肪酸水平相比较的示意图；且
36.图9为说明油形式的这两种组分的组合(在各种共混百分比下)在调节cox2活性方面比趋势线所预期的更有效的示意图。
37.详细描述
38.glm用于向体内提供efa。它们通过在抗炎系统中优先作用，产生抗炎介体，来支持抗炎过程。在不存在这些ω-3efa的情况下，其他efa(特别是花生四烯酸)将用作底物，产生促炎介体。
39.根据所用glm的量的不同，观察到有效的剂量反应，即随着浓度增加，炎症过程的活性(cox2活性)下降-参见图1。
40.本发明人已经确定，当glm以相同浓度使用但至关重要地具有较低的efa规格时，可以观察到对炎症过程的作用降低-参见图2。
41.此外，本发明人已经鉴定了ω-3efa与炎症过程的活性之间的相关性，即随着ω-3efa的增加，炎症过程的活性降低-参见图3。
42.已经进一步确定，尽管具有相似水平的总efa，但某些海洋物种在降低炎症过程水平方面更有效，这启示与所有测试的相比，生物活性与特定efa相关-参见图4。
43.已经将hr鉴定为显然具有与一些efa中的glm相似的某些efa的更高分布的一个来源。因此，进一步研究了利用hr作为降低的efa规格glm和降低的全规格glm浓度的替代/补充的潜力。
44.基于glm和hr对炎症过程的相对影响，测试了添加的降低浓度的glm/hr或添加的降低的efa glm/hr的许多组合。基于原始glm&hr样品的炎症性能计算预期的累加效应，目的在于维持根据全浓度、全规格glm预期的效应-参见图5。
45.事实上，本发明人鉴定的是，与从各个组成部分的总和预期的相比，该组合对炎症过程的影响更大。本发明证明了明显的协同效应，其可用于维持对抗炎系统的更好水平的支持。
46.认为efa作为任何组合物中的组分是重要的，其旨在帮助支持与人或动物关节相
关的天然抗炎过程，如前所述。
47.特别地，ω-3efa显然通过环氧合酶(cox)和脂氧合酶(lox)途径作为花生四烯酸氧化的双重竞争剂，且由此可用于所述应用。
48.efa和ω-3脂肪酸特别地可以在绿唇贻贝(glm)或绿壳贻贝(gsm；perna canaliculus)中发现。如前所述，由于glm粉末规格的变化以及许多现有的glm粉末来源单独地不一定提供具有足够含量的ω-3脂肪酸的规格的事实，寻求研究替代物或添加剂。
49.各种海洋来源被认为是期望的ω-3脂肪酸组分的潜在来源。通常，海洋衍生的高ω-3脂肪酸来源是来自贝类或鱼器官的油。
50.将一系列这些类型的油筛选为包含glm的组合物的组成部分的潜在替代物，以改善总ω-3脂肪酸含量。尽管本身是ω-3脂肪酸的良好来源，但发现难以将油与glm粉末共混以提供适于配制成适用产品的均匀粉末。
51.然而，ω-3脂肪酸的一种这样的来源是来自蓝尖尾无须鳕(macruronus novaezelandiae)或白鱼长尾鳕的干燥的鱼子粉。因此，测试长尾鳕鱼子(hr)粉末以确定将其添加到glm粉末中是否会改善efa的含量，特别是ω-3脂肪酸的含量。
52.通过在添加hr粉末之前，然后在添加之后测量glm粉末中ω-3脂肪酸的水平来确定hr粉末的适用性，以检查ω-3水平是否通该组合升高至所需规格。所需的规格由glm粉末提供，已知所述glm粉末得到商业上期望的治疗结果，具有相对高的ω-3脂肪酸规格。
53.为了确保新的粉末共混物也表现出期望的抗炎活性(尽管包含较低ω-3含量的glm)，测试了体外酶活性并与本技术人使用的标准期望规格产品进行比较。
54.使用通常使用的测量抗炎活性的体外方法，即通过测定cox2酶的体外竞争水平，已知其为显著牵涉炎症过程的途径，如前文所讨论的。
55.方法
56.新西兰绿唇贻贝(glm)粉末和新西兰hr粉末从商业来源获得，并且使用bligh和dyer方法从单独的粉末或粉末的共混物获得脂质提取物。所述方法描述于以下涉及所述方法的公开参考文献中(a rapid method of total lipid extraction and purification.canadian journal of biochemistry and physiology 1959,37:911-917)。使用aoac方法963.22测量该脂质提取物的脂肪酸组分。
57.结果
58.通过测量和比较本技术人已知具有可接受规格的glm产品(x)的标准参考来源中的ω-3脂肪酸的量以及因此适合和期望使用的ω-3脂肪酸的所需量来产生第一组数据。还测量了已知具有较低规格的glm粉末(x)的另一来源。
59.单独的glm x粉末表现不充分，在比具有低cox2活性或调节的参比粉末glm(x)显著更少的ω-3脂肪酸下测量且由此低于上文提及的商业上期望的应用所需的规格。
60.测试新的组合以确定当以下规格的产品x补充有一定量的已知富含ω-3的不同粉末时ω-3脂肪酸水平如何受到影响。
61.hr粉末(h)先前已选自多种来源，基于其具有提高总ω-3脂肪酸含量的良好潜力并且能够容易地共混到glm粉末中。
62.为了确定较低规格的glm粉末是否可以通过添加hr粉末而提高到所需规格，理论上确定，添加到较低规格的glm粉末(x)中的至少5％(w/w)，优选8％(w/w)的特定hr粉末
(bn:hr114)可以使总ω-3含量得分(产品的总脂肪中脂肪酸％的量度)提高到满足所需规格的水平。
63.通过测量确定，通过将8％(w/w)hr粉末(h)包括在与以下规格glm粉末(x)的共混物中，ω-3脂肪酸含量增加至3.5％(w/w)，非常接近于如表1中所示的标准粉末x(bn32132)的水平：
64.表1
[0065][0066][0067]
生物活性和图形分析
[0068]
将不同质量规格的glm(ω-3脂肪酸水平不同)与hr粉末以不同比例组合。然后，与来源glm(x)和长尾鳕粉末(h)相比，我们测量了组合产品中的总ω-3脂肪酸和那些粉末的cox抑制或调节评分。
[0069]
接下来，测量上述实施例的抗炎活性，以确定与基于来源的ω-3脂肪酸的新组合的预期活性相比，该组合的生物学影响的可能潜力。
[0070]
通过将粉末共混物组合的脂质提取物与商购哺乳动物cox2酶一起温育来确定cox2抑制或调节，并且将酶的活性测量为通过前列腺素g2(pgg2)对n,n,n,n
’‑
四甲基-对苯二胺(tmpd)的共氧化以产生氧化的tmpd，其为蓝色并且在611nm处易于检测到。
[0071]
粉末共混物组合的cox2抑制或调节活性由cox2酶的脂质提取物浓度依赖性抑制或调节来确定，或通过粉末样品的抗炎活性(ai)评分来确定，所述评分计算为抑制或调节50％的cox2酶所需的脂质提取物浓度(ic
50
)的倒数乘以从粉末共混物组合提取的脂质的总重量。
[0072]
从图中可以看出，确定了以下规格的glm粉末(x)与8％(w/w)hr粉末(h)共混以产生x h(bn32127)粉末对cox2的浓度依赖性抑制或调节显著大于单独的glm粉末x(bn32132)，其显示出相似的ω-3脂肪酸水平(如表1中所示)，且由此可以被视为相似的。
[0073]
相当更令人惊讶地，如图6中具体所示，x h(bn 32127)对cox2的浓度依赖性抑制或调节甚至大于100％hr粉末h(bn:hr114)，其表现出显著大于x h的ω-3水平(如表1所
示)。
[0074]
正如从图7中可以观察到的，进一步确定了x h在不同百分比的％h共混物(菱形数据点)下表现出的抗炎(ai)活性大于当绘制显示glm粉末x(最左边的正方形数据点)和hr粉末h单独(最右边的正方形数据点)的活性的线性趋势线时预期的(ai)活性所预期的抗炎活性。两者之间的线性趋势线指示从两种粉末的简单累加效应可能预期的结果，这启示两者具有增强的效应，其组合远远超过单独效应的累加。
[0075]
在图8中进一步观察到这种趋势，因为在不同％粉末共混物下x h的抗炎(ai)活性(菱形数据点)也大于从单独的h和x中的总ω-3脂肪酸水平预期的(如图3中所示)。
[0076]
大的正方形数据点显示线性趋势线相关性，其表明通过组合两种粉末实现的简单累加效应所预期的结果。然而，正如可以观察到的，共混粉末相当显著地超过预期的ai活性，这表明新的组合提供增强的和因此协同的效应，而不仅仅是累积或累加效应。
[0077]
本发明人另外测试了这些组分的基于油的组合，并确定在不同百分比的h共混物(圆形数据点)下表现出的抗炎活性也大于从油组分的累加活性预期的抗炎活性。这证实了与单独的组分相比，基于油的组分组合在产生增强的生物活性方面也是有效的。
[0078]
表2显示了如下基于油的组分测试的结果：
[0079][0080]
图9通过绘制100％glm油(最左边的正方形)和100％hr油(最右边的正方形)任一单独使用时可能预期的相对cox2活性，以图形形式说明了这些结果(如表2所示)的显著性。两个绘制的数据方点之间的线性趋势线指示了从两种油的简单累加效应可能预期的结果。
[0081]
如上表2所示，在各种组合中观察到的实际活性的绘图结果(绘制为圆形数据点)启示，油组分组合也具有增强的协同效应，其超过了单独油组分的累加效应。